Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.5. Sử dụng lần lượt phương pháp xử lý nhiệt và sóng siêu âm phá tế bào L
4.5.2. Khảo sát quá trình xử lý siêu âm sau khi xử lý nhiệt
Mẫu huyền phù tế bào sau khi xử lý ở nhiệt độ 45 oC trong thời gian 20 phút tiếp tục được xử lý bằng sóng siêu âm. Để xác định điều kiện siêu âm hiệu quả nhất
chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của hai yếu tố công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính -galactosidase giải phóng, cuối cùng tiến hành tối ưu hóa hai yếu tố trên bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
4.5.2.1. Ảnh hưởng của công suất siêu âm
Chúng tôi khảo sát công suất siêu âm trong khoảng từ 263 đến 413 W (thời gian siêu âm 3 phút, thể tích mẫu 15 ml, nồng độ huyền phù 5 %(w/v), trong quá trình siêu âm nhiệt độ của mẫu luôn được giữ dưới 10 oC). Kết quả ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính -galactosidase giải phóng được mô tả qua hình 4.16.
Hình 4.16. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính -galactosidase giải phóng
sau khi tế bào được xử lý nhiệt
Mẫu đối chứng chỉ xử lý nhiệt (45 oC, 20 phút) mà không xử lý siêu âm thu được hoạt tính -galactosidase 95.73 (U/g tế bào khô), hoạt tính riêng 0.52 (U/ mg proetin).
Kết quả cho thấy khi tăng công suất siêu âm từ 263, 300 đến 338 W thì hoạt tính -galactosidase giải phóng tăng từ 599.10, 719.72 đến 813.77 (U/g tế bào khô), tăng lần lượt 45.83 %, 41.04 % và 30.23 % so với mẫu xử lý ở cùng công suất và thời gian siêu âm mà không qua quá trình xử lý nhiệt (tăng 525.82 %, 651.83 %, đến 750.07 % so với mẫu đối chứng chỉ xử lý nhiệt mà không xử lý siêu âm). Nếu tiếp tục tăng công suất siêu âm thì hoạt tính thu được thay đổi không có ý nghĩa về mặt thống kê ( = 0.05). Hoạt tính riêng cũng tăng dần khi tăng công suất siêu âm và đạt 3.76 U/mg protein ở công suất siêu âm 300 W (tăng 42.72 % so với mẫu xử lý ở cùng công suất, thời gian siêu âm và tăng 19.62 % so với mẫu xử lý siêu âm
hiệu quả nhất mà không qua quá trình xử lý nhiệt). Hoạt tính riêng tăng không có ý nghĩa về mặt thống kê ( = 0.05) khi tăng công suất lên 338 W và bắt đầu giảm nếu tiếp tục tăng công suất xử lý.
Quy luật thay đổi hoạt tính -galactosidase giải phóng theo công suất siêu âm trong trường hợp này tương tự như biến đổi của mẫu chỉ xử lý bằng siêu âm. Tuy
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
250 300 350 400
Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Hoạt tính (U/g chất khô)
Công suất siêu âm (W)
Hoạt tính (U/g chất khô) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
nhiên, do tế bào đã được xử lý nhiệt, một lượng lớn -galactosidase được chuyển vị
trí từ cytoplasmic ra periplasmic nên công suất siêu âm cần thiết để phá tế bào giải phóng -galactosidase giảm (để thu được hoạt tính cực đại công suất giảm 9.87 %
so với khi chỉ xử lý bằng siêu âm). Do enzyme được chuyển vị trí ra periplasmic nên được giải phóng triệt để hơn khi tế bào vỡ, hơn nữa công suất siêu âm giảm làm
giảm những tác động bất lợi của nhiệt độ và áp suất cục bộ tác động đến enzyme, kết quả là hoạt tính -galactosidase tối đa thu được tăng 12.95 % so với trường hợp mẫu tế bào chỉ xử lý siêu âm hiệu quả nhất (813.77 so với 720.47 (U/g tế bào khô)).
Hoạt tính riêng thu được trong xử lý này cao hơn hẳn so với mẫu chỉ xử lý siêu âm (tăng 19.62 % so với mẫu xử lý siêu âm hiệu quả nhất). Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Balasundaram và cộng sự (2001) cho rằng quá trình chuyển vị trí khi xử lý tế bào là quá trình chọn lọc đối với một số protein nhất định và nghiên cứu của Kuboi và cộng sự (1997) cho rằng quá trình xử lý nhiệt làm các protein tập hợp
lại tạo cấu trúc không tan và sẽ bị loại ra cùng với các mảnh vỡ tế bào.
Như vậy, công suất siêu âm thích hợp trong trường hợp này là 338 W.
4.5.2.2. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Chúng tôi khảo sát thời gian xử lý siêu âm trong khoảng từ 2 phút đến 4 phút (công suất siêu âm 338 W, thể tích mẫu 15 ml, nồng độ huyền phù 5 %(w/v), trong quá trình siêu âm nhiệt độ của mẫu luôn được giữ dưới 10 oC).
Hình 4.17. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính -galactosidase giải phóng sau
khi tế bào được xử lý nhiệt
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
400 500 600 700 800 900
2 2.5 3 3.5 4 Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Hoạt tính (U/g chất khô)
Thời gian siêu âm (W)
Hoạt tính (U/g chất khô) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Chúng tôi thấy rằng khi tăng thời gian xử lý siêu âm từ 2 đến 3 phút thì hoạt tính tăng từ 622.46 lên 817.44 (U/g tế bào khô), khi thời gian xử lý tăng lên 3.5 phút thì hoạt tính thay đổi không có ý nghĩa về mặt thống kê ( = 0.05) và bắt đầu giảm dần khi tăng thời gian xử lý lên 4 phút. Hoạt tính riêng cũng tăng và đạt cao nhất
3.79 (U/mg protein) ở 3 phút siêu âm sau đó giảm dần. Quy luật thay đổi hoạt tính và hoạt tính riêng của -galactosidase theo thời gian siêu âm trong trường hợp này tương tự như biến đổi của mẫu chỉ xử lý bằng siêu âm. Hoạt tính riêng trong giai đoạn đầu thấp và tăng nhanh hơn sự tăng hoạt tính cho thấy trong những phút siêu âm đầu tiên lượng protein được giải phóng rất nhiều. Điều này có thể do tốc độ chuyển vị trí của enzyme -galactosidase và các protein khác trong tế bào là khác
nhau (Farkade và Pandit, 2005).
Như vậy, sau khi được xử lý nhiệt thì thời gian siêu âm thích hợp để phá tế bào
L. acidophilus giải phóng -galactosidase là 3 phút.