hoàng thị loan xây dựng phương pháp xác định tạp acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrulin malat

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TẠP ACID MALEIC VÀ ACID

FUMARIC TRONG NGUYÊN LIỆU

CITRULIN MALAT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

FUMARIC TRONG NGUYÊN LIỆU

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày những nội dung thuộc đề tài nghiên cứu của mình, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn đồng hành, hỗ trợ em trong suốt thời gian làm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn

Thị Thuận – giảng viên Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện tối đa trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của em

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành nhất cho gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt những năm tháng học tập và nghiên cứu ở ngôi trường

này Đặc biệt, tôi xin cảm ơn anh Lã Hải Long, em Vũ Thị Diễm Quỳnh, em Chu Thị Trang, em Bùi Văn Quân, em Nguyễn Tuyết Mai và các em khóa 76, H1K2 đã luôn

đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại bộ môn

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024 Sinh viên

Hoàng Thị Loan

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤCDANH MỤC KÝ TỰ VIẾT TẮTDANH MỤC BẢNG BIỂUDANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ

1.2 Sơ lược về L – citrullin DL – malat (1:1) 5

1.2.1 Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat 5

1.2.2 Cơ chế sinh học L – Citrullin DL – malat 5

1.3 Tạp chất acid maleic và acid fumaric trong CM 7

1.3.1 Acid maleic 7

1.3.2 Acid fumaric 8

1.4 Các phương pháp xác định AM và AF 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 11

2.1.1 Đối tượng khảo sát 11

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.3 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 11

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu Citrullin malat 12

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Khảo sát phương pháp phân tích 18

3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện 18

3.1.2 Khảo sát chương trình gradient dung môi 18

3.1.3 Khảo sát pH đệm phosphat 20

3.2 Thẩm định phương pháp xác định tạp chất AM và AF bằng HPLC 21

3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 21

3.2.2 Độ đặc hiệu 23

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 24

3.2.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 25

3.2.5 Độ đúng 27

3.2.6 Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian) 28

3.3 Quy trình xác định acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat 30

3.4 Ứng dụng phân tích lô nguyên liệu CM nhà sản xuất cung cấp 31

3.5 Bàn luận 32

3.5.1 Về lựa chọn bước sóng phát hiện 32

3.5.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký 32

3.5.3 Về thẩm định phương pháp 33

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35

4.1 Kết luận 35

4.2 Đề xuất 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao KH2PO4 Kali dihydrophosphat

LC – MS Sắc ký lỏng - khối phổ

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) S/N Tỉ lệ tín hiệu so với nhiễu (Signal to noise ratio)

TCA Chu trình acid Tricarboxylic

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.2: Tổng hợp các phương pháp phân tích AM và AF 9

Bảng 2.1: Chương trình dung môi 1 14

Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2 14

Bảng 2.3: Nồng độ từng chất trong mỗi dung dịch chuẩn hỗn hợp 16

Bảng 3.1: Kết quả độ phù hợp hệ thống của AM 22

Bảng 3.2: Kết quả độ phù hợp hệ thống của AF 22

Bảng 3.3: Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp 24

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của AM 25

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của AF 26

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AM 27

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AF 27

Bảng 3.8: Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian trong 2 ngày phân tích khác nhau của AM và AF 28

Bảng 3.9: Kết quả độ chính xác trung gian khác người phân tích của AM và AF 29

Bảng 3.10: Kết quả phân tích lô nguyên liệu CM 31

DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat 5

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn các cơ chế sinh học của L – citrullin 6

Hình 1.3: Sơ đồ biểu diễn cơ chế sinh học của Malat 6

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của AM 7

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của AF 8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nhiều năm gần đây, xu hướng sử dụng thực phẩm chức năng để tăng cường thể lực và bảo vệ sức khỏe ngày càng tăng Đặc biệt, đối với các vận động viên thì việc sử dụng các sản phẩm này là rất cần thiết Bởi vì, họ thường xuyên phải tập luyện thể lực, chuyên môn, thi đấu với cường độ cao và liên tục, điều này có thể dẫn đến cạn kiệt năng lượng và gặp phải các tai nạn nghề nghiệp Việc sử dụng thực phẩm chức năng với các vai trò như: cải thiện hiệu suất tập luyện, tăng tốc độ hồi phục và ngăn ngừa các chấn thương có thể xảy ra trong quá trình tập luyện [16]

Một trong số các thực phẩm chức năng hiện nay được khuyến khích sử dụng cho

các vận động viên là L – citrullin DL – malat (CM) CM là một chất có tiềm năng sinh

học, tham gia vào một số chu trình trao đổi, chuyển hóa của cơ thể người, cung cấp năng lượng và làm tăng hiệu suất tập luyện thể lực của các vận động viên

Chính vì tác dụng có lợi này mà CM ngày càng được biết đến và sử dụng rất rộng rãi, các thực phẩm chức năng có chứa thành phần này ngày càng xuất hiện nhiều trên thị trường Việt Nam Vậy nên, việc kiểm soát chất lượng của CM càng cần được quy định chặt chẽ, tránh lưu hành các sản phẩm kém chất lượng, gây hại đến sức khỏe người sử dụng

Hiện nay, tại Việt Nam chưa có công bố khoa học nào đề cập đến việc kiểm soát chất lượng của CM Một trong những yếu tố đảm bảo chất lượng và an toàn cho sản phẩm chính là việc kiểm soát hàm lượng tạp chất còn tồn dư trong nguyên liệu Đối với

nguyên liệu CM có khả năng tồn tại các tạp chất là: acid maleic, acid fumaric và N –

acetylornithin Vì vậy, đề tài của chúng tôi lựa chọn xác định tạp chất liên quan của nó là acid maleic và acid fumaric

Đề tài “Xây dựng phương pháp xác định tạp acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrulin malat” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp xác định tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hai tạp chất acid maleic và acid fumaric nguyên liệu citrullin malat

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu

+ Dung môi tồn dư: là những chất lỏng vô cơ hoặc hữu cơ còn tồn dư sau quá trình tổng hợp nguyên liệu

quá trình phân hủy thuốc (ví dụ: các vết kim loại…) + Một số tạp chất không gây ra các tác động trên nhưng nó biểu thị cho mức độ

sạch (mức độ tinh chế) của nguyên liệu

1.1.3 Các phương pháp xác định tạp chất

Hầu hết các chuyên luận dược điển hay tiêu chuẩn cơ sở đều quy định về việc xác định các tạp chất (bao gồm tạp vô cơ, hữu cơ, tạp chất liên quan) Đối với các tạp chất vô cơ là các tạp có nguồn gốc từ môi trường sản xuất, đa số xuất hiện trong các nguyên liệu, phương pháp xác định giới hạn sẽ được quy định trong một chuyên luận chung của dược điển, bằng các phương pháp hóa học, quang phổ, góc quay cực… Các tạp chất liên quan trong nguyên liệu (thường là tạp hữu cơ) có thể xuất hiện trong bước tổng hợp, từ nguyên liệu quan ban đầu, chất trung gian Các tạp này có thể khác nhau giữa các nguyên liệu, nên các phương pháp xác định thường được quy định trong từng chuyên luận riêng, cụ thể với từng chất

Tạp chất liên quan trong nguyên liệu được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như hóa học, quang phổ tử ngoại… Các phương pháp chủ yếu hay được sử

3dụng nhất là nhóm các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao Nhóm phương pháp này có tính ổn định và chính xác cao, có khả năng phân tích được nhiều chất khác nhau, khả năng ứng dụng rộng rãi

Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký: Sắc ký bao gồm nhiều kỹ thuật phân tách dựa trên sự phân bố hoặc phân chia của mẫu giữa pha chuyển động được gọi là pha động và pha cố định được gọi là pha tĩnh Sắc ký có thể được xem như một loạt các cân bằng giữa pha động và pha tĩnh Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác, do đó ái lực của nó với pha tĩnh và pha động khác nhau

• Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [2]: - Nguyên tắc: Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu

phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định, di chuyển trên bản mỏng dưới tác động của lực mao quản Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động

- Ứng dụng: TLC có thể xác định được nhiều tạp chất có nồng độ cao, có khả

năng phát huỳnh quang hoặc thực hiện các phản ứng hiện màu đặc trưng

Xác định tạp định danh trong nguyên liệu hóa dược bằng cách so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng

- Ưu - Nhược điểm của phương pháp:

+ Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng thực hiện, không cần hệ thống máy móc cầu kỳ + Chuẩn bị mẫu đơn giản – ít gặp vấn đề về nền mẫu

+ Thời gian và chi phí cho phân tích thấp + Độ nhạy của phương pháp thấp, nồng độ tạp chất trong mẫu phải cao + Đối với hệ TLC đơn giản chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được

• Phương pháp sắc ký khí (GC) [2]: - Nguyên tắc: Pha động trong GC là chất khí Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc

chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn (GSC) và sắc ký khí lỏng (GLC) Chất phân tích được pha động đưa vào cột dưới dạng hơi Trong cột xảy ra quá trình tương tác giữa chất phân tích trong pha động (hơi) với pha tĩnh Thành phần hòa tan nhiều hơn trong pha tĩnh di chuyển chậm hơn trong cột, ngược lại thành phần ít hòa tan hơn trong pha tĩnh di chuyển nhanh hơn Do

4đó, các thành phần có trong hỗn hợp mẫu được phân tách theo hệ số phân chia của chúng giữa thành phần trong mẫu và pha tĩnh Do các chất phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng được tách ra khỏi nhau

- Ứng dụng: GC là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dụng

trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt Tạp chất phân tích bằng GC gồm sản phẩm phân hủy, tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và dung môi tồn dư

- Ưu - Nhược điểm của phương pháp:

+ Là phương pháp xanh, do giảm thiểu việc sử dụng các dung môi hữu cơ + Chỉ áp dụng được với các tạp chất có khả năng bay hơi và không bị phân hủy bởi

nhiệt + Đòi hỏi nhiệt độ và áp suất phù hợp cho sự bay hơi của chất phân tích

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[2]: - Nguyên tắc: Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới

tác động của pha động lỏng Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau Các cơ chế tách bằng HPLC có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, ái lực, tách đồng phân đối quang

- Ứng dụng: HPLC được sử dụng để xác định các tạp chất ở trạng thái lỏng hoặc

tạp chất rắn có khả năng hòa tan trong dung môi thích hợp HPLC cho phép phân tích các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt có cấu trúc rất khác nhau, từ những chất có khối lượng phân tử nhỏ đến lớn, các kim loại, anion vô cơ, các chất hữu cơ bao gồm cả những chất có nguồn gốc tự nhiên, sản phẩm sinh học

- Ưu – nhược điểm của phương pháp:

+ Phạm vi ứng dụng rộng, với khoảng nồng độ có thể phân tích cỡ hàng trăm ppm đến dưới ppb

+ Phương pháp dễ dàng đáp ứng yêu cầu về độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc cũng như độ nhạy cao ứng với quy trình phân tích tương ứng

+ Áp dụng được thử giới hạn và định lượng tạp chất trong nguyên liệu + Không áp dụng được cho tạp chất rắn không tan

+ Giá thành thiết bị, hóa chất tiêu hao cao, yêu cầu chất chuẩn phân tích cao

1.2 Sơ lược về L – citrullin DL – malat (1:1)

L – Citrullin DL- malat (CM) là sự kết hợp của hai thành phần L – citrullin và DL – malat (hoặc acid DL – malic) theo tỷ lệ 1:1 [5] CM là một muối hữu cơ tham gia vào

quá trình chuyển hóa của cơ thể tạo ra năng lượng, tăng khả năng cung cấp oxy và dinh dưỡng đến các cơ trong quá trình tập luyện cường độ cao

1.2.1 Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat

• Danh pháp IUPAC: (2S) – 2 – amino – 5 – (carbamoylamino)pentanoic acid; 2 –

hydroxybutanedioic acid [13] • Công thức phân tử: C10H19N3O8 [13] • Trọng lượng phân tử: 309,27 g/mol [13]

1.2.2 Cơ chế sinh học L – Citrullin DL – malat

Tác dụng sinh học của CM là do sự hiệp đồng tác dụng của cả L – citrullin và DL –

malat ở cơ [19]

L – citrullin là một acid amin không thiết yếu, được sản xuất thông qua hai quá trình trao đổi chất quan trọng: từ glutamin trong đường ruột và từ việc chuyển L – arginin thành nitric oxid (NO) [18] Tác dụng của CM được thể hiện thông qua tác dụng của L

– citrullin bằng 2 cơ chế sau:

Thứ nhất, L – Citrullin khi hấp thu vào cơ thể sẽ làm tăng nồng độ L – arginin trong máu khi nghỉ ngơi và khi tập luyện thể dục L – arginin là hợp chất chính trong con đường tổng hợp NO Khi uống L – citrullin có thể gián tiếp làm tăng nồng độ NO trong

máu thông qua con đường L – arginin – NO (Hình 1.2) NO được tổng hợp sẽ tác động

lên cơ trơn làm giãn mạch máu, từ đó cải thiện lưu lượng máu đến các cơ bắp đang hoạt động, cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, làm giảm đau nhức cơ bắp [11]

Thứ hai, L – citrullin tham gia hỗ trợ quá trình loại bỏ amoniac thông qua chu trình

ure (Hình 1.2)

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn các cơ chế sinh học của L – citrullin

(CPS: carbamoyl phosphat synthetase, OTC: ornithin transcarbamylase, ASS: argininosuccinat synthase, ASL: argininosuccinat lyase, NOS: Nitric oxid synthases)

Amoniac là một chất thải của quá trình chuyển hóa, nó sản sinh ra nhiều hơn với người tập luyện cường độ cao Nồng độ amoniac trong máu tăng cao sẽ cản trở quá trình

cung cấp ATP cho cơ xương Khi tập thể dục cường độ cao, bổ sung L – Citrullin giúp

giải độc amoniac trong máu, từ đó làm tăng cường khả năng sử dụng pyruvat hiếu khí và cung cấp ATP cho cơ xương [11]

Hình 1.3: Sơ đồ biểu diễn cơ chế sinh học của Malat

(MEc: enzym malic trong tế bào chất, DIC: dicarboxylat carrier, MEm: enzym malic trong ty

thể, PC: pyruvat carboxylase, PDH: pyruvat dehydrogenase)

7Cơ chế sinh học cuối cùng của CM được biết đến là nhờ tác dụng của thành phần malat Malat là chất trung gian hoạt động trong chu trình acid tricarboxylic (TCA), có thể đóng vai trò quan trọng trong tốc độ sản xuất ATP hiếu khí thông qua phản ứng

anaplerotic (Hình 1.3) Malat bị khử hydro trong chu trình TCA thành oxaloacetat –

nồng độ của nó là yếu tố quan trọng trong kiểm soát tốc độ sản xuất ATP hiếu khí Bên cạnh đó, nó còn được vận chuyển qua màng ty thể vào tế bào chất bằng hệ vận chuyển dicarboxylate, được chuyển hóa thành pyruvat Malat được cho là tham gia vào các phản ứng phụ trợ có thể làm thay đổi nồng độ của chất trung gian TCA, từ đó ảnh hướng đến các dòng vào và ra khỏi chu trình TCA [5]

Như vậy, CM có tác dụng làm tăng hiệu suất tập luyện và khả năng phục hồi cơ bằng nhiều cách khác nhau, bao gồm: giãn mạch, cải thiện khả năng cung cấp oxy và chất dinh dưỡng đến các cơ, tăng sản xuất ATP trong quá trình tập luyện thể dục; đồng thời CM làm giảm sự sản xuất các chất thải lactat và amoniac [10]

1.3 Tạp chất acid maleic và acid fumaric trong CM

CM được tổng hợp bằng cách kết hợp 2 thành phần L – citrullin và acid DL –

malic, vậy nên trong CM có thể tồn tại các tạp chất của hai thành phần này Theo USP

43, tạp chất định danh trong L – citrullin là N – acetylornithin [9], tạp chất định danh

tồn tại trong acid malic cần kiểm soát là acid maleic (AM) và acid fumaric (AF) [8] Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai tạp chất của acid malic là acid maleic và acid fumaric, hai acid xuất hiện trong quá trình tổng hợp của acid malic

1.3.1 Acid maleic

1.3.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của acid maleic [14]

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của AM

• Danh pháp IUPAC: (Z)-but-2-enedioic acid

• Công thức phân tử: C4H4O4

• Trọng lượng phân tử: 116.07 g/mol • Cảm quan: Acid maleic là chất rắn kết tinh không màu, có mùi nhẹ • Độ tan trong 100ml nước ở 25oC là: 78g

• Nhiệt độ nóng chảy: 130 – 131oC • Nhiệt độ sôi: 275oF ở 760 mmHg (phân hủy) • Hằng số phân ly: pKa1 = 1,94 và pKa2 = 6,22 ở 25 oC • LogP = - 0,48

1.3.1.2 Độc tính của acid maleic

Một số nghiên cứu khoa học in vitro và in vivo đã chứng minh acid maleic tác

động trên ống lượn gần gây ra hội chứng Fanconi và rối loạn chức năng thận cấp tính

Nghiên cứu trên chuột cho thấy: acid maleic ức chế cạnh tranh hoạt động của hai enzym quan trọng cho quá trình oxy hóa glutamat là glutamat dehydrogenase và alpha – ketoglutarat dehydrogenase, do đó làm xáo trộn quá trình chuyển hóa oxy xảy ra trong ty thể ở thận [20]

Phiếu an toàn hóa chất của acid maleic (SDS) cũng đưa ra cảnh báo độc hại có thể xảy ra khi nuốt phải acid maleic (độc tính cấp 4)

Vì vấn đề an toàn, USP 43 đã quy định giới hạn cho phép của acid maleic trong một số chuyên luận như:

• Chuyên luận acid malic [8]: NMT 0,05% • Chuyên luận acid fumaric [6]: NMT 0,1%

1.3.2 Acid fumaric

1.3.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của acid fumaric [15]

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của AF

• Danh pháp IUPAC: (E)-but-2-enedioic acid

• Công thức phân tử: C4H4O4

• Trọng lượng phân tử: 116.07 g/mol • Tính chất: Acid fumaric có dạng chất rắn kết tinh không màu, không mùi • Điểm sôi: 329oF ở 1,7 mmHg

• Độ hòa tan trong nước kém: 0,63 g/100ml ở 25oC • Hằng số phân ly: pKa1 = 3,03 và pKa2 = 4,54 ở 25oC • LogP = 0,46

1.3.2.2 Độc tính của acid fumaric

AF thường được coi là một nguyên liệu hóa dược tương đối an toàn, được sử dụng trong các công thức dược phẩm và các thực phẩm được sử dụng đường uống Tuy nhiên, đã ghi nhận các phản ứng bất lợi và suy thận cấp xảy ra trên bệnh nhân khi sử dụng AF và các dẫn xuất của nó gây ra Các tác dụng phụ khác khi sử dụng AF và dẫn xuất đường uống bao gồm: rối loạn chức năng của da, chức năng gan, tác dụng trên đường tiêu hóa và đỏ bừng mặt [17]

LD50 của acid fumaric được báo cáo là:

9LD50 (chuột, IP): 0,1 g/kg LD50 (chuột, uống): 9,3 g/kg

Với độc tính như trên, giới hạn của AM và AF trong chuyên luận acid malic là: NMT 0,05% và NMT 1,0% Vì vậy, giới hạn có thể chấp nhận được của AM và AF trong CM được xác định là: 0,025% và 0,5% (do tỉ lệ acid malic trong CM là 50%)

1.4 Các phương pháp xác định AM và AF

Hiện nay, trong các dược điển Việt Nam V, Anh, Mỹ, châu Âu đều chưa có

chuyên luận về L – citrullin DL – malat Cũng chưa có công bố quốc tế hay trong nước

nào nghiên cứu về việc xác định các tạp chất AM và AF có trong CM Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu đã xây dựng phương pháp xác định tạp AM và AF trong CM dựa trên việc tham khảo tài liệu liên quan đến phân tích AM và AF

Bảng 1.1: Tổng hợp các phương pháp phân tích AM và AF

Tài liệu tham khảo

Chất phân tích

Mẫu phân tích Phương pháp phân tích

[12]

Acid oxalic Acid fumaric

Acid maleic Acid succinic

Acid tartaric và

acid malic

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ức chế ion: - Cột Nova – Pak C18

- Pha động: Gradient rửa giải, sử dụng nước được điều chỉnh ở pH 2,10 – 2,15 bằng acid perchloric

- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Nhiệt độ cột: 30oC

[7] Acid malic

Acid fumaric

Acid maleic

Sắc ký lỏng hiệu năng cao: - Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Cột sắc ký: L1, 4,6 mm x 15 cm; 3µm - Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút

- Thể tích tiêm: 10 µl - Pha động triển khai theo chương trình dung môi với 2 kênh:

+ Kênh A: Đệm kali phosphat 10mM được điều chỉnh đến pH 2,3 bằng acid phosphoric (đệm phosphat)

+ Kênh B: Acetonitril (ACN): Kênh A (55:45) - Dung môi pha mẫu: ACN: kênh A = 2:98

[8] Acid maleic

Acid fumaric

Acid malic

Sắc ký lỏng hiệu năng cao: - Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Cột sắc ký: L17, 6,5 mm x 30 cm - Nhiệt độ cột: 37 ± 1oC

- Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Pha động: acid sulfuric 0,01N

[6] Acid maleic Acid

fumaric

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): - Pha động: acid sulfuric 0,005 N - Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Cột sắc ký: L17, 4,6 mm x 22 cm - Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút

- Thể tích tiêm: 5 µl Nhận xét: Các nghiên cứu trên đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để tiến hành phân tích, chỉ khác nhau ở cột phân tích sắc ký, từ đó có các hệ pha động và điều kiện phân tích khác nhau

Trên cơ sở thiết bị và hóa chất sẵn có tại phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn quy trình phân tích tương tự như trong chuyên luận acid maleic của USP 43[7], với các điều kiện sau:

- Phương pháp phân tích: HPLC - Cột sắc ký pha đảo: C18, 250 x 4,6mm, 5µm - Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút

- Thể tích tiêm: 10 µl - Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Dung môi pha mẫu (DMPM): Acetonitril: Đệm phosphat = 2:98 - Chương trình dung môi:

Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng khảo sát

Nguyên liệu L – citrullin DL – malat (1:1) của Jing Jing Pharmaceutical Co., Ltd

+ Số lô: C562305009 + Ngày sản xuất: 19/05/2023 + Hạn sử dụng: 2 năm

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Hai tạp chất trong nguyên liệu CM: Acid maleic và acid fumaric

2.1.3 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

- Acid maleic: + Độ tinh khiết: 99,0% + Nhà sản xuất: Bidepharmatech + Số lô: DLX760

+ Ngày sản xuất: 02/12/2022 + Hạn sử dụng: 11/11/2026 - Acid fumaric:

+ Độ tinh khiết: 99,5% + Nhà sản xuất: Shanghai Zhanyun Chemical Co.,Ltd + Số lô: 231210

+ Hạn sử dụng: 5 năm - Acetonitril dùng cho HPLC, Fisher – Hàn Quốc - Acid phosphoric đậm đặc (AR): 85,0%, Guangdong Guanghua Sci-Tech Co.,Ltd - Kali dihydrophosphat (AR): 99,5%, Xilong Scientific Co.,Ltd

Vis + Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6mm, 5µm) + Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 µm) Máy lọc hút chân không Gast

Manufacturing, INC, Mỹ + Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105, Mỹ + Máy đo pH Eutech, Singapore

+ Máy siêu âm Soronex Bandelin, Đức

12+ Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh - Dụng cụ: Bình định mức, pipet chính xác, pipet chia vạch, quả bóp cao su, màng lọc cellulose acetat 0,45 µm và các dụng cụ thủy tinh khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu Citrullin malat

Trên cơ sở chuyên luận acid maleic của USP 43 [7], nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại để xây dựng phương pháp xác định tạp chất AM và AF trong nguyên liệu CM bằng thiết bị HPLC

- Điều kiện cố định: • Cột sắc ký pha đảo: C18, 250 x 4,6mm, 5µm • Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút

• Thể tích tiêm: 10 µl • DMPM: ACN : Đệm phosphat = 2:98 - Các yếu tố cần khảo sát:

• Bước sóng phát hiện • Điều kiện sắc ký:

+ Chương trình gradient dung môi, gồm 2 kênh

• Kênh Acetonitril • Kênh đệm kali dihydrophosphat 3,33mM, pH = 2,3

+ pH của dung dịch đệm phosphat

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn của AOAC[4] và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3] với các tiêu chí sau:

- Độ phù hợp hệ thống - Độ đặc hiệu của phương pháp - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Độ đúng - Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian)

2.2.3 Ứng dụng

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hai tạp chất acid maleic và acid fumaric trong lô nguyên liệu CM của Jing Jing Pharmaceutical Co.,Ltd

+ Số lô: C562305009 + Ngày sản xuất: 19/05/2023

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xử lý mẫu

Dung môi pha mẫu (DMPM) là hỗn hợp ACN : đệm phosphat với tỉ lệ 2 : 98

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn AM

+ Dung dịch chuẩn gốc AM 250 µg/ml: Cân chính xác khoảng 25,25 mg AM vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng 50 ml DMPM, siêu âm 15 phút cho đến khi tan hết, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn làm việc AM 25 µg/ml: Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn AM 2,5 µg/ml: Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc vào bình định mức 50,0 ml, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn AF

+ Dung dịch chuẩn gốc AF 5 mg/ml: Cân chính xác khoảng 125,6 mg AF vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút cho đến khi tan hết, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn làm việc AF 500 µg/ml: Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn AF 50 µg/ml: Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp

Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc AM và 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc AF vào một bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch thử CM

Dung dịch thử Citrullin malat 10 mg/ml: Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu Citrullin malat vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn

+ Dung dich thử thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 75,39 mg CM vào bình định mức 25,0 ml, thêm chính xác lần lượt một lượng dung dịch chuẩn làm việc AM và AF tương ứng với nồng độ của chất chuẩn là 30%, 100%, 110% vào bình định mức trên, thêm khoảng 10ml DMPM, siêu âm trong vòng 45 phút; thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

14+ Dung dịch thử thêm chuẩn (sử dụng cho chỉ tiêu thẩm định độ đặc hiệu): Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu Citrullin malat vào bình định mức 25,0 ml, thêm một lượng chuẩn làm việc AM và AF tương ứng với nồng độ 100%, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

2.3.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

- Như đã được trình bày ở trên, đề tài tiến hành cố định các điều kiện sắc ký như sau: + Cột sắc ký pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút + Thể tích tiêm: 10 µl + Dung môi pha mẫu: ACN : Đệm phosphat= 2 : 98 - Tiến hành khảo sát lại các điều kiện sắc ký sau:

+ Bước sóng phát hiện: căn cứ vào kết quả quét phổ mẫu chuẩn để lựa chọn bước sóng

+ Chương trình dung môi: khảo sát trên hai chương trình • Chương trình 1:

Bảng 2.1: Chương trình dung môi 1

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

• Chương trình 2:

Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

Yêu cầu: AF và AM phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp khác và độ phân giải

phải đạt ít nhất 1,5; pic cân xứng

Cách tiến hành: Phân tích bằng hệ thống sắc ký lặp lại 6 lần trên dung dịch

chuẩn hỗn hợp AM và AF có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính lần lượt là 2,5 µg/ml và 50 µg/ml, ghi lại sắc ký đồ và kết quả phân tích Đánh giá tính phù hợp của hệ thống trên thời gian lưu (tR), diện tích pic (Spic), số đĩa lý thuyết, độ phân giải (Rs) và hệ số đối xứng pic (Tf) của hai pic AM và AF giữa các lần tiêm

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu, diện tích pic ≤ 2,0%

2.3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ)

16Tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp như trên bảng, ghi lại sắc ký đồ Trên sắc ký đồ thu được, xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

Yêu cầu: LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 nhiễu

đường nền, thông thường lấy S/N = 3 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10

2.3.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Cách tiến hành:

Từ dung dịch chuẩn làm việc AM và AF có nồng độ lần lượt chính xác khoảng 25 (µg/ml) và 500 (µg/ml), pha loãng với DMPM để được các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ như sau:

Bảng 2.3: Nồng độ từng chất trong mỗi dung dịch chuẩn hỗn hợp

Chuẩn hỗn hợp

Chất chuẩn (µg/ml)

Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng và hệ số tương quan nằm trong

khoảng 0,995 ≤ R ≤ 1, độ chệch (bias) tại các điểm không vượt quá ± 15%, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

2.3.3.5 Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)

Cách tiến hành:

- Độ lặp lại: Tiến hành phân tích độc lập 6 dung dịch thử có nồng độ 10 mg/ml, tính kết quả dựa vào dung dịch chuẩn hỗn hợp tiến hành trong cùng điều kiện Xác định độ lặp lại dựa vào giá trị RSD (%) giữa các lần phân tích

- Độ chính xác trung gian: Tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng thực hiện trong 2 ngày khác nhau và 2 người phân tích khác nhau, thực hiện trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm và thiết bị Xác định độ chính xác trung gian dựa vào giá trị RSD (%) giữa các lần phân tích trong các ngày và giữa các ngày khác nhau và giữa hai người khác nhau

Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử biểu diễn bằng RSD (%) không

quá 5,3% đối với AM và 3,7% đối với AF

2.3.3.6 Độ đúng

Cách tiến hành:

Chuẩn bị 3 loại dung dịch thử thêm chuẩn bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào các dung dịch thử Lượng chuẩn thêm vào tương ứng với khoảng 30%, 100%, 110% so với giới hạn của mỗi acid Mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu độc lập, tiến hành phân tích sắc ký Ghi lại sắc ký đồ thu được, tính độ thu hồi hàm lượng của AM và AF

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn AM 2,5 (µg/ml) và AF 50 (µg/ml) thu được kết quả như sau:

Hình 3.1: Phổ UV của AF và AM

Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện để tiến hành xác định tạp chất

3.1.2 Khảo sát chương trình gradient dung môi

Tiến hành khảo sát dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử CM với 2 chương trình gradient dung môi như sau:

+ Đệm phosphat: Đệm kali dihydrophosphat 3,3 mM, pH = 2,3 • Chương trình 1:

Bảng 2.1: Chương trình gradient dung môi 1

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

• Chương trình 2:

Bảng 2.2: Chương trình gradient dung môi 2

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình 1 được thể hiện trên Hình 3.2:

(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp

(b) Dung dịch thử CM

Hình 3.2: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (a) và dung dịch thử CM (b) với

chương trình 1

Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình 2 được thể hiện trên Hình 3.3:

(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp

3.1.3 Khảo sát pH đệm phosphat

Sau khi khảo sát xong chương trình dung môi với đệm phosphat pH 2,3 ở mục

3.1.2, nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát pH đệm phosphat

Tiến hành khảo sát trên đệm phosphat pH 2,0 với chương trình dung môi đã chọn

ở mục 3.1.2 Kết quả phân tích sắc ký của dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử CM như Hình 3.4:

(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp

Từ các khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là: • Cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6mm; 5 µm) • Thể tích tiêm: 10 µl

• Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút • Nhiệt độ cột: 25oC

• Bước sóng phát hiện: UV 210 nm • Chương trình dung môi:

+ Đệm phosphat: Đệm KH2PO4 3,3mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH 2,0

Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

Kết quả độ phù hợp hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp AM

và AF với nồng độ tương ứng là 2.58 µg/ml và 50.04 µg/ml được thể hiện ở Bảng 3.1 và 3.2:

Số đĩa lý thuyết

Độ phân giải

Hệ số đối xứng pic

Số đĩa lý thuyết

Độ phân giải

Hệ số đối xứng pic

Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic của AM và AF đều thấp hơn 2,0% Số đĩa lý thuyết trung bình của mỗi acid đều lớn hơn 2000 Độ phân giải Rs của các chất đều lớn hơn 1,5

Như vậy: Điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết nên hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích xác định 2 tạp chất AM và AF theo AOAC[4] và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3]

3.2.2 Độ đặc hiệu

Chuẩn bị độc lập mẫu dung môi, các dung dịch chuẩn, dung dịch thử thêm chuẩn,

dung dịch thử (như trình bày ở mục 2.3.3.2) Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn

Kết quả được trình bày ở Hình 3.5:

Hình 3.5: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu

Mẫu dung môi không cho tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Trên sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn xuất hiện pic có thời gian lưu và phổ UV tương ứng với pic của AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp

Để khẳng định, nhóm nghiên cứu tiến hành chồng phổ UV của hai pic AM và AF có trong dung dịch thử so với trong dung dịch chuẩn

(a) AF: Hệ số Match 0,9997 (b) AM: Hệ số Match 0,9977

Hình 3.6: Kết quả chồng phổ UV của AF (a) và AM (b)

Kết quả cho thấy, hệ số Match của cả AF và AM đều > 0,99 Như vậy: Phương pháp đã xây dựng có tính đặc hiệu cao theo yêu cầu của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp pha loãng (như mục 2.3.3.3)

để xác định LOD, LOQ Sắc ký đồ xác định LOD và LOQ của AM và AF được thể hiện

Bảng 3.3: Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp

3.2.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Tiến hành phân tích sắc ký với dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (chuẩn bị như đã

trình bày ở mục 2.3.3.4) theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn Kết quả được thể hiện trong

Độ chệch (%)

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

của acid maleic

y = 57.719x + 0.5852R² = 0.9999

0.0050.00100.00150.00200.00250.00

Độ chệch (%)

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

của acid fumaric

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AM và AF Đường chuẩn của các chất đều có hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1, độ chệch tại các điểm không vượt quá ± 15 %, riêng điểm nồng độ LOQ không vượt quá ± 20 %

Như vậy: Độ tuyến tính và đường chuẩn của AM và AF phù hợp với yêu cầu của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”

y = 70.661x - 1.8082R² = 0.9999

0.001000.002000.003000.004000.005000.006000.00

3.2.5 Độ đúng

Chuẩn bị các dung dịch thử thêm chuẩn như mục 2.3.3.6 Tiến hành sắc ký theo

điều kiện đã chọn Kết quả độ thu hồi của các chất được trình bày trong các Bảng 3.6 và 3.7:

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AM

Nồng độ chuẩn thêm vào

(µg/ml)

Phép thử

Diện tích pic (mAU.s)

Lượng chuẩn thêm vào (µg)

Lượng chuẩn

tìm thấy (µg)

Tỉ lệ thu hồi (%)

Trung bình

(%)

RSD (%)

(µg/ml)

Phép thử

Diện tích pic (mAU.s)

Lượng chuẩn thêm vào

(µg)

Lượng chuẩn tìm thấy

(µg)

Tỉ lệ thu hồi

(%)

Trung bình

(%)

RSD (%)

28Nhận xét: Kết quả cho thấy độ thu hồi của AM nằm trong khoảng 90,0 – 107,0%, RSD ≤ 5,3% và độ thu hồi của AF nằm trong khoảng 95,0 – 105,0%, RSD ≤ 3,7%

Như vậy: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng của “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC

3.2.6 Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian)

Tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập theo quy trình như mục 2.3.3.5 trong 2

ngày khác nhau với 2 người phân tích để xác định độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian được trình bày ở Bảng 3.8 và 3.9:

Bảng 3.8: Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian trong 2 ngày phân tích khác

nhau của AM và AF

Ngày STT

Lượng cân thử

(g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng

(%)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng

(g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (%)

30Nhận xét: RSD của AM và AF trong cùng ngày, khác ngày, cùng người phân tích và khác người phân tích đều thỏa mãn yêu cầu là:

+ AM: RSD ≤ 5,3% + AF: RSD ≤ 3,7% Như vậy: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác theo yêu cầu của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”

Nhận xét chung: Phương pháp đã xây dựng đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu

của “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC

3.3 Quy trình xác định acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin malat

• Chuẩn bị các dung dịch chuẩn AM và AF:

(1) Chuẩn bị dung dịch chuẩn AM

- Cân chính xác khoảng 25,25 mg AM vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng 50 ml DMPM, siêu âm 15 phút cho đến khi tan hết, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Pha loãng bằng DMPM để được dung dịch chuẩn AM có nồng độ 2.5 µg/ml Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

(2) Chuẩn bị dung dịch chuẩn AF

- Cân chính xác khoảng 125,6 mg AF vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút cho đến khi tan hết, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Pha loãng bằng DMPM để được dung dịch chuẩn AF có nồng độ 50 µg/ml Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

• Chuẩn bị dung dịch thử CM: Dung dịch thử CM 10 mg/ml: Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu CM vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm rồi tiến hành chạy sắc ký

• Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký pha đảo C18 (4mm x 250 mm, 5 µm) - Thể tích tiêm: 10 µl

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút - Nhiệt độ cột: 25oC

- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm - Chương trình gradient pha động:

+ Đệm phosphat: Đệm KH2PO4 3,3mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH 2,0

Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)

• Xử lý kết quả: Tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch thử để thu lấy kết quả diện tích pic của các acid Hàm lượng của từng acid trong mẫu thử CM được tính theo công thức:

% Hàm lượng acid = 𝑚𝑎

𝑚𝑡 𝑥 100% 𝑚𝑎 =𝐶𝑡𝑥 𝐹𝑡

1000Trong đó: 𝐶𝑡 = 𝐶𝑐 𝑥 𝑆𝑡

𝑆𝑐

Chú thích:

Ft: Độ pha loãng của mẫu thử Ct(µg/ml): Nồng độ acid có trong mẫu thử Cc(µg/ml): Nồng độ dung dịch acid chuẩn mt(mg): Khối lượng cân mẫu thử

ma(mg): Khối lượng acid có trong mẫu thử St, Sc: Diện tích pic của acid trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn

3.4 Ứng dụng phân tích lô nguyên liệu CM nhà sản xuất cung cấp

Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để xác định hai tạp chất AM và AF trong lô nguyên liệu CM:

+ Nhà sản xuất: Jing Jing Pharmaceutical Co.,Ltd + Số lô: C562305009

+ Ngày sản xuất: 19/05/2023 Tiến hành phân tích độc lập 3 lần trên cùng 1 lô sản xuất, để thu được kết quả chính xác

Bảng 3.10: Kết quả phân tích lô nguyên liệu CM

Lần Khối lượng cân

thử (g)

Hàm lượng AM (%)

Hàm lượng AF (%)

Kết luận: Trong lô nguyên liệu CM này xác định có chứa hai tạp chất AM và AF,

hàm lượng tạp chất nằm trong giới hạn cho phép (AM ≤ 0,025%, AF ≤ 0,5%)

3.5 Bàn luận

Phương pháp xác định tạp chất này được xây dựng dựa trên phương pháp xác định tạp chất trong chuyên luận acid maleic của USP 43 [7] Để phù hợp với nội dung của nghiên cứu, đề tài tiến hành khảo sát một số thông số và điều kiện sắc ký

3.5.1 Về lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ tử ngoại cho thấy AM có cực đại hấp thụ tại bước sóng 210 nm, và AF có cực đại tại 208 nm Đề tài quyết định lấy bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện để tiến hành phân tích xác định hai tạp chất AM và AF trong nguyên liệu CM bởi 2 lý do sau:

- AM có giới hạn cho phép thấp hơn so với AF, nên nếu trong mẫu thử có tồn tại tạp chất thì AM sẽ có nồng độ thấp hơn AF, do đó đề tài ưu tiên lựa chọn bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện tốt hơn cho AM

- Ngoài ra, bước sóng phát hiện càng thấp thì sắc ký đồ càng dễ bị nhiễu bởi nhiều tạp chất bị hấp thụ Vì vậy, nguy cơ bị nhiễu sắc ký đồ ở bước sóng 208 nm cao hơn bước sóng 210 nm

3.5.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký

- Chương trình dung môi:

Đề tài tiến hành khảo sát dựa trên cơ sở chương trình dung môi trong chuyên luận acid maleic của USP 43 [7] (chương trình 1)

Bảng 2.1: Chương trình dung môi 1

Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)