Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Các phương pháp phân tích
2010; Mahajian và cộng sự, 2012) Phương pháp xác định vị trí β-galactosidase trong tế bào được thực hiện như
sau:
Lấy 0.05 g sinh khối đã được rã đông huyền phù hóa vào 1 ml đệm sodium phosphate 0.05 M (pH 7.0) chứa trong eppendoft. Thêm vào hỗn hợp 1 ml lysozyme nồng độ 10 mg/ml, ủ trong 2 giờ ở 37 oC cho tới khi tế bào L.
acidophilus hình thành hầu như dạng spheroplast (spheroplast là dạng tế bào
trần, đã mất thành bảo vệ).
Ly tâm hỗn hợp 5000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC thu được dịch nổi A và
spheroplast.
Dịch nổi A tiếp tục ly tâm 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC thu được
dịch nổi là periplasmic và cặn dưới là thành tế bào.
Spheroplast xử lý với NaCl 10 mM hòa tan trong đệm sodium phosphate, tạo môi trường nhược trương nhằm phá vỡ màng tế bào. Sau 30 phút đem ly tâm hỗn hợp 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC thu dịch nổi là cytoplasmic và cặn dưới là màng tế bào.
Sơ đồ chi tiết thể hiện qua hình 3.3.
Hình 3.3. Sơ đồ xác định vị trí enzyme β-galactosidase trong tế bào L. acidophilus
Sau khi xử lý thu được bốn phân đoạn cấu trúc tế bào có thể có enzyme β-
galactosidase là thành tế bào, periplasmic, cytoplasmic và màng tế bào.
Xác định hoạt tính β-galactosidase ở bốn phân đoạn trên bằng cơ chất ONPG.
Tính phần trăm hoạt tính ở mỗi vị trí trong tế bào so với tổng hoạt tính.
3.4.2. Xác định hoạt tính β-galactosidase (Ismail và cộng sự, 2010)
Định nghĩa
Một đơn vị hoạt tính của enzyme -galactosidase là tổng lượng enzyme xúc tác chuyển hóa ONPG thành 1 mol ONP trên 1 g tế bào khô trong 1 phút ở 37 oC.
Tế bào L. acidophilus
Xử lý lysozyme
Spheroplast
Xử lý NaCl 10 mM
Dịch nổi (Cytoplasmic)
Màng tế bào Ly tâm 15000 vòng/phút, 20 phút, 4o C
Ly tâm 15000 vòng/phút, 20 phút, 4o C
Thành tế bào Dịch nổi
(Periplasmic)
Dịch nổi A
Nguyên tắc
Hoạt tính -galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme phản ứng với cơ chất tổng hợp ONPG. Dưới tác dụng của enzyme, ONPG sẽ bị thủy phân thành galactose và o-nitrophenol (ONP). ONP khi giải phóng sẽ làm hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu vàng và hấp thu ở bước sóng 420 nm. Phản ứng được dừng lại bằng cách sử dụng dung dịch Na2CO3 10 % để đưa môi trường về pH 11.
Hình 3.4. Phản ứng thủy phân ONPG của β-galactosidase (Clark và cộng sự, 2012)
Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.
3.4.3. Định lượng protein hòa tan (Lowry và cộng sự, 1951)
Nguyên tắc: phương pháp xác định nồng độ protein hòa tan dựa vào phản ứng
Biuret: các liên kết peptide của protein sẽ phản ứng với Cu trong môi trường kiềm để tạo ra Cu+, ion Cu+ tạo ra sẽ phản ứng với thuốc thử Folin tạo thành dung dịch có màu xanh tím, cường độ màu phụ thuộc vào thành phần tyrosin và tryptophan trong protein.
Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.
3.4.4. Xác định hàm lượng chất khô tế bào (Herich, 1992)
Nguyên tắc: sử dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi.
Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.
3.4.5. Phương pháp chụp SEM (Scanning Electron Microscope)
(Goldstein và cộng sự, 2003) Nguyên tắc:
Kính hiển vi điện tử quét hoạt động theo nguyên tắc: súng phóng điện phát ra các điện tử, các điện tử được tăng tốc (thế tăng tốc từ 10 đến 50kV) và hội tụ thành chùm điện tử hẹp nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các
cuộn quét tĩnh điện. Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này. Các bức xạ chủ yếu gồm:
Điện tử thứ cấp (Secondary electrons): là các điện tử phát ra từ bề mặt mẫu với độ sâu chỉ vài nanomet, do vậy chúng tạo ra ảnh hai chiều của bề mặt mẫu.
Điện tử tán xạ ngược (Backscattered electrons): điện tử tán xạ ngược là chùm điện tử ban đầu khi tương tác với bề mặt mẫu bị bật ngược trở lại, ảnh điện tử tán xạ ngược rất hữu ích cho phân tích về độ tương phản thành phần hóa học.