đoàn thị hương giang xây dựng phương pháp xác định hàm lượng polydextrose trong thực phẩm bổ sung bằng sắc ký trao đổi ion với đầu dò xung ampe hpaec pad

Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về xác định polydextrose trong thực phẩm như phương pháp quang phổ UV-VIS [25], phương pháp kết hợp enzym- khối lượng [8], sắc ký lỏng hiệu

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VỚI ĐẦU DÒ XUNG AMPE (HPAEC-PAD)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ HƯƠNG GIANG 2091021

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYDEXTROSE TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION VỚI ĐẦU DÒ XUNG AMPE (HPAEC-PAD)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi

và những người bạn khác đã đồng hành cùng tôi trong suốt những năm tháng học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ và gia đình đã luôn

ủng hộ, cổ vũ tôi cũng như chuẩn bị mọi hành trang tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Một lần nữa, tôi xin cảm ơn và kính chúc các thầy cô, anh chị nghiên cứu viên, bạn bè và gia đình luôn có một sức khỏe dồi dào, luôn thành công trong công việc và hạnh phúc trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2024

Đoàn Thị Hương Giang

Các phương pháp phân tích Polydextrose 7

1.2.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký 10

1.2.2 Sắc ký trao đổi ion 11

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 14

2.1.3 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 14

2.1.4 Pha dung dịch chuẩn 14

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 15

2.2.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 15

2.2.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 15

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 17

Độ phù hợp hệ thống 17

Độ đặc hiệu 17

Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic 17

Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 18

Độ lặp lại và độ thu hồi 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 20

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23

3.2.1 Độ đặc hiệu 25

3.2.2 Độ thích hợp hệ thống 26

3.2.3 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic 26

3.2.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 28

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IEC Ion Exchange Chromatography Sắc ký trao đổi ion

LDL Low density lipoprotein cholesterol lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp

RSD(%) % Relative Standard Deviation % Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của polydextrose 4

Hình 1.2 Hệ thống sắc ký trao đổi ion 13

Hình 3.1 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose có xử lý với enzym và ly tâm tốc độ cao 20

Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose không xử lý enzym và không ly tâm 21

Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose không sử dụng enzyme, có ly tâm tốc độ cao 22 Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose có xử lý enzyme, không ly tâm 22

Hình 3.5 Chương trình pha động 23

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát nồng độ muối acetat trong pha động 24

Hình 3.7 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 25

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic 27

Hình 3.9 Sắc ký đồ của một số mẫu thực phẩm chức năng 32

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khuyến nghị bổ sung chất xơ theo giai đoạn tuổi 3

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên sự hấp thu khoáng chất 6

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên hệ vi sinh vật 6

Bảng 1.4 Các phương pháp phân tích polydextrose 9

Bảng 3.1 Kết quả thời gian thời gian lưu và diện tích pic 26

Bảng 3.2 Kết quả phân tích mối liên quan giữa đường chuẩn và diện tích pic 27

Bảng 3.3 Kết quả của giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 28

Bảng 3.4 Kết quả của độ lặp lại 29

Bảng 3.5 Kết quả của độ thu hồi 30

Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng của polydextrose trong mẫu thực phẩm 33

Bảng 3.7 Hàm lượng phần trăm so với lượng ghi trên nhãn 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất xơ đã được công nhận là một nhu cầu dinh dưỡng thiết yếu đối với cơ thể con người Nhiều công bố đã khẳng định chất xơ trong chế độ ăn có liên quan trực tiếp đến nhiều lợi ích sức khỏe như kiểm soát cân nặng, ngăn ngừa táo bón, ổn định đường huyết, giảm mức cholesterol, ngăn ngừa một số loại ung thư ở đường ruột Mặc dù vậy, lượng chất xơ từ chế độ ăn uống của chúng ta đang thấp hơn đáng kể so với lượng khuyến nghị hàng ngày khoảng 35g [17] Chất xơ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, các nhà sản xuất dần chú ý đến việc cải thiện hàm lượng chất xơ có trong các sản phẩm thực phẩm Ngày càng nhiều các sản phẩm mới được tung ra thị trường với hàm lượng chất xơ cao Polydextrose là một loại chất xơ hòa tan đóng vai trò như một giải pháp để tăng cường hàm lượng chất xơ cũng như giảm lượng tiêu thụ đường trong các sản phẩm thực phẩm hiện đại Polydextrose được chấp nhận như là một loại phụ gia thực phẩm tại Mỹ, Châu Âu và hầu hết các nước trên thế giới [13] Với nhiều ưu điểm như ổn định trong môi trường acid, nhiệt độ cao, độ nhớt thấp, hòa tan tốt trong nước, có khả năng đệm và tạo cấu trúc với vị trung tính, do đó polydextrose được sử dụng rộng rãi trong sản suất thực phẩm cũng như bổ sung vào trong thực phẩm chức năng Việc phân tích hàm lượng polydextrose trong các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp đánh giá chất lượng sản phẩm, bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng

Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về xác định polydextrose trong thực phẩm như phương pháp quang phổ UV-VIS [25], phương pháp kết hợp enzym- khối lượng [8], sắc ký lỏng hiệu năng cao [31], Sắc ký trao đổi anion áp suất cao với đầu dò điện hóa [15] Tuy nhiên, ở Việt Nam việc phân tích chất xơ polydextrose gặp nhiều khó khăn do đây là lĩnh vực mới và thiết bị sắc ký trao đổi ion với đầu dò xung ampe chưa thực sự phổ biến Do đó đề tài “Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng polydextrose trong thực phẩm bổ sung bằng sắc ký trao đổi ion với đầu dò xung ampe (HPAEC-PAD)” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng polydextrose trong thực phẩm bổ sung bằng HPAEC-PAD

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dụng để phân tích hàm lượng polydextrose trong một số mẫu thực phẩm bổ sung

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về polydextrose

1.1.1 Giới thiệu về chất xơ

Các hạt ngũ cốc và chất xơ đã được biết đến là có lợi cho sức khỏe, vào năm 300 trước công nguyên đã có khuyến nghị về việc bổ sung chất xơ Kellogg và C.W Post đã phát hiện ra các bệnh mãn tính ở phương Tây ít khi xuất hiện tại các vùng nông thôn Châu Phi, ở những người tiêu thụ thực phẩm giàu carbohydrat và chất xơ Các nghiên cứu sau này đã góp phần trong việc phổ biến tầm quan trọng của chất xơ trong chế độ ăn hàng ngày Các thực phẩm từ thực vật không chỉ chứa mình chất xơ, các lợi ích từ chế độ ăn giàu thực vật đến từ nhiều thành phần dinh dưỡng khác nữa như vitamin, khoáng chất Cho đến hiện nay, đã có rất nhiều nghiên cứu khác chỉ ra tầm quan trọng của việc bổ sung chất xơ vào chế độ ăn uống hàng ngày Những thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật không chỉ cung cấp cho con người chất xơ mà còn bổ sung thêm các vitamin và các khoáng chất cần thiết khác cho con người [17]

Trong đó, ngoài hàm lượng chất xơ tự nhiên có sẵn trong bản chất của sản phẩm, các nhà sản xuất còn bổ sung thêm các dạng chất xơ khác như: polydextrose, inulin, fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS)… Một số sản phẩm có bổ sung thêm tinh bột kháng, maltodextrin kháng tiêu hóa hay β-glucan cũng được xếp vào nhóm chất xơ [17]

Nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ béo phì ngày càng gia tăng do sự dư thừa calo trong mỗi bữa ăn Để giảm thiểu tình trạng này các chuyên gia khuyến nghị nên thay đổi chế độ ăn uống và mức tiêu thụ chất xơ Tuy nhiên, theo báo cáo lượng tiêu thụ thường không đạt đến mức được khuyến nghị bởi các quốc gia khác nhau Ví dụ, ở Úc, lượng chất xơ trung bình của người trưởng thành được báo cáo là 18,2g so với lượng khuyến nghị lần lượt là 25g và 40g đối với phụ nữ và nam giới Việc đạt được lượng tiêu thụ chất xơ khuyến nghị không chỉ giúp người dân giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và tiểu đường tuýp II mà còn kéo theo giá trị kinh tế thông qua việc giảm chi phí chăm sóc sức khỏe [17]

Polydextrose là một loại chất xơ hòa tan đóng vai trò như một giải pháp để tăng cường hàm lượng chất xơ trong các sản phẩm thực phẩm hiện đại Polydextrose được chấp nhận như là một loại phụ gia thực phẩm tại Mỹ, Châu Âu và hầu hết các nước trên thế giới Với nhiều ưu điểm như: ổn định trong môi trường acid, nhiệt độ cao, độ nhớt thấp, hòa tan tốt trong nước, có khả năng đệm và tạo cấu trúc với vị trung tính, do đó polydextrose được sử dụng rộng rãi trong sản suất thực phẩm, từ nước giải khát, bánh, kẹo, sữa, chocolate…

Bảng 1.1 Khuyến nghị bổ sung chất xơ theo giai đoạn tuổi [17]

Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

Công thức phân tử: (C6H10O5)n với n trung bình là 12 Khối lượng phân tử: < 22000 Da

Tên khoa học: Không có do đặc tính cấu trúc Tên thương mại: polydextrose

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của polydextrose

Polydextrose là chất rắn màu trắng đến nâu nhạt, có rất ít vị ngọt, tan tốt trong nước tạo thành dung dịch trong suốt, không màu đến vàng rơm, khoảng pH 2,5 đến 7,0 đối với polydextrose (dung dịch 10%) Nhiệt độ nóng chảy của nó khoảng 130oC

Polydextrose hay còn gọi là poly-d-glucose là một loại polysaccarit không tiêu hóa được Polydextrose là polyme có trọng lượng phân tử thấp của glucose Polydextrose được sản xuất bằng phản ứng ngưng tụ glucose và sorbitol tan chảy số lượng lớn kết kết hợp với một lượng nhỏ acid Phản ứng tiến hành ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy trong môi trường chân không hoàn toàn Các acid polycaboxylic đóng vai trò là chất xúc tác cho quá trình trùng hợp, các acid được sử dụng là các acid có thể ăn được như: acid citric, acid carboxylic… Nó là một polysaccarit liên kết ngẫu nhiên của glucose với tất cả các liên kết glucosid có thể có Tuy nhiên, liên kết 1,6 anpha và beta tạo nên có thành phần có tính ổn định cao Nó DP trung bình là 12 và trọng lượng phân tử là 2000 (với phạm vi từ 162 đến xấp xỉ 20000) [30]

 Độ hòa tan:

Polydextrose là thành phần vô định hình có khả năng hòa tan cao Các dung dịch trong suốt có nồng độ trên 80% w/w có thể được tạo ra ở 25oC trong nước (Allingham 1982) Polydextrose có đặc tính phân tán và hoàn tan tốt Trộn trước với các thành phần khác (chẳng hạn như đường) có thể cải thiện khả năng phân tán trong điều kiện trộn kém

như trong đồ uống dạng bột Cũng như nhiều nguyên liệu khác, cần phải trộn cơ học tốt để chuẩn bị dung dịch đậm đặc Polydextrose dạng hạt có khả năng phân tán cao với lượng bụi tối thiểu [19]

 Độ nhớt:

Polydextrose có độ nhớt hoạt động như chất lỏng Newton Dung dịch polydextrose 70% ở 25oC đo được khoảng 1800 cps Ở mức này (70%, w/w), dung dịch polydextrose có độ nhớt cao hơn dung dịch surcalose hoặc siro ngô có hàm lượng fructose cao (HFCS) ở nồng độ tương tự [19]

 Tính ổn định:

Polydextrose rất ổn định trong dung dịch vì nó là một phân tử phân nhánh phức tạp và chứa nhiều liên kết glucosid có khả năng chống thủy phân bằng acid Polydextrose chứa chủ yếu các liên kết 1-6, có khả năng chống thủy phân acid cao gấp hai đến 4 lần so với cá các liên kết 1-2, 1-3, 1-4 Hơn nữa hình dạng ba chiều phức tạp, phân nhánh cao góp phần ổn định acid Polydextrose đã được chứng minh là ổn định trong suốt quá trình sản xuất đồ uống và điều kiện bảo quản điển hình ở pH 3 và 7 (Beer et al 1991) [23]

Tác dụng của polydextrose

Polydextrose có nhiều tác dụng khác nhau đối với cơ thể con người và trong các sản phẩm thực phẩm Cùng với GOS, FOS, polydextrose thuộc nhóm xơ hòa tan tổng hợp, có khả năng hòa tan rất tốt trong nước và thường được bổ sung vào các loại thực phẩm khác nhau Polydextrose còn hoạt động như một chất độn, chất tạo khối trong công thức thực phẩm, cung cấp thêm khối lượng và tạo nên kết cấu cho sản phẩm mà không làm tăng lượng calo lên đáng kể Điều này thật sự có giá trị trong việc sản xuất các thực phẩm ít đường, ít calo khi nhu cầu của người tiêu dùng hiện nay ngày càng tăng cao

 Tăng khả năng hấp thụ khoáng chất:

Polydextrose đã được ghi nhận là được lên men từ từ và các tác dụng có lợi của polydextrose được điều hòa thông qua các chất chuyển hóa được tạo ra góp phần làm giảm độ pH của các chất tiêu hóa ở đại tràng => tăng khả năng hòa tan của canxi và magie và tăng hấp thu các chất này

Theo Tiến Sĩ Legette và cộng sự [24] đã chứng minh trên mô hình loài gặm nhấm sau mãn kinh rằng việc sản xuất SCFA (acid béo chuỗi ngắn) tăng lên sau khi tiêu thụ Polydextrose đã làm tăng sự hấp thụ khoáng chất ở ruột kết Các con vật nhận được 5 g/100 g Polydextrose trong 4 tuần và sau đó, sự gia tăng đáng kể về khả năng lưu giữ cấp tính canxi (102%) và magie (56%) đã được thấy ở những con vật được cho ăn chế độ ăn bổ sung Polydextrose khi so sánh với nhóm đối chứng

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên sự hấp thu khoáng chất

Vật thử

Chuột 5g/100g Tăng khả năng giữ canxi cấp tính (102%)

Tăng khả năng giữ magie cấp tính [24] Chuột 5g/100g

Tăng khả năng hấp thu canxi rõ ràng (16%) Tăng mật độ khoáng xương (xương đùi (7%), xương chày (9%) và cột sống (7%)

[7]

Chuột 4g/100g Tăng khả năng hấp thu canxi của xương

 Tác dụng đối với hệ vi sinh vật

Polydextrose làm tăng khối lượng phân, giảm thời gian vận chuyển, làm mềm phân và giảm độ pH trong phân Quá trình lên men chậm và bền vững của Polydextrose đã được chứng minh in vitro, in vivo và trong các thử nghiệm can thiệp vào chế độ ăn uống của con người [1] Nó điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột, tăng cường các vi khuẩn có lợi như Lactobacillus, Bifidobacteria và giảm các loài có hại như Clostridium

Theo Tiến sĩ Hooda và cộng sự kết luận rằng việc bổ sung Polydextrose rõ ràng có tác động tích cực đến thành phần vi khuẩn của hệ vi sinh vật đường ruột ở người [23]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên hệ vi sinh vật

Vật thử nghiệm

Liều

Con người 21g/ngày

Tăng lượng phân Clostridiaceae (5%), Veillonellaceae (2%), Faecalibacteria (5%), Phascolarctobacter (1%) và Dialister (1%) so với giả dược

Giảm Eubacteriaceae (4%) so với giả dược

[23]

Trong ống nghiệm

2% hoặc 4% (v/v)

Giảm sự phát triển của Clostridium difficile

Điều chế thành phần microbiota đại tràng [20]  Tác dụng lên chuyển hóa glucose và lipid trong máu

Polydextrose được chứng minh là có tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid Một nghiên cứu ở những người trưởng thành khỏe mạnh cho thấy không có báo cáo tăng cholesterol máu, đồng thời đã quan sát thấy việc giảm lượng cholesterol tổng số khi dùng 15g polydextrose hàng ngày trong hai tháng Một nghiên cứu khác cũng cho thấy với liều dùng từ 10 – 18g polydextrose một ngày làm giảm cholesterol LDL và cholesterol toàn phần đồng thời không ảnh hưởng tới HDL và triglyceride[24]

 Chống ung thư:

Giống với các chất xơ thông thường, polydextrose thúc đẩy quá trình lên men ở ruột già, đây là yếu tố quan trong trong việc ức chế hình thành ung thư Việc ăn polydextrose có thể ngăn ngừa ung thư đại trực tràng Cân bằng các phản ứng miễn dịch ở ruột già đặc biệt quan trọng để giảm nguy cơ phát triển ung thư ruột kết

 Tăng độ ngọt của sản phẩm:

Polydextrose thường được sử dụng kết hợp với các chất làm ngọt khác, chẳng hạn như chất làm ngọt cường độ cao hoặc chất làm ngọt tự nhiên để tối ưu hóa độ ngọt của sản phẩm Sự kết hợp này cho phép các nhà xây dựng công thức đạt được mức độ ngọt mong muốn đồng thời giảm hàm lượng đường tổng thể Polydextrose vẫn mang lại vị ngọt nhưng tác động rất ít đến đường huyết khiến nó cực kỳ phù hợp để đưa vào các sản phẩm dành cho bệnh nhân tiểu đường hay những người phải kiểm soát lượng đường trong máu

Polydextrose có hàm lượng calo thấp, chỉ 1kcal/g Do đó polydextrose trở thành nguyên liệu phù hợp để thay thế các phụ gia thực phẩm nhiều calo hơn và tạo nên các sản phẩm ít calo, ít đường Polydextrose là phần lý tưởng cho các sản phẩm quản lý cân nặng, có thể kết hợp vào thanh dinh dưỡng, sữa, sản phẩm công thức để thay thế bữa ăn và các công thức giảm cân khác[14]

 Chất tạo khối trong thực phẩm

Polydextrose hoạt động như một chất độn, chất tạo khối trong công thức thực phẩm Nó cung cấp thêm khối lượng và tạo nên kết cấu cho sản phẩm mà không làm tăng lượng calo lên đáng kể Polydextrose có thể ổn định nhũ tương, cải thiện kết cấu và tăng thời hạn sử dụng của các sản phẩm nước sốt như nước sốt salad, sốt mayonnaise… Nó còn có thể hình thành và ổn định gel Vì thế, polydextrose thường được sử dụng trong sản xuất món tráng miệng hay bánh kẹo có gel[14]

Các phương pháp phân tích Polydextrose

Ban đầu, các chất xơ được xác định theo phương pháp AOAC 985.29, sử dụng phương pháp kết hợp enzym – khối lượng Tuy nhiên Stuart A.S.Craig đã phát hiện ra polydextrose không bị thủy phân bởi các enzym trong phương pháp AOAC 985.29 và không thể định lượng được theo phương pháp này[8]

Phương pháp quang phổ UV-VIS là phương pháp đầu tiên xác định polydextrose được tác giả Michel Dubois và cộng sự công bố năm 1956 Phương pháp sử dụng acid để thủy phân phá vỡ liên kết glycosid sau đó khử nước và tạo dẫn xuất dextrose bằng phenol và acid sulfuric Dextrose tạo dẫn xuất được đo bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 490 nm Phương pháp này phức tạp và có độ chính xác không cao, độ chính xác của phương pháp bị ảnh hưởng bởi các carbohydrate khác có thể có trong thực phẩm

Đồng thời phương pháp UV-VIS cho độ nhạy kém, sai số do quá trình định lượng gián tiếp thông qua dextrose [25]

Tác giả Stuart A.S.Craig và cộng sự đã phân tích polydextrose bằng kỹ thuật Sắc ký trao đổi anion áp suất cao với đầu dò điện hóa (HPAEC–ED) Polydextrose được chiết ra khỏi thực phẩm bằng nước nóng, sau đó ly tâm, lọc phần nổi phía trên qua bộ siêu lọc ly tâm để loại bỏ các chất gây nhiễu có khối lượng phân tử cao Dịch lọc được xử lý bằng hỗn hợp enzym (isoamylase, amyloglucosidase và fructanase) để loại bỏ các chất gây nhiễu oligosaccharide chủ yếu là malto-oligomer và fructan Chất chuẩn polydextrose được xử lý theo cùng một quy trình Nghiên cứu sử dụng cột Carbopak PA1 Dionex (250 x 4 mm) với tiền cột tương ứng (23 x 3 mm) Sử dụng hệ pha động là natri hydroxyd và natri acetat, tốc độ dòng chảy là 1,2 ml/phút Xây dựng đường chuẩn theo phương trình bậc 2 với hệ số r > 0,998 Độ thu hồi trong khoảng từ 83-104%, trung bình 96%, n=24, độ lệch chuẩn trong khoảng từ 0,7-13%, trung bình 3,3%[15]

Tác giả Veena và cộng sự đã phân tích polydextrose sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector chỉ số khúc xạ (HPLC-RID) Nghiên cứu sử dụng hệ thống HPLC bao gồm bơm dung môi Model 515, thể tích tiêm 20 µl (Rheodine, PIN7725) và máy dò chỉ số khúc xạ Waters Model 2414 Dữ liệu được thu thập và đánh giá bằng phần mềm Empower Build 2154 (Waters, Milford, MA, USA) Hệ thống sử dụng cột Aminex HPX-87C (300 mm × 7,8 mm (id)) được rửa giải bằng canxi sunfat 5 mM, tốc độ dòng 0,6 ml/phút Phương pháp này đơn giản, có thể lặp lại và đáng tin cậy Độ thu hồi khối lượng polydextrose dao động từ 94,3% đến 99,3% với RSD là 2,68% [31]

Bảng 1.4 Các phương pháp phân tích Polydextrose

Phương

khối lượng

Xác định polydetrose gián tiếp bằng sản phẩm thủy phân Thủy phân bằng acid để phá vỡ liên kết glycosid,

sau đó tạo dẫn xuất dextrose => đem đo quang

Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi các

carbohydrate có trong mẫu

[25]

ED

HPAEC-Thực phẩm

Dịch lọc được xử lý bằng hỗn hợp emzym (amyloglycosidase, fructanase, isoamylase) loại

các oligasaccharide)

Đường chuẩn bậc 2 với r >0,998 Độ thu hồi 83-104% (trung bình

96%, n=24, RSD từ 0,7-13% (trung

được cho là đơn giản, có thể lặp lại và đáng tin cậy,

bên cạnh đó cũng không ảnh hưởng đến lactose có

trong sữa

Độ thu hồi dao động từ 94,3 đến 99,3% với RSD là

2,68%

[31]

1.2 Tổng quan về sắc ký ion

1.2.1 Giới thiệu về phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật học người Nga Michael C.Txvet Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm [1]

Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloid từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá học [5,6].Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao Cột mao quản và các detector sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cỡ ppm và ppb Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong thực tế

Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography- HPLC) [21] Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC) Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Sắc ký là quá trình phức tạp, có sự tương tác giữa 3 thành phần: Chất phân tích, pha tĩnh, pha động [1]

 Phân loại các phương pháp sắc ký Theo bản chất quá trình sắc ký:

Sắc ký hấp phụ (Adsorption chromatography): Pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ các chất Cân bằng này xuất hiện trong hệ lỏng – rắn và khí – rắn

Sắc ký phân bố (Partition chromatography): Phân tích sắc ký này dựa vào phân

bố các chất giữa hai hệ lỏng- lỏng và khí – lỏng

Sắc ký trao đổi ion (ion – exchange chromatography): Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion Nhựa này mang những ion trao đổi được với ion cùng dấu trong mẫu phân tích Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kính hydrat hoá của các ion chất phân tích

1.2.2 Sắc ký trao đổi ion

Sắc kí trao đổi ion là một nhánh trong sắc ký lỏng Đây là kĩ thuật tách cấu tử cation hoặc anion từ hỗn hợp qua cột sắc kí dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động Ion được phân tách bằng sự hấp phụ của chúng trên một giá đỡ có chứa điện tích cố định trên bề mặt của nó Phương pháp này dựa vào sự tương tác (hoặc trao đổi) của các ion trong mẫu hoặc pha động với ion cố định các nhóm điện tích trái dấu liên kết với giá đỡ và đóng vai trò là pha tĩnh

Nguyên tắc của quá trình trao đổi ion:

Kĩ thuật tách cấu tử cation hoặc anion từ hỗn hợp qua cột sắc kí dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động Sắc kí trao đổi ion tách các ion và phân tử phân cực dựa trên điện tích của chúng Ion càng bị giữ mạnh bởi pha tĩnh thì càng ra muộn Hệ thống sắc ký ion thường dùng để tách các hạt mang điện tích từ một dung dịch chất lỏng và nồng độ của chất này với độ chính xác tới ppb Sắc ký ion có thể phân tích được các anion như F–, Cl–, NO3–, NO2–, các cation như Li+, Na+, NH4+, K+, Ca2+, và Mg2+; các muối hữu cơ như các axit carboxylic, nhóm amin và các protein [2] Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của phân tử tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích, khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chất trao đổi ion, bản chất của các quá trình phân tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) của ionit [2] Dựa vào điện tích trên các phối tử trao đổi ion, sắc ký trao đổi ion được chia thành hai loại chính: sắc ký trao đổi anion và sắc ký trao đổi cation

Các detector thích hợp dùng trong sắc kí trao đổi ion để phân tích carbohydrat là detector đo xung ampe (PAD), detector tán xạ bay hơi (ELSD), detector chỉ số khúc xạ (RID), … Trong đó, RID ít được ưa chuộng hơn vì có độ nhạy kém, phụ thuộc vào nhiệt độ phòng, không cho phép hoạt động với gradient dung môi ELSD nhạy hơn RID, có hoạt động với sự rửa giải gradient, carbohydrat dễ dàng phân tách, tuy nhiên có một số nghiên cứu ELSD không tuyến tính và có thể có độ chính xác thấp hơn RID Detector PAD có độ nhạy tốt hơn, khả năng tuyến tính tốt, sử dụng được trong khoảng nồng độ

pH cao [1,22] Do đó HPAEC-PAD đang là xu hướng mới cho các phân tích về nhóm carbohydrat

Hệ thống sắc kí trao đổi ion có thiết kế cơ bản bao gồm: bình chứa dung môi, đường dẫn pha động, các van, bơm, hệ thống tiêm mẫu, cột phân tích, bộ triệt nhiễu nền, đầu dò, bộ ghi, máy tính và máy in [1]

Bình chứa dung môi: để việc phân tích định lượng được chính xác, dung môi

cần có độ sạch cao và chuyên dụng Pha động có thể là dung môi methanol, axetonitril hoặc có thể là hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ các thành phần

Bơm: đẩy pha động qua cột làm tăng và ổn định tốc độ dòng pha động trong quá

trình sắc ký, rửa giải chất chất tan ra khỏi cột Bơm này phải trơ với dung môi

Hệ thống tiêm: tiêm mẫu tự động đơn giản

Cột sắc ký: là nơi chứa pha tĩnh và là nơi diễn ra quá trình tách sắc ký Hiệu quả

tách sắc ký chủ yếu dựa vào cột, nên tùy theo bản chất của từng chất phân tích để chọn côt cho phù hợp

Bộ triệt nhiễu nền: làm giảm độ dẫn điện của pha động sau khi qua khỏi cột

phân tích, do dó cho phép phát hiện chất phân tích ở nồng độ thấp

Đầu dò (detector): phát hiện và đo nồng độ chất phân tích Khi nối các đầu dò

phương pháp cho phép định tính dựa vào thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao hoặc diện tích pic Chế độ PAD (Pulsed Amperometric Detection) phát hiện chất phân tích bằng cách đo dòng điện tạo ra bởi quá trình oxy hóa chất phân tích trên bề mặt của điện cực vàng Do chỉ phát hiện những hợp chất có chứa nhóm chức có thể oxy hóa ở mức điện áp phát hiện sử dụng nên phương pháp cho độ nhạy rất tốt trong phân tích nhóm carbohydrate Điện cực được tự động làm sạch và chuẩn bị để phát hiện theo từng chuỗi điện thế được lập trình, do đó giảm thiểu điện cực bám bẩn bởi các sản phẩm oxy hóa của chất phân tích với các hợp chất mẫu khác Detector chỉ sử dụng phát hiện những

hợp chất có chứa nhóm chức có thể bị oxy hóa ở điện áp phát hiện

Bộ ghi: phải thật chính xác và đa năng, có thể đo được thời gian lưu, tự động hóa

trong việc phát hiện và đo diện tích pic Có khả năng lưu giữ các dữ liệu trong bộ nhớ để có thể lặp lại tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu qua hệ sắc ký nhiều lần

Sơ đồ hệ thống sắc ký trao đổi ion được trình bày trong hình 1.2

Hình 1.2 Hệ thống sắc ký trao đổi ion

HPAEC-PAD là phương pháp có nhiều ưu điểm về tính chọn lọc, độ nhạy tốt, độ lặp lại tốt trong phân tích các hợp chất carbohydrat Do đó chúng tôi phát triển phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân tích hàm lượng polydextrose trong thực phẩm

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu này là polydextrose Đối tượng mẫu là sản phẩm thực phẩm bổ sung

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị: Hệ thống máy sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao Dionex ICS-6000 với detector PAD, Cột CarboPak PA1, Cân kỹ thuật, độ chính xác 0,01g, Cân phân tích, độ chính xác 0,0001g, Máy ly tâm tốc độ cao, Máy lắc vortex, Máy lắc ngang

ml, Cốc 50, 100 ml, Pipet pasteur, Pipet man, Vial đựng mẫu, màng lọc mẫu Minisart RC hydrophilic 0,2 µm hoặc 0,45 µm, Màng lọc pha động Cellulose Acetate 0,2 µm hoặc 0,45 µm.

2.1.3 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi

Chất chuẩn: Chuẩn polydextrose Biosynth, Code YP29207, Lot: YP292071701

Các dung môi hóa chất sử dụng là loại tinh khiết phân tích: NaOH 50%, Natri acetate

(Merck), Acid acetic (Merck), Fructanase (exo-inulinase), 667 U/mL, Amyloglucosidase, 3260 U/mL, Isoamylase, 200 U/mL, Nước cất 2 lần

2.1.4 Pha dung dịch chuẩn

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc trong dung môi: + Dung dịch chuẩn gốc: 20000 ppm (mg/L)

Cân chính xác khoảng 1000 mg polydextrose, chính xác đến 10 mg, cho vào lọ có nắp vặn đã được cân trước Thêm khoảng 30 mL nước nóng (khoảng 80°C) vặn chặt nắp và lắc vortex trong 30s Cho lọ vào nồi cách thủy ở 80°C trong 10 phút để hòa tan polydextrose Lấy lọ ra khỏi nồi cách thủy, để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút, chuyển dung dịch vào bình định mức 50 mL và định mức đến vạch

Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian polydextrose:

Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc 20000 mg/L trong nước để thu được dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 2000 mg/L

Dung dịch chuẩn làm việc: Cân chính xác một lượng dung dịch chuẩn vào trong ống eppendorf 1,7 mL, tiếp tục cân enzyme vào ống để lượng có trong ống khoảng 1 g

Dung dịch chuẩn làm việc sau đó được xử lý như mẫu thử

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.2.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Quá trình xử lý mẫu được xây dựng sau khi phân tích các tính chất lý hóa của polydextrose và tham khảo một số quy trình của các nghiên cứu [8], [10], [15], [16], [22], đề tài đã lựa chọn xử lý mẫu theo phương pháp AOAC 2000.11 [8] bằng cách sử dụng hỗn hợp enzym Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của enzym cũng như của tốc độ ly tâm cao tốc để tìm điều kiện xử lý mẫu tối ưu cho độ thu hồi cao, độ lặp lại tốt và phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm Dưới đây là quy trình xử lý mẫu:

Chuẩn bị mẫu thử:

Nghiền hoặc cắt nhỏ mẫu Bảo quản mẫu trong vật chứa kín để tránh thay đổi độ ẩm

Chiết polydextrose ra khỏi mẫu

Cân từ 0,1 – 5 g mẫu thử chính xác đến 10mg, cho vào ống ly tâm 50 mL có nắp vặn Thêm khoảng 30 mL nước nóng (khoảng 80°C) và vặn chặt nắp Lắc vortex trong 30 giây để phân tán mẫu Cho lọ vào bể rung siêu âm ở 80°C trong 10 phút để hòa tan polydextrose Lấy lọ ra khỏi bể rung siêu âm , để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm ở 6000 rpm trong 5 phút

Thủy phân enzyme (chuẩn làm việc, mẫu thử)

Hút 0,2 mL dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu thử đã ly tâm vào ống ống eppendorf 1,7 mL Tiếp tục hút 0,8 mL hỗn hợp đệm enzym (amyloglucosidase + isomylase + fructanase) Đóng nắp cẩn thận Thủy phân enzyme trong bếp cách thủy ở 50°C trong 1 giờ Làm lạnh trong bể nước đá hoặc tủ đá cho đến khi enzym kết tủa (khoảng 5 phút trong đá lạnh)

Ly tâm ở 11000 rpm trong 5 phút Thu dịch trong phía trên vào vial, phân tích trên thiết bị HPAEC-PAD

Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được biểu diễn trong hình 2.1

2.2.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Sau khi tham khảo một số tài liệu về điều kiện sắc ký của các nghiên cứu [8], [10], [15], [16], [22], đề tài đã lựa điều kiện sắc ký theo phương pháp AOAC 2000.11 [8] với các thông số như sau:

- Cột sắc ký: Dionex™ CarboPac™ PA1 (250mm x 4 mm) và tiền cột (50mm x 4 mm)

- Detector: PAD (điện cực Au/AgCl) - Thể tích tiêm: 10 µL

- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút

- Thời gian phân tích: 25 phút

- Pha động gồm 2 kênh: Kênh A: NaOH 150mM

Kênh B: NaOH 150mM + Natri acetat

Tiến hành khảo sát nồng độ pha động để có thể tách và phát hiện chất phân tích, sắc ký đồ đẹp và thời gian phân tích không quá dài

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích bằng kỹ thuật HPAEC-PAD theo hướng dẫn của AOAC 2016 Các chỉ tiêu cần thẩm định gồm: tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), đường cong chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi

Yêu cầu: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic

phải nhỏ hơn hoặc bằng 2,0% [4]

Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện được chát phân tích khi có các thành phần khác trong mẫu Trong phép phân tích định lượng là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng bởi tất cả các yêu tố khác nhằm hướng đến kết quả chính xác

Độ đặc hiệu của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh tín hiệu của chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Mỗi mẫu thực hiện 6 lần

Mẫu trắng: mẫu không có chứa chất phân tích Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn của chất phân tích Mẫu trắng thêm chuẩn: mẫu trắng thêm chất chuẩn

Yêu cầu: Mẫu trắng không được lên tín hiệu của chất phân tích, nếu mẫu trắng có

hơn 10% dương tính hoặc xuất hiện tín hiệu thì thay đổi phương pháp khác để loại trừ ảnh hưởng Mẫu trắng thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn (chênh lệch không quá 5,0%)

Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

- Cách xác định:

Phân tích một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc đến khi cho đến khi không còn tuyến tính nữa

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính, tiến hành xây dựng mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic

Mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic được đánh giá qua hai tiêu chí là hệ số tương quan tuyến tính R và độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

- Hệ số tương quan tuyến tính R, yêu cầu R ≥ 0,995 (hoặc R2 ≥ 0,99)

- Độ chệch: Sau khi lập mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic Độ chệch của từng điểm chuẩn không vượt quá 15%, riêng tại điểm LOQ cho phép không vượt quá 20% [4]

Giá trị độ chệch được tính theo công thức:

∆𝒊=𝑪𝒊(𝒕𝒕)− 𝑪𝒊(𝒍𝒕)

𝑪𝒊(𝒍𝒕) × 𝟏𝟎𝟎

Trong đó:

∆𝒊: Độ chệch của điểm chuẩn thứ i

𝑪𝒊(𝒕𝒕): Nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm thứ i 𝑪𝒊(𝒍𝒕): Nồng độ lý thuyết của điểm chuẩn thứ i

Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- LOD: là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện về mặt định tính nhưng chưa thể định lượng được

Xác định giá trị LOD, LOQ dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử: Phân tích mẫu thử 10 lần song song Sau đó xác định LOD thông qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, đánh giá LOD đã được tính thông qua giá trị R:

R= 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ𝐿𝑂𝐷

Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R [8]

Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn SD LOD = 3 x SD



- LOQ: là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp

Công thức tính LOQ dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử: LOQ= 10 x SD Sau khi xác định được LOQ, cần kiểm tra độ lặp lại và độ thu hồi trên mẫu trắng thêm chuẩn tại LOQ Số lần lặp lại tối thiểu là 4 lần Các kết quả phải đạt theo độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp [8]

Độ lặp lại và độ thu hồi

 Độ lặp lại

Đánh giá độ lặp lại thông qua phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở cùng một hàm lượng, làm lặp lại tối thiếu 6 lần Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) Độ lặp lại phải đáp ứng được yêu cầu tương ứng với nồng độ theo AOAC 2016 được viết trong phụ lục 3.7 Dưới đây là công thức tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối:

RSD% = S

x × 100 S = √∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅)2𝑛−1Trong đó:

𝑥𝑖: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i” 𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm S: Độ lệch chuẩn

n: Số lần thử nghiệm  Độ thu hồi

Độ thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

Cách xác định:

Chuẩn bị các mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức hàm lượng khác nhau Với mỗi mức hàm lượng làm 3 mẫu độc lập Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:

- Đối với mẫu thử: 𝑅% = C(m+c)−Cm

- Đối với mẫu trắng: 𝑅% = 𝐶 𝑡𝑡

𝐶𝑐 𝑥100 Trong đó R%: Độ thu hồi

C(m+c): Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp định lượng

Tham khảo quy trình phân tích theo AOAC 2000.11, áp dụng quy trình xử lý mẫu bằng enzym sau đó phân tích trên thiết bị HPAEC-PAD thu được pic sắc ký đồ của polydextrose trong khoảng thời gian lưu 13,2 phút như hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose có xử lý với enzym và ly tâm tốc độ cao Tuy nhiên trong quy trình có bước sử dụng enzym thủy phân chuẩn và bước ly tâm tốc độ cao (11000 rpm) cần có hóa chất và thiết bị ly tâm chuyên dụng Về lý thuyết các enzym sử dụng trong nghiên cứu có tác dụng thủy phân tinh bột, các chất gây nhiễu oligosaccharide chủ yếu là malto-oligomer và fructan mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của polydextrose Do đó em tiến hành khảo sát ảnh hưởng của enzym cũng như ảnh hưởng của ly tâm tốc độ cao trong quy trình xử lý mẫu

3.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Với quy trình xử lý mẫu dự kiến ở mục 2.2.1.1, khảo sát vai trò của enzym và ly tâm trong quá trình xử lý mẫu bằng cách: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn polydextrose có nồng độ 2000 mg/L, không qua bước xử lý với enzym và ly tâm vào hệ thống HPAEC-PAD với các điều kiện sắc kí được mục 2.2.1.2 Sắc ký đồ thu được như hình 3.2

Nhận xét: Không xuất hiện tín hiệu của polydextrose tại thời gian lưu tương ứng

Có xuất hiện pic tạp chất tại khoảng thời gian lưu từ 1,3 – 2 phút

Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose không xử lý enzym và không ly tâm Tiếp tục khảo sát quy trình phân tích chuẩn polydextrose ở cùng nồng độ 2000 mg/L với điều kiện không sử dụng enzym, có ly tâm ở 11000 rpm trong 5 phút và có sử dụng enzym nhưng không ly tâm tốc độ cao Sắc ký đồ được trình bày lần lượt trong hình 3.3 và 3.4

Nhận xét: Việc sử dụng enzym và ly tâm tốc độ cao ảnh hưởng rất nhiều đến kết

quả phân tích kể cả trong trường hợp phân tích chuẩn polydextrose tinh khiết Do đó quy trình xử lý enzym và ly tâm tốc độ cao là cần thiết cả trong xử lý mẫu cũng như xây dựng đường chuẩn

Kết luận: Sử dụng enzym và ly tâm tốc độc cao đều cần thiết cho quá trình xử lý

mẫu Nếu không sử dụng enzym thì không thể phát hiện được chất phân tích có trong mẫu thử hay trên cả mẫu chuẩn Việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ các tạp chất và không làm ảnh hưởng đến pic của chất phân tích