TỔNG QUAN
Giới thiệu về đối tượng nghiên cứu
Các NSAIDs được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học, cụ thể bao gồm: dẫn xuất của acid salicylic, acid acetic, acid enolic, acid anthranilic và acid propionic Trong đó, diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid là những NSAIDs thông dụng được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi động vật.
- Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2 (M = 296,2) [24]
- Tên khoa học: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid [24]
- Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (283 o C- 285 o C) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,5 cho nên diclofenac rất ít tan trong nước, dễ tan trong methanol [24]
- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,0) [24] Dạng dược dụng thường được sử dụng là diclofenac natri
- Tên khoa học: 2-[2-methyl-3-(trifluoromethyl)anilino]pyridin-3-carboxylic acid [22]
- Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy xác định (226 o C - 228 o C) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 4,1 cho nên flunixin rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [22]
- Tính chất hóa học: Tính acid yếu Dạng dược dụng thường được sử dụng là dạng muối kết hợp với meglumin
- Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1,2- benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid [21]
- Tính chất vật lý: Bột màu vàng nhạt, đa hình, nhiệt độ nóng chảy xác định (254 o C - 256 o C) [21] Thực tế không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, rất khó tan trong ethanol 96% [2]
- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 4,1) [21]
- Công thức phân tử: C14H12ClNO2 (M = 261,7) [20]
- Tên khoa học: 2-[(3-chloro-2-methylphenyl)amino]benzoic acid [20]
- Tính chất vật lý: Chất rắn kết tinh, nhiệt độ nóng chảy xác định (207 o C - 207,5 o C) Logarit của hệ số phân bố của hợp chất giữa pha hữu cơ (octanol) và pha nước: LogP = 5,2 cho nên tolfenamic acid rất ít tan trong nước, dễ tan trong các dung môi kém phân cực [20]
- Tính chất hóa học: Tính acid yếu (pKa = 5,1) [20]
1.1.2 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs
Các thuốc NSAIDs phổ biến với nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm: nhiễm độc đường tiêu hóa, nguy cơ tim mạch, tổn thương chức năng gan, thận và các rối loạn nhỏ khác [7] Một sơ đồ tóm tắt các độc tính của nhóm NSAIDs trên cơ thể con người được trình bày ở Hình 1.1
Hình 1.1 Độc tính của các thuốc thuộc nhóm NSAIDs 1.1.2.1 Tác động lên hệ tiêu hóa
Gây ra các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như đầy hơi, khó tiêu, ợ nóng, buồn nôn Khi phơi nhiễm NSAIDs kéo dài và đặc biệt ở liều cao, con người có thể bị viêm loét và xuất huyết dạ dày Những người có sẵn bệnh viêm đường tiêu hóa hoặc người lớn trên 65 tuổi là các đối tượng có nguy cơ cao gặp phải độc tính này [23]
1.1.2.2 Tác động lên hệ tim mạch
Sử dụng thuốc NSAID làm tăng huyết áp và khiến việc kiểm soát huyết áp bằng thuốc trở nên khó khăn hơn Ngoài ra, NSAID còn gia tăng nguy cơ đau tim ở những người mắc bệnh tim mạch (bệnh động mạch vành) hoặc có nguy cơ cao bị bệnh tim mạch.
1.1.2.3 Tác động lên chức năng gan - thận
Thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs) có thể gây hại cho thận, đặc biệt là ở những người mắc bệnh thận Ngoài ra, độc tính trên gan do NSAIDs cũng đáng lưu ý khi sử dụng với liều cao hoặc trong thời gian dài.
1.1.2.4 Tác động lên hệ hô hấp
Các NSAIDs gây kích ứng làm tăng nặng bệnh hen suyễn và gây ra các phản ứng dị ứng [23]
1.1.3 Quy định hiện hành về giới hạn hàm lượng NSAIDs trong thực phẩm
Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc NSAIDs trong thực phẩm Ngày 14/08/2013, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Thông tư số
24/2013/TT-BYT ngày 14 tháng 8 năm 2013 quy định mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm nhưng chưa có nhóm thuốc NSAIDs trong danh mục [1]
Trên thế giới, Ủy ban châu Âu đã có quy định về giới hạn tồn dư các thuốc trong thực phẩm (MRLs) trong đó có các thuốc thuộc nhóm NSAIDs [10]
Bảng 1.1 Các mức MRLs của DIC, FLU, MEL, TOL do EU quy định
Chất phân tích Các loài động vật MRL Mẫu
Meloxicam (MEL) Trâu, bò, lợn, thỏ, ngựa 20 àg/kg Thịt
(TOL) Bũ, lợn 50 àg/kg Thịt
Tổng quan về phương pháp phân tích
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
Do chưa ban hành quy định giới hạn hàm lượng các thuốc NSAIDs trong thực phẩm [1] nên hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam xây dựng phương pháp xác định nhóm NSAIDs trong thịt Dưới đây là một số nghiên cứu trên thế giới đã xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng các thuốc thuộc nhóm NSAIDs trong thịt bằng nhiều phương pháp khác nhau
Bảng 1.2 Các nghiên cứu đã được thực hiện để xác định nhóm NSAIDs trong thịt
T Đối tượng phân tích và nền mẫu
Phương pháp xử lý mẫu
NSAIDs trong thịt và sữa động vật
Thủy phân bằng enzym: (đệm acetat pH 4,5; enzym β- glucosidase; nhiệt độ 37 o C)
Chiết xuất bằng acetonitril; làm sạch bằng bột hấp phụ C18
Dịch chiết được bay hơi và hoàn nguyên trong DMSO
Pha tĩnh: Cột Luna C8 được kết nối với tiền cột Phenomenex C8 (2,0 × 4 mm, USA)
Pha động: methanol/acetonotr -il (kênh A) và amoni format 0,01
- 790 àg/kg Độ thu hồi: từ 85 -
Dư lượng metamizol và các dạng chuyển hóa của metamizol trong thịt bò
Chiết xuất bằng acetonitril và đệm acetat 0,33 M (pH 5,0)
Chiết SPE bằng cột SepPak Alumina N
Sau đó phần nổi được trộn với pha động và được phân tích bằng LC- MS/MS
Pha tĩnh: Cột C8 (3 àm, 2,1 ì 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) kết nối với tiền cột Luna C8 (2,0 × 4 mm)
Pha động: methanol:acetonitri -l (8:2) (kênh A) và amoni format 0,01
Khoảng tuyến tính: không công bố
- 139 àg/kg Độ thu hồi: từ 45 - 95%
NSAIDs, bốn chất chuyển hóa metamizol và năm loại corticosteroi
Thủy phân bằng enzym: sử dụng đệm acetat; enzym β- glucosidase; nhiệt độ 37 o C
Chiết xuất bằng dung môi acetonitril
Dịch chiết sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ -20 o C
Dịch chiết được tập trung, bay hơi và hoàn nguyên trong dung môi pha động
Pha tĩnh: Cột Luna C18 (3 μm, 4,6 ×150 mm, USA) gắn với tiền cột Phenomenex C18 (2,0 × 4 mm, USA) Pha động: methanol:acetonitri -l (8:2, chứa 0,1% acid formic - kênh A) và amoni format 0,01 M, pH 5,0 (kênh B)
- 125 àg/kg Độ thu hồi:
Dư lượng của 30 thuốc chống viêm không steroid trong thịt lợn
Chiết xuất bằng hỗn hợp acetonitril và acid phosphoric
Dịch chiết được làm khô bởi khí N2 Hoàn nguyên trong hỗn hợp methanol
Pha tĩnh: Cột AcquityTM UPLC BEH C18 (50 àm ì 2,1 mm, 1,7 àm)
Tiếp theo, chiết SPE sử dụng cột HLB, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi amoni hydroxit:axetonitril: metyl tert-butyl ete (5:95:1) và bay hơi đến khô
Hoàn nguyên trong hỗn hợp acetonitril và acid formic 0,1%, lọc qua màng và chuyển vào vial và dung dịch acid formic 0,1% chứa 0,5 mmol/L amoni acetat (kênh B) àg/kg Độ thu hồi:
-on, acid tolfenamic, meloxicam và ketoprofen trong thịt bò
Chiết bằng acetonitril, sau đó dịch chiết được làm bay hơi đến khô
Chiết SPE qua cột Oasis HLB và rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol và acid acetic trong n-hexan (10%) Dịch rửa giải được làm bay hơi đến khô
Hoàn nguyên trong hỗn hợp dung môi pha động và được chuyển vào vial
Pha tĩnh: cột Alltima HP C18 (5 àm, 150 x 2,1 mm, Alltech, Deerfield,
Pha động: methanol (kênh A) và nước với 0,1% acid acetic (kênh B)
Khoảng tuyến tính: không công bố
- 68,20 àg/kg Độ thu hồi: không công bố
NSAIDs trong thịt động vật
Thủy phân bằng enzym: đệm acetat (pH 4,5); enzym β- glucosidase; nhiệt độ
Pha tĩnh: Cột Inertsil ODS-3 (3 àm, 2,1 x 150 mm,
GL Science, Nhật Bản) được kết nối
Khoảng tuyến tính: không công bố
Tiếp theo, chiết SPE bằng cột Sep Pak Alumina N và làm bay hơi trong thiết bị cô quay
Chiết SPE sử dụng cột C18 để tinh chế sau đó bay hơi đến khô
Hoàn nguyên trong pha động và chuyển vào vial với tiền cột Luna C18 (2,0 x 4 mm, Phenomenex, Hoa Kỳ)
Pha động: acetonitril (kênh A) và acid formic 0,1% (kênh B) công bố Độ thu hồi:
Nhận xét: Điểm chung của các phương pháp là đều gồm các bước: Chiết xuất - Chiết SPE
- Làm khô - Hoàn nguyên Dung môi chiết xuất được sử dụng là acetonitril do khả năng hòa tan tốt các chất phân tích có trong mẫu Tiếp theo dịch chiết sẽ được cho đi qua các cột thích hợp và rửa giải bằng dung môi hoặc sẽ được cô đến cắn và được hoàn nguyên trong dung môi thích hợp để làm giàu, tinh chế chất phân tích Phương pháp phân tích được sử dụng trong các nghiên cứu trên là LC-MS/MS và UHPLC- MS/MS đều là các phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian phân tích ngắn phù hợp với nồng độ của chất cần phân tích Điểm khác nhau: Một số phương pháp có thêm bước thủy phân với enzym trước khi chiết xuất Enzym được sử dụng là β-glucuronidase trong môi trường đệm acetat và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ
1.2.2 Tổng quan về phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu này là LC-MS/MS (Liquid chromatography - mass spectrometry and tandem mass spectrometry) hoạt động trên nguyên tắc tách phân lập các chất trong hỗn hợp nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS) Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện (LOD) nhỏ có thể lên tới 10 -14 g Hiện nay khối phổ là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ như xác định công thức cấu tạo, xác định đồng vị, định tính, định lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên
1.2.2.1 Bộ phận sắc ký lỏng
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 1.2.2.2 Bộ phận khối phổ
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất
Hình 1.3 Cấu tạo thiết bị khối phổ
Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm ba phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện Nguồn ion là nơi các mẫu được ion hóa Thiết bị phân tích khối tách các ion theo tỉ số m/z Bộ phận phát hiện khuếch đại và chuyển các ion thành tín hiệu Các tín hiệu này được máy tính xử lý và lưu trữ.
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI) Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất a) Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)
Kỹ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:
- Tạo thành các giọt mang điện tích
- Làm giảm kích thước của các hạt và phân nhỏ các hạt
- Quá trình hình thành pha hơi các ion
Dung dịch mẫu sau khi tách sắc ký được đưa vào ống mao quản mang điện thế cao, tạo thành các giọt mang điện Những giọt này được giảm kích thước qua quá trình hóa hơi dung môi và bắn phá bởi các giọt cùng dấu, tạo thành pha hơi ion Nhờ lực hút tĩnh điện, các ion này được dẫn qua cửa sổ nhỏ vào máy phân tích khối phổ, trong khi dung môi và khí trơ bị hút ra ngoài bởi dòng khí Curtain Gas.
Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500 o C Một điện thế cao từ 3 - 5kV tạo ra các electron và ion hóa chất phân tích
2 Bộ phận phân tích khối
Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có nhiều bộ phận phân tích khối khác nhau như: bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay…
Các máy phân tích khối tứ cực và khối tứ cực chập ba được sử dụng trong phổ khối để phân tách các ion theo tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z) của chúng Chúng hoạt động bằng cách sử dụng sự kết hợp của điện trường và từ trường để chặn các ion không mong muốn, chỉ cho phép các ion m/z mục tiêu đi tới bộ phận phát hiện.
Bộ phận phân tích khối bẫy ion sử dụng bốn điện cực có bề mặt hypebol để bẫy các ion có m/z xác định Bằng cách áp dụng các điện thế khác nhau, các ion này được lựa chọn và hướng đến bộ phận phát hiện Bẫy ion cho phép lựa chọn và giữ lại các ion, tạo điều kiện cho quá trình phân mảnh để tạo thành các ion con Việc lựa chọn liên tiếp các ion tạo nên khả năng thực hiện phép đo phổ khối nhiều lần, tăng cường sức mạnh định tính của kỹ thuật MS bẫy ion.
- Bộ phân tích khối thời gian bay: Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Các ion có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian các ion đi tới detector sẽ khác nhau Do có năng lượng động học hay vận tốc, các ion này sẽ bay với khoảng cách là d trong một khoảng thời gian t, trong đó t phụ thuộc vào tỉ số m/z Hiện nay, thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron giúp kéo dài quãng đường các ion đi tới detector và do đó làm tăng độ phân giải của thiết bị và tăng cường khả năng định tính với các chất chưa biết
Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành các tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng của nghiên cứu là bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs thường dùng cho động vật chăn nuôi bao gồm: diclofenac, meloxicam, flunixin, tolfenamic acid Đối tượng phân tích là các mẫu thịt động vật được mua ngẫu nhiên tại các chợ, cửa hàng ở
Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với hệ thống HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Applied Biosystem
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg (Mettler Toledo - Mỹ)
- Cân kỹ thuật chính xác 0,01 g (Mettler Toledo - Mỹ)
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 rpm đối với ống ly tâm 50 mL, Mikro 200R (Hettich - Đức)
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 rpm đối với ống ly tâm 2 mL, Mikro 200R (Hettich - Đức)
- Máy lắc xoáy vortex (IKA - Đức)
- Máy rung siêu âm (Elma - Đức)
- Bộ lọc dung môi sắc ký
- Hệ thống thổi khô nitơ
- Bình định mức các loại: 5, 10, 20 và 25 mL
- Ống ly tâm nhựa 50 mL có nắp kín
- Ống ly tâm nhựa 2 mL có nắp kín
- Màng lọc mẫu 0,45 àm - 0,2 àm.
Dung môi, hóa chất, chất chuẩn
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích:
- Dung môi, hóa chất tinh khiết (Merck): methanol, acetonitril, acid formic, acid acetic, amoni acetat, β-glucosidase, natri clorid khan, magie sulfat khan, natri acetat khan
- Dung môi, hóa chất tinh khiết (Agilent): bột hấp phụ C18, bột hấp phụ PSA, carbon hoạt tính
- Dung dịch acid formic 1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi
- Dung dịch đệm acetat pH 3,0: Hòa tan 4 g natri acetat khan (TT) trong khoảng
840 mL nước, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid acetic băng (TT) (dùng khoảng 155 mL), thêm nước vừa đủ 1000 mL
- Dung dịch đệm acetat pH 4,0: Hòa tan 10 g natri acetat khan (TT) trong 300 mL nước, điều chỉnh tới pH 4,0 bằng acid acetic băng (TT) và thêm nước vừa đủ 1000 mL Nếu cần thiết, điều chỉnh lại tới pH 4,0 bằng acid acetic băng (TT) hoặc bằng natri acetat khan (TT) trước khi dùng
- Dung dịch đệm acetat pH 4,5: Hòa tan 77,1 g amoni acetat (TT) trong nước, thêm 70 mL acid acetic băng (TT), thêm nước vừa đủ 1000 mL
- Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hòa tan 13,6 g natri acetat (TT) và 6 mL acid acetic băng (TT) trong nước và thêm nước vừa đủ 1000 mL
- Dung dịch đệm acetat pH 6,0: Hòa tan 4,1 g natri acetat khan (TT) trong 1000 mL nước, điều chỉnh pH đến 6,0 bằng acid acetic băng (TT)
Các chất chuẩn nhóm NSAIDs, có độ tinh khiết cao (từ hãng Dr Ehrenstorfer): diclofenac (99,34%, số lô: G1343992), flunixin (97,22%, số lô: G1089114), meloxicam (99,22%, số lô: G1436236) và tolfenamic acid (99,76%, số lô: G163395)
2.3.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn đơn của diclofenac, flunixin, meloxicam và tolfenamic acid nồng độ 500 µg/mL được pha chế bằng cách cân chính xác 0,0100 g từng chất chuẩn thuộc nhóm NSAIDs vào bình định mức 20 mL, hòa tan và định mức đến 20 mL bằng methanol để thu được dung dịch chuẩn gốc 500 µg/mL Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8°C và có thời hạn sử dụng trong 6 tháng.
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL: Dựng micropipet lấy chớnh xỏc khoảng 100 àL mỗi dung dịch chuẩn đơn 500 àg/mL cho vào bỡnh định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8 o C, dung dịch bền trong 3 tháng
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 àg/mL: Dựng micropipet lấy chớnh xỏc khoảng 1000 àL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL cho vào bỡnh định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8 o C, dung dịch bền trong 3 tháng
Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 0,1 àg/mL: Dựng micropipet lấy chớnh xỏc khoảng 100 àL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 àg/mL cho vào bỡnh định
14 mức 10 mL, định mức tới vạch bằng methanol, lắc đều Dung dịch chuẩn trung gian có thể bảo quản ở 2 - 8 o C, dung dịch bền trong 3 tháng
Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian bằng methanol để thu được các dung dịch có nồng độ như sau: 0,02; 0,04; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 àg/mL
Bảng 2.1 Pha các dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn trung gian sử dụng (àg/mL)
Thể tích chuẩn trung gian sử dụng (àL)
Thể tích methanol sử dụng (àL)
Thể tích định mức (mL)
Dãy dung dịch chuẩn làm việc được chuẩn bị mới khi dùng, sử dụng trong vòng
Là mẫu thịt được xác định là âm tính với diclofenac, flunixin, meloxicam và tolfenamic acid sau đó được xử lý mẫu theo phương pháp đã được tối ưu.
Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS
2.4.1.1 Điều kiện khối phổ Để khảo sát điều kiện khối phổ, tiến hành tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 50 ng/mL vào khối phổ và tối ưu hóa tự động để lựa chọn ion mẹ, ion con và năng lượng va chạm
- Lựa chọn cột sắc ký
- Khảo sát và lựa chọn thành phần, chương trình gradient pha động
2.4.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
Trên cơ sở tham khảo tài liệu tham khảo và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu với các điều kiện sau: có sử dụng enzym hay không, pH của dung dịch đệm, nhiệt độ ủ, muối chiết và muối làm sạch Sử
15 dụng mẫu thịt động vật đã được xác định là dương tính với diclofenac và meloxicam để thực hiện các bước khảo sát, cụ thể như sau:
2.4.2.1 Khảo sát vai trò của enzym
Thay đổi sự có mặt của enzym: có enzym và không có enzym
2.4.2.2 Khảo sát pH của dung dịch đệm
Thay đổi giá trị pH của dung dịch đệm lần lượt là 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0
2.4.2.3 Khảo sát nhiệt độ ủ mẫu
Thay đổi nhiệt độ ủ mẫu lần lượt là nhiệt độ phòng (21 o C); 37 o C; 40 o C; 50 o C;
Thay đổi muối chiết mẫu lần lượt là không sử dụng; MgSO4; NaCl; hỗn hợp MgSO4 và NaCl
2.4.2.5 Khảo sát muối làm sạch
Thay đổi muối làm sạch lần lượt là không sử dụng; hỗn hợp NaCl và
CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và NaCl; hỗn hợp bột C18, NaCl và CH3COONa
2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu/chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi, độ phù hợp hệ thống Các kết quả được đánh giá, so sánh với các quy định theo AOAC 2016 [6] và theo tài liệu hướng dẫn chuyên khảo [4]
2.4.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc
Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như: các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất…
Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc
Tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh tín hiệu của chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5%
Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC/808/2021 của Châu Âu [9] Trong đó đối với kỹ thuật LC-MS/MS được tính là 1 điểm, 1 ion mẹ được tính là 1 điểm, 2 ion con thì mỗi ion được tính là 1,5 điểm
2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện với mức tin cậy xác định
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn
LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N)
Trong đó: S là tín hiệu của chất phân tích
N là tín hiệu nhiễu của đường nền
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N= 10
LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 - 3 lần nhiễu đường nền và có thể được tính từ LOQ thông qua công thức:
2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp là dải nồng độ mà tại đó có mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ của chất phân tích Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ tuyến tính này, cung cấp thông tin về độ nhạy và phạm vi tuyến tính của phương pháp phân tích.
Xác định bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thử nghiệm
𝑥 𝑖 : nồng độ của lần thử nghiệm thứ i 𝑥̅ : nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm RSD (%): Độ lệch chuẩn tương đối
Tiến hành thực hiện phân tích lặp lại 6 lần mẫu trắng thêm chuẩn
17 Độ thu hồi (độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết
Trong đó: R (%): độ thu hồi
Ctt: nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL) Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)
2.4.3.5 Độ phù hợp hệ thống Đánh giá sự phù hợp hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng Cần đánh giá hàng ngày tùy thuộc vào độ ổn định của hệ thống hoặc số lượng mẫu phân tích
Phép thử đánh giá phù hợp hệ thống của phương pháp sắc ký được quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) như sau:
- Độ chụm của thời gian lưu, diện tích pic sắc ký: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Số lần bơm tối thiểu 5 lần phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng
- Độ phân giải giữa hai chất
- Các thông số khác nhau: độ trôi đường nền, nhiễu đường nền (khi giới hạn phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phương pháp)
2.4.4 Áp dụng phương pháp để phân tích các mẫu thực tế
Các mẫu bia được thực hiện thu thập ngẫu nhiên từ các chợ và cửa hàng trên địa bàn Hà Nội Quá trình xử lý mẫu được tuân thủ theo quy trình đã xây dựng sẵn Dữ liệu sau khi thu thập được tiến hành xử lý trên các phần mềm Excel 2016 và thiết bị chuyên dụng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích LC-MS/MS
3.1.1.1 Điều kiện khối phổ a) Lựa chọn ion mẹ và ion con
Lựa chọn kỹ thuật ion hóa ESI để xác định các ion mẹ và ion con của từng thuốc thuộc nhóm NSAIDs Thế đầu vào, năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu tự động theo thiết bị Các kết quả được trình bày ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Điều kiện MS/MS sử dụng trong phân tích các chất nhóm NSAIDs
Tên chất Công thức cấu tạo Ion mẹ Ion con CE
Ghi chú: * Ion định lượng b) Tối ưu hóa các điều kiện MS
Sau khi xác định được các ion mẹ và các ion con, tiến hành tối ưu các điều kiện của nguồn ion hóa với sự có mặt của hệ dung môi sắc ký Lựa chọn chế độ tự động để tối ưu các thông số: thế ion hóa (ISV), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1
19 (GS1), áp suất khí nguồn 2 (GS2), áp suất khí màng (CUR), áp suất khí (CAD) Kết quả tối ưu điều kiện MS được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS
STT Thông số Giá trị tối ưu
2 Nhiệt độ nguồn ion (TEM) 650 o C
3 Áp suất khí nguồn 1 (GS1) 50 psi
4 Áp suất khí nguồn 2 (GS2) 55 psi
5 Áp suất khí màng (CUR) 30 psi
6 Áp suất khí (CAD) 8 psi
3.1.1.2 Điều kiện sắc ký a) Khảo sát và lựa chọn chương trình pha động
Sau khi lựa chọn được ion mẹ, ion con và các điều kiện tối ưu của khối phổ, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp của 4 chất diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid có nồng độ 100 ng/mL
Trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu [13], [14], [17], [19] và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm một số điều kiện sắc ký được cố định như sau:
Sử dụng cột Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 àm), tốc độ dũng 0,5 mL/phỳt, thể tớch tiờm 10 àL, với chương trỡnh gradient dung mụi pha động như sau:
Các dung môi pha động được khảo sát gồm:
(1) acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B)
(2) acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và methanol (kênh B)
(3) acid formic 0,1%, amoni format 10 mM trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B)
Hình 3.1 Sắc ký đồ của diclofenac 100 ng/mL trong các dung môi pha động
Hình 3.2 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các dung môi pha động
Hình 3.3 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các dung môi pha động
Hình 3.4 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các dung môi pha động
Hình ảnh sắc ký của các chất thu được khi sử dụng hệ pha động (1) và (3) tương tự nhau, có dạng cân đối, sắc và không dính đỉnh Ngược lại, hệ (2) cho đỉnh sắc ký tù, thời gian lưu chất phân tích dài hơn so với hệ (1) và (3) Trong một số sắc ký đồ sử dụng hệ pha động (2), đỉnh của chất phân tích không xuất hiện do hệ pha động này kéo dài thời gian lưu chất phân tích vượt quá chương trình sắc ký thiết lập.
Do đó, pha động acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B) được chọn b) Khảo sát cột sắc ký
Sau khi lựa chọn được pha động là acid formic 0,1% trong nước và acetonitril, sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp của 4 chất diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid có nồng độ 100 ng/mL để tiến hành khảo sát cột sắc ký bao gồm (A) Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 àm), (B) Xbridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm x 2,5 àm) và (C) Symmetry C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 àm) Kết quả được thể hiện trong Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7 và Hình 3.8
Hình 3.5 Sắc ký đồ của diclofenac 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau
Hình 3.6 Sắc ký đồ của flunixin 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau
Hình 3.7 Sắc ký đồ của meloxicam 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau
Hình 3.8 Sắc ký đồ của tolfenamic acid 100 ng/mL trong các cột sắc ký khác nhau
Từ các sắc ký đồ của 4 chất, tín hiệu sắc ký thu được khi phân tích bằng cột sắc ký (B) không cân xứng và bị tù, cột sắc ký (C) có hiện tượng chẻ pic, trong khi đó cột sắc ký (A) cho pic cân đối, nhọn và không dính pic Đối với sắc ký đồ của tolfenamic acid khi sử dụng cột sắc ký (B) không thấy xuất hiện pic là do sử dụng cột sắc ký (B) khiến cho thời gian lưu của chất phân tích dài hơn chương trình sắc ký đã thiết lập Do đú, lựa chọn cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 àm) cho cỏc khảo sỏt tiếp theo
Như vậy, sau khi khảo sát pha động và cột sắc ký thì điều kiện sắc ký được lựa chọn là: cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm x 5,0 àm), pha động acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và methanol (kênh B)
3.1.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu đề xuất gồm các điều kiện cần khảo sát như sử dụng enzym, pH dung dịch đệm, nhiệt độ ủ, muối chiết và muối làm sạch Mỗi điều kiện được thực hiện lặp lại 2-3 lần và so sánh kết quả thông qua diện tích pic của chất cần phân tích Mẫu thử là mẫu dương tính với diclofenac và meloxicam do không có mẫu thực dương tính với flunixin và tolfenamic acid tại thời điểm nghiên cứu, đồng thời xét đến tính chất vật lý của các chất này.
25 hóa học và công thức cấu tạo của diclofenac với flunixin và tolfenamic acid là tương tự nhau (phần 1.1.1 Giới thiệu chung ) nên khảo sát diclofenac có thể đại diện cho flunixin và tolfenamic acid
Hình 3.9 Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thờm 4mL đệm acetat pH 4,5 và 50 àL β- glucosidase
Lắc xoáy kỹ trong 1 phút và ủ ở 37 o C trong 60 phút
Thêm 10 mL acetonitril và lắc đều, siêu âm ở 40 o C trong 30 phút
Thêm 2 g MgSO 4 và 0,5 g NaCl, lắc xoáy trong 1 phút và ly tâm 5 phút ở 6000 vòng/phút
Lớp dịch chiết phía trên được chuyển vào ống ly tâm 15 mL có chứa 0,5 g chất hấp phụ C18 và 0,5 g NaCl
Ly tâm trong 3 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút
Chuyển dịch phía trên sang một ống ly tâm 15 mL khác và làm bay hơi đến khô bằng bộ thổi khô N 2
Hòa cắn trong 1 mL methanol
Lọc dịch qua màng 0,22 àm rồi chuyển vào lọ phõn tích trên LC-MS/MS
3.1.2.1 Khảo sát vai trò của enzym
Thực hiện khảo sát việc sử dụng enzym β-glucuronidase để xử lý mẫu: có sử dụng enzym và không sử dụng enzym
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sử dụng enzym để xử lý mẫu
Có sử dụng enzym (lần 1) 2,97E+07
Có sử dụng enzym (lần 2) 2,88E+07 2,72E+05
Có sử dụng enzym (lần 3) 2,77E+07 2,75E+05
Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi sử dụng enzym để thủy phân mẫu cho tín hiệu cao hơn 12% so với khi không sử dụng enzym đối với meloxicam và cao hơn 55% đối với diclofenac Điều này có thể được giải thích là do các chất NSAIDs có một phần tồn tại trong cơ thể động vật ở dạng liên hợp glucuronid Sử dụng enzym β- glucuronidase sẽ phân tách các dạng liên hợp này, giải phóng NSAIDs về dạng đơn chất Trong nghiên cứu của Jedziniak, P và các cộng sự [12], hàm lượng flunixin trong các mẫu sữa khi phân tích bằng thủy phân với enzym β-glucuronidase cũng cao hơn khi thủy phân không sử dụng enzym (khoảng 54%) Do đó, sử dụng enzym để thủy phân mẫu được lựa chọn làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo
3.1.2.2 Khảo sát pH của dung dịch đệm
Thực hiện khảo sát ở các dung dịch đệm có pH khác nhau: 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0
Hình 3.10 Kết quả khảo sát pH của dung dịch đệm
Kết quả ở Hình 3.10 cho thấy, pH của dung dịch đệm là 4,5 cho tín hiệu cao nhất Hoạt độ của enzym β-glucuronidase bị ảnh hưởng rất lớn bởi pH của dung dịch đệm, vì ở điều kiện pH thích hợp enzym mới có khả năng hoạt động tốt nhất, nếu không enzym sẽ bị bất hoạt Theo Amin, H A [5], enzym β-glucuronidase hoạt động tốt nhất ở pH từ 4 - 5,5, phù hợp với kết quả của nghiên cứu Vì vậy, dung dịch đệm có pH là 4,5 được sử dụng làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo
Thực hiện khảo sát ở các mức nhiệt độ ủ khác nhau: nhiệt độ phòng (21 o C);
Hình 3.11 Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ mẫu
Tương tự như pH, nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của enzym Từ kết quả ở Hình 3.11, ở nhiệt độ 37°C cho tín hiệu chất phân tích lớn nhất Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Amin, H A [5], enzym β-
Diệ n tí ch p ic pH dung dịch đệm
Khảo sát pH của dung dịch đệm
Diện tích pic meloxicam (E+07) Diện tích pic diclofenac (E+05)
Khảo sát nhiệt độ ủ mẫu
Diện tích pic meloxicam (E+06) Diện tích pic diclofenac (E+04)
28 glucuronidase hoạt động tốt nhất ở khoảng nhiệt độ 35 - 40 o C Vì vậy, thủy phân mẫu ở nhiệt độ 37 o C được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
Thực hiện khảo sát các muối chiết khác nhau: không sử dụng; MgSO4; NaCl; hỗn hợp MgSO4 và NaCl
Hình 3.12 Kết quả khảo sát muối chiết
Từ kết quả ở Hình 3.12 cho thấy, sử dụng hỗn hợp muối MgSO4 và NaCl cho kết quả tốt hơn so với chỉ dùng riêng từng muối Điều này có thể được giải thích là do MgSO4 có tác dụng làm cho lớp acetonitril tách ra khỏi pha nước, NaCl tan tốt trong nước nên làm tăng khả năng chuyển pha của chất phân tích từ pha nước sang pha hữu cơ Do đó, hỗn hợp MgSO4 và NaCl được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
3.1.2.5 Khảo sát muối làm sạch
Thực hiện khảo sát các muối làm sạch khác nhau: không sử dụng; hỗn hợp NaCl và CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và CH3COONa; hỗn hợp bột C18 và NaCl; hỗn hợp bột C18, NaCl và CH3COONa
Không sử dụng MgSO4 NaCl MgSO4 + NaCl
Diện tích pic meloxicam (E+07) Diện tích pic diclofenac (E+05)
Hình 3.13 Kết quả khảo sát muối làm sạch
Kết quả ở Hình 3.13 cho thấy, sử dụng hỗn hợp muối C18 + NaCl cho tín hiệu tương đương so với hỗn hợp C18 + CH3COONa + NaCl, cao hơn so với C18 +
CH3COONa và CH3COONa + NaCl, do đó hỗn hợp muối C18 + NaCl được lựa chọn làm điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này
3.1.2.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu
Thủy phân bằng enzym: Cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tõm 50 mL Thờm 4 mL đệm acetat pH 4,5 và 50 àL β-glucosidase cú hoạt độ 50
IU Mẫu được lắc xoáy kỹ trong 1 phút và ủ ở 37 o C trong 60 phút
Chiết xuất: Thêm 10 mL acetonitril vào và lắc đều, siêu âm ở 40 o C trong 30 phút Sau đó thêm 2 g MgSO4 và 0,5 g NaCl, lắc xoáy trong 1 phút và ly tâm 5 phút ở
6000 vòng/phút Lớp dịch chiết phía trên được chuyển vào ống ly tâm 15 mL có chứa 0,5 g chất hấp phụ C18 và 0,5 g NaCl, lắc xoáy trong 1 phút Mẫu được ly tâm trong 3 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút
Làm khô: Chuyển dịch phía trên sang một ống ly tâm 15 mL khác và làm bay hơi đến khô bằng bộ thổi khô N2
Hoàn nguyờn: Hũa cắn trong 1 mL methanol Lọc dịch qua màng 0,22 àm rồi chuyển vào lọ đựng mẫu và phân tích bằng LC-MS/MS.
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của diclofenac (50 ppb), flunixin (50 ppb), meloxicam (50 ppb) và tolfenamic acid (50 ppb) trên nền mẫu thịt động vật
CH3COONa bột C18 + CH3COONa bột C18 + NaCl bột C18 + NaCl +
Khảo sát muối làm sạch
Diện tích pic meloxicam (E+07) Diện tích pic diclofenac (E+05)
Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của diclofenac
Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của meloxicam
Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của flunixin
Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của tolfenamic acid
Sắc đồ đưa ra tại Hình 3.14, Hình 3.15, Hình 3.16 và Hình 3.17 cho thấy mẫu trắng không có tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích Thời gian lưu của chuẩn và mẫu thêm chuẩn không chênh lệch quá 5%, đáp ứng quy định của châu Âu (EC/808/2021) [9]
Số điểm IP của bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs được tính toán trong Bảng 3.4
Bảng 3.4 Số điểm IP của bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs
Chất phân tích Thời gian Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Số điểm IP
Kết quả đưa ra tại Bảng 3.4 cho thấy số điểm IP của bốn thuốc thuộc nhóm
NSAIDs đều là 5, đạt yêu cầu đối với phân tích trên khối phổ theo quy định của châu Âu (EC/808/2021) [9]
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn Sau đó, tiến hành so sánh tỷ lệ ion thu được Bảng tỷ lệ ion của các chất được đưa ra tại Bảng 3.5
Bảng 3.5 Bảng tỷ lệ cường độ giữa hai ion con của bốn thuốc thuộc nhóm NSAIDs
Tỷ lệ cường độ ion mẫu chuẩn
Tỷ lệ cường độ ion mẫu thêm chuẩn
% cho phép sai lệch Nhận xét
Tolfenamic acid 51,2 54,9 ± 20% Đạt yêu cầu
Kết quả từ Bảng 3.5 chỉ ra rằng độ sai lệch tỷ lệ ion giữa mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cả bốn chất cần phân tích đều nằm trong phạm vi cho phép, cụ thể là tỷ lệ ion là 20%.
- 50 cho phép lệch không quá ± 25%, tỷ lệ ion > 50 cho phép lệch không quá ± 20%), đáp ứng giới hạn cho phép theo quy định châu Âu
3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp ở các mức nồng độ thấp dần Tiến hành xác định tỷ lệ S/N dựa trên phần mềm của thiết bị sau đó dựa vào kết quả S/N để xác định và giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả được trình bày ở Hình 3.18, 3.19 và Bảng 3.6
Hình 3.18 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn NSAIDs tại giới hạn định lượng (LOQ) (1) DIC,
Hình 3.19 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn NSAIDs tại giới hạn phát hiện (LOD) (1) DIC, (2)
Bảng 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của 4 chất thuộc nhóm NSAIDs
Chất phân tích S/N LOQ (ppb) S/N LOD (ppb)
3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Thực hiện thêm chuẩn vào mẫu thịt động vật âm tính với các chất cần phân tích được xử lý như mẫu thực với các mức nồng độ LOQ; 4LOQ; 10LOQ; 20LOQ; 50LOQ Xây dựng đường phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ các chất cần phân tích Đường chuẩn phương trình hồi quy và hệ số tương quan được thể hiện ở Hình 3.20 và Bảng 3.7
Hình 3.20 Đường chuẩn của các chất cần phân tích trên nền mẫu
Bảng 3.7 Đường chuẩn, hệ số tương quan của các chất cần phân tích trên nền mẫu
Hệ số tương quan (R) Độ lệch (%)
Di ện tí ch pi c
Nồng độ diclofenac (ppb) Đường chuẩn diclofenac y = 39027x + 3419.3 R² = 0.9999
Di ệm tí ch pi c
Nồng độ flunixin (ppb) Đường chuẩn flunixin y = 36974x + 6274.7
Nồng độ meloxicam (ppb) Đường chuẩn meloxicam y = 1329.2x - 687.62 R² = 0.9973
Di ện tí ch pi c
Nồng độ tolfenamic acid (ppb) Đường chuẩn tolfenamic acid
Kết quả đưa ra tại Bảng 3.7 cho thấy các phương trình đường chuẩn của 4 chất cần phân tích đều có hệ số tương quan r > 0,995 Do đó trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng Độ lệch tại tất cả các điểm nồng độ đều không vượt quá 15%, độ lệch tại điểm chuẩn có giá trị bằng LOQ không vượt quá 20% Như vậy đường chuẩn của cả 4 chất cần phân tích đạt yêu cầu cho khoảng tuyến tính với các mức nồng độ LOQ; 4LOQ; 10LOQ; 20LOQ; 50LOQ
3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu thịt đã được xác định không chứa chất phân tích, tiến hành xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã tối ưu Các mẫu được thêm chuẩn ở các mức nồng độ LOQ; 4LOQ; 10LOQ Các kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.8
Bảng 3.8 Độ lặp lại và thu hồi của 4 chất phân tích trên nền mẫu thịt
Mức thêm chuẩn (àg/kg) Diện tớch pic R(%) RSD(%)
Từ kết quả đưa ra tại Bảng 3.8 cho thấy độ thu hồi ở ba mức nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu thịt đạt được trong khoảng 82,4 - 110% với diclofenac; 86,8 - 110% với flunixin; 89,0 - 108% với meloxicam; 91,6 - 110% với tolfenamic acid Các kết quả này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng theo yêu cầu của AOAC
2016 [6] Độ lặp lại ở ba mức nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu thịt có độ lệch trong khoảng 2,45 - 9,59% với diclofenac; 4,83 - 8,05% với flunixin; 5,47 - 7,14% với meloxicam; 4,21 - 5,67% với tolfenamic acid Kết quả này đáp ứng được yêu cầu ≤ 21% theo AOAC 2016 [6]
3.2.5 Độ tái lặp nội bộ
Bố trí 2 kiểm nghiệm viên thực hiện phân tích 6 lần lặp lại mẫu trắng thêm chuẩn ở mức nồng độ 20 ppb ở các ngày khác nhau
Bảng 3.9 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích diclofenac
TT Kiểm nghiệm viên A Kiểm nghiệm viên B
Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
Bảng 3.10 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích flunixin
TT Kiểm nghiệm viên A Kiểm nghiệm viên B
Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
Bảng 3.11 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích meloxicam
TT Kiểm nghiệm viên A Kiểm nghiệm viên B
Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
Bảng 3.12 Kết quả xác định độ tái lặp nội bộ phân tích tolfenamic acid
TT Kiểm nghiệm viên A Kiểm nghiệm viên B
Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%) Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
RSD (%) 7,60 Độ tái lặp nội bộ tối đa tại mức nồng độ 20 ppb được tính theo công thức Hozwitz:
PRSDR = 2 x C -0,15 = 28,57% Độ tái lặp của các chất phân tích lần lượt là: 7,15% đối với diclofenac; 7,53% đối với flunixin; 4,67% đối với meloxicam; 7,60% đối với tolfenamic acid Do đó phương pháp đạt yêu cầu về độ tái lặp
3.2.6 Độ phù hợp hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần chuẩn hỗn hợp diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid có nồng độ 4LOQ trong methanol
Bảng 3.13 Kết quả thời gian lưu
Thời gian lưu (phút) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Trung bình
RSD (%) Diclofenac 6,50 6,48 6,49 6,50 6,48 6,49 6,49 0,14 Flunixin 6,55 6,56 6,55 6,56 6,55 6,57 6,56 0,12 Meloxicam 6,14 6,14 6,14 6,14 6,13 6,15 6,14 0,10 Tolfenamic acid 6,95 6,93 6,92 6,95 6,94 6,98 6,95 0,30
Bảng 3.14 Kết quả diện tích pic
Diện tích pic Diclofenac Flunixin Meloxicam Tolfenamic acid
RSD thời gian lưu và RSD diện tích pic sắc ký của cả 6 chất đều thấp hơn 2% Như vậy có thể kết luận hệ thống đáp ứng được theo yêu cầu của AOAC 2016 [6].
Ứng dụng phương pháp phân tích nhóm NSAIDs
Phương pháp đã được ứng dụng để xác định hàm lượng 4 chất diclofenac, flunixin, meloxicam, tolfenamic acid trong 15 mẫu thịt được thu thập ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội Kết quả được trình bày ở Bảng 3.15
Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm lượng 4 chất DIC, MEL, FLU, TOL trong 15 mẫu thịt
Thể tích dung môi chiết (mL)
Hàm lượng chất phân tớch (àg/kg) Đạt/Không đạt tiêu chuẩn EU
M2 Thịt bò 10 1 1,9850 MEL < LOQ Đạt
M3 Thịt gà 10 1 1,9783 TOL < LOQ Đạt
*Ghi chú: ND: Không phát hiện
Từ kết quả thu được ở Bảng 3.15, trong 15 mẫu thịt đã phân tích không có mẫu nào phát hiện diclofenac và flunixin, có 1 mẫu thịt gà và 1 mẫu thịt bò có phát hiện meloxicam nhưng chưa đạt mức định lượng (hàm lượng