Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
3.3.2. Khảo sát quá trình phá tế bào thu β-galactosidase
Quá trình phá tế bào L. acidophilus thu -galactosidase được mô tả qua sơ đồ
3.2.
Sinh khối sau khi rã đông được tái huyền phù trong dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M (pH = 7.0).
Tiến hành phá tế bào bằng các phương pháp: (1) xử lý tế bào bằng sóng siêu âm; (2) thủy phân thành tế bào bằng enzyme lysozyme; (3) thủy phân thành tế bào
bằng enzyme lysozyme trước, sau đó xử lý siêu âm; (4) xử lý tế bào bằng nhiệt độ trước, sau đó xử lý siêu âm.
Sau quá trình phá vỡ tế bào, ly tâm hỗn hợp 5000 vòng/phút trong 20 phút ở 4
oC để loại các mảnh vỡ tế bào, thu dịch chứa enzyme -galactosidase.
Tiến hành xác định hoạt tính enzyme và nồng độ protein.
Hình 3.2. Sơ đồ quá trình phá tế bào L.acidophilus thu -galactosidase
3.3.2.1. Xử lý tế bào bằng sóng siêu âm
Sử dụng thiết bị siêu âm dạng thanh (Sonics vibracell - VC750) có tần số cố định 20 kHz, công suất tối đa 750 W. Để hạn chế biến tính enzyme do sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu âm, mẫu huyền phù được giữ trong đá lạnh (nhiệt độ mẫu giữ dưới 10 oC) và quá trình siêu âm được thực hiện theo chu kỳ 15 giây, nghỉ 45
giây. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ huyền phù, công suất siêu âm và thời gian siêu âm đến lượng enzyme -galactosidase giải phóng.
a- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ huyền phù
Thông số khảo sát: nồng độ huyền phù thay đổi từ 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15
%(w/v).
Tế bào
L. acidophilus
Rã đông
Tái huyền phù
Phá tế bào
Ly tâm
-galactosidase
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10 oC, công suất siêu âm
300 W, thời gian siêu âm 3 phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
b- Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm
Thông số khảo sát: công suất siêu âm thay đổi từ 225, 263, 300, 338, 375,
413, 450 (W).
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10 oC, thời gian siêu âm 3
phút, nồng độ huyền phù (kết quả từ khảo sát trên).
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
c- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thông số khảo sát: thời gian siêu âm 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 phút.
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10 oC, nồng độ huyền phù
(kết quả từ khảo sát trên), công suất siêu âm (kết quả từ khảo sát trên).
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian và công suất siêu âm, chúng tôi sử dụng mẫu đối chứng là mẫu có nồng độ huyền phù theo kết quả của thí nghiệm khảo sát nồng độ và không xử lý siêu âm.
d- Tối ưu hoá quá trình xử lý siêu âm bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Mục đích: khảo sát sự ảnh hưởng tương tác của các yếu tố đến quá trình giải phóng enzyme -galactosidase và dùng quy hoạch thực nghiệm để tìm ra giá trị của các yếu tố khảo sát đạt hiệu quả xử lý cao nhất.
Tiến hành: từ các giá trị lựa chọn được trong phần thực nghiệm cổ điển, chúng tôi thực hiện phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thực hiện quá trình tối ưu hóa bằng mô hình trực giao cấp hai có tâm xoay với năm thí nghiệm ở tâm. Sử dụng phần mềm Modde phiên bản 5.0 để phân tích kế hoạch thí nghiệm và dữ kiện của quá trình.
3.3.2.2. Xử lý tế bào bằng enzyme lysozyme
Enzyme lysozyme được sử dụng để thủy phân lớp peptidoglycan trên thành tế bào L. acidophilus, lysozyme được pha trong dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M (pH 6.8) có bổ sung NaCl nồng độ 10 mM để tạo môi trường nhược giúp tăng
hiệu quả phá tế bào (Mahajian và cộng sự, 2012). Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lysozyme và thời gian xử lý đến lượng -galactosidase giải phóng.
a- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Thông số khảo sát: nồng độ enzyme thay đổi từ 0.025, 0.05, 0.075, 0.1,
0.125, 0.15 %(w/v).
Thông số cố định: nồng độ huyền phù 5 %(w/v), nhiệt độ 37 oC, thời gian xử
lý 120 phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
b- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme
Thông số khảo sát: thời gian xử lý enzyme thay đổi từ 30, 60, 90, 120, 150,
180 phút.
Thông số cố định: nồng độ huyền phù 5%(w/v), nhiệt độ 37 oC, nồng độ
enzyme (kết quả từ khảo sát trên).
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Trong hai thí nghiệm trên chúng tôi sử dụng mẫu đối chứng là mẫu có nồng độ huyền phù 5 %(w/v) và không xử lý lysozyme.
c- Tối ưu hoá quá trình xử lý enzyme bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Chúng tôi thực hiện quá trình tối ưu hóa hai yếu tố nồng độ và thời gian xử lý enzyme bằng mô hình trực giao cấp hai có tâm xoay với năm thí nghiệm ở tâm. Sử dụng phần mềm Modde phiên bản 5.0 để phân tích kế hoạch thí nghiệm và dữ kiện của quá trình.
3.3.2.3. Xử lý tế bào bằng siêu âm sau khi xử lý lysozyme
Để nâng cao hiệu quả phá tế bào L.acidophilus giải phóng -galactosidase, chúng tôi tiến hành kết hợp phương pháp thủy phân bằng lysozyme và xử lý siêu
âm. Trước hết, chúng tôi xử lý mẫu huyền phù tế bào bằng enzyme lysozyme theo các thông số tối ưu đã xác định được từ thí nghiệm 3.3.2.2, sau đó tiếp tục xử lý mẫu bằng sóng siêu âm. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số siêu âm (công suất và thời gian) đến quá trình xử lý.
a- Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm
Thông số khảo sát: công suất siêu âm thay đổi từ 150, 188, 225, 263, 300,
338, 375 (W).
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10 oC, thời gian siêu âm 3
phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
b- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thông số khảo sát: thời gian siêu âm thay đổi từ 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 phút.
Thông số cố định: thể tích mẫu (15 ml), nhiệt độ (<10 oC), công suất siêu âm
(kết quả từ khảo sát trên).
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Mẫu đối chứng cho hai thí nghiệm này là mẫu đã được xử lý bằng điều kiện lysozyme tối ưu.
c- Tối ưu hoá quá trình xử lý siêu âm sau khi xử lý lysozyme bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Chúng tôi thực hiện quá trình tối ưu hóa hai yếu tố công suất và thời gian siêu bằng mô hình trực giao cấp hai có tâm xoay với năm thí nghiệm ở tâm. Sử dụng phần mềm Modde phiên bản 5.0 để phân tích kế hoạch thí nghiệm và dữ kiện của quá trình.
3.3.2.4. Xử lý tế bào bằng siêu âm sau khi xử lý nhiệt
Chúng tôi xử lý huyền phù tế bào L. acidophilus ở nhiệt độ cao để kích thích sự chuyển vị trí enzyme -galactosidase nội bào, sau đó tiếp tục xử lý bằng sóng siêu
âm để phá tế bào. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt (nhiệt độ, thời gian xử lý) và quá trình siêu âm (công suất, thời gian siêu âm) đến lượng -galactosidase giải phóng.
a- Khảo sát quá trình xử lý nhiệt
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý
Thông số khảo sát: nhiệt độ xử lý thay đổi từ 40, 45, 50, 55, 60 oC.
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, thời gian xử lý nhiệt 20 phút, công
suất siêu âm 300 W, thời gian siêu âm 3 phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý
Thông số khảo sát: thời gian xử lý thay đổi từ 10, 15, 20, 25, 30 phút.
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ xử lý (kết quả từ khảo sát
trên), công suất siêu âm 300 W, thời gian siêu âm 3 phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Mẫu đối chứng cho hai thí nghiệm này là mẫu xử lý bằng siêu âm với công suất 300 W, thời gian 3 phút (không qua giai đoạn xử lý nhiệt).
b- Khảo sát quá trình xử lý siêu âm
Chúng tôi tiến hành xử lý nhiệt tế bào theo điều kiện đã xác định từ thí nghiệm ở trên, sau đó xử lý siêu âm.
Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm
Thông số khảo sát: công suất siêu âm thay đổi từ 188, 225, 263, 300, 338,
375 (W).
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10 oC, thời gian siêu âm 3
phút.
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Thông số khảo sát: thời gian siêu âm thay đổi từ 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 phút
Thông số cố định: thể tích mẫu 15 ml, nhiệt độ <10oC, công suất siêu âm (kết
quả từ khảo sát trên).
Hàm mục tiêu: hoạt tính enzyme -galactosidase.
Mẫu đối chứng cho hai thí nghiệm này là mẫu chỉ được xử lý nhiệt mà không xử lý siêu âm.
Tối ưu hoá quá trình xử lý siêu âm sau khi xử lý nhiệt bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Chúng tôi thực hiện quá trình tối ưu hóa hai yếu tố công suất và thời gian siêu bằng mô hình trực giao cấp hai có tâm xoay với năm thí nghiệm ở tâm. Sử dụng phần mềm Modde phiên bản 5.0 để phân tích kế hoạch thí nghiệm và dữ kiện của quá trình.