Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính -galactosidase giải phóng khi tế bào đã được xử lý với lysozyme .... Tình trạng không dung nạp lactose ở người có thể giải quyết bằng nhiều
GIỚI THIỆU
Trên thế giới, một lượng lớn dân số không có khả năng tiêu thụ lactose, dẫn đến việc họ không thể sử dụng những sản phẩm chứa lactose như sữa và những sản phẩm chế biến từ sữa (phô mai, yogurt, sữa chua…) (Bannan và cộng sự, 1996)
Enzyme β-galactosidase xúc tác thủy phân lactose thành glucose và galactose tạo sản phẩm thích hợp cho những người không dung nạp lactose Điều này không những mở ra tiềm năng trong sản xuất, tiêu thụ các sản phẩm từ sữa mà còn hỗ trợ những người này có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dồi dào trong sữa (protein, chất béo, vitamin và khoáng chất ) (Eisenhardt và cộng sự, 2003) Bên cạnh đó, enzyme β-galactosidase còn có hoạt tính chuyển galactosyl giúp tổng hợp các galacto- oligosaccharide (GOS) - một prebiotic rất có lợi cho sức khỏe (Gosling và cộng sự, 2010) Ngoài ra, enzyme này còn có vai trò trong cải thiện các đặc tính kỹ thuật của thực phẩm, giúp mở rộng khả năng tận dụng nguồn whey góp phần giải quyết vấn đề về ô nhiễm môi trường (Rabiu và cộng sự, 2001; Coté và cộng sự, 2004).
Trong số các vi sinh vật sản xuất β-galactosidase thì vi khuẩn lactic là nguồn cung cấp tiềm năng đáng được quan tâm vì điều kiện lên men dễ dàng, hoạt tính enzyme cao, ổn định và đặc biệt là tính an toàn (Vasiljevic và Jelen, 2001) - galactosidase từ vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng trong ngành chế biến sữa và sản xuất phomai (Adam và cộng sự , 2004) Mặc dù vậy, enzyme từ nguồn này vẫn chưa nhận được nhiều sự quan tâm về mặt khoa học
L acidophilus là một trong những vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao nhất (Klaenhammer và cộng sự, 2008) Tuy nhiên, enzyme này ở L acidophilus là enzyme nội bào, nhạy cảm với các tác động môi trường nên quá trình xử lý phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme một cách hiệu quả là yếu tố vô cùng quan trọng
Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc tìm ra phương pháp và các thông số xử lý tế bào L acidophilus nhằm thu nhận β-galactosidase một cách hiệu quả nhất.
TỔNG QUAN
Enzyme -galactosidase
-galactosidase (-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23) thường được gọi là lactase nhờ khả năng thủy phân lactose thành các đường đơn galactose và glucose (Panesar và cộng sự, 2006)
-galactosidase ngoài thủy phân lactose còn xúc tác các phản ứng chuyển nhóm galactosyl tạo thành các GOS Ngoài ra, enzyme này cũng liên quan đến sự chuyển hóa của các galactoside phức hợp (glycoprotein và glycolipid) (Panesar và cộng sự, 2006)
Hình 2.1 Sự thủy phân lactose bằng -galactosidase (Raymond và cộng sự, 2003)
Enzyme β-galactosidase xúc tác thủy phân tại vị trí galactosyl của β-D- galactopyranoside liên kết với các aglycon (Matthews, 2005) Đầu tiên, Glu 537 ái nhân của enzyme sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị α-D- galactosyl với cơ chất dưới sự hỗ trợ của acid, Glu 461 hay Mg 2+ , đồng thời liên kết glycoside trong cơ chất bị phân giải Sau đó, một liên kết được hình thành giữa nhóm galactosyl và enzyme, chuyển nhóm galactosyl đến một chất nhận có khả năng cho điện tử (hình 2.2) Kết quả phản ứng tùy thuộc vào chất nhận galactosyl
Nếu chất nhận galactosyl là nước (R2 = H) thì sản phẩm sẽ là galactose Nếu chất nhận galactosyl là saccharide (R2 = glucose, galactose, lactose) thì xảy ra sự chuyển vị galactosyl và tổng hợp GOS (Gosling và cộng sự, 2010)
Hình 2.2 Cơ chế hoạt động của β-galactosidase trên galactoside (Gosling và cộng sự,
Sự hình thành GOS tăng khi nồng độ lactose cao hoặc giảm nồng độ nước Sản xuất GOS đạt hiệu suất từ 2 - 32 % khi nồng độ lactose ban đầu từ 14 - 40 %(w/v)
Do đó, khi sử dụng β-galactosidase thủy phân lactose trong những sản phẩm có nồng độ lactose ban đầu thấp như sữa và whey thì β-galactosidase không thể hiện hoạt tính chuyển galactosyl (Valero, 2009)
Enzyme -galactosidase có ứng dụng rất quan trọng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, sinh học cũng như trong kỹ thuật và môi trường (Jurado và cộng sự, 2002)
2.1.3.1 Loại trừ lactose giúp người không dung nạp lactose
Trong sữa và các sản phẩm từ sữa có chứa một lượng lớn lactose Lượng lactose chiếm 4.5 - 5 % trong sữa bò, hơn một phần ba lượng chất khô trong sữa; xấp xỉ 20
% trong ice cream và 72 % trong chất khô của whey Disaccharide này hình thành nên các chức năng sinh học quan trọng như thúc đẩy sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột và cung cấp galactose, một thành phần dinh dưỡng cần thiết giúp hình thành các GOS và các galactolipid trong não (Maldonado và cộng sự, 1998)
Lactose không thể được hấp thu trực tiếp mà phải qua quá trình thủy phân thành các monosaccharise bằng enzyme -galactosidase trong ruột Một lượng lớn dân số
(khoảng 75 %) không thể tiêu hóa lactose vì thiếu gen mã hóa enzyme này (Bannan và cộng sự, 1996) Đối với những người thiếu enzyme -galactosidase, khi đưa một lượng lớn lactose vào ruột có thể gây ra các triệu chứng như: đầy hơi, đau bụng, chuột rút và tiêu chảy (tình trạng lâm sàng được gọi là không dung nạp lactose) (Ruch, 2004)
Tình trạng không dung nạp lactose ở người có thể giải quyết bằng nhiều cách: thủy phân trước lactose trong sữa và các sản phẩm từ sữa bằng cách sử dụng enzyme β-galactosidase hoặc điều chế enzyme β-galactosidase thành dạng viên và ăn vào trực tiếp trước khi sử dụng các sản phẩm sữa (Eisenhardt và cộng sự, 2003)
Sử dụng enzyme β-galactosidase thủy phân lactose để sản xuất các sản phẩm sữa nghèo lactose sẽ hỗ trợ cho những người không dung nạp lactose có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dồi dào trong sữa (protein, chất béo, vitamin và khoáng chất) và giúp tăng sản lượng sữa tiêu thụ
GOS được hình thành đồng thời trong quá trình thủy phân lactose do hoạt tính chuyển galactosyl của enzyme β-galactosidase (Rabiu và cộng sự, 2001)
Những oligosaccharide như GOS có nhiều tác động tích cực đối với sức khỏe con người (Urgell và cộng sự, 2001) GOS thuộc nhóm prebiotic - thực phẩm có khả năng hỗ trợ sự phát triển của các probiotic - hệ vi sinh đường ruột có lợi cho sức khỏe con người (Bifidobacterium sp và Lactobacillus sp) Các oligosaccharide thường có vai trò hỗ trợ hoạt động trao đổi chất của tất cả các vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên GOS lại chọn lọc cho vi khuẩn probiotic có tính acid
2.1.3.3 Cải thiện đặc tính kỹ thuật và cảm quan của thực phẩm Đối với sản phẩm sữa không lên men
Trong ice-cream, whey và sữa cô đặc nếu hàm lượng lactose cao có thể dẫn đến sự hình thành tinh thể, gây nên cấu trúc bột, cát trong sản phẩm Sử dụng enzyme β- galactosidase trong quá trình sản xuất những sản phẩm trên có thể làm giảm nồng độ lactose đến giá trị thích hợp, vì vậy giúp cải thiện một số đặc tính kỹ thuật và cảm quan của sản phẩm: sản phẩm mềm, mịn hơn, tiêu hóa dễ dàng hơn… (Zadow và cộng sự, 1993) Đối với sản phẩm lên men từ sữa
Quá trình sản xuất sữa chua từ sữa thủy phân lactose giúp rút ngắn thời gian lên men do tốc độ tạo axit tăng Hương vị chua cũng được cải thiện nhờ glucose và galactose, giúp sữa chua phù hợp hơn với người tiêu dùng Hơn nữa, glucose và galactose còn tăng vị ngọt đáng kể cho sản phẩm, giúp giảm lượng chất ngọt bổ sung trong sữa chua, từ đó giảm lượng calo (Rabiu và cộng sự, 2001).
Tương tự, trong sản xuất phô mai, khi sử dụng nguyên liệu sữa đã thủy phân lactose sẽ giảm được thời gian lên men và khối đông ít bị vỡ hơn
Whey là sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình sản xuất phô mai, thành phần chính của whey là lactose (44 - 52 g/l), ngoài ra còn có protein (6 - 8 g/l) và khoáng chất (4.3 - 9.5 g/l) (Johansen và cộng sự, 2002) Một phần whey được xử lý siêu lọc để sản xuất whey protein concentrate (WPI) Tuy nhiên, vẫn còn một lượng lớn whey bị thải bỏ và điều này gây ra các vấn đề về môi trường Hơn 90 % nguyên nhân làm chỉ số sinh học (BOD) tăng cao được xác định là do lactose (Khider và cộng sự, 2004) Để xử lý vấn đề lactose trong whey, giải pháp được đưa ra là sử dụng các vi sinh vật thủy phân lactose Tuy nhiên, lượng vi sinh vật có thể trực tiếp sử dụng lactose như nguồn carbon thấp hơn so với lượng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa trực tiếp glucose và galactose Do đó, quá trình thủy phân sơ bộ lactose bằng β-galactosidase sẽ giúp tăng hiệu quả quá trình xử lý và có thể thu được các sản phẩm là các chế phẩm sinh học (lactate, acetate, ethanol, buthanediol ), các biopolymer và sinh khối ứng dụng vào các ngành công nghiệp khác (Coté và cộng sự, 2004)
Ngoài ra, whey sau khi được xử lý enzyme còn có thể được sử dụng để sản xuất syrup và các GOS (Novalin và cộng sự, 2005)
2.1.4 Nguồn thu nhận β-galactosidase β-galactosidase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên theo các vai trò chức năng của nó như vai trò trong tiêu hóa, thoái hóa lysosomal, vai trò trong quá trình dị hóa Tuy nhiên, β-galactosidase được tìm thấy phổ biến ở thực vật, ruột động vật có vú và đặc biệt ở các vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn (Raymond và cộng sự, 2003)
Enzyme β-galactosidase từ L acidophilus
Theo khóa phân loại của Bergey thì L acidophilus thuộc:
- Loài: Lactobacillus acidophilus L acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, có chiều dài 1.5 - 6.0 àm, chiều rộng 0.6 - 0.9 àm Cỏc tế bào vi khuẩn này thường xếp theo dạng cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc trong môi trường thạch có kích thước 2 - 5 mm, lồi, đục, mịn, bóng và không có sắc tố (Gopal, 2011)
2.2.2 Cấu tạo thành tế bào L acidophilus
Thành phần chính của thành tế bào L acidophilus là peptidoglycan, ngoài ra còn có một số thành phần khác: teichoic acid, S-layer, và polysaccharide
Hình 2.3 Mô hình cấu trúc thành tế bào L acidophilus (Jafarei và cộng sự, 2011)
Peptidoglycan (murein) là thành phần chủ yếu tạo nên cấu trúc bền vững cho thành tế bào Peptidoglycan chiếm 50 - 80 % khối lượng thành tế bào, gồm những polysaccharide xếp song song chứa các monomer gồm acid N-acetyl-muramic (M) và N-acetyl-D-glucosamine (G) nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside Các lớp polysaccharide được nối với nhau nhờ các peptide gắn ở N-acetyl-muramic acid hình thành mạng lưới không gian ba chiều (hình 2.4)
Hình 2.4 Thành phần của peptidoglycan ở vi khuẩn lactic (Jafarei và cộng sự, 2011)
Nhân tố chính kháng lại quá trính phá vỡ thành tế bào chính là mạng lưới peptidoglycan Độ bền của mạng lưới này phụ thuộc vào mức độ xuất hiện của các peptide trong chuỗi glycan và mức độ liên kết ngang của các peptide Trong quá trình chuyển từ pha phát triển lũy thừa sang pha ổn định, có sự thay đổi đáng kể trong cấu trúc peptidoglycan Mức độ các liên kết ngang tăng lên đáng kể, tần số xuất hiện của các trimer cao hơn làm cho lớp peptidoglycan dày đặc hơn
Peptidoglycan góp phần tạo nên hình dạng tế bào và là bộ khung cho những thành phần khác như protein và techoic acid bám vào Thành phần này cũng liên quan mật thiết với quá trình phát triển, phân chia tế bào Bất cứ nhân tố nào tác động đến quá trình sinh tổng hợp hoặc làm biến đổi peptidoglycan đều dẫn đến kết quả là tế bào bị phân giải (Vollmer và cộng sự, 2008)
Thành phần acid teichoic trong thành tế bào vi khuẩn thay đổi tùy thuộc vào các yếu tố như loài, giai đoạn sinh trưởng, pH môi trường, nguồn cacbon và phosphate Teichoic acid đóng vai trò quan trọng trong thành tế bào: teichoic acid (TA) và acid teichuronic (TUA) liên kết với peptidoglycan, lipoteichoic acid (LTA) và lipoglycan (LG) liên kết với màng tế bào chất Ngoài ra, một số phần khác của teichoic acid có thể nằm tự do trong thành tế bào hoặc được giải phóng vào môi trường.
LTA ở L acidophilus liên kết đồng hóa trị với glycolipid và chuỗi polyglycerophosphate qua D-Alanin Liên kết này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và điều khiển chức năng sinh lý của L acidophilus.
S-layer của L acidophilus M92 có kích thước 45 kDa (Frece và cộng sự, 2005)
S-layer gồm nhiều tiểu phần giống hệt nhau, liên kết không hóa trị, tạo thành nhiều dạng cấu trúc khác nhau: lưới, vuông, sáu cạnh Protein S-layer ở vi khuẩn có tính acid, kỵ nước và chứa các hydroxyl amino acid, điểm đẳng điện (pI) nằm trong vùng acid yếu (4 - 6) nhưng với Lactobacilli pI có giá trị trong khoảng 9 - 10 (Hynửnen, 2009)
S-layer có vai trò quan trọng trong việc duy trì các chức năng của tế bào vi khuẩn, quyết định và duy trì hình dạng tế bào Nó có thể chịu được các điều kiện khắc nghiệt về pH, nhiệt độ, phóng xạ, áp suất cao, một số tác nhân phân giải protein S-layer hoạt động như một tấm chắn bảo vệ những receptor nhận diện bởi vỏ phage ở dưới vách tế bào Ngoài ra, nó còn có khả năng tương tác và điều khiển những tế bào miễn dịch thông qua cảm ứng sự hoạt động của cytokine (Jafarei và cộng sự, 2011)
EPS là thành phần polysaccharide tìm thấy ở bên ngoài thành tế bào vi khuẩn (Lam và cộng sự, 2007), chúng liên kết với bề mặt tế bào ở dạng bao nhầy hoặc được tiết ra môi trường ngoại bào ở dạng chất nhờn
Thành phần hóa học, trọng lượng phân tử, độ cứng của EPS ở L acidophilus thay đổi tùy theo điều kiện sinh trưởng (Çelik, 2007; Brzozowski và cộng sự, 2009)
EPS giúp tế bào vi sinh chống lại điều kiện khô, thực bào, phage, độc tố, chất kháng sinh, protozoa và áp suất thẩm thấu
Trong những nguồn β-galactosidase từ vi sinh vật, nguồn enzyme từ vi khuẩn được cho là thích hợp hơn cả vì dễ dàng lên men, hoạt tính enzyme cao và ổn định
(Vasiljevic và Jelen, 2001) Trong đó, vi khuẩn lactic bao gồm lactococci, streptococci và lactobacilli đang trở thành mục tiêu tiềm năng cho nhiều nghiên cứu do những nguyên nhân sau:
Khi sử dụng enzyme này thủy phân lactose trong các sản phẩm lên men thì không hoặc ít gây phản ứng phụ
Vi khuẩn lactic được đánh giá là an toàn, vì vậy enzyme thu nhận từ chúng có thể được sử dụng trực tiếp mà không cần tinh sạch (Vasiljevic và Jelen,
Nhiều chủng thuộc nhóm vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic cải thiện chức năng đường tiêu hóa (Vinderola và Reinheimer, 2003)
Trong số các vi khuẩn lactic đa dạng, nhóm Lactobacillus sp nổi bật vì đóng vai trò thiết yếu trong hệ tiêu hóa của cả người và động vật.
Lactobacillus sp được phân lập từ dạ dày động vật và được sử dụng trong quá trình lên men các sản phẩm sữa Khi vào cơ thể người vi khuẩn này sẽ thủy phân lactose ở đại tràng, lượng Lactobacillus sp trong đại tràng giúp đánh giá khả năng thủy phân lactose trong đường tiêu hóa (Husain, 2010) Trong số các Lactobacillus sp thì L acidophilus là loài được biết đến nhiều nhất và có hoạt tính β-galactosidase cao nhất (Klaenhammer và cộng sự, 2008) Các probiotic lactobacilli được ứng dụng trong sản xuất các enzyme tiêu hóa quan trọng giúp làm giảm triệu chứng không dung nạp lactose, giảm tác động của cholesterol, và hỗ trợ miễn dịch Sử dụng -galactosidase từ các loài probiotic để sản xuất prebiotic GOS là một hướng nghiên cứu mới cho các thực phẩm chức năng có nguồn gốc carbohydrate Xa hơn, sự kết hợp giữa prebiotic GOS và probiotic lactobacilli cho sự phát triển của thực phẩm chức năng synbiotic có thể đem lại nhiều ứng dụng mới
Tuy nhiên, enzyme -galactosidase từ các lactobacilli như L acidophilus là enzyme nội bào nên để thu nhận và nghiên cứu, điều cần thiết đầu tiên là phá vỡ tế bào vi sinh vật nhằm giải phóng enzyme.
Các phương pháp phá tế bào
Để thu nhận các sản phẩm nội bào, cần chọn lựa phương pháp phù hợp phá vỡ cấu trúc tế bào Các yếu tố cần lựa chọn phụ thuộc vào đặc điểm loài vi sinh vật, vị trí của sản phẩm cần thu nhận và tính nhạy cảm của sản phẩm đối với các tác nhân gây biến tính
Các phương pháp phá vỡ tế bào vi sinh được chia thành hai nhóm: phương pháp cơ học và phương pháp không cơ học Quá trình phá tế bào được thực hiện bằng phương pháp cơ học thường không đặc hiệu, trong khi các phương pháp không cơ học (vật lý, hóa học, enzyme) đặc hiệu và nhẹ nhàng hơn
Hình 2.5 Các phương pháp phá tế bào vi sinh vật (Middelberg, 1995)
Nguyên lý chung của các phương pháp cơ học là xử lý tế bào dưới điều kiện ma sát hoặc áp lực cao khi tế bào tiếp xúc với tác nhân xử lý Tác động gây nên sự phá vỡ tế bào là hiện tượng sủi bong bóng, sự va chạm, lực cắt, hoặc sự kết hợp giữa các tác động trên Làm lạnh sâu huyền phù tế bào trong quá trình xử lý là điều cần thiết để loại nhiệt sinh ra do tác động cơ học
Phương pháp này phù hợp để phá tế bào ở cả quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp (Doucha và Livansky, 2008) Đây là phương pháp đơn giản và khá hiệu quả đối với nhiều loài vi sinh vật khác nhau Cấu tạo cơ bản của thiết bị gồm: một khoang nghiền (nằm ngang hoặc dọc) và một trục xoay ở trung tâm Trục xoay này được gắn với máy khuấy để truyền động lực đến các hạt nhỏ trong khoang nghiền, làm chúng va chạm vào nhau, giúp phá vỡ tế bào và giải phóng các hợp chất
Phương pháp phá tế bào
Phương pháp cơ học Phương pháp không cơ học
Xử lý rắn Xử lý lỏng Vật lý Hóa học Enzyme
- Nghiền bi - X-press - Hughes press
- Sóng siêu âm - Đồng hóa áp lực cao - Frenh press
- Sốc nhiệt - Sốc thẩm thấu - Giảm áp lực
- Kháng sinh - Chất tẩy - Dung môi - Chất kìm hãm
- Enzyme thủy phân - Tự phân
(Doucha và Livansky, 2008) Các enzyme có vị trí trong tế bào chất (cytoplasm) được thu nhận bằng cách sử dụng các hạt bi nhỏ, đối với enzyme có vị trí giữa màng tế bào và tế bào chất (bound to cytoplasmic membrane) hay trong không gian chu chất (periplasmic) thường sử dụng các hạt bi có kích tước lớn hơn vì không yêu cầu phá vỡ hoàn toàn tế bào Các hạt bi có đường kính 0.1 - 0.15 mm được xem là tối ưu để phá vỡ tế bào vi khuẩn trong khi đường kính phù hợp để phá tế bào nấm men là 0.25 - 0.75 mm Các loại máy trong công nghiệp thường sử dụng các hạt bi có đường kính 0.4 - 0.6 mm để thuận tiện trong việc phân tách các hạt bi ra khỏi huyền phù tế bào
2.3.1.2 Đồng hóa áp lực cao
Phá tế bào bằng phương pháp đồng hóa áp lực cao được thực hiện bằng cách nén huyền phù tế bào dưới áp lực cao qua một khe hẹp Thông số quyết định hiệu quả của quá trình là áp lực hoạt động, số lần mẫu huyền phù đi qua khe, nhiệt độ huyền phù, và thiết kế khe hẹp Phương pháp này phá vỡ tế bào không đặc hiệu, áp lực sử dụng thường nằm trong khoảng 55 - 200 MPa và hiệu quả phá tế bào không phụ thuộc vào nồng huyền phù ban đầu trong một khoảng rộng (Bury và cộng sự, 2001)
Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường được sử dụng để phá tế bào vi khuẩn và nấm men ở quy mô công nghiệp, ứng dụng trong công nghiệp dược và công nghệ sinh học Nhược điểm của phương pháp này là khó điều khiển nhiệt độ trong quá trình xử lý nên ít được sử dụng để tách chiết những thành phần nhạy cảm
2.3.1.3 Sóng siêu âm a- Định nghĩa
Sóng siêu âm là âm thanh có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (18 - 500 kHz) (Ohlsson và Bengtsson, 2002)
Hình 2.6 Khoảng tần số của siêu âm (Kuldioke, 2002) b- Tác động phá vỡ tế bào của sóng siêu âm
Sóng siêu âm là một trong những phương pháp phá tế bào được sử dụng rộng rãi nhất ở quy mô thí nghiệm (Borthwick và cộng sự, 2005; Gogate và Kabadi, 2009) Quá trình xử lý siêu âm có thể phá vỡ hoàn toàn tế bào vi sinh để thu nhận tất cả các enzyme nội bào, hoặc chỉ “xé rách” (shear-driven) thành tế bào và kết quả là chỉ có enzyme hiện diện ở thành tế bào hoặc periplasmic được thu nhận
Sóng siêu âm tác động theo chu kỳ, trong một chu kỳ có hai pha nén và giãn Ở cường độ siêu âm cao, áp suất cục bộ trong pha giãn của chu kỳ sẽ thấp hơn áp suất hơi của chất lỏng làm hình thành những bong bóng nhỏ, những bong bóng này sẽ lớn dần lên Trong pha nén, bong bóng bị co lại một phần Quá trình nén và giãn diễn ra liên tục, bong bóng trở nên lớn hơn qua một vài chu kỳ và khi đạt đến kích thước tới hạn bong bóng sẽ nổ Khi bong bóng nổ, vùng vi môi trường xung quanh bong bóng có thể đạt đến nhiệt độ 5000 o K và áp suất 1000 atm, từ đó gây ra sự hỗn loạn trong vùng sủi bong bóng và tạo ra một sóng năng lượng có lực cắt lớn Lực cắt này tạo nên những cơn lốc xoáy Trường hợp các cơn lốc xoáy được hình thành có kích thước lớn hơn kích thước tế bào, huyền phù tế bào sẽ bị khuấy trộn mạnh
Khi những cơn lốc xoáy được hình thành có kích thước nhỏ hơn, sẽ có khả năng sinh ra lực phá vỡ tế bào Theo đó, các tế bào có kích thước lớn sẽ dễ bị phá vỡ hơn so với các tế bào có kích thước nhỏ
Hình 2.7 Diễn biến hiện tượng sủi bong bóng (Laborde và cộng sự, 1998) c- Những thông số của quá trình siêu âm ảnh hưởng đến hiệu quả phá tế bào
Khi tăng công suất siêu âm sẽ làm tăng sự hình thành những cơn lốc xoáy nhỏ, từ đó tăng hiệu quả quá trình phá tế bào Đã có nhiều nghiên cứu chứng tỏ lượng protein được giải phóng tăng tuyến tính với sự tăng công suất siêu âm như khi xử lý mẫu huyền phù tế bào nấm men (200 ml) với công suất từ 67 - 187 W (James và cộng sự, 1972) hay xử lý huyền phù tế bào E coli (5 - 30 ml) sử dụng công suất 35 - 95 W (Feliu và cộng sự, 1998)
Khi tăng thể tích mẫu thì hiệu quả thu nhận protein nội bào giảm (Feliu và cộng sự, 1998) Sự tăng thể tích mẫu sẽ làm giảm năng lượng phân bố trên một đơn vị thể tích, điều này dẫn đến hình thành những cơn lốc xoáy lớn hơn và giảm số lượng những cơn lốc xoáy trên một đơn vị thể tích, từ đó giảm hiệu quá phá vỡ tế bào
Nồng độ ban đầu của huyền phù tế bào trong một giới hạn nhất định được ghi nhận là không tác động đến hiệu quả phá tế bào như nghiên cứu của Kuboi và cộng sự (1995) trên mẫu huyền phù E.coli nồng độ 3.5 - 20 g/l Hằng số tốc độ giải phóng protein xác định được tăng tuyến tính với công suất siêu âm và giảm tuyến tính với thể tích mẫu (kiểm tra với thể tích 2.5 - 10 ml)
Hầu hết năng lượng siêu âm được hấp thu vào trong huyền phù tế bào sẽ gây ra sự tăng nhiệt độ, điều khiển được nhiệt độ trong quá trình xử lý là điều rất quan trọng trong quá trình thu nhận các sản phẩm nội bào, đặc biệt là các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt như enzyme
Bảng 2.3 Hiệu quả phá tế bào của các phương pháp cơ học đối với Lactobacillus sp
Vi sinh vật Phương pháp (thiết bị/thông số)
Môi trường sinh trưởng/xử lý trước khi phá tế bào
Sóng siêu âm (Braun-Sonic 2000/75W)
MRS broth 18 - 24 giờ nuôi cấy
L.delbrueckii subsp bulgaricus 2515 Đồng hóa áp lực cao (MSK cell homogenizer - hạt thủy tinh đường kính 0.1 mm, 90 giây)
Sóng siêu âm (Sonic dismembrator 300 -
Môi trường chứa 12% sữa hoàn nguyên, 18 giờ
Hiệu suất được tính dựa trên số lượng tế bào đếm được trước và sau quá trình phá vỡ (cfu/ml)
2.3.2 Phương pháp không cơ học
Phương pháp không cơ học được ứng dụng ở quy mô giới hạn hơn so với phương pháp cơ học (Denis và cộng sự, 2009)
Hai phương pháp vật lý phổ biến dùng phá vỡ tế bào là sốc thẩm thấu và sốc nhiệt, cơ chế là làm loãng huyền phù tế bào sau cân bằng thẩm thấu cao hoặc xử lý nhiệt tế bào vi sinh Ngoài ra, còn có phương pháp giảm áp, đưa áp lực siêu tới hạn vào tế bào rồi giải phóng, gây vỡ tế bào Các phương pháp này xử lý nhẹ nhàng, phá vỡ tế bào thành mảnh lớn giúp dễ phân tách dung dịch protein, enzyme hay sản phẩm sinh học.
Nhược điểm của chúng là trong hầu hết trường hợp xử lý hiệu quả thu được không cao
Một số nghiên cứu về thu nhận enzyme -galactoside
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về enzyme -galactosidase bao gồm tách chiết, tinh sạch, kỹ thuật tái tổ hợp cũng như ứng dụng của enzyme này từ nhiều vi sinh vật khác nhau như Aspergillus, Kluyveromyces, Bacillus hay E coli Ở Việt
Nam, có một số công trình nghiên cứu về enzyme -galactoside của nhóm tác giả Nguyễn Thu Hà và cộng sự (2006), tác giả Trần văn Giang và cộng sự (2009), tác giả Trần Minh Trí và cộng sự (2011) Tuy nhiên, các nghiên cứu đi sâu vào khảo sát điều kiện tối ưu của quá trình phá vỡ tế bào nhằm giải phóng enzyme vẫn chưa nhiều, đặc biệt là enzyme từ các vi khuẩn lactic như L acidophilus
Kim và cộng sự (2000) nghiên cứu quá trình thu nhận và các đặc điểm của β- galactosidase từ L crispatus Tế bào được phá vỡ hiệu quả nhất bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm Enzyme thu được có nhiệt độ tối ưu 45 oC và pH 6 - 6.5
Becerra và cộng sự (2001) nghiên cứu thu nhận β-galactosidase từ K lactis
Tế bào được phá vỡ bằng chloroform và sóng siêu âm Sau đó enzyme được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký
Vasiljevic và Jelen (2002) nghiên cứu β-galactosidase từ L bulgaricus
11842 Tế bào được phá bằng phương pháp nghiền với hạt thủy tinh có đường kính 0.2 - 0.3 mm trong thời gian 2 phút ở nhiệt độ 4 o C Enzyme được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion
Connell và cộng sự (2006) nghiên cứu thu nhận β-galactosidase từ K marxianus Tế bào được phá vỡ bằng cách sử dụng sóng siêu âm Enzyme được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, sử dụng cột sephacryl và hydroxylapatile Kết quả xác định trọng lượng phân tử của enzyme bằng phương pháp điện di là 123 kDa và bằng phương pháp lọc gel là 251 kDa
Enzyme thu được có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 37 o C và pH hoạt động tối ưu 6.8 Chế phẩm có hoạt tính riêng 791 U/mg
Nghiên cứu của Akolkar và cộng sự (2006) đã đánh giá các phương pháp phá tế bào để thu hồi β-galactosidase từ L acidophilus lên men trong môi trường MRS Phương pháp nghiền và đồng hóa cho hoạt tính β-galactosidase cao nhất (2000 U/ml), vượt trội so với các phương pháp siêu âm, hóa chất hay sốc nhiệt (500 - 1000 U/ml) Sau khi siêu lọc (cut-off 50 kDa), β-galactosidase được tinh sạch qua sắc ký Sephadex G-200, đạt hoạt tính riêng đáng kể (570 U/mg) và hiệu suất 15,65%.
% khi so sánh với β-galactosidase thương mại tách từ K Lactis thì chế phẩm có hoạt tính cao hơn và ổn định hơn
Nghiên cứu của Nguyen et al (2006) đã tinh sạch β-galactosidase từ L acidophilus bằng phương pháp kết tủa amoni sulfat tiếp theo là sắc ký ái lực Để phá vỡ tế bào và thu được enzyme thô, họ sử dụng phương pháp đồng hóa áp lực cao bằng thiết bị French Press Enzyme thu được là heterodimer có trọng lượng phân tử 105 kDa, bao gồm hai tiểu phần: tiểu phần lớn 72 kDa và tiểu phần nhỏ 35 kDa Hoạt tính đặc trưng của enzyme là 230 U/mg protein, điểm đẳng điện (pI) là 4,8, nhiệt độ tối ưu là 55 °C và pH tối ưu nằm trong khoảng 6,5 - 8.
Goulas và cộng sự (2009) nghiên cứu β-galactosidase từ Bifidobacterium bifidum NCIMB41171 Sau khi nuôi cấy, tế bào được phá vỡ bằng cách xử lý siêu âm ở 4 o C Enzyme thu được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel, trọng lượng phân tử xác định được nằm trong khoảng 80 - 190 kDa
Ismail và cộng sự (2010) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và phương pháp thu nhận β-galactosidase từ L acidophilus NRRL 4495 Hiệu suất thu nhận cao nhất khi vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường nguồn carbon là whey acid (3.5 %), nguồn nitơ là ammonium sulphate (3 %) trong thời gian 48 giờ
Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp nghiền với cát trong điều kiện lạnh để thu enzyme nội bào Enzyme thu được có hoạt tính cao nhất ở 40 °C và pH 7
Choonia và Lele (2011) nghiên cứu thu β-galactosidase từ L acidophilus bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm phá tế bào Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và công suất siêu âm đến hoạt tính và hiệu suất thu hồi enzyme
Patil và cộng sự (2011) nghiên cứu phương pháp tinh sạch và đặc điểm của β-galactosidase từ Bacillus sp MTCC-864 Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp đồng hóa áp lực cao để thu enzyme nội bào Dung dịch enzyme giải phóng ra được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột (sephacryl-200)
Kết quả hoạt tớnh β-galactosidase thu được cao nhất khoảng 350 àmol ONP/phút/ml Nhiệt độ hoạt động tối ưu 50 o C, hoạt tính duy trì được 75 % ở 60 o C trong 30 phút.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguồn giống vi sinh vật giàu β- galactosidase là L acidophilus do phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học - trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh cung cấp
L acidophilus được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng, theo phương pháp cấy chuyền định kỳ Môi trường giữ giống được sử dụng là môi trường MRS agar với thành phần như sau (g/lít môi trường): glucose: 20, peptone: 10, cao thịt: 10, cao nấm men: 5, tween 80: 1, K2HPO4: 2, CH3COONa: 5, triamonium citrate: 2, MgSO4: 0.2, MnSO4: 0.2, agar: 2.5, pH môi trường từ 6.2 - 6.4 Môi trường được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút trước khi sử dụng Nhiệt độ bảo quản thạch nghiêng là 4 o C, thời gian giữa 2 lần cấy chuyền liên tiếp là 1 tháng
Môi trường hoạt hóa và nhân giống L acidophilus được sử dụng là môi trường MRS dịch thể với thành phần như sau (g/lít môi trường): glucose: 20, peptone: 10, cao thịt: 10, cao nấm men: 5, tween 80: 1, K2HPO4: 2, CH3COONa: 5, triamonium citrate: 2, MgSO4: 0.2, MnSO4: 0.2, pH môi trường từ 6.2 - 6.4 Môi trường được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút trước khi sử dụng
Môi trường lên men sinh tổng hợp β-galactosidase có thành phần như sau (g/lít môi trường): lactose: 10, cao nấm men: 60, tween 80: 6, K2HPO4: 3, KH2PO4: 1,
CH3COONa: 3, MgSO4: 0.5, MnSO4: 0.15 Môi trường được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút trước khi sử dụng
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) (Merck): dạng bột trắng (độ tinh khiết > 98.0 %), sử dụng để xác định hoạt tính-galactosidase
Ortho-nitrophenyl (ONP) (Merck): dạng bột màu vàng (độ tinh khiết > 98.0
%), sử dụng để dựng đường chuẩn xác định hoạt tính-galactosidase
Lyophilized lysozyme enzyme, from Sigma, is a whitish powder containing >90% protein With a specific activity of 70,000 U/mg, it optimally functions at a pH of 6.2, ranging from 6.0 to 9.0.
Albumin huyết thanh bò (Merck): dạng bột trắng (độ tinh khiết > 96.0 %), sử dụng để dựng đường chuẩn xác định hàm lượng protein hòa tan
Thuốc thử Folin (Merck): dung dịch màu vàng, sử dụng để xác định hàm lượng protein hòa tan
Hóa chất phân tích các loại
Thiết bị siêu âm dạng thanh (Sonics vibracell - VC750)
Các thiết bị sử dụng trong bảo quản và nuôi cấy vi sinh vật
Các thiết bị phân tích
Sơ đồ nghiên cứu
Chúng tôi thực hiện quá trình lên men thu nhận tế bào L acidophilus giàu - galactosidase theo các điều kiện đã được nghiên cứu từ trước Sau đó, thực hiện các khảo sát để đánh giá hiệu quả quá trình phá tế bào giải phóng -galactosidase của các phương pháp: (1) xử lý tế bào bằng sóng siêu âm; (2) thủy phân thành tế bào bằng enzyme lysozyme; (3) thủy phân tế bào bằng enzyme lysozyme trước, sau đó xử lý siêu âm; (4) xử lý tế bào bằng nhiệt độ cao để làm chuyển vị trí β- galactosidase bên trong tế bào trước, sau đó xử lý siêu âm Nội dung nghiên cứu được trình bày trong hình 3.1
Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Lên men thu nhận tế bào
Khảo sát quá trình phá tế bào thu
So sánh hiệu quả của các phương pháp xử lý
Xử lý bằng enzyme lysozyme
Thời gian xử lý Tối ưu hóa Nồng độ enzyme
Xử lý siêu âm sau khi xử lý lysozyme lysozyme
Thời gian siêu âm Tối ưu hóa Công suất siêu âm Công suất siêu âm Xử lý bằng sóng siêu âm Thời gian siêu âm
Thời gian siêu âm Tối ưu hóa Công suất siêu âm Nhiệt độ xử lý
Thời gian xử lý nhiệt Xử lý siêu âm sau khi xử lý nhiệt
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
Quá trình lên men thu nhận tế bào L acidophilus được thực hiện trong erlen 1 lít chứa 0.5 lít môi trường Điều kiện lên men được tóm tắt như sau:
- Tỉ lệ giống cấy: 1 ml canh trường nhân giống/100 ml môi trường
- Tốc độ lắc: 100 vòng/phút
- Thời gian lên men: 50 giờ Khi quá trình lên men kết thúc, thu sinh khối bằng cách ly tâm canh trường
Sinh khối được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút, thời gian 20 phút tại nhiệt độ 4°C Sau đó rửa sinh khối bằng dung dịch đệm natri phosphat 0,05 M (pH = 7,0) hai lần Tiếp tục ly tâm ở cùng tốc độ và thời gian, ở nhiệt độ 4°C để thu sinh khối ướt Sinh khối thu được bảo quản ở nhiệt độ -20°C cho đến khi sử dụng.
3.3.2 Khảo sát quá trình phá tế bào thu β-galactosidase
Quá trình phá tế bào L acidophilus thu -galactosidase được mô tả qua sơ đồ
Sinh khối sau khi rã đông được tái huyền phù trong dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M (pH = 7.0)
Tiến hành phá tế bào bằng các phương pháp: (1) xử lý tế bào bằng sóng siêu âm; (2) thủy phân thành tế bào bằng enzyme lysozyme; (3) thủy phân thành tế bào bằng enzyme lysozyme trước, sau đó xử lý siêu âm; (4) xử lý tế bào bằng nhiệt độ trước, sau đó xử lý siêu âm
Sau quá trình phá vỡ tế bào, ly tâm hỗn hợp 5000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC để loại các mảnh vỡ tế bào, thu dịch chứa enzyme -galactosidase
Tiến hành xác định hoạt tính enzyme và nồng độ protein
Hình 3.2 Sơ đồ quá trình phá tế bào L.acidophilus thu -galactosidase
3.3.2.1 Xử lý tế bào bằng sóng siêu âm
Sử dụng thiết bị siêu âm dạng thanh (Sonics vibracell - VC750) có tần số cố định 20 kHz, công suất tối đa 750 W Để hạn chế biến tính enzyme do sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu âm, mẫu huyền phù được giữ trong đá lạnh (nhiệt độ mẫu giữ dưới 10 o C) và quá trình siêu âm được thực hiện theo chu kỳ 15 giây, nghỉ 45 giây Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ huyền phù, công suất siêu âm và thời gian siêu âm đến lượng enzyme -galactosidase giải phóng a- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ huyền phù
Thông số khảo sát: nồng độ huyền phù thay đổi từ 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ
