Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về xác định polydextrose trong thực phẩm như phương pháp quang phổ UV-VIS [25], phương pháp kết hợp enzym- khối lượng [8], sắc ký lỏng hiệu
TỔNG QUAN
Giới thiệu về chất xơ
Các hạt ngũ cốc và chất xơ đã được biết đến là có lợi cho sức khỏe, vào năm 300 trước công nguyên đã có khuyến nghị về việc bổ sung chất xơ Kellogg và C.W Post đã phát hiện ra các bệnh mãn tính ở phương Tây ít khi xuất hiện tại các vùng nông thôn Châu Phi, ở những người tiêu thụ thực phẩm giàu carbohydrat và chất xơ Các nghiên cứu sau này đã góp phần trong việc phổ biến tầm quan trọng của chất xơ trong chế độ ăn hàng ngày Các thực phẩm từ thực vật không chỉ chứa mình chất xơ, các lợi ích từ chế độ ăn giàu thực vật đến từ nhiều thành phần dinh dưỡng khác nữa như vitamin, khoáng chất Cho đến hiện nay, đã có rất nhiều nghiên cứu khác chỉ ra tầm quan trọng của việc bổ sung chất xơ vào chế độ ăn uống hàng ngày Những thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật không chỉ cung cấp cho con người chất xơ mà còn bổ sung thêm các vitamin và các khoáng chất cần thiết khác cho con người [17]
Trong đó, ngoài hàm lượng chất xơ tự nhiên có sẵn trong bản chất của sản phẩm, các nhà sản xuất còn bổ sung thêm các dạng chất xơ khác như: polydextrose, inulin, fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS)… Một số sản phẩm có bổ sung thêm tinh bột kháng, maltodextrin kháng tiêu hóa hay β-glucan cũng được xếp vào nhóm chất xơ [17]
Nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ béo phì ngày càng gia tăng do sự dư thừa calo trong mỗi bữa ăn Để giảm thiểu tình trạng này các chuyên gia khuyến nghị nên thay đổi chế độ ăn uống và mức tiêu thụ chất xơ Tuy nhiên, theo báo cáo lượng tiêu thụ thường không đạt đến mức được khuyến nghị bởi các quốc gia khác nhau Ví dụ, ở Úc, lượng chất xơ trung bình của người trưởng thành được báo cáo là 18,2g so với lượng khuyến nghị lần lượt là 25g và 40g đối với phụ nữ và nam giới Việc đạt được lượng tiêu thụ chất xơ khuyến nghị không chỉ giúp người dân giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và tiểu đường tuýp II mà còn kéo theo giá trị kinh tế thông qua việc giảm chi phí chăm sóc sức khỏe [17]
Polydextrose được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm nhờ các ưu điểm như ổn định trong điều kiện axit và nhiệt độ cao, có độ nhớt thấp, hòa tan tốt trong nước, có khả năng đệm, tạo cấu trúc và vị trung tính Với những đặc tính này, polydextrose đóng vai trò như một giải pháp hiệu quả để tăng cường chất xơ cho các sản phẩm thực phẩm hiện đại Tại nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm cả Mỹ và Châu Âu, polydextrose được công nhận là một loại phụ gia thực phẩm an toàn.
Bảng 1.1 Khuyến nghị bổ sung chất xơ theo giai đoạn tuổi [17]
Polydextrose
Tiến sĩ Hans Rennhard, công tác tại Phòng Thí Nghiệm của Trung Tâm nghiên cứu của hãng Pifzer đã phát hiện ra polydextrose vào năm 1965 khi đang tìm kiếm một chất tạo khối có hàm lượng calo thấp Mục tiêu của ông lúc đó là phát triển một thành phần có thể kết hợp với chất tạo ngọt trong thực phẩm chế biến sẵn để thay thế carbohydrat có nhiều calo Ông đã đạt được mục tiêu khi tìm ra polydextrose Polydextrose là một chất tạo khối, cung cấp năng lượng thấp, được sử dụng để thay thế một phần hoặc hoàn toàn đường có trong thực phẩm mà không làm thay đổi cấu trúc và vị ngon của sản phẩm Ngoài ra, polydextrose là một chất phụ gia thực phẩm đa chức năng, có thể sử dụng nhằm giữ độ ẩm, tạo hình sản phẩm, tạo độ đặc, tăng tính ổn định, bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp Năm 1981, Cục Quản Lý Thực Phẩm và Dược của
Mỹ (FDA) đã cho phép sử dụng polydextrose trong chế biến thực phẩm [28] Hiện nay, polydextrose đã trở thành một chất phụ gia thực phẩm được cho phép sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới trong đó có Việt Nam Tính an toàn là điều kiện cần để polydextrose trở thành một nguyên liệu được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong chế biến thực phẩm trên toàn thế giới Các thử nghiệm lâm sàng về polydextrose đã được thực hiện nhiều trên các loài động vật như chuột… Không có tác dụng phụ nào được báo cáo về polydextrose trong các nghiên cứu trường diễn trên chuột, chó, khỉ cũng như các nghiên cứu về ung thư trên chuột nhắt và chuột cống Liều cao nhất được thử nghiệm lên tới
15000 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày Do đó cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) kết luận không cần đưa ra ngưỡng lượng tiêu thụ hàng ngày chấp nhận được (ADI) đối với polydextrose [22]
Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
Công thức phân tử: (C6H10O5)n với n trung bình là 12
Khối lượng phân tử: < 22000 Da
Tên khoa học: Không có do đặc tính cấu trúc
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của polydextrose Polydextrose là chất rắn màu trắng đến nâu nhạt, có rất ít vị ngọt, tan tốt trong nước tạo thành dung dịch trong suốt, không màu đến vàng rơm, khoảng pH 2,5 đến 7,0 đối với polydextrose (dung dịch 10%) Nhiệt độ nóng chảy của nó khoảng 130 o C
Polydextrose hay còn gọi là poly-d-glucose là một loại polysaccarit không tiêu hóa được Polydextrose là polyme có trọng lượng phân tử thấp của glucose Polydextrose được sản xuất bằng phản ứng ngưng tụ glucose và sorbitol tan chảy số lượng lớn kết kết hợp với một lượng nhỏ acid Phản ứng tiến hành ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy trong môi trường chân không hoàn toàn Các acid polycaboxylic đóng vai trò là chất xúc tác cho quá trình trùng hợp, các acid được sử dụng là các acid có thể ăn được như: acid citric, acid carboxylic… Nó là một polysaccarit liên kết ngẫu nhiên của glucose với tất cả các liên kết glucosid có thể có Tuy nhiên, liên kết 1,6 anpha và beta tạo nên có thành phần có tính ổn định cao Nó
DP trung bình là 12 và trọng lượng phân tử là 2000 (với phạm vi từ 162 đến xấp xỉ 20000) [30]
Polydextrose là một thành phần dạng sợi hòa tan cao, có thể tạo dung dịch trong suốt với nồng độ trên 80% w/w ở 25 độ C trong nước Đặc tính phân tán và hòa tan tốt của polydextrose giúp dễ dàng kết hợp với các thành phần khác trong hỗn hợp, ngay cả trong điều kiện trộn kém.
Polydextrose dạng hạt có khả năng phân tán dễ dàng trong nước, tạo ra dung dịch cô đặc với lượng bụi tối thiểu Trộn cơ học thích hợp là cần thiết để tạo ra dung dịch polydextrose đậm đặc như trong đồ uống dạng bột.
Polydextrose có độ nhớt hoạt động như chất lỏng Newton Dung dịch polydextrose 70% ở 25 o C đo được khoảng 1800 cps Ở mức này (70%, w/w), dung dịch polydextrose có độ nhớt cao hơn dung dịch surcalose hoặc siro ngô có hàm lượng fructose cao (HFCS) ở nồng độ tương tự [19]
Polydextrose có khả năng chống thủy phân axit cao do cấu trúc phân nhánh phức tạp và nhiều liên kết glucosid 1-6 Liên kết này bền gấp 2-4 lần liên kết 1-2, 1-3, 1-4 Cấu trúc ba chiều phức tạp cũng tăng độ ổn định axit Polydextrose đã được chứng minh là ổn định trong quá trình sản xuất đồ uống và điều kiện bảo quản điển hình ở pH 3 và 7.
Polydextrose có nhiều tác dụng khác nhau đối với cơ thể con người và trong các sản phẩm thực phẩm Cùng với GOS, FOS, polydextrose thuộc nhóm xơ hòa tan tổng hợp, có khả năng hòa tan rất tốt trong nước và thường được bổ sung vào các loại thực phẩm khác nhau Polydextrose còn hoạt động như một chất độn, chất tạo khối trong công thức thực phẩm, cung cấp thêm khối lượng và tạo nên kết cấu cho sản phẩm mà không làm tăng lượng calo lên đáng kể Điều này thật sự có giá trị trong việc sản xuất các thực phẩm ít đường, ít calo khi nhu cầu của người tiêu dùng hiện nay ngày càng tăng cao
Tăng khả năng hấp thụ khoáng chất:
Polydextrose đã được ghi nhận là được lên men từ từ và các tác dụng có lợi của polydextrose được điều hòa thông qua các chất chuyển hóa được tạo ra góp phần làm giảm độ pH của các chất tiêu hóa ở đại tràng => tăng khả năng hòa tan của canxi và magie và tăng hấp thu các chất này
Theo Tiến Sĩ Legette và cộng sự [24] đã chứng minh trên mô hình loài gặm nhấm sau mãn kinh rằng việc sản xuất SCFA (acid béo chuỗi ngắn) tăng lên sau khi tiêu thụ Polydextrose đã làm tăng sự hấp thụ khoáng chất ở ruột kết Các con vật nhận được 5 g/100 g Polydextrose trong 4 tuần và sau đó, sự gia tăng đáng kể về khả năng lưu giữ cấp tính canxi (102%) và magie (56%) đã được thấy ở những con vật được cho ăn chế độ ăn bổ sung Polydextrose khi so sánh với nhóm đối chứng
Bảng 1.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên sự hấp thu khoáng chất
Vật thử nghiệm Liều lượng Các hiệu ứng TLTK
Chuột 5g/100g Tăng khả năng giữ canxi cấp tính (102%)
Tăng khả năng giữ magie cấp tính [24] Chuột 5g/100g
Tăng khả năng hấp thu canxi rõ ràng (16%) Tăng mật độ khoáng xương (xương đùi (7%), xương chày (9%) và cột sống (7%)
Chuột 4g/100g Tăng khả năng hấp thu canxi của xương
Tác dụng đối với hệ vi sinh vật
Polydextrose làm tăng khối lượng phân, giảm thời gian vận chuyển, làm mềm phân và giảm độ pH trong phân Quá trình lên men chậm và bền vững của Polydextrose đã được chứng minh in vitro, in vivo và trong các thử nghiệm can thiệp vào chế độ ăn uống của con người [1] Nó điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột, tăng cường các vi khuẩn có lợi như Lactobacillus, Bifidobacteria và giảm các loài có hại như Clostridium
Nghiên cứu của Tiến sĩ Hooda và các đồng nghiệp đưa ra kết luận rằng bổ sung Polydextrose có tác động tích cực rõ rệt lên hệ vi khuẩn trong hệ vi sinh đường ruột của con người [23].
Bảng 1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng polydextrose lên hệ vi sinh vật
Liều lượng Các hiệu ứng TLTK
Tăng lượng phân Clostridiaceae (5%), Veillonellaceae (2%), Faecalibacteria (5%), Phascolarctobacter (1%) và Dialister (1%) so với giả dược
Giảm Eubacteriaceae (4%) so với giả dược
Giảm sự phát triển của Clostridium difficile Điều chế thành phần microbiota đại tràng [20]
Tác dụng lên chuyển hóa glucose và lipid trong máu
Polydextrose được chứng minh là có tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid Một nghiên cứu ở những người trưởng thành khỏe mạnh cho thấy không có báo cáo tăng cholesterol máu, đồng thời đã quan sát thấy việc giảm lượng cholesterol tổng số khi dùng 15g polydextrose hàng ngày trong hai tháng Một nghiên cứu khác cũng cho thấy với liều dùng từ 10 – 18g polydextrose một ngày làm giảm cholesterol LDL và cholesterol toàn phần đồng thời không ảnh hưởng tới HDL và triglyceride[24]
Giới thiệu về phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật học người Nga Michael C.Txvet Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm [1]
Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloid từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá học [5,6].Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao Cột mao quản và các detector sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cỡ ppm và ppb Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong thực tế
Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography- HPLC) [21] Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-
MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC) Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Sắc ký là quá trình phức tạp, có sự tương tác giữa 3 thành phần: Chất phân tích, pha tĩnh, pha động [1]
Phân loại các phương pháp sắc ký
Theo bản chất quá trình sắc ký:
Sắc ký hấp phụ là phương pháp tách dựa trên khả năng hấp phụ các chất trên pha tĩnh là chất rắn Quá trình hấp phụ xảy ra ở trạng thái cân bằng giữa pha lỏng hoặc khí với pha rắn, dẫn đến sự phân tách các chất dựa trên mức độ tương tác và affinities hấp phụ khác nhau với pha tĩnh.
Sắc ký phân bố (Partition chromatography): Phân tích sắc ký này dựa vào phân bố các chất giữa hai hệ lỏng- lỏng và khí – lỏng
Sắc ký trao đổi ion (ion – exchange chromatography): Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion Nhựa này mang những ion trao đổi được với ion cùng dấu trong mẫu phân tích Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kính hydrat hoá của các ion chất phân tích.
Sắc ký trao đổi ion
Sắc kí trao đổi ion là một nhánh trong sắc ký lỏng Đây là kĩ thuật tách cấu tử cation hoặc anion từ hỗn hợp qua cột sắc kí dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động Ion được phân tách bằng sự hấp phụ của chúng trên một giá đỡ có chứa điện tích cố định trên bề mặt của nó Phương pháp này dựa vào sự tương tác (hoặc trao đổi) của các ion trong mẫu hoặc pha động với ion cố định các nhóm điện tích trái dấu liên kết với giá đỡ và đóng vai trò là pha tĩnh
Nguyên tắc của quá trình trao đổi ion:
Kĩ thuật tách cấu tử cation hoặc anion từ hỗn hợp qua cột sắc kí dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động Sắc kí trao đổi ion tách các ion và phân tử phân cực dựa trên điện tích của chúng Ion càng bị giữ mạnh bởi pha tĩnh thì càng ra muộn Hệ thống sắc ký ion thường dùng để tách các hạt mang điện tích từ một dung dịch chất lỏng và nồng độ của chất này với độ chính xác tới ppb Sắc ký ion có thể phân tích được các anion như F – , Cl – , NO3 –, NO2 –, các cation như Li + , Na + , NH4 +, K + ,
Ca 2+ , và Mg 2+ ; các muối hữu cơ như các axit carboxylic, nhóm amin và các protein [2]
Sắc ký trao đổi ion dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của phân tử tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích, khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh trong trường hợp này được gọi là chất trao đổi ion, bản chất của các quá trình phân tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) của ionit [2] Dựa vào điện tích trên các phối tử trao đổi ion, sắc ký trao đổi ion được chia thành hai loại chính: sắc ký trao đổi anion và sắc ký trao đổi cation
Các detector thích hợp dùng trong sắc kí trao đổi ion để phân tích carbohydrat là detector đo xung ampe (PAD), detector tán xạ bay hơi (ELSD), detector chỉ số khúc xạ (RID), … Trong đó, RID ít được ưa chuộng hơn vì có độ nhạy kém, phụ thuộc vào nhiệt độ phòng, không cho phép hoạt động với gradient dung môi ELSD nhạy hơn RID, có hoạt động với sự rửa giải gradient, carbohydrat dễ dàng phân tách, tuy nhiên có một số nghiên cứu ELSD không tuyến tính và có thể có độ chính xác thấp hơn RID Detector PAD có độ nhạy tốt hơn, khả năng tuyến tính tốt, sử dụng được trong khoảng nồng độ
12 pH cao [1,22] Do đó HPAEC-PAD đang là xu hướng mới cho các phân tích về nhóm carbohydrat
Hệ thống sắc kí trao đổi ion có thiết kế cơ bản bao gồm: bình chứa dung môi, đường dẫn pha động, các van, bơm, hệ thống tiêm mẫu, cột phân tích, bộ triệt nhiễu nền, đầu dò, bộ ghi, máy tính và máy in [1]
Để đảm bảo độ chính xác trong phân tích định lượng, dung môi sử dụng phải sạch và chuyên dụng Các loại dung môi phổ biến được sử dụng bao gồm methanol, axetonitril hoặc hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ các thành phần cụ thể.
Bơm: đẩy pha động qua cột làm tăng và ổn định tốc độ dòng pha động trong quá trình sắc ký, rửa giải chất chất tan ra khỏi cột Bơm này phải trơ với dung môi
Hệ thống tiêm: tiêm mẫu tự động đơn giản
Cột sắc ký: là nơi chứa pha tĩnh và là nơi diễn ra quá trình tách sắc ký Hiệu quả tách sắc ký chủ yếu dựa vào cột, nên tùy theo bản chất của từng chất phân tích để chọn côt cho phù hợp
Bộ triệt nhiễu nền: làm giảm độ dẫn điện của pha động sau khi qua khỏi cột phân tích, do dó cho phép phát hiện chất phân tích ở nồng độ thấp Đầu dò (detector): phát hiện và đo nồng độ chất phân tích Khi nối các đầu dò phương pháp cho phép định tính dựa vào thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao hoặc diện tích pic Chế độ PAD (Pulsed Amperometric Detection) phát hiện chất phân tích bằng cách đo dòng điện tạo ra bởi quá trình oxy hóa chất phân tích trên bề mặt của điện cực vàng Do chỉ phát hiện những hợp chất có chứa nhóm chức có thể oxy hóa ở mức điện áp phát hiện sử dụng nên phương pháp cho độ nhạy rất tốt trong phân tích nhóm carbohydrate Điện cực được tự động làm sạch và chuẩn bị để phát hiện theo từng chuỗi điện thế được lập trình, do đó giảm thiểu điện cực bám bẩn bởi các sản phẩm oxy hóa của chất phân tích với các hợp chất mẫu khác Detector chỉ sử dụng phát hiện những hợp chất có chứa nhóm chức có thể bị oxy hóa ở điện áp phát hiện
Bộ ghi: phải thật chính xác và đa năng, có thể đo được thời gian lưu, tự động hóa trong việc phát hiện và đo diện tích pic Có khả năng lưu giữ các dữ liệu trong bộ nhớ để có thể lặp lại tính toán kết quả mà không cần đưa mẫu qua hệ sắc ký nhiều lần
Sơ đồ hệ thống sắc ký trao đổi ion được trình bày trong hình 1.2
Hình 1.2 Hệ thống sắc ký trao đổi ion HPAEC-PAD là phương pháp có nhiều ưu điểm về tính chọn lọc, độ nhạy tốt, độ lặp lại tốt trong phân tích các hợp chất carbohydrat Do đó chúng tôi phát triển phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân tích hàm lượng polydextrose trong thực phẩm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Quá trình xử lý mẫu được xây dựng sau khi phân tích các tính chất lý hóa của polydextrose và tham khảo một số quy trình của các nghiên cứu [8], [10], [15], [16], [22], đề tài đã lựa chọn xử lý mẫu theo phương pháp AOAC 2000.11 [8] bằng cách sử dụng hỗn hợp enzym Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của enzym cũng như của tốc độ ly tâm cao tốc để tìm điều kiện xử lý mẫu tối ưu cho độ thu hồi cao, độ lặp lại tốt và phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm Dưới đây là quy trình xử lý mẫu:
Nghiền hoặc cắt nhỏ mẫu Bảo quản mẫu trong vật chứa kín để tránh thay đổi độ ẩm
Chiết polydextrose ra khỏi mẫu
Cân từ 0,1 – 5 g mẫu thử chính xác đến 10mg, cho vào ống ly tâm 50 mL có nắp vặn Thêm khoảng 30 mL nước nóng (khoảng 80°C) và vặn chặt nắp Lắc vortex trong
30 giây để phân tán mẫu Cho lọ vào bể rung siêu âm ở 80°C trong 10 phút để hòa tan polydextrose Lấy lọ ra khỏi bể rung siêu âm , để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm ở
Thủy phân enzyme (chuẩn làm việc, mẫu thử)
Hút 0,2 mL dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu thử đã ly tâm vào ống ống eppendorf 1,7 mL Tiếp tục hút 0,8 mL hỗn hợp đệm enzym (amyloglucosidase + isomylase + fructanase) Đóng nắp cẩn thận Thủy phân enzyme trong bếp cách thủy ở 50°C trong 1 giờ Làm lạnh trong bể nước đá hoặc tủ đá cho đến khi enzym kết tủa (khoảng 5 phút trong đá lạnh)
Ly tâm ở 11000 rpm trong 5 phút Thu dịch trong phía trên vào vial, phân tích trên thiết bị HPAEC-PAD
Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được biểu diễn trong hình 2.1
Khảo sát điều kiện sắc ký
Sau khi tham khảo một số tài liệu về điều kiện sắc ký của các nghiên cứu [8], [10], [15], [16], [22], đề tài đã lựa điều kiện sắc ký theo phương pháp AOAC 2000.11 [8] với các thông số như sau:
- Cột sắc ký: Dionex™ CarboPac™ PA1 (250mm x 4 mm) và tiền cột (50mm x 4 mm)
- Detector: PAD (điện cực Au/AgCl)
- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
- Thời gian phân tích: 25 phút
- Pha động gồm 2 kênh: Kênh A: NaOH 150mM
Kênh B: NaOH 150mM + Natri acetat Tiến hành khảo sát nồng độ pha động để có thể tách và phát hiện chất phân tích, sắc ký đồ đẹp và thời gian phân tích không quá dài
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu
17 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích bằng kỹ thuật HPAEC-PAD theo hướng dẫn của AOAC 2016 Các chỉ tiêu cần thẩm định gồm: tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), đường cong chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi Độ phù hợp hệ thống Đối với kỹ thuật sắc ký, phép thử độ phù hợp của hệ thống nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Tính phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của diện tích pic và thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn, tiến hành lặp lại 6 lần cùng một nồng độ với điều kiện sắc ký đã khảo sát
Yêu cầu về độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic dưới 2,0% Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện và xác định chính xác chất phân tích trong mẫu, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác Kiểm tra độ đặc hiệu bằng cách so sánh tín hiệu chất phân tích trên mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn, mỗi loại thực hiện 6 lần.
Mẫu trắng: mẫu không có chứa chất phân tích
Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn của chất phân tích
Mẫu trắng thêm chuẩn: mẫu trắng thêm chất chuẩn
Mẫu trắng phải đảm bảo không có tín hiệu của chất phân tích Nếu mẫu trắng có tỷ lệ dương tính trên 10% hoặc xuất hiện tín hiệu, cần thay đổi phương pháp kiểm tra khác để loại bỏ ảnh hưởng Mẫu trắng bổ sung chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn, với chênh lệch không quá 5%.
Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic
Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
Phân tích một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc đến khi cho đến khi không còn tuyến tính nữa
Sau khi xác định được khoảng tuyến tính, tiến hành xây dựng mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic
Mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic được đánh giá qua hai tiêu chí là hệ số tương quan tuyến tính R và độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích
- Hệ số tương quan tuyến tính R, yêu cầu R ≥ 0,995 (hoặc R 2 ≥ 0,99)
- Độ chệch: Sau khi lập mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng mối quan hệ tương quan giữa nồng độ và diện tích pic Độ chệch của từng điểm chuẩn không vượt quá 15%, riêng tại điểm LOQ cho phép không vượt quá 20% [4]
Giá trị độ chệch được tính theo công thức:
∆ 𝒊 : Độ chệch của điểm chuẩn thứ i
𝑪 𝒊(𝒕𝒕) : Nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm thứ i
𝑪 𝒊(𝒍𝒕) : Nồng độ lý thuyết của điểm chuẩn thứ i
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- LOD: là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện về mặt định tính nhưng chưa thể định lượng được
Xác định giá trị LOD, LOQ dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử: Phân tích mẫu thử 10 lần song song Sau đó xác định LOD thông qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, đánh giá LOD đã được tính thông qua giá trị R:
Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy
Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R
Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R [8]
Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn SD
- LOQ: là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp
Công thức tính LOQ dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử: LOQ= 10 x SD
Sau khi xác định được LOQ, cần kiểm tra độ lặp lại và độ thu hồi trên mẫu trắng thêm chuẩn tại LOQ Số lần lặp lại tối thiểu là 4 lần Các kết quả phải đạt theo độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp [8] Độ lặp lại và độ thu hồi
Đánh giá độ lặp lại thông qua phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở cùng một hàm lượng, thực hiện ít nhất 6 lần lặp lại Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối để đánh giá độ lặp lại của phương pháp.
(RSD) Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) Độ lặp lại phải đáp ứng được yêu cầu tương ứng với nồng độ theo AOAC 2016 được viết trong phụ lục
3.7 Dưới đây là công thức tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối:
𝑥 𝑖 : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm
S: Độ lệch chuẩn n: Số lần thử nghiệm
Độ thu hồi Độ thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp định lượng
Tham khảo quy trình phân tích theo AOAC 2000.11, áp dụng quy trình xử lý mẫu bằng enzym sau đó phân tích trên thiết bị HPAEC-PAD thu được pic sắc ký đồ của polydextrose trong khoảng thời gian lưu 13,2 phút như hình 3.1
Hình 3.1 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose có xử lý với enzym và ly tâm tốc độ cao Tuy nhiên trong quy trình có bước sử dụng enzym thủy phân chuẩn và bước ly tâm tốc độ cao (11000 rpm) cần có hóa chất và thiết bị ly tâm chuyên dụng Về lý thuyết các enzym sử dụng trong nghiên cứu có tác dụng thủy phân tinh bột, các chất gây nhiễu oligosaccharide chủ yếu là malto-oligomer và fructan mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của polydextrose Do đó em tiến hành khảo sát ảnh hưởng của enzym cũng như ảnh hưởng của ly tâm tốc độ cao trong quy trình xử lý mẫu
3.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Thử nghiệm tiến hành tiêm mẫu dung dịch chuẩn polydextrose không qua bước xử lý với enzym và ly tâm vào hệ thống HPAEC-PAD nhằm khảo sát vai trò của enzym và ly tâm trong quy trình xử lý mẫu trình bày ở mục 2.2.1.1 Sắc ký đồ thu được ở Hình 3.2 phản ánh kết quả thí nghiệm này.
Nhận xét: Không xuất hiện tín hiệu của polydextrose tại thời gian lưu tương ứng
Có xuất hiện pic tạp chất tại khoảng thời gian lưu từ 1,3 – 2 phút
Hình 3.2 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose không xử lý enzym và không ly tâm Tiếp tục khảo sát quy trình phân tích chuẩn polydextrose ở cùng nồng độ 2000 mg/L với điều kiện không sử dụng enzym, có ly tâm ở 11000 rpm trong 5 phút và có sử dụng enzym nhưng không ly tâm tốc độ cao Sắc ký đồ được trình bày lần lượt trong hình 3.3 và 3.4
Nhận xét: Việc sử dụng enzym và ly tâm tốc độ cao ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả phân tích kể cả trong trường hợp phân tích chuẩn polydextrose tinh khiết Do đó quy trình xử lý enzym và ly tâm tốc độ cao là cần thiết cả trong xử lý mẫu cũng như xây dựng đường chuẩn
Tóm lại, ứng dụng của enzim và ly tâm tốc độ cao là những bước thiết yếu để xử lý mẫu Sử dụng enzim hỗ trợ phát hiện chất phân tích trong cả mẫu thử và chuẩn, còn ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ tạp chất mà không làm ảnh hưởng đến đỉnh của chất phân tích.
Hình 3.3 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose không sử dụng enzyme, có ly tâm tốc độ cao
Hình 3.4 Sắc ký đồ chuẩn polydextrose có xử lý enzyme, không ly tâm Điều kiện xử lý mẫu được lựa chọn:
Nghiền hoặc cắt nhỏ mẫu Bảo quản mẫu trong vật chứa kín để tránh thay đổi độ ẩm Cân từ 0,1 – 5 g mẫu thử chính xác đến 10mg, cho vào ống ly tâm 50 mL có nắp vặn Thêm khoảng 30 mL nước nóng (khoảng 80°C) và vặn chặt nắp Lắc xoáy trong
30 giây để phân tán mẫu Cho lọ vào bể rung siêu âm ở 80°C trong 10 phút để hòa tan polydextrose Lấy lọ ra khỏi bể rung siêu âm , để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm ở
6000 rpm trong 5 phút Hút 0,2 mL dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu thử đã ly tâm vào ống ống eppendorf 1,7 mL Tiếp tục hút 0,8 mL hỗn hợp đệm enzym (amyloglucosidase + isomylase + fructanase) Đóng nắp cẩn thận Thủy phân enzym trong bếp cách thủy ở 50°C trong 1 giờ Làm lạnh trong bể nước đá hoặc tủ đá cho đến khi enzym kết tủa
(khoảng 5 phút trong đá lạnh) Ly tâm ở 11000 rpm trong 5 phút Thu dịch trong phía trên vào vial, phân tích trên thiết bị HPAEC-PAD
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Từ các nghiên cứu đã công bố, nghiên cứu này đã lựa chọn một số đều kiện cố định như sau:
- Cột sắc ký: Dionex™ CarboPac™ PA1 (250mm x 4 mm) và tiền cột (50mm x 4 mm)
- Detector: PAD (điện cực Au/AgCl)
- Thể tớch tiờm: 10 àL, tốc độ dũng: 1,2 mL/phỳt
Do cấu trúc cồng kềnh, polydextrose không thể rửa giải ra ngoài bằng NaOH thông thường Thay vào đó, natri acetat - chất tẩy rửa mạnh cho cột CarboPac PA1 - được dùng để kéo polydextrose khỏi cột Vì nồng độ natri acetat sử dụng rất cao (0,5M), nên nghiên cứu này khảo sát lại nồng độ muối acetat của pha động hệ B ở nhiều mức (0,1M; 0,25M; 0,5M; 0,75M) với chương trình gradient pha động thể hiện trong hình 3.5.
Pha động gồm 2 kênh: Kênh A: NaOH 150mM
Kênh B: NaOH 150mM + natri acetat
Khảo sát nồng độ muối natri acetat
Tiến hành phân tích tại 4 nồng độ khác nhau với điều kiện pha tĩnh, tốc độ dòng, thể tích tiêm và chương trình gredient pha động được nêu ở trên thì sắc ký đồ thu được thể hiện ở hình 3.6
Hình 3.5 Chương trình pha động
Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát nồng độ muối acetat trong pha động
Nhận xét: Tại nồng độ của natri acetat là 0,1M và 0,25M đều không thấy tín hiệu của pic polydextrose trong khoảng thời gian chạy mẫu là 25 phút, điều này chứng tỏ nồng độ thấp không kéo được polydextrose ra khỏi cột phân tích Bắt đầu từ nồng độ 0,5M và 0,75M mới xuất hiện tín hiệu của polydextrose, nhưng natri acetat 0,5M xuất hiện tín hiệu ở 13 phút, còn ở nồng độ 0,75M xuất hiện tín hiệu ở 10 phút Có thể giải thích điều này do khi tăng nồng độ muối acetat càng cao pic polydextrose xuất hiện sớm hơn Những để tiết kiệm hóa chất cũng như bảo vệ cột, nồng độ muối acetat 0,5M được lựa chọn cho nghiên cứu Điều kiện sắc ký đã lựa chọn:
- Cột sắc ký: Dionex™ CarboPac™ PA1 (250 mm x 4 mm) và tiền cột (50 mm x
- Detector: PAD (điện cực Au/AgCl)
- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
- Thời gian phân tích: 25 phút
- Pha động: Kênh A là NaOH 150mM và kênh B là NaOH 150mM + natri acetat 0,5M với chương trình gradient
25 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành so sánh phổ của phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn được trình bày trong hình 3.7
Hình 3.7 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu
Nhận xét: Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, pic của chất chuẩn được nhận diện rõ ràng, hình dạng cân đối và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác
Trên sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu chất phân tích, trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn có tín hiệu của chất phân tích tại cùng vị trí thời gian lưu
Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu theo AOAC
3.2.2 Độ thích hợp hệ thống