Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.5. Sử dụng lần lượt phương pháp xử lý nhiệt và sóng siêu âm phá tế bào L
4.5.1. Khảo sát quá trình xử lý nhiệt
4.5.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý chúng tôi thay đổi nhiệt độ trong
khoảng từ 40 đến 60 oC (thể tích mẫu 15 ml, thời gian xử lý 20 phút, sau đó mẫu được siêu âm với công suất 300 W, trong thời gian 3 phút). Kết quả thí nghiệm được biểu diễn qua bảng 4.13 và hình 4.14.
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hoạt tính -galactosidase giải phóng
Nhiệt độ (oC)
Hoạt tính (U/g chất khô)
Hoạt tính riêng (U/mg protein)
40 690.68±32.35a 2.976±0.102a
45 811.62±11.13b 3.656±0.078b
50 774.59±21.54b 3.214±0.167c
55 641.62±27.82c 2.640±0.069b
60 553.87±11.12d 2.198±0.110d
Hình 4.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đến hoạt tính -galactosidase giải phóng
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
400 500 600 700 800 900
40 45 50 55 60
Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Hoạt tính (U/g chất khô)
Nhiệt độ xử lý (oC)
Hoạt tính (U/g chất khô) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Mẫu đối chứng chỉ xử lý bằng siêu âm với công suất 300 W trong thời gian 3 phút thu được hoạt tính -galactosidase 624.15 (U/g tế bào khô), hoạt tính riêng 2.66 (U/ mg protein).
Qua hình 4.14 chúng tôi nhận thấy khi mẫu huyền phù được xử lý với nhiệt độ thay đổi từ 40 oC đến 45 oC thì hoạt tính -galactosidase giải phóng tăng từ 690.68 lên 811.62 (U/g tế bào khô), tăng 10.69 % đến 30.07 % so với mẫu đối chứng chỉ xử lý bằng siêu âm ở cùng công suất và thời gian. Hoạt tính riêng cũng tăng khi
nhiệt độ xử lý thay đổi từ 40 đến 45 oC, ở 45 oC hoạt tính riêng đạt giá trị lớn nhất 3.66 (U/ mg protein), tăng 38.64 % so với mẫu đối chứng. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thêm nữa thì hoạt tính và hoạt tính riêng của -galactosidase giải phóng giảm dần.
Khi tế bào được xử lý nhiệt, bên trong tế bào sẽ xảy ra: (1) sự tổng hợp các
“heat shock” protein và sự tái gấp nếp các protein đã bị phá hủy, (2) sự tập hợp các protein tạo cấu trúc trơ - không tan, (3) sự biến tính protein bởi hoạt động của
protease và (4) sự chuyển vị trí protein qua màng tế bào.
Ở điều kiện bình thường các acid amin kỵ nước trong cấu trúc enzyme bị nhốt chặt, enzyme duy trì tính ưa nước tự nhiên. Khi nhiệt độ tăng, một phần cấu trúc enzyme bị phá hủy để lộ ra những acid amin kỵ nước, khi cấu trúc enzyme lộ ra một phần mới chỉ có một số acid amin kỵ nước xuất hiện trên bề mặt, nhiệt độ tiếp tục
làm lộ ra những phần này cho đến khi bề mặt enzyme hoàn toàn kỵ nước. Nhiệt độ tăng làm tăng tính thấm của màng phospholipid, tăng khả năng khuếch tán enzyme qua màng. Kết quả là enzyme từ cytoplasmic chuyển vị trí ra periplasmic và có thể
dễ dàng giải phóng ra ngoài khi xử lý siêu âm (Farkade và Pandit, 2005). Nhiệt độ xử lý tăng, hiệu quả tác động lên tế bào tăng nên lượng -galactosidase giải phóng tăng. Tuy nhiên, nhiệt độ tăng quá cao sẽ gây ra sự biến tính enzyme, làm hỏng cấu trúc tế bào, giảm hoạt tính enzyme giải phóng.
Nghiên cứu của Farkade và Pandit (2005) khi tiến hành xử lý nhiệt và siêu âm trên đối tượng K. lactis cũng cho kết quả tương tự. Khi nhiệt độ xử lý nằm trong khoảng 40 đến 45 oC lượng -galactosidase giải phóng tăng 2.33 đến 2.81 lần so với
mẫu tế bào không được xử lý nhiệt nhưng khi xử lý ở 50 oC hoạt tính thu được giảm chỉ còn cao hơn 1.43 lần so với mẫu đối chứng (21 U/ml).
Quá trình xử lý nhiệt làm các protein tập hợp lại tạo cấu trúc trơ - không tan, kết quả là các protein này bị loại ra trong quá trình ly tâm sau khi xử lý siêu âm cùng với các mảnh vỡ tế bào, do đó lượng protein phi enzyme trong sản phẩm thu được giảm, hoạt tính riêng của sản phẩm tăng (hoạt tính riêng tăng 38.64 % so với mẫu đối chứng chỉ xử lý siêu âm ở cùng công suất và thời gian).
4.5.1.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý
Chúng tôi thay đổi thời gian xử lý trong khoảng từ 10 đến 30 phút (nhiệt độ xử lý 40 oC, thể tích mẫu 15 ml, sau đó mẫu được siêu âm với công suất 300 W, trong
thời gian 3 phút).
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hoạt tính -galactosidase giải phóng
Hình 4.15. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hoạt tính -galactosidase giải phóng
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
600 650 700 750 800 850 900
10 15 20 25 30 t tính riêng (U/mg protein)Hoạ
Hoạt tính (U/g chất khô)
Thời gian xử lý (phút)
Hoạt tính (U/g chất khô) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Thời gian
(phút)
Hoạt tính (U/g chất khô)
Hoạt tính riêng (U/mg protein) 10 747.33±12.22a 3.146±0.091a 15 780.67±21.83b 3.151±0.058a 20 810.70±10.11c 3.599±0.146b 25 790.07±15.28bc 3.250±0.069a 30 702.03±14.833d 2.506±0.134c
Từ hình 4.15, chúng tôi thấy rằng khi tăng thời gian xử lý lần lượt từ 10, 15 đến 20 phút thì hoạt tính -galactosidase thu được tăng từ 747.33, 780.67 đến 810.70
(U/g tế bào khô), sau đó hoạt tính giảm dần khi tiếp tục tăng thời gian xử lý. Hoạt tính riêng cũng tăng khi thời gian xử lý tăng, sau 20 phút xử lý nhiệt hoạt tính riêng đạt giá trị lớn nhất 3.60 (U/ mg protein), sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng thời gian xử lý.
Khi xử lý nhiệt cần có thời gian để các biến đổi bên trong tế bào diễn ra, do đó với thời gian xử lý nhất định hiệu quả giải phóng enzyme sẽ đạt cao nhất. Khi toàn bộ lượng enzyme mong muốn đã được chuyển vị trí ra ngoài, kéo dài thời gian xử lý chỉ làm tăng thời gian enzyme tiếp xúc với nhiệt độ cao, làm tăng khả năng enzyme bị biến tính.
Nghiên cứu trên đối tượng K. lactis của Farkade và Pandit (2005) cũng cho thấy lượng -galactosidase giải phóng tăng khi tăng thời gian xử lý nhiệt và đạt cao nhất sau 8 phút xử lý ở 45 oC (59 U/ml), khi tiếp tục kéo dài thời gian hoạt tính thu được giảm dần.
Như vậy, các kết quả trên cho thấy thông số thích hợp nhất cho quá trình xử lý tế bào L. acidophilus giải phóng -galactosidase là xử lý ở nhiệt độ 45 oC trong thời gian 20 phút.