Đối với các tạp chất vô cơ là các tạp có nguồn gốc từ môi trường sản xuất, đa số xuất hiện trong các nguyên liệu, phương pháp xác định giới hạn sẽ được quy định trong một chuyên luận chu
TỔNG QUAN
Vài nét về xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu
Tạp chất là bất kỳ thành phần nào không phải hoạt chất và có thể ảnh hưởng đến chất lượng của nguyên liệu
Các tạp chất có thể tồn tại trong nguyên liệu như:
+ Tạp chất vô cơ: có thể phát sinh từ quá trình sản xuất, từ môi trường như: kim loại nặng, muối vô cơ, thuốc thử, chất xúc tác…
+ Tạp chất hữu cơ: có thể phát sinh trong quá trình sản xuất hoặc bảo quản nguyên liệu Các tạp này có thể được xác định hoặc không xác định, dễ bay hơi hoặc không dễ bay hơi, bao gồm như: sản phẩm phân hủy, chất trung gian, thuốc thử, chất xúc tác, nguyên liệu ban đầu…
+ Dung môi tồn dư: là những chất lỏng vô cơ hoặc hữu cơ còn tồn dư sau quá trình tổng hợp nguyên liệu
1.1.2 Ảnh hưởng của tạp chất
Các tạp chất trong nguyên liệu hóa dược dù rất nhỏ nhưng cũng có thể gây ra các tác động xấu như [1]:
+ Gây tác hại cho sức khỏe (như tạp chất bari tan, arsen, chì…)
+ Gây hiện tượng tương kỵ hóa học, ảnh hưởng đến phẩm chất hay độ bền của nguyên liệu
+ Một số tạp chất có thể không gây hại nhưng lại là những chất xúc tác đẩy nhanh quá trình phân hủy thuốc (ví dụ: các vết kim loại…)
+ Một số tạp chất không gây ra các tác động trên nhưng nó biểu thị cho mức độ sạch (mức độ tinh chế) của nguyên liệu
1.1.3 Các phương pháp xác định tạp chất
Hầu hết các chuyên luận dược điển hay tiêu chuẩn cơ sở đều quy định về việc xác định các tạp chất (bao gồm tạp vô cơ, hữu cơ, tạp chất liên quan) Đối với các tạp chất vô cơ là các tạp có nguồn gốc từ môi trường sản xuất, đa số xuất hiện trong các nguyên liệu, phương pháp xác định giới hạn sẽ được quy định trong một chuyên luận chung của dược điển, bằng các phương pháp hóa học, quang phổ, góc quay cực… Các tạp chất liên quan trong nguyên liệu (thường là tạp hữu cơ) có thể xuất hiện trong bước tổng hợp, từ nguyên liệu quan ban đầu, chất trung gian Các tạp này có thể khác nhau giữa các nguyên liệu, nên các phương pháp xác định thường được quy định trong từng chuyên luận riêng, cụ thể với từng chất
Tạp chất liên quan trong nguyên liệu được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như hóa học, quang phổ tử ngoại… Các phương pháp chủ yếu hay được sử
3 dụng nhất là nhóm các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao Nhóm phương pháp này có tính ổn định và chính xác cao, có khả năng phân tích được nhiều chất khác nhau, khả năng ứng dụng rộng rãi
Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký: Sắc ký bao gồm nhiều kỹ thuật phân tách dựa trên sự phân bố hoặc phân chia của mẫu giữa pha chuyển động được gọi là pha động và pha cố định được gọi là pha tĩnh Sắc ký có thể được xem như một loạt các cân bằng giữa pha động và pha tĩnh Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác, do đó ái lực của nó với pha tĩnh và pha động khác nhau
• Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [2]:
- Nguyên tắc: Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định, di chuyển trên bản mỏng dưới tác động của lực mao quản Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động
- Ứng dụng: TLC có thể xác định được nhiều tạp chất có nồng độ cao, có khả năng phát huỳnh quang hoặc thực hiện các phản ứng hiện màu đặc trưng
Xác định tạp định danh trong nguyên liệu hóa dược bằng cách so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng
- Ưu - Nhược điểm của phương pháp:
+ Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng thực hiện, không cần hệ thống máy móc cầu kỳ + Chuẩn bị mẫu đơn giản – ít gặp vấn đề về nền mẫu
+ Thời gian và chi phí cho phân tích thấp
+ Độ nhạy của phương pháp thấp, nồng độ tạp chất trong mẫu phải cao
+ Đối với hệ TLC đơn giản chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được
• Phương pháp sắc ký khí (GC) [2]:
- Nguyên tắc: Pha động trong GC là chất khí Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn (GSC) và sắc ký khí lỏng (GLC) Chất phân tích được pha động đưa vào cột dưới dạng hơi Trong cột xảy ra quá trình tương tác giữa chất phân tích trong pha động (hơi) với pha tĩnh Thành phần hòa tan nhiều hơn trong pha tĩnh di chuyển chậm hơn trong cột, ngược lại thành phần ít hòa tan hơn trong pha tĩnh di chuyển nhanh hơn Do
4 đó, các thành phần có trong hỗn hợp mẫu được phân tách theo hệ số phân chia của chúng giữa thành phần trong mẫu và pha tĩnh Do các chất phân tích khác nhau về tính chất hóa lý, chúng được tách ra khỏi nhau
- Ứng dụng: GC là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dụng trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt Tạp chất phân tích bằng GC gồm sản phẩm phân hủy, tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và dung môi tồn dư
- Ưu - Nhược điểm của phương pháp:
+ Là phương pháp xanh, do giảm thiểu việc sử dụng các dung môi hữu cơ
+ Chỉ áp dụng được với các tạp chất có khả năng bay hơi và không bị phân hủy bởi nhiệt
+ Đòi hỏi nhiệt độ và áp suất phù hợp cho sự bay hơi của chất phân tích
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[2]:
- Nguyên tắc: Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc khác nhau, tính chất khác do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha động khác nhau Các cơ chế tách bằng HPLC có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, ái lực, tách đồng phân đối quang
- Ứng dụng: HPLC được sử dụng để xác định các tạp chất ở trạng thái lỏng hoặc tạp chất rắn có khả năng hòa tan trong dung môi thích hợp HPLC cho phép phân tích các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt có cấu trúc rất khác nhau, từ những chất có khối lượng phân tử nhỏ đến lớn, các kim loại, anion vô cơ, các chất hữu cơ bao gồm cả những chất có nguồn gốc tự nhiên, sản phẩm sinh học
- Ưu – nhược điểm của phương pháp:
+ Phạm vi ứng dụng rộng, với khoảng nồng độ có thể phân tích cỡ hàng trăm ppm đến dưới ppb
+ Phương pháp dễ dàng đáp ứng yêu cầu về độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc cũng như độ nhạy cao ứng với quy trình phân tích tương ứng
+ Áp dụng được thử giới hạn và định lượng tạp chất trong nguyên liệu + Không áp dụng được cho tạp chất rắn không tan
+ Giá thành thiết bị, hóa chất tiêu hao cao, yêu cầu chất chuẩn phân tích cao
Sơ lược về L – citrullin DL – malat (1:1)
L – Citrullin DL- malat (CM) là sự kết hợp của hai thành phần L – citrullin và DL
– malat (hoặc acid DL – malic) theo tỷ lệ 1:1 [5] CM là một muối hữu cơ tham gia vào quá trình chuyển hóa của cơ thể tạo ra năng lượng, tăng khả năng cung cấp oxy và dinh dưỡng đến các cơ trong quá trình tập luyện cường độ cao
1.2.1 Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của L – citrullin DL – malat
• Danh pháp IUPAC: (2S) – 2 – amino – 5 – (carbamoylamino)pentanoic acid; 2 – hydroxybutanedioic acid [13]
• Trọng lượng phân tử: 309,27 g/mol [13]
1.2.2 Cơ chế sinh học L – Citrullin DL – malat
Tác dụng sinh học của CM là do sự hiệp đồng tác dụng của cả L – citrullin và DL – malat ở cơ [19]
L – citrullin là một acid amin không thiết yếu, được sản xuất thông qua hai quá trình trao đổi chất quan trọng: từ glutamin trong đường ruột và từ việc chuyển L – arginin thành nitric oxid (NO) [18] Tác dụng của CM được thể hiện thông qua tác dụng của L – citrullin bằng 2 cơ chế sau:
Thứ nhất, L – Citrullin khi hấp thu vào cơ thể sẽ làm tăng nồng độ L – arginin trong máu khi nghỉ ngơi và khi tập luyện thể dục L – arginin là hợp chất chính trong con đường tổng hợp NO Khi uống L – citrullin có thể gián tiếp làm tăng nồng độ NO trong máu thông qua con đường L – arginin – NO (Hình 1.2) NO được tổng hợp sẽ tác động lên cơ trơn làm giãn mạch máu, từ đó cải thiện lưu lượng máu đến các cơ bắp đang hoạt động, cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, làm giảm đau nhức cơ bắp [11]
Thứ hai, L – citrullin tham gia hỗ trợ quá trình loại bỏ amoniac thông qua chu trình ure (Hình 1.2)
Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn các cơ chế sinh học của L – citrullin
(CPS: carbamoyl phosphat synthetase, OTC: ornithin transcarbamylase, ASS: argininosuccinat synthase, ASL: argininosuccinat lyase, NOS: Nitric oxid synthases)
Amoniac là một chất thải của quá trình chuyển hóa, nó sản sinh ra nhiều hơn với người tập luyện cường độ cao Nồng độ amoniac trong máu tăng cao sẽ cản trở quá trình cung cấp ATP cho cơ xương Khi tập thể dục cường độ cao, bổ sung L – Citrullin giúp giải độc amoniac trong máu, từ đó làm tăng cường khả năng sử dụng pyruvat hiếu khí và cung cấp ATP cho cơ xương [11]
Hình 1.3: Sơ đồ biểu diễn cơ chế sinh học của Malat (MEc: enzym malic trong tế bào chất, DIC: dicarboxylat carrier, MEm: enzym malic trong ty thể, PC: pyruvat carboxylase, PDH: pyruvat dehydrogenase)
Cơ chế sinh học cuối cùng của CM được biết đến là nhờ tác dụng của thành phần malat Malat là chất trung gian hoạt động trong chu trình acid tricarboxylic (TCA), có thể đóng vai trò quan trọng trong tốc độ sản xuất ATP hiếu khí thông qua phản ứng anaplerotic (Hình 1.3) Malat bị khử hydro trong chu trình TCA thành oxaloacetat – nồng độ của nó là yếu tố quan trọng trong kiểm soát tốc độ sản xuất ATP hiếu khí Bên cạnh đó, nó còn được vận chuyển qua màng ty thể vào tế bào chất bằng hệ vận chuyển dicarboxylate, được chuyển hóa thành pyruvat Malat được cho là tham gia vào các phản ứng phụ trợ có thể làm thay đổi nồng độ của chất trung gian TCA, từ đó ảnh hướng đến các dòng vào và ra khỏi chu trình TCA [5]
Như vậy, CM có tác dụng làm tăng hiệu suất tập luyện và khả năng phục hồi cơ bằng nhiều cách khác nhau, bao gồm: giãn mạch, cải thiện khả năng cung cấp oxy và chất dinh dưỡng đến các cơ, tăng sản xuất ATP trong quá trình tập luyện thể dục; đồng thời CM làm giảm sự sản xuất các chất thải lactat và amoniac [10].
Tạp chất acid maleic và acid fumaric trong CM
CM được tổng hợp bằng cách kết hợp 2 thành phần L – citrullin và acid DL – malic, vậy nên trong CM có thể tồn tại các tạp chất của hai thành phần này Theo USP
43, tạp chất định danh trong L – citrullin là N – acetylornithin [9], tạp chất định danh tồn tại trong acid malic cần kiểm soát là acid maleic (AM) và acid fumaric (AF) [8] Trong đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai tạp chất của acid malic là acid maleic và acid fumaric, hai acid xuất hiện trong quá trình tổng hợp của acid malic
1.3.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của acid maleic [14]
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của AM
• Danh pháp IUPAC: (Z)-but-2-enedioic acid
• Trọng lượng phân tử: 116.07 g/mol
• Cảm quan: Acid maleic là chất rắn kết tinh không màu, có mùi nhẹ
• Độ tan trong 100ml nước ở 25 o C là: 78g
• Nhiệt độ sôi: 275 o F ở 760 mmHg (phân hủy)
• Hằng số phân ly: pKa1 = 1,94 và pKa2 = 6,22 ở 25 o C
1.3.1.2 Độc tính của acid maleic
Một số nghiên cứu khoa học in vitro và in vivo đã chứng minh acid maleic tác động trên ống lượn gần gây ra hội chứng Fanconi và rối loạn chức năng thận cấp tính
Nghiên cứu trên chuột cho thấy: acid maleic ức chế cạnh tranh hoạt động của hai enzym quan trọng cho quá trình oxy hóa glutamat là glutamat dehydrogenase và alpha – ketoglutarat dehydrogenase, do đó làm xáo trộn quá trình chuyển hóa oxy xảy ra trong ty thể ở thận [20]
Phiếu an toàn hóa chất của acid maleic (SDS) cũng đưa ra cảnh báo độc hại có thể xảy ra khi nuốt phải acid maleic (độc tính cấp 4)
Vì vấn đề an toàn, USP 43 đã quy định giới hạn cho phép của acid maleic trong một số chuyên luận như:
• Chuyên luận acid malic [8]: NMT 0,05%
• Chuyên luận acid fumaric [6]: NMT 0,1%
1.3.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của acid fumaric [15]
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của AF
• Danh pháp IUPAC: (E)-but-2-enedioic acid
• Trọng lượng phân tử: 116.07 g/mol
• Tính chất: Acid fumaric có dạng chất rắn kết tinh không màu, không mùi
• Độ hòa tan trong nước kém: 0,63 g/100ml ở 25 o C
• Hằng số phân ly: pKa1 = 3,03 và pKa2 = 4,54 ở 25 o C
1.3.2.2 Độc tính của acid fumaric
AF thường được coi là một nguyên liệu hóa dược tương đối an toàn, được sử dụng trong các công thức dược phẩm và các thực phẩm được sử dụng đường uống Tuy nhiên, đã ghi nhận các phản ứng bất lợi và suy thận cấp xảy ra trên bệnh nhân khi sử dụng AF và các dẫn xuất của nó gây ra Các tác dụng phụ khác khi sử dụng AF và dẫn xuất đường uống bao gồm: rối loạn chức năng của da, chức năng gan, tác dụng trên đường tiêu hóa và đỏ bừng mặt [17]
LD50 của acid fumaric được báo cáo là:
LD50 (chuột, uống): 9,3 g/kg Với độc tính như trên, giới hạn của AM và AF trong chuyên luận acid malic là:
NMT 0,05% và NMT 1,0% Vì vậy, giới hạn có thể chấp nhận được của AM và AF trong
CM được xác định là: 0,025% và 0,5% (do tỉ lệ acid malic trong CM là 50%).
Các phương pháp xác định AM và AF
Hiện nay, trong các dược điển Việt Nam V, Anh, Mỹ, châu Âu đều chưa có chuyên luận về L – citrullin DL – malat Cũng chưa có công bố quốc tế hay trong nước nào nghiên cứu về việc xác định các tạp chất AM và AF có trong CM Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu đã xây dựng phương pháp xác định tạp AM và AF trong CM dựa trên việc tham khảo tài liệu liên quan đến phân tích AM và AF
Bảng 1.1: Tổng hợp các phương pháp phân tích AM và AF
Mẫu phân tích Phương pháp phân tích
Acid tartaric và acid malic
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ức chế ion:
- Pha động: Gradient rửa giải, sử dụng nước được điều chỉnh ở pH 2,10 – 2,15 bằng acid perchloric
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Cột sắc ký: L1, 4,6 mm x 15 cm; 3àm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
- Pha động triển khai theo chương trình dung môi với 2 kênh:
+ Kênh A: Đệm kali phosphat 10mM được điều chỉnh đến pH 2,3 bằng acid phosphoric (đệm phosphat)
- Dung môi pha mẫu: ACN: kênh A = 2:98
Sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Cột sắc ký: L17, 6,5 mm x 30 cm
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Cột sắc ký: L17, 4,6 mm x 22 cm
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút
- Thể tớch tiờm: 5 àl Nhận xét: Các nghiên cứu trên đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để tiến hành phân tích, chỉ khác nhau ở cột phân tích sắc ký, từ đó có các hệ pha động và điều kiện phân tích khác nhau
Trên cơ sở thiết bị và hóa chất sẵn có tại phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn quy trình phân tích tương tự như trong chuyên luận acid maleic của USP 43[7], với các điều kiện sau:
- Phương pháp phân tích: HPLC
- Cột sắc ký pha đảo: C18, 250 x 4,6mm, 5àm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Dung môi pha mẫu (DMPM): Acetonitril: Đệm phosphat = 2:98
Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%)
Phương pháp sẽ được tiến hành khảo sát và điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện cơ sở, sau đó được thẩm định theo các tiêu chí của “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3] và AOAC[4]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu L – citrullin DL – malat (1:1) của Jing Jing Pharmaceutical Co., Ltd + Số lô: C562305009
Hai tạp chất trong nguyên liệu CM: Acid maleic và acid fumaric
2.1.3 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi
+ Nhà sản xuất: Shanghai Zhanyun Chemical Co.,Ltd
- Acetonitril dùng cho HPLC, Fisher – Hàn Quốc
- Acid phosphoric đậm đặc (AR): 85,0%, Guangdong Guanghua Sci-Tech Co.,Ltd
- Kali dihydrophosphat (AR): 99,5%, Xilong Scientific Co.,Ltd
Thiết bị và dụng cụ sử dụng phục vụ cho đề tài thuộc bộ môn Hóa Dược, khoa Công nghệ Hóa Dược
+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Agilent 1290/6460 Infinite detector UV – Vis
+ Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6mm, 5àm)
+ Bộ lọc dung mụi (màng lọc 0,45 àm) Mỏy lọc hỳt chõn khụng Gast Manufacturing, INC, Mỹ
+ Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105, Mỹ
+ Máy đo pH Eutech, Singapore
+ Máy siêu âm Soronex Bandelin, Đức
12 + Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh
- Dụng cụ: Bình định mức, pipet chính xác, pipet chia vạch, quả bóp cao su, màng lọc cellulose acetat 0,45 àm và cỏc dụng cụ thủy tinh khỏc.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định tạp chất acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu Citrullin malat
Trên cơ sở chuyên luận acid maleic của USP 43 [7], nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại để xây dựng phương pháp xác định tạp chất AM và AF trong nguyên liệu
CM bằng thiết bị HPLC
• Cột sắc ký pha đảo: C18, 250 x 4,6mm, 5àm
• Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
- Các yếu tố cần khảo sát:
+ Chương trình gradient dung môi, gồm 2 kênh
• Kênh đệm kali dihydrophosphat 3,33mM, pH = 2,3
+ pH của dung dịch đệm phosphat
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn của AOAC[4] và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3] với các tiêu chí sau:
- Độ phù hợp hệ thống
- Độ đặc hiệu của phương pháp
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
- Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
2.2.3 Ứng dụng Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hai tạp chất acid maleic và acid fumaric trong lô nguyên liệu CM của Jing Jing Pharmaceutical Co.,Ltd
Phương pháp nghiên cứu
Dung môi pha mẫu (DMPM) là hỗn hợp ACN : đệm phosphat với tỉ lệ 2 : 98
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn AM
+ Dung dịch chuẩn gốc AM 250 àg/ml: Cõn chớnh xỏc khoảng 25,25 mg AM vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng 50 ml DMPM, siêu âm 15 phút cho đến khi tan hết, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều
+ Dung dịch chuẩn làm việc AM 25 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều
+ Dung dịch chuẩn AM 2,5 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc vào bình định mức 50,0 ml, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn AF
+ Dung dịch chuẩn gốc AF 5 mg/ml: Cân chính xác khoảng 125,6 mg AF vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút cho đến khi tan hết, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều
+ Dung dịch chuẩn làm việc AF 500 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều
+ Dung dịch chuẩn AF 50 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc vào bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp
Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc AM và 5,00 ml dung dịch chuẩn làm việc AF vào một bình định mức 50,0 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
- Chuẩn bị dung dịch thử CM
Dung dịch thử Citrullin malat 10 mg/ml: Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu Citrullin malat vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phỳt, thờm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
- Chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn
+ Dung dich thử thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 75,39 mg CM vào bình định mức 25,0 ml, thêm chính xác lần lượt một lượng dung dịch chuẩn làm việc AM và AF tương ứng với nồng độ của chất chuẩn là 30%, 100%, 110% vào bình định mức trên, thêm khoảng 10ml DMPM, siêu âm trong vòng 45 phút; thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
14 + Dung dịch thử thêm chuẩn (sử dụng cho chỉ tiêu thẩm định độ đặc hiệu): Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu Citrullin malat vào bình định mức 25,0 ml, thêm một lượng chuẩn làm việc AM và AF tương ứng với nồng độ 100%, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kích thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
2.3.2 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
- Như đã được trình bày ở trên, đề tài tiến hành cố định các điều kiện sắc ký như sau: + Cột sắc ký pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
+ Dung môi pha mẫu: ACN : Đệm phosphat= 2 : 98
- Tiến hành khảo sát lại các điều kiện sắc ký sau:
+ Bước sóng phát hiện: căn cứ vào kết quả quét phổ mẫu chuẩn để lựa chọn bước sóng
+ Chương trình dung môi: khảo sát trên hai chương trình
Bảng 2.1: Chương trình dung môi 1
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
+ pH đệm phosphat: Tiến hành khảo sát trên pH = 2,3 và pH = 2,0
Các kết quả trong từng khảo sát được đánh giá và so sánh về thời gian lưu (tR), hệ số phân giải (Rs) và hệ số kéo đuôi (Tf)
Yêu cầu: AF và AM phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp khác và độ phân giải phải đạt ít nhất 1,5; pic cân xứng
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát lại các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3] và AOAC[4]
2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống
Cách tiến hành: Phân tích bằng hệ thống sắc ký lặp lại 6 lần trên dung dịch chuẩn hỗn hợp AM và AF cú nồng độ nằm trong khoảng tuyến tớnh lần lượt là 2,5 àg/ml và 50 àg/ml, ghi lại sắc ký đồ và kết quả phõn tớch Đỏnh giỏ tớnh phự hợp của hệ thống trên thời gian lưu (tR), diện tích pic (Spic), số đĩa lý thuyết, độ phân giải (Rs) và hệ số đối xứng pic (Tf) của hai pic AM và AF giữa các lần tiêm
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu, diện tích pic ≤ 2,0%
Tiến hành phân tích sắc ký theo quy trình phân tích và ghi lại thông số thời gian lưu, diện tích pic tương ứng của các mẫu sau:
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp
- Dung dịch thử thêm chuẩn
- Sắc ký đồ của mẫu dung môi không được có pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 pic AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp
- Thời gian lưu và phổ UV của pic chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch thử thêm chuẩn phải tương ứng với thời gian lưu và phổ UV của pic chất phân tích trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn đơn và dung dịch chuẩn hỗn hợp Pic của chất phân tích trong dung dịch thử thêm chuẩn phải tách hoàn toàn khỏi các pic khác trong nền mẫu
2.3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ)
Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ giảm dần như dưới đây:
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 2 3 4 5 6
16 Tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp như trên bảng, ghi lại sắc ký đồ Trên sắc ký đồ thu được, xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)
Yêu cầu: LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10
2.3.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Từ dung dịch chuẩn làm việc AM và AF có nồng độ lần lượt chính xác khoảng
25 (àg/ml) và 500 (àg/ml), pha loóng với DMPM để được cỏc dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ như sau:
Bảng 2.3: Nồng độ từng chất trong mỗi dung dịch chuẩn hỗn hợp
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp từ 1 đến 8 trong cùng một điều kiện, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan R
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát phương pháp phân tích
3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện
Tiến hành quột phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn AM 2,5 (àg/ml) và AF
50 (àg/ml) thu được kết quả như sau:
Hình 3.1: Phổ UV của AF và AM
Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện để tiến hành xác định tạp chất
3.1.2 Khảo sát chương trình gradient dung môi
Tiến hành khảo sát dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử CM với 2 chương trình gradient dung môi như sau:
+ Đệm phosphat: Đệm kali dihydrophosphat 3,3 mM, pH = 2,3
Bảng 2.1: Chương trình gradient dung môi 1
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Bảng 2.2: Chương trình gradient dung môi 2
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
19 Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình 1 được thể hiện trên Hình 3.2:
(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp
Hình 3.2: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (a) và dung dịch thử CM (b) với chương trình 1
Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình 2 được thể hiện trên Hình 3.3:
(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp
(b) Dung dịch thử CM Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp (a) và dung dịch thử CM (b) với chương trình 2
Nhận xét: Chương trình dung môi 1 có hiệu lực tách 2 pic AM và AF trong dung dịch chuẩn hỗn hợp tốt, hai pic tách hoàn toàn khỏi nhau (Rs = 10,3), nhưng trong dung dịch thử, chương trình này chưa tách được pic AM khỏi các pic tạp khác của nền mẫu (AM có Rs = 1,1), pic AF bị dính với pic phía sau Chương trình dung môi 2 chưa tách được pic AF khỏi pic tạp phía trước (Rs = 1,01) nhưng đã tách được hoàn toàn pic AM (Rs so với pic phía trước = 2,96, Rs so với pic phía sau = 4,15) Vậy nên chương trình
2 là phù hợp cho phân tích Tiến hành khảo sát tiếp các yếu tố khác của quá trình sắc ký để tách hoàn toàn pic AF
3.1.3 Khảo sát pH đệm phosphat
Sau khi khảo sát xong chương trình dung môi với đệm phosphat pH 2,3 ở mục
3.1.2, nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát pH đệm phosphat
Tiến hành khảo sát trên đệm phosphat pH 2,0 với chương trình dung môi đã chọn ở mục 3.1.2 Kết quả phân tích sắc ký của dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử
(a) Dung dịch chuẩn hỗn hợp
(b) Dung dịch thử CM Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp (a) và dung dịch thử CM (b) với đệm phosphat pH 2,0
Nhận xét: Khi sử dụng đệm phosphatpH = 2,0, hai pic acid chính đã tách khỏi các pic tạp khác có trong dung dịch thử CM, với độ phân giải của AM và AF lần lượt là: 1,6 và 3,2, do đó nhóm nghiên cứu lựa chọn pH này cho quy trình phân tích
Từ các khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:
• Cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6mm; 5 àm)
• Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
• Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
+ Đệm phosphat: Đệm KH2PO4 3,3mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH 2,0
Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Thẩm định phương pháp xác định tạp chất AM và AF bằng HPLC
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
Kết quả độ phù hợp hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp AM và AF với nồng độ tương ứng là 2.58 àg/ml và 50.04 àg/ml được thể hiện ở Bảng 3.1 và 3.2:
Bảng 3.1: Kết quả độ phù hợp hệ thống của AM
Số đĩa lý thuyết Độ phân giải
Hệ số đối xứng pic
Bảng 3.2: Kết quả độ phù hợp hệ thống của AF
STT Thời gian lưu (phút)
Số đĩa lý thuyết Độ phân giải
Hệ số đối xứng pic
Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic của AM và AF đều thấp hơn 2,0% Số đĩa lý thuyết trung bình của mỗi acid đều lớn hơn 2000 Độ phân giải Rs của các chất đều lớn hơn 1,5
Như vậy: Điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết nên hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích xác định 2 tạp chất AM và AF theo AOAC[4] và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”[3]
Chuẩn bị độc lập mẫu dung môi, các dung dịch chuẩn, dung dịch thử thêm chuẩn, dung dịch thử (như trình bày ở mục 2.3.3.2) Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn Kết quả được trình bày ở Hình 3.5:
Hình 3.5: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu
Mẫu dung môi không cho tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Trên sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn xuất hiện pic có thời gian lưu và phổ UV tương ứng với pic của AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp Để khẳng định, nhóm nghiên cứu tiến hành chồng phổ UV của hai pic AM và AF có trong dung dịch thử so với trong dung dịch chuẩn
(a) AF: Hệ số Match 0,9997 (b) AM: Hệ số Match 0,9977
Hình 3.6: Kết quả chồng phổ UV của AF (a) và AM (b)
Kết quả cho thấy, hệ số Match của cả AF và AM đều > 0,99
Như vậy: Phương pháp đã xây dựng có tính đặc hiệu cao theo yêu cầu của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”
3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp pha loãng (như mục 2.3.3.3) để xác định LOD, LOQ Sắc ký đồ xác định LOD và LOQ của AM và AF được thể hiện ở các Hình 3.7 và 3.8:
Hình 3.7: Sắc ký đồ xác định LOD của AM và AF
Với dung dịch hỗn hợp chuẩn 0,03 (àg/ml) cú tỉ lệ S/N của hai acid lần lượt là: + AM: S/N = 2,9
Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định LOQ của AM và AF
Với dung dịch hỗn hợp chuẩn 0,1 (àg/ml) cú tỉ lệ S/N của hai acid lần lượt là:
Bảng 3.3: Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp
Như vậy: kết quả thực nghiệm cho thấy AM và AF cú LOD = 0,03 àg/ml và LOQ
3.2.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tiến hành phân tích sắc ký với dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (chuẩn bị như đã trình bày ở mục 2.3.3.4) theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn Kết quả được thể hiện trong
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của AM
Diện tích pic (mAU.s) Độ chệch (%)
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của acid maleic y = 57.719x + 0.5852 R² = 0.9999
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của AF
Diện tích pic (mAU.s) Độ chệch (%)
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của acid fumaric
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AM và AF Đường chuẩn của các chất đều có hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1, độ chệch tại các điểm không vượt quá ± 15 %, riêng điểm nồng độ LOQ không vượt quá ± 20 %
Như vậy: Độ tuyến tính và đường chuẩn của AM và AF phù hợp với yêu cầu của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” y = 70.661x - 1.8082 R² = 0.9999
Chuẩn bị các dung dịch thử thêm chuẩn như mục 2.3.3.6 Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Kết quả độ thu hồi của các chất được trình bày trong các Bảng 3.6 và 3.7:
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AM
Nồng độ chuẩn thêm vào
Lượng chuẩn thêm vào (àg)
Lượng chuẩn tìm thấy (àg)
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AF
Nồng độ chuẩn thêm vào
Lượng chuẩn thêm vào (àg)
Lượng chuẩn tìm thấy (àg)
28 Nhận xét: Kết quả cho thấy độ thu hồi của AM nằm trong khoảng 90,0 – 107,0%, RSD ≤ 5,3% và độ thu hồi của AF nằm trong khoảng 95,0 – 105,0%, RSD ≤ 3,7%
Như vậy: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng của “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC
3.2.6 Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
Tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập theo quy trình như mục 2.3.3.5 trong 2 ngày khác nhau với 2 người phân tích để xác định độ lặp lại và độ chính xác trung gian Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian được trình bày ở Bảng 3.8 và 3.9:
Bảng 3.8: Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian trong 2 ngày phân tích khác nhau của AM và AF
Bảng 3.9: Kết quả độ chính xác trung gian khác người phân tích của AM và AF
30 Nhận xét: RSD của AM và AF trong cùng ngày, khác ngày, cùng người phân tích và khác người phân tích đều thỏa mãn yêu cầu là:
Như vậy: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác theo yêu cầu của AOAC và
“Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích”
Nhận xét chung: Phương pháp đã xây dựng đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu của “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC.
Quy trình xác định acid maleic và acid fumaric trong nguyên liệu citrullin
• Chuẩn bị các dung dịch chuẩn AM và AF:
(1) Chuẩn bị dung dịch chuẩn AM
- Cân chính xác khoảng 25,25 mg AM vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng
50 ml DMPM, siêu âm 15 phút cho đến khi tan hết, thêm vừa đủ DMPM đến vạch, lắc đều Pha loãng bằng DMPM để được dung dịch chuẩn AM có nồng độ 2.5 àg/ml Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
(2) Chuẩn bị dung dịch chuẩn AF
- Cân chính xác khoảng 125,6 mg AF vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút cho đến khi tan hết, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Pha loãng bằng DMPM để được dung dịch chuẩn AF có nồng độ 50 àg/ml Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
• Chuẩn bị dung dịch thử CM:
Dung dịch thử CM 10 mg/ml: Cân chính xác khoảng 251,3 mg nguyên liệu CM vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml DMPM, siêu âm 45 phút, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc kớch thước 0,45 àm rồi tiến hành chạy sắc ký
- Cột sắc ký pha đảo C18 (4mm x 250 mm, 5 àm)
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
- Bước sóng phát hiện: UV 210 nm
- Chương trình gradient pha động:
+ Đệm phosphat: Đệm KH2PO4 3,3mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH 2,0
Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch chuẩn và dung dịch thử để thu lấy kết quả diện tích pic của các acid Hàm lượng của từng acid trong mẫu thử CM được tính theo công thức:
Ft: Độ pha loãng của mẫu thử
Ct(àg/ml): Nồng độ acid cú trong mẫu thử Cc(àg/ml): Nồng độ dung dịch acid chuẩn mt(mg): Khối lượng cân mẫu thử ma(mg): Khối lượng acid có trong mẫu thử
St, Sc: Diện tích pic của acid trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn
Ứng dụng phân tích lô nguyên liệu CM nhà sản xuất cung cấp
Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để xác định hai tạp chất AM và AF trong lô nguyên liệu CM:
+ Nhà sản xuất: Jing Jing Pharmaceutical Co.,Ltd
Tiến hành phân tích độc lập 3 lần trên cùng 1 lô sản xuất, để thu được kết quả chính xác
Bảng 3.10: Kết quả phân tích lô nguyên liệu CM
Lần Khối lượng cân thử (g)
Kết luận: Trong lô nguyên liệu CM này xác định có chứa hai tạp chất AM và AF, hàm lượng tạp chất nằm trong giới hạn cho phép (AM ≤ 0,025%, AF ≤ 0,5%).
Bàn luận
Phương pháp xác định tạp chất này được xây dựng dựa trên phương pháp xác định tạp chất trong chuyên luận acid maleic của USP 43 [7] Để phù hợp với nội dung của nghiên cứu, đề tài tiến hành khảo sát một số thông số và điều kiện sắc ký
3.5.1 Về lựa chọn bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ tử ngoại cho thấy AM có cực đại hấp thụ tại bước sóng 210 nm, và AF có cực đại tại 208 nm Đề tài quyết định lấy bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện để tiến hành phân tích xác định hai tạp chất AM và AF trong nguyên liệu
CM bởi 2 lý do sau:
- AM có giới hạn cho phép thấp hơn so với AF, nên nếu trong mẫu thử có tồn tại tạp chất thì AM sẽ có nồng độ thấp hơn AF, do đó đề tài ưu tiên lựa chọn bước sóng 210 nm làm bước sóng phát hiện tốt hơn cho AM
- Ngoài ra, bước sóng phát hiện càng thấp thì sắc ký đồ càng dễ bị nhiễu bởi nhiều tạp chất bị hấp thụ Vì vậy, nguy cơ bị nhiễu sắc ký đồ ở bước sóng 208 nm cao hơn bước sóng 210 nm
3.5.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký
Bảng 1.1 cho thấy đa số các nghiên cứu đều sử dụng cột phân tích sắc ký L17, chỉ có một nghiên cứu sử dụng cột L1
L17 là cột trao đổi ion - cột này phù hợp cho việc xác định các acid, điều kiện phân tích đơn giản hơn L1 Tuy nhiên, do cơ sở không có cột L17 nên đề tài lựa chọn cột L1 và tham khảo các điều kiện sắc ký trong chuyên luận acid maleic của USP 43[7]
- Chương trình dung môi: Đề tài tiến hành khảo sát dựa trên cơ sở chương trình dung môi trong chuyên luận acid maleic của USP 43 [7] (chương trình 1)
Bảng 2.1: Chương trình dung môi 1
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Kết quả cho thấy pic của AM có thời gian lưu 10,432 phút, AF có thời gian lưu 13,692, khả năng tách 2 chất trong mẫu chuẩn tốt (Rs = 10,3) Nhưng đề tài sử dụng nền mẫu là nguyên liệu CM – nền mẫu khác với nền mẫu của chuyên luận dược điển, nên
33 trong sắc ký đồ của mẫu thử có xuất hiện các pic tạp khác, các pic của AM và AF không thể tách khỏi các pic tạp này Vậy nên, đề tài đã thay đổi chương trình dung môi trong thời gian 10 phút đầu (Bảng 2.2), độ phân cực của pha động tăng lên, AM được rửa giải sớm hơn (tR = 8,89 phút) và tách khỏi các pic tạp khác (Rs to pre peak = 2,95, Rs to next peak = 4,13)
Bảng 2.2: Chương trình dung môi 2
Thời gian (phút) ACN (%) Đệm phosphat (%)
Vì đối tượng nghiên cứu của đề tài là các acid dễ bị ảnh hưởng bởi pH của dung môi, nên đề tài đã thay đổi pH của đệm phosphat có thể tách được pic của AF ra khỏi các pic tạp khác của nền mẫu
Kết quả khảo sát cho thấy, pH = 2,0 cho phép tách được pic AF ra khỏi các pic tạp phía trước (Rs = 3,2), pic đối xứng (Tf = 1,1) Vậy nên đề tài lựa chọn pH = 2,0 làm điều kiện phân tích sắc ký
3.5.3 Về thẩm định phương pháp
Phương pháp đề xuất đã được thẩm định phương pháp theo các tiêu chí của AOAC và “Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích” Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đã đáp ứng các tiêu chí:
- Độ phù hợp hệ thống tốt:
+ Acid maleic: %RSD của thời gian lưu = 1,2 % (< 2%), %RSD của diện tích pic = 0,9 % (< 2%)
+ Acid fumaric: %RSD của thời gian lưu = 0,5 % (< 2%), %RSD của diện tích pic = 0,1 % (< 2%)
+ Mẫu dung môi không cho tín hiệu của chất phân tích
+ Thời gian lưu của pic AM và AF trên sắc ký đồ của dung dịch thử thêm chuẩn tương ứng với pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp Hệ số Match của AM và AF đều > 0,99
- Giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng thấp: LOD = 0,03 àg/ml, LOQ = 0,1 àg/ml
+ Acid maleic: 0,1 – 3,61 àg/ml với r = 0,9999
34 + Acid fumaric: 0,1 – 70,06 àg/ml với r = 0,9999
+ Acid maleic: Độ thu hồi từ 100,1 – 101,6 % nằm trong khoảng yêu cầu: 90,0 – 107,0% và %RSD ở 3 khoảng nồng độ đều ≤ 5,3%
+ Acid fumaric: Độ thu hồi từ 100,6 – 102,5 % nằm trong khoảng yêu cầu: 95,0 – 105,0% và %RSD ở 3 khoảng nồng độ đều ≤ 3,7%
+ Độ lặp lại tốt: %RSD của AM và AF lần lượt là: 1,4% và 0,7% (trong giới hạn yêu cầu)
+ Độ chính xác trung gian cao: %RSD (n) của AM và AF lần lượt là 0,9% và 0,8%
Do đó, phương pháp đã lựa chọn có khả năng ứng dụng rộng rãi trong việc xác định tạp chất AM và AF trong nguyên liệu CM