trần vũ đức xây dựng phương pháp xác định tồn dư nsaids trong mẫu thịt bằng lc msms

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VŨ ĐỨC

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỒN DƯ NSAIDS TRONG MẪU THỊT

BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN VŨ ĐỨC Mã sinh viên: 1901118

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỒN DƯ NSAIDS TRONG MẪU THỊT

BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: 1 ThS Nguyễn Thị Thùy Linh 2 CN Phùng Công Lý

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

2 Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh

thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, cho phép em được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

ThS Nguyễn Thị Thùy Linh và CN Phùng Công Lý, những người đã trực tiếp

hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc cũng như các cán bộ

đang công tác tại khoa Độc học Dị nguyên - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu tại khoa

Em cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo tại bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, cũng như thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho em được hoàn thành khóa luận và cả trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Trong quá trình thực hiện đề tài, dù đã rất nỗ lực nhưng đề tài vẫn còn những thiếu sót và hạn chế, em rất mong sẽ nhận được những ý kiến đóng góp cho khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Trần Vũ Đức

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu 2

1.1.1 Giới thiệu chung 2

1.1.2 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs 3

1.1.3 Quy định hiện hành về giới hạn hàm lượng NSAIDs trong thực phẩm 4

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân tích 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.2.1 Thiết bị 12

2.2.2 Dụng cụ 12

2.3 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn 12

2.3.1 Dung môi, hóa chất 12

2.3.2 Chất chuẩn 13

2.4 Nội dung nghiên cứu 14

2.4.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 14

2.4.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 14

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 15

2.4.4 Áp dụng phương pháp để phân tích các mẫu thực tế 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 18

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích LC-MS/MS 18

3.1.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu 24

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 29

3.2.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 29

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 32

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 35

3.4.2 Ứng dụng phân tích mẫu trong thực tế 41

3.4.3 Quản lý việc sử dụng NSAIDs trong chăn nuôi 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AOAC Association of Official Analytical

ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử

GC-MS Gas chromatography mass

spectrometry

Sắc ký khí ghép nối khối phổ

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IP Identification point Điểm nhận dạng

LC-MS/MS Liquid chromatography - tandem

mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

MRLs Maximum residue limits Giới hạn tối đa dư lượng NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đố

UHPLC Ultra high performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các mức MRLs của DIC, FLU, MEL, TOL do EU quy định 5

Bảng 1.2 Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định nhóm NSAIDs trong thịt 5

Bảng 3.1 Điều kiện MS/MS sử dụng trong phân tích các chất nhóm NSAIDs 18

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS 19

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sử dụng enzym để xử lý mẫu 26

Bảng 3.4 Số điểm IP của bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs 31

Bảng 3.5 Bảng tỷ lệ cường độ giữa hai ion con của bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs 32Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của 4 chất thuộc nhóm NSAIDs 34

Bảng 3.7 Đường chuẩn, hệ số tương quan của các chất cần phân tích trên nền mẫu 34Bảng 3.8 Độ lặp lại và thu hồi của 4 chất phân tích trên nền mẫu thịt 35

Bảng 3.9 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích diclofenac 37

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích flunixin 38

Bảng 3.11 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích meloxicam 38

Bảng 3.12 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích tolfenamic acid 38

Bảng 3.13 Kết quả thời gian lưu 39

Bảng 3.14 Kết quả diện tích pic 39

Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm lượng 4 chất DIC, MEL, FLU, TOL trong 15 mẫu thịt 40

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs 4

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 9

Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ 9

Hình 3.1 Sắc ký đồ của diclofenac 100 ng/mL trong các dung môi pha động 20

Hình 3.2 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các dung môi pha động 20

Hình 3.3 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các dung môi pha động 21

Hình 3.4 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các dung môi pha động 21

Hình 3.5 Sắc ký đồ của diclofenac 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau 22

Hình 3.6 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau 23

Hình 3.7 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau 23

Hình 3.8 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau 24

Hình 3.9 Quy trình xử lý mẫu dự kiến 25

Hình 3.10 Kết quả khảo sát pH của dung dịch đệm 27

Hình 3.11 Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ mẫu 27

Hình 3.12 Kết quả khảo sát muối chiết 28

Hình 3.13 Kết quả khảo sát muối làm sạch 29

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của diclofenac 30

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của meloxicam 30

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của flunixin 31

Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của tolfenamic acid 31Hình 3.18 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn NSAIDs tại giới hạn định lượng (LOQ) (1) DIC, (2) FLU, (3) MEL, (4) TOL 33

Hình 3.19 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn NSAIDs tại giới hạn phát hiện (LOD) (1) DIC, (2) FLU, (3) MEL, (4) TOL 33

Hình 3.20 Đường chuẩn của các chất cần phân tích trên nền mẫu 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc giảm đau, chống viêm không steroid (NSAIDs) là nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi cho người cũng như trong thú y Chúng có tác dụng giảm đau, chống viêm và hạ sốt [16] Do có hiệu quả tốt trong chăn nuôi nên nhóm thuốc này thường hay bị lạm dụng và sử dụng bừa bãi từ đó có thể gây ra dư lượng thuốc ở trong thực phẩm Đây là một vấn đề vô cùng quan trọng về an toàn thực phẩm nếu những thực phẩm chứa dư lượng thuốc đi vào chuỗi thức ăn

Nồng độ dư lượng thuốc đo được trong thực phẩm có thể làm tăng mức độ phơi nhiễm của con người trong phạm vi microgam mỗi ngày, thấp hơn ít nhất ba đến bốn bậc so với mức cần thiết để tạo ra tác dụng dược lý Do đó, rủi ro phát sinh từ phơi nhiễm cấp tính có thể được coi là khó xảy ra Tuy nhiên, chúng thường có khả năng phân hủy sinh học thấp, có thể tích lũy đạt tới lượng có thể phát hiện được và gây ra độc tính với cơ thể người như: tổn thương hệ thống tiêu hóa, tổn thương thận, độc tính với gan…

Vì lý do này, việc giám sát dư lượng các thuốc nhóm NSAIDs trong thực phẩm có nguồn gốc động vật là một nhiệm vụ quan trọng Năm 2010, Liên minh châu Âu (EU) đã quy định mức giới hạn tối đa (MRLs) trong thực phẩm của một số thuốc nhóm NSAIDs Các quốc gia phát triển khác như Nhật, Mỹ, Trung Quốc cũng đã đưa nhóm thuốc NSAIDs vào chương trình giám sát dư lượng trong thực phẩm [11]

Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm NSAIDs trong trong thịt lợn, thịt bò, sữa và thực phẩm bảo vệ sức khỏe như sắc ký khí khối phổ GC-MS [8], quang phổ tử ngoại tỷ đối [3] và sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS [13], [14], [17], [19] Các nghiên cứu đã công bố chủ yếu sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS do có thể phân tích đồng thời được nhiều chất với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian phân tích ngắn Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định về mức giới hạn tối đa của nhóm NSAIDs trong thực phẩm [1] cũng như chưa có phương pháp phân tích đồng thời các chất này Do đó, đề tài “Xây dựng phương pháp xác định tồn dư NSAIDs trong mẫu thịt bằng LC-MS/MS” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs (diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid) trong thịt động vật sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng một số thuốc nhóm NSAIDs trong thịt động vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Giới thiệu chung

Nhóm NSAIDs được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học Trong đó các NSAIDs phổ biến là dẫn xuất chính của acid salicylic, acid acetic, acid enolic, acid anthranilic hoặc acid propionic [18] Một số NSAIDs điển hình thường sử dụng cho động vật chăn nuôi bao gồm: diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid…

1.1.1.1 Diclofenac

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2 (M = 296,2) [24] - Tên khoa học: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid [24] - Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (283oC- 285oC) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,5 cho nên diclofenac rất ít tan trong nước, dễ tan trong methanol [24]

- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,0) [24] Dạng dược dụng thường được sử dụng là diclofenac natri

1.1.1.2 Flunixin

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C14H11F3N2O2 (M = 296,2) [22] - Tên khoa học: 2-[2-methyl-3-(trifluoromethyl)anilino]pyridin-3-carboxylic acid [22]

- Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (226oC - 228oC) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,1 cho nên flunixin rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [22]

- Tính chất hóa học: Tính acid yếu Dạng dược dụng thường được sử dụng là dạng muối kết hợp với meglumin

1.1.1.3 Meloxicam

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C14H13N3O4S2 (M = 351,4) [21] - Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid [21]

- Tính chất vật lý: Bột màu vàng nhạt, đa hình, nhiệt độ nóng chảy xác định (254oC - 256oC) [21] Thực tế không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, rất khó tan trong ethanol 96% [2]

- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,1) [21]

1.1.1.4 Tolfenamic acid

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C14H12ClNO2 (M = 261,7) [20] - Tên khoa học: 2-[(3-chloro-2-methylphenyl)amino]benzoic acid [20] - Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh, nhiệt độ nóng chảy xác định (207oC - 207,5oC) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 5,2 cho nên tolfenamic acid rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [20]

- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 5,1) [20]

1.1.2 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs

Các thuốc NSAIDs phổ biến với nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm: nhiễm độc đường tiêu hóa, nguy cơ tim mạch, tổn thương chức năng gan, thận và các rối loạn nhỏ khác [7] Một sơ đồ tóm tắt các độc tính của nhóm NSAIDs trên cơ thể

con người được trình bày ở Hình 1.1

Hình 1.1 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs1.1.2.1 Tác động lên hệ tiêu hóa

Gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu, ợ nóng, buồn nôn Khi phơi nhiễm NSAIDs kéo dài và đặc biệt ở liều cao, con người có thể bị viêm loét và xuất huyết dạ dày Những người có sẵn bệnh viêm đường tiêu hóa hoặc người lớn trên 65 tuổi là các đối tượng có nguy cơ cao gặp phải độc tính này [23]

1.1.2.2 Tác động lên hệ tim mạch

Làm tăng huyết áp và gây bất lợi cho việc kiểm soát huyết áp bằng thuốc Các NSAIDs cũng làm tăng nguy cơ xuất hiện cơn đau tim ở người có bệnh tim mạch (bệnh động mạch vành) hoặc có nguy cơ cao mắc bệnh tim mạch [23]

1.1.2.3 Tác động lên chức năng gan - thận

NSAIDs gây hại đến thận đặc biệt ở những người đã có bệnh nền ở thận Độc tính trên gan của NSAIDs cũng cần phải lưu ý khi phơi nhiễm ở liều cao hoặc trong thời gian dài [23]

1.1.2.4 Tác động lên hệ hô hấp

Các NSAIDs gây kích ứng làm tăng nặng bệnh hen suyễn và gây ra các phản ứng dị ứng [23]

1.1.3 Quy định hiện hành về giới hạn hàm lượng NSAIDs trong thực phẩm

Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc

NSAIDs trong thực phẩm Ngày 14/08/2013, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Thông tư số

24/2013/TT-BYT ngày 14 tháng 8 năm 2013 quy định mức giới hạn tối đa dư lượng

thuốc thú y trong thực phẩm nhưng chưa có nhóm thuốc NSAIDs trong danh mục [1]

Trên thế giới, Ủy ban châu Âu đã có quy định về giới hạn tồn dư các thuốc trong thực phẩm (MRLs) trong đó có các thuốc thuộc nhóm NSAIDs [10]

Bảng 1.1 Các mức MRLs của DIC, FLU, MEL, TOL do EU quy định

Lợn

5 µg/kg 5 µg/kg

Thịt Thịt

Flunixin (FLU)

Bò Lợn Ngựa

20 µg/kg 50 µg/kg 10 µg/kg

Thịt Thịt Thịt

Meloxicam (MEL) Trâu, bò, lợn, thỏ,

Tolfenamic acid

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

Do chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc NSAIDs trong thực phẩm [1] nên hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam xây dựng phương pháp xác định nhóm NSAIDs trong thịt Dưới đây là một số nghiên cứu trên thế giới đã xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng các thuốc thuộc nhóm NSAIDs trong thịt bằng nhiều phương pháp khác nhau

Bảng 1.2 Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định nhóm NSAIDs trong thịt

STT

Đối tượng phân tích và

Tài liệu tham khảo

1 21 thuốc nhóm NSAIDs trong thịt và sữa động vật

Thủy phân bằng enzym: (đệm acetat pH 4,5; enzym β-glucosidase; nhiệt độ 37oC)

Chiết xuất bằng acetonitril; làm sạch bằng bột hấp phụ C18

Dịch chiết được bay hơi và hoàn nguyên trong DMSO

LC-MS/MS Pha tĩnh: Cột Luna C8 được kết nối với tiền cột Phenomenex C8 (2,0 × 4 mm, USA)

Pha động: methanol/acetonotr-il (kênh A) và amoni format 0,01 M, pH 5,0 (kênh B)

Khoảng tuyến tính: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 MRL CCα: 5,56 - 57,1 µg/kg CCβ: 4,48 - 790 µg/kg Độ thu hồi: từ 85 -

[17]

109%

2 Dư lượng metamizol và các dạng chuyển hóa của

metamizol trong thịt bò

Chiết xuất bằng acetonitril và đệm acetat 0,33 M (pH 5,0)

Chiết SPE bằng cột SepPak Alumina N Sau đó phần nổi được trộn với pha động và được phân tích bằng LC-MS/MS

LC-MS/MS Pha tĩnh: Cột C8 (3 µm, 2,1 × 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) kết nối với tiền cột Luna C8 (2,0 × 4 mm) Pha động: methanol:acetonitri-l (8:2) (kênh A) và amoni format 0,01 M, pH 5,0 (kênh B)

Khoảng tuyến tính: không công bố CCα: 12,6 - 113 µg/kg CCβ: 15,8 - 139 µg/kg Độ thu hồi: từ 45 - 95%

[13]

3 16 thuốc thuộc nhóm NSAIDs, bốn chất chuyển hóa metamizol và năm loại corticosteroi-d) trong thịt động vật

Thủy phân bằng enzym: sử dụng đệm acetat; enzym β-glucosidase; nhiệt độ 37oC

Chiết xuất bằng dung môi acetonitril Dịch chiết sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ -20oC Dịch chiết được tập trung, bay hơi và hoàn nguyên trong dung môi pha động

LC-MS/MS Pha tĩnh: Cột Luna C18 (3 μm, 4,6 ×150 mm, USA) gắn với tiền cột Phenomenex C18 (2,0 × 4 mm, USA) Pha động:

methanol:acetonitri-l (8:2, chứa 0,1% acid formic - kênh A) và amoni format 0,01 M, pH 5,0 (kênh B)

Khoảng tuyến tính: LOQ - 20 LOQ LOQ: 0,18 - 125 µg/kg Độ thu hồi: 36,1 - 124%

[14]

4 Dư lượng của 30 thuốc chống viêm không steroid trong thịt lợn

Chiết xuất bằng hỗn hợp acetonitril và acid phosphoric Dịch chiết được làm khô bởi khí N2 Hoàn nguyên trong hỗn hợp methanol

UHPLC-MS/MS Pha tĩnh: Cột AcquityTM UPLC BEH C18 (50 µm × 2,1 mm, 1,7 µm) Pha động:

acetonitril (kênh A)

Khoảng tuyến tính: LOQ - 100 LOQ LOD: 0,4 - 2 µg/kg LOQ: 1 - 5

[11]

và acid phosphoric Tiếp theo, chiết SPE sử dụng cột HLB, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi amoni hydroxit:axetonitril:metyl tert-butyl ete (5:95:1) và bay hơi đến khô

Hoàn nguyên trong hỗn hợp acetonitril và acid formic 0,1%, lọc qua màng và chuyển vào vial

và dung dịch acid formic 0,1% chứa 0,5 mmol/L amoni acetat (kênh B)

µg/kg Độ thu hồi: 61,7 - 122,7%

5 Acid acetylsalicyl-ic, flunixin, phenylbutaz-on, acid tolfenamic, meloxicam và

ketoprofen trong thịt bò

Chiết bằng acetonitril, sau đó dịch chiết được làm bay hơi đến khô Chiết SPE qua cột Oasis HLB và rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol và acid acetic trong n-hexan (10%) Dịch rửa giải được làm bay hơi đến khô Hoàn nguyên trong hỗn hợp dung môi pha động và được chuyển vào vial

LC-MS/MS Pha tĩnh: cột Alltima HP C18 (5 µm, 150 x 2,1 mm, Alltech, Deerfield, IL, Hoa Kỳ) Pha động: methanol (kênh A) và nước với 0,1% acid acetic (kênh B)

Khoảng tuyến tính: không công bố CCα: 20,58 - 29,10 µg/kg CCβ: 21,15 - 68,20 µg/kg Độ thu hồi: không công bố

[19]

6 10 thuốc thuộc nhóm NSAIDs trong thịt động vật

Thủy phân bằng enzym: đệm acetat (pH 4,5); enzym β-glucosidase; nhiệt độ 37oC

Chiết xuất hai lần

LC-MS/MS Pha tĩnh: Cột Inertsil ODS-3 (3 µm, 2,1 x 150 mm, GL Science, Nhật Bản) được kết nối

Khoảng tuyến tính: không công bố LOQ: không

[15]

bằng acetonitril Tiếp theo, chiết SPE bằng cột Sep Pak Alumina N và làm bay hơi trong thiết bị cô quay

Chiết SPE sử dụng cột C18 để tinh chế sau đó bay hơi đến khô

Hoàn nguyên trong pha động và chuyển vào vial

với tiền cột Luna C18 (2,0 x 4 mm, Phenomenex, Hoa Kỳ)

Pha động: acetonitril (kênh A) và acid formic 0,1% (kênh B)

công bố Độ thu hồi: 36 - 192%

Nhận xét: Điểm chung của các phương pháp là đều gồm các bước: Chiết xuất - Chiết SPE - Làm khô - Hoàn nguyên Dung môi chiết xuất được sử dụng là acetonitril do khả năng hòa tan tốt các chất phân tích có trong mẫu Tiếp theo dịch chiết sẽ được cho đi qua các cột thích hợp và rửa giải bằng dung môi hoặc sẽ được cô đến cắn và được hoàn nguyên trong dung môi thích hợp để làm giàu, tinh chế chất phân tích Phương pháp phân tích được sử dụng trong các nghiên cứu trên là LC-MS/MS và UHPLC-MS/MS đều là các phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian phân tích ngắn phù hợp với nồng độ của chất cần phân tích

Điểm khác nhau: Một số phương pháp có thêm bước thủy phân với enzym trước khi chiết xuất Enzym được sử dụng là β-glucuronidase trong môi trường đệm acetat và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ

1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu này là LC-MS/MS (Liquid chromatography - mass spectrometry and tandem mass spectrometry) hoạt động trên nguyên tắc tách phân lập các chất trong hỗn hợp nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS) Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện (LOD) nhỏ có thể lên tới 10-14g Hiện nay khối phổ là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ như xác định công thức cấu tạo, xác định đồng vị, định tính, định lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

1.2.2.1 Bộ phận sắc ký lỏng

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 1.2.2.2 Bộ phận khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện (detector) Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện, sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ

1 Nguồn ion Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI) Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất

a) Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI) Kỹ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau: - Tạo thành các giọt mang điện tích

- Làm giảm kích thước của các hạt và phân nhỏ các hạt - Quá trình hình thành pha hơi các ion

Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào ống mao quản bằng kim loại Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4 - 6 kV) Khi điện tích dư trên đầu mao quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích Tiếp đó các giọt mang điện này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên tục xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N2 được liên tục thổi vào và sự bắn phá của các giọt tích điện cùng dấu Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của các ion Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa sổ rất nhỏ Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas)

b) Chế độ ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (APCI) Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500oC Một điện thế cao từ 3 - 5kV tạo ra các electron và ion hóa chất phân tích

2 Bộ phận phân tích khối Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có nhiều bộ phận phân tích khối khác nhau như: bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay…

- Bộ phân tích tứ cực và bộ phân tích tứ cực chập ba: Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện

- Bộ phân tích khối bẫy ion: Các ion từ nguồn được đưa đến bộ phận bẫy, có cấu tạo gồm 4 điện cực có các bề mặt hình hypebol ở bên trong Các ion có m/z xác định được lựa chọn để đưa đến bộ phận phát hiện nhờ việc áp các điện thế khác nhau Các ion này cũng có thể được lựa chọn và giữ lại trong bẫy, sau đó tiếp tục được bắn phá để tạo thành các ion con, sau đó các ion lại được lựa chọn tiếp Do đó, về mặt nguyên tắc MS bẫy ion có thực hiện được MS nhiều lần nên sẽ tăng khả năng định tính

- Bộ phân tích khối thời gian bay: Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Các ion có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian các ion đi tới detector sẽ khác nhau Do có năng lượng động học hay vận tốc, các ion này sẽ bay với khoảng cách là d trong một khoảng thời gian t, trong đó t phụ thuộc vào tỉ số m/z Hiện nay, thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron giúp kéo dài quãng đường các ion đi tới detector và do đó làm tăng độ phân giải của thiết bị và tăng cường khả năng định tính với các chất chưa biết

3 Bộ phận phát hiện Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành các tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu là bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs thường dùng cho động vật chăn nuôi bao gồm: diclofenac, meloxicam, flunixin, tolfenamic acid Đối tượng phân tích là các mẫu thịt động vật được mua ngẫu nhiên tại các chợ, cửa hàng ở Hà Nội

- Bộ lọc dung môi sắc ký - Hệ thống thổi khô nitơ

2.2.2 Dụng cụ

- Micropipet 10 - 100, 20 - 200, 100 - 1000, 500 - 5000 µL - Bình định mức các loại: 5, 10, 20 và 25 mL

- Ống ly tâm nhựa 50 mL có nắp kín - Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín - Pipet pasteur

- Màng lọc mẫu 0,45 µm - 0,2 µm

2.3 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn

2.3.1 Dung môi, hóa chất

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích: - Dung môi, hóa chất tinh khiết (Merck): methanol, acetonitril, acid formic, acid acetic, amoni acetat, β-glucosidase, natri clorid khan, magie sulfat khan, natri acetat khan

- Dung môi, hóa chất tinh khiết (Agilent): bột hấp phụ C18, bột hấp phụ PSA, carbon hoạt tính

- Nước deion

- Dung dịch acid formic 1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi

- Dung dịch đệm acetat pH 3,0: Hòa tan 4 g natri acetat khan (TT) trong khoảng 840 mL nước, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid acetic băng (TT) (dùng khoảng 155 mL), thêm nước vừa đủ 1000 mL

- Dung dịch đệm acetat pH 4,0: Hòa tan 10 g natri acetat khan (TT) trong 300 mL nước, điều chỉnh tới pH 4,0 bằng acid acetic băng (TT) và thêm nước vừa đủ 1000 mL Nếu cần thiết, điều chỉnh lại tới pH 4,0 bằng acid acetic băng (TT) hoặc bằng natri acetat khan (TT) trước khi dùng

- Dung dịch đệm acetat pH 4,5: Hòa tan 77,1 g amoni acetat (TT) trong nước, thêm 70 mL acid acetic băng (TT), thêm nước vừa đủ 1000 mL

- Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hòa tan 13,6 g natri acetat (TT) và 6 mL acid acetic băng (TT) trong nước và thêm nước vừa đủ 1000 mL

- Dung dịch đệm acetat pH 6,0: Hòa tan 4,1 g natri acetat khan (TT) trong 1000 mL nước, điều chỉnh pH đến 6,0 bằng acid acetic băng (TT)

2.3.2 Chất chuẩn

2.3.2.1 Chất chuẩn

Các chất chuẩn nhóm NSAIDs, có độ tinh khiết cao (từ hãng Dr Ehrenstorfer): diclofenac (99,34%, số lô: G1343992), flunixin (97,22%, số lô: G1089114), meloxicam (99,22%, số lô: G1436236) và tolfenamic acid (99,76%, số lô: G163395)

2.3.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn đơn diclofenac, flunixin, meloxicam và tolfenamic acid 500 µg/mL: Cân chính xác 0,0100 g các chất chuẩn nhóm NSAIDs trên cân phân tích bằng bình định mức 20 mL, hòa tan và định mức đến 20 mL bằng methanol, thu được dung dịch chuẩn gốc 500 µg/mL Dung dịch được bảo quản nhiệt độ từ 2 - 8oC, dung dịch bền trong 6 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: Dùng micropipet lấy chính xác khoảng 100 µL mỗi dung dịch chuẩn đơn 500 µg/mL cho vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8oC, dung dịch bền trong 3 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: Dùng micropipet lấy chính xác khoảng 1000 µL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL cho vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8oC, dung dịch bền trong 3 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 0,1 µg/mL: Dùng micropipet lấy chính xác khoảng 100 µL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL cho vào bình định

mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8oC, dung dịch bền trong 3 tháng

Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian bằng methanol để thu được các dung dịch có nồng độ như sau: 0,02; 0,04; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 µg/mL

Bảng 2.1 Pha các dung dịch chuẩn làm việc

Nồng độ chuẩn (µg/mL)

Chuẩn trung gian sử dụng

(µg/mL)

Thể tích chuẩn trung gian sử

dụng (µL)

Thể tích methanol sử

dụng (µL)

Thể tích định mức (mL)

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS

2.4.1.1 Điều kiện khối phổ

Để khảo sát điều kiện khối phổ, tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 50 ng/mL vào khối phổ và tối ưu hóa tự động để lựa chọn ion mẹ, ion con và năng lượng va chạm

2.4.1.2 Điều kiện sắc ký

- Lựa chọn cột sắc ký - Khảo sát và lựa chọn thành phần, chương trình gradient pha động

2.4.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Trên cơ sở tham khảo tài liệu tham khảo và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu với các điều kiện sau: có sử dụng enzym hay không, pH của dung dịch đệm, nhiệt độ ủ, muối chiết và muối làm sạch Sử

dụng mẫu thịt động vật đã được xác định là dương tính với diclofenac và meloxicam

để thực hiện các bước khảo sát, cụ thể như sau:

2.4.2.1 Khảo sát vai trò của enzym

Thay đổi sự có mặt của enzym: có enzym và không có enzym

2.4.2.2 Khảo sát pH của dung dịch đệm

Thay đổi giá trị pH của dung dịch đệm lần lượt là 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0

2.4.2.3 Khảo sát nhiệt độ ủ mẫu

Thay đổi nhiệt độ ủ mẫu lần lượt là nhiệt độ phòng (21oC); 37oC; 40oC; 50oC; 60oC; 80oC

2.4.2.4 Khảo sát muối chiết

Thay đổi muối chiết mẫu lần lượt là không sử dụng; MgSO4; NaCl; hỗn hợp MgSO4 và NaCl

2.4.2.5 Khảo sát muối làm sạch

Thay đổi muối làm sạch lần lượt là không sử dụng; hỗn hợp NaCl và CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và NaCl; hỗn hợp bột C18, NaCl và CH3COONa

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu/chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi, độ phù hợp hệ thống Các kết quả được đánh giá, so sánh với các quy định theo AOAC 2016 [6] và theo tài liệu hướng dẫn chuyên khảo [4]

Tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh tín hiệu của chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5%

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC/808/2021 của Châu Âu [9] Trong đó đối với kỹ thuật LC-MS/MS được tính là 1 điểm, 1 ion mẹ được tính là 1 điểm, 2 ion con thì mỗi ion được tính là 1,5 điểm

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) Trong đó: S là tín hiệu của chất phân tích

N là tín hiệu nhiễu của đường nền LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N= 10

LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 - 3 lần nhiễu đường nền và có thể được tính từ LOQ thông qua công thức:

LOD= 𝐿𝑂𝑄3,3

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ mà tại đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Xác định bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

Tiến hành thực hiện phân tích lặp lại 6 lần mẫu trắng thêm chuẩn

Độ thu hồi (độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

R (%) = 𝐶𝑡𝑡

𝐶𝑐 × 100%

Trong đó: R (%): độ thu hồi

Ctt: nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL) Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

2.4.3.5 Độ phù hợp hệ thống

Đánh giá sự phù hợp hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng Cần đánh giá hàng ngày tùy thuộc vào độ ổn định của hệ thống hoặc số lượng mẫu phân tích

Phép thử đánh giá phù hợp hệ thống của phương pháp sắc ký được quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) như sau:

- Độ chụm của thời gian lưu, diện tích pic sắc ký: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Số lần bơm tối thiểu 5 lần phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm

- Độ phân giải giữa hai chất - Hệ số kéo đuôi

- Các thông số khác nhau: độ trôi đường nền, nhiễu đường nền (khi giới hạn phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phương pháp)

2.4.4 Áp dụng phương pháp để phân tích các mẫu thực tế

Các mẫu thực tế được mua ngẫu nhiên tại các chợ và cửa hàng tại Hà Nội Xử lý mẫu thực tế theo quy trình đã xây dựng Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2016 và phần mềm thiết bị

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích LC-MS/MS

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ

a) Lựa chọn ion mẹ và ion con

Lựa chọn kỹ thuật ion hóa ESI để xác định các ion mẹ và ion con của từng thuốc thuộc nhóm NSAIDs Thế đầu vào, năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu tự

động theo thiết bị Các kết quả được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Điều kiện MS/MS sử dụng trong phân tích các chất nhóm NSAIDs

Tên chất Công thức cấu tạo Ion mẹ Ion con CE

(eV)

Số điểm

IP

215,0* 31

5 250,0 19

264,0* 47

5 210,0 45

115,0* 53

5 141,0 23

Tolfenamic

244,0* 27

5 209,0 37

Ghi chú: * Ion định lượng

b) Tối ưu hóa các điều kiện MS

Sau khi xác định được các ion mẹ và các ion con, tiến hành tối ưu các điều kiện của nguồn ion hóa với sự có mặt của hệ dung môi sắc ký Lựa chọn chế độ tự động để tối ưu các thông số: thế ion hóa (ISV), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1

(GS1), áp suất khí nguồn 2 (GS2), áp suất khí màng (CUR), áp suất khí (CAD) Kết

quả tối ưu điều kiện MS được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS

STT Thông số Giá trị tối ưu

2 Nhiệt độ nguồn ion (TEM) 650oC 3 Áp suất khí nguồn 1 (GS1) 50 psi 4 Áp suất khí nguồn 2 (GS2) 55 psi

3.1.1.2 Điều kiện sắc ký

a) Khảo sát và lựa chọn chương trình pha động

Sau khi lựa chọn được ion mẹ, ion con và các điều kiện tối ưu của khối phổ, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp của 4 chất diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid có nồng độ 100 ng/mL

Trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu [13], [14], [17], [19] và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm một số điều kiện sắc ký được cố định như sau:

Sử dụng cột Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 µm), tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL, với chương trình gradient dung môi pha động như sau:

Hình 3.1 Sắc ký đồ của diclofenac 100 ng/mL trong các dung môi pha động

Hình 3.2 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các dung môi pha động

Hình 3.3 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các dung môi pha động

Hình 3.4 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các dung môi pha động

Pic của cả 4 chất thu được khi sử dụng hệ pha động (1) và (3) gần tương tự nhau, cân đối, nhọn và không có hiện tượng dính pic, trong khi đó hệ (2) cho pic sắc ký tù, thời gian lưu của chất phân tích dài hơn so với hệ (1) và (3) Ở một số sắc ký đồ sử dụng hệ pha động (2) không xuất hiện pic của chất phân tích do hệ pha động (2) kéo dài thời gian lưu của chất phân tích dài hơn chương trình sắc ký đã được thiết lập Do đó, pha động acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B) được chọn

b) Khảo sát cột sắc ký

Sau khi lựa chọn được pha động là acid formic 0,1% trong nước và acetonitril, sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp của 4 chất diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid có nồng độ 100 ng/mL để tiến hành khảo sát cột sắc ký bao gồm (A) Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 µm), (B) Xbridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm x 2,5 µm) và (C) Symmetry C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm) Kết quả được thể

Hình 3.6 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau

Hình 3.7 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau

(A)

(B)

(C) (A)

(B)

(C)

Hình 3.8 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau

Từ các sắc ký đồ của 4 chất, tín hiệu sắc ký thu được khi phân tích bằng cột sắc ký (B) không cân xứng và bị tù, cột sắc ký (C) có hiện tượng chẻ pic, trong khi đó cột sắc ký (A) cho pic cân đối, nhọn và không dính pic Đối với sắc ký đồ của tolfenamic acid khi sử dụng cột sắc ký (B) không thấy xuất hiện pic là do sử dụng cột sắc ký (B) khiến cho thời gian lưu của chất phân tích dài hơn chương trình sắc ký đã thiết lập Do đó, lựa chọn cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 µm) cho các khảo sát tiếp theo

Như vậy, sau khi khảo sát pha động và cột sắc ký thì điều kiện sắc ký được lựa chọn là: cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 µm), pha động acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và methanol (kênh B)

3.1.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [17] và điều kiện thực tế trong phòng thí nghiệm,

quy trình xử lý mẫu dự kiến được đề xuất ở Hình 3.9, các điều kiện cần khảo sát gồm:

có sử dụng enzym hay không, pH của dung dịch đệm, nhiệt độ ủ, muối chiết và muối làm sạch để quy trình xử lý mẫu được tốt nhất Thực hiện khảo sát ở các điều kiện khác nhau, mỗi điều kiện thực hiện lặp lại 2 - 3 lần Kết quả của mỗi lần khảo sát sẽ được so sánh qua thông số là diện tích pic của chất cần phân tích Mẫu được sử dụng là mẫu dương tính với diclofenac và meloxicam Vì không có mẫu thực tại thời điểm nghiên cứu dương tính với flunixin và tolfenamic acid Mặt khác do tính chất vật lý,

(A)

(B)

(C)

hóa học và công thức cấu tạo của diclofenac với flunixin và tolfenamic acid là tương

tự nhau (phần 1.1.1 Giới thiệu chung) nên khảo sát diclofenac có thể đại diện cho

flunixin và tolfenamic acid

Hình 3.9 Quy trình xử lý mẫu dự kiến

Cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm 4mL đệm acetat pH 4,5 và 50 µL β-

glucosidase

Lắc xoáy kỹ trong 1 phút và ủ ở 37oC trong 60 phút

Thêm 10 mL acetonitril và lắc đều, siêu âm ở 40oC

Hòa cắn trong 1 mL methanol

Lọc dịch qua màng 0,22 µm rồi chuyển vào lọ phân

tích trên LC-MS/MS

3.1.2.1 Khảo sát vai trò của enzym

Thực hiện khảo sát việc sử dụng enzym β-glucuronidase để xử lý mẫu: có sử dụng enzym và không sử dụng enzym

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sử dụng enzym để xử lý mẫu

Diện tích pic meloxicam

Trung bình

Diện tích pic diclofenac

Trung bình Có sử dụng

enzym (lần 1) 2,97E+07

2,87E+07

2,77E+05

2,75E+05 Có sử dụng

Có sử dụng

Không sử dụng enzym

dụng enzym (lần 2)

Không sử dụng enzym

(lần 3)

Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi sử dụng enzym để thủy phân mẫu cho tín hiệu

cao hơn 12% so với khi không sử dụng enzym đối với meloxicam và cao hơn 55% đối với diclofenac Điều này có thể được giải thích là do các chất NSAIDs có một phần tồn tại trong cơ thể động vật ở dạng liên hợp glucuronid Sử dụng enzym β-glucuronidase sẽ phân tách các dạng liên hợp này, giải phóng NSAIDs về dạng đơn chất Trong nghiên cứu của Jedziniak, P và các cộng sự [12], hàm lượng flunixin trong các mẫu sữa khi phân tích bằng thủy phân với enzym β-glucuronidase cũng cao hơn khi thủy phân không sử dụng enzym (khoảng 54%) Do đó, sử dụng enzym để thủy phân mẫu được lựa chọn làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo

3.1.2.2 Khảo sát pH của dung dịch đệm

Thực hiện khảo sát ở các dung dịch đệm có pH khác nhau: 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0

Hình 3.10 Kết quả khảo sát pH của dung dịch đệm

Kết quả ở Hình 3.10 cho thấy, pH của dung dịch đệm là 4,5 cho tín hiệu cao

nhất Hoạt độ của enzym β-glucuronidase bị ảnh hưởng rất lớn bởi pH của dung dịch đệm, vì ở điều kiện pH thích hợp enzym mới có khả năng hoạt động tốt nhất, nếu không enzym sẽ bị bất hoạt Theo Amin, H A [5], enzym β-glucuronidase hoạt động tốt nhất ở pH từ 4 - 5,5, phù hợp với kết quả của nghiên cứu Vì vậy, dung dịch đệm có pH là 4,5 được sử dụng làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo

3.1.2.3 Khảo sát nhiệt độ ủ

Thực hiện khảo sát ở các mức nhiệt độ ủ khác nhau: nhiệt độ phòng (21oC); 37oC; 50oC; 60oC; 80oC

Hình 3.11 Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ mẫu

Tương tự như pH, nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ

của enzym Từ kết quả ở Hình 3.11, ở nhiệt độ 37°C cho tín hiệu chất phân tích lớn

nhất Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Amin, H A [5], enzym

Diện tích pic meloxicam (E+07)Diện tích pic diclofenac (E+05)

Diện tích pic meloxicam (E+06)Diện tích pic diclofenac (E+04)