2.3. Các phương pháp phá tế bào
2.3.1. Phương pháp cơ học
Nguyên lý chung của các phương pháp cơ học là xử lý tế bào dưới điều kiện ma sát hoặc áp lực cao khi tế bào tiếp xúc với tác nhân xử lý. Tác động gây nên sự phá vỡ tế bào là hiện tượng sủi bong bóng, sự va chạm, lực cắt, hoặc sự kết hợp giữa các tác động trên. Làm lạnh sâu huyền phù tế bào trong quá trình xử lý là điều cần thiết để loại nhiệt sinh ra do tác động cơ học.
2.3.1.1. Nghiền bi
Phương pháp này phù hợp để phá tế bào ở cả quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp (Doucha và Livansky, 2008). Đây là phương pháp đơn giản và khá hiệu quả đối với nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Cấu tạo cơ bản của thiết bị gồm:
một khoang nghiền (nằm ngang hoặc dọc) và một trục xoay ở trung tâm. Trục xoay này được gắn với máy khuấy để truyền động lực đến các hạt nhỏ trong khoang nghiền, làm chúng va chạm vào nhau, giúp phá vỡ tế bào và giải phóng các hợp chất
Phương pháp phá tế bào
Phương pháp cơ học Phương pháp không cơ học
Xử lý rắn Xử lý lỏng Vật lý Hóa học Enzyme
- Nghiền bi - X-press - Hughes press
- Sóng siêu âm - Đồng hóa áp
lực cao - Frenh press
- Sốc nhiệt - Sốc thẩm
thấu - Giảm áp lực
- Kháng sinh - Chất tẩy - Dung môi - Chất kìm
hãm
- Enzyme thủy phân - Tự phân
(Doucha và Livansky, 2008). Các enzyme có vị trí trong tế bào chất (cytoplasm) được thu nhận bằng cách sử dụng các hạt bi nhỏ, đối với enzyme có vị trí giữa màng tế bào và tế bào chất (bound to cytoplasmic membrane) hay trong không gian chu chất (periplasmic) thường sử dụng các hạt bi có kích tước lớn hơn vì không yêu cầu phá vỡ hoàn toàn tế bào. Các hạt bi có đường kính 0.1 - 0.15 mm được xem là tối ưu để phá vỡ tế bào vi khuẩn trong khi đường kính phù hợp để phá tế bào nấm men là 0.25 - 0.75 mm. Các loại máy trong công nghiệp thường sử dụng các hạt bi có đường kính 0.4 - 0.6 mm để thuận tiện trong việc phân tách các hạt bi ra khỏi huyền phù tế bào.
2.3.1.2. Đồng hóa áp lực cao
Phá tế bào bằng phương pháp đồng hóa áp lực cao được thực hiện bằng cách nén huyền phù tế bào dưới áp lực cao qua một khe hẹp. Thông số quyết định hiệu quả của quá trình là áp lực hoạt động, số lần mẫu huyền phù đi qua khe, nhiệt độ huyền phù, và thiết kế khe hẹp. Phương pháp này phá vỡ tế bào không đặc hiệu, áp lực sử dụng thường nằm trong khoảng 55 - 200 MPa và hiệu quả phá tế bào không phụ thuộc vào nồng huyền phù ban đầu trong một khoảng rộng (Bury và cộng sự, 2001).
Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường được sử dụng để phá tế bào vi khuẩn và nấm men ở quy mô công nghiệp, ứng dụng trong công nghiệp dược và công nghệ sinh học. Nhược điểm của phương pháp này là khó điều khiển nhiệt độ trong quá trình xử lý nên ít được sử dụng để tách chiết những thành phần nhạy cảm.
2.3.1.3. Sóng siêu âm
a- Định nghĩa
Sóng siêu âm là âm thanh có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (18 - 500 kHz) (Ohlsson và Bengtsson, 2002).
Hình 2.6. Khoảng tần số của siêu âm (Kuldioke, 2002)
b- Tác động phá vỡ tế bào của sóng siêu âm
Sóng siêu âm là một trong những phương pháp phá tế bào được sử dụng rộng rãi nhất ở quy mô thí nghiệm (Borthwick và cộng sự, 2005; Gogate và Kabadi, 2009). Quá trình xử lý siêu âm có thể phá vỡ hoàn toàn tế bào vi sinh để thu nhận tất cả các enzyme nội bào, hoặc chỉ “xé rách” (shear-driven) thành tế bào và kết quả là chỉ có enzyme hiện diện ở thành tế bào hoặc periplasmic được thu nhận
(Balasundaram và Pandit, 2001).
Sóng siêu âm tác động theo chu kỳ, trong một chu kỳ có hai pha nén và giãn. Ở cường độ siêu âm cao, áp suất cục bộ trong pha giãn của chu kỳ sẽ thấp hơn áp suất hơi của chất lỏng làm hình thành những bong bóng nhỏ, những bong bóng này sẽ lớn dần lên. Trong pha nén, bong bóng bị co lại một phần. Quá trình nén và giãn diễn ra liên tục, bong bóng trở nên lớn hơn qua một vài chu kỳ và khi đạt đến kích thước tới hạn bong bóng sẽ nổ. Khi bong bóng nổ, vùng vi môi trường xung quanh bong bóng có thể đạt đến nhiệt độ 5000oK và áp suất 1000 atm, từ đó gây ra sự hỗn loạn trong vùng sủi bong bóng và tạo ra một sóng năng lượng có lực cắt lớn. Lực
cắt này tạo nên những cơn lốc xoáy. Trường hợp các cơn lốc xoáy được hình thành có kích thước lớn hơn kích thước tế bào, huyền phù tế bào sẽ bị khuấy trộn mạnh.
Khi những cơn lốc xoáy được hình thành có kích thước nhỏ hơn, sẽ có khả năng sinh ra lực phá vỡ tế bào. Theo đó, các tế bào có kích thước lớn sẽ dễ bị phá vỡ hơn so với các tế bào có kích thước nhỏ.
Hình 2.7. Diễn biến hiện tượng sủi bong bóng (Laborde và cộng sự, 1998)
c- Những thông số của quá trình siêu âm ảnh hưởng đến hiệu quả phá tế
bào
Công suất siêu âm
Khi tăng công suất siêu âm sẽ làm tăng sự hình thành những cơn lốc xoáy nhỏ,
từ đó tăng hiệu quả quá trình phá tế bào. Đã có nhiều nghiên cứu chứng tỏ lượng protein được giải phóng tăng tuyến tính với sự tăng công suất siêu âm như khi xử lý mẫu huyền phù tế bào nấm men (200 ml) với công suất từ 67 - 187 W (James và cộng sự, 1972) hay xử lý huyền phù tế bào E. coli (5 - 30 ml) sử dụng công suất 35 - 95 W (Feliu và cộng sự, 1998).
Thể tích mẫu
Khi tăng thể tích mẫu thì hiệu quả thu nhận protein nội bào giảm (Feliu và cộng
sự, 1998). Sự tăng thể tích mẫu sẽ làm giảm năng lượng phân bố trên một đơn vị thể tích, điều này dẫn đến hình thành những cơn lốc xoáy lớn hơn và giảm số lượng những cơn lốc xoáy trên một đơn vị thể tích, từ đó giảm hiệu quá phá vỡ tế bào.
Nồng độ tế bào
Nồng độ ban đầu của huyền phù tế bào trong một giới hạn nhất định được ghi nhận là không tác động đến hiệu quả phá tế bào như nghiên cứu của Kuboi và cộng sự (1995) trên mẫu huyền phù E.coli nồng độ 3.5 - 20 g/l. Hằng số tốc độ giải
phóng protein xác định được tăng tuyến tính với công suất siêu âm và giảm tuyến tính với thể tích mẫu (kiểm tra với thể tích 2.5 - 10 ml).
Nhiệt độ
Hầu hết năng lượng siêu âm được hấp thu vào trong huyền phù tế bào sẽ gây ra sự tăng nhiệt độ, điều khiển được nhiệt độ trong quá trình xử lý là điều rất quan trọng trong quá trình thu nhận các sản phẩm nội bào, đặc biệt là các sản phẩm nhạy cảm với nhiệt như enzyme.
Bảng 2.3. Hiệu quả phá tế bào của các phương pháp cơ học đối với Lactobacillus sp.
(Geciova và cộng sự, 2002)
Vi sinh vật Phương pháp (thiết
bị/thông số)
Môi trường sinh trưởng/xử lý trước khi phá tế
bào
Hiệu suất (%) Tham khảo
L. delbrueckii subsp.
bulgaricus (ATCC
11842)
Sóng siêu âm (Braun-Sonic 2000/75W)
MRS broth 18 - 24 giờ nuôi
cấy
89
Kreft và cộng sự (2001)
L.delbrueckii subsp.
bulgaricus 2515
Đồng hóa áp lực cao (MSK cell homogenizer - hạt
thủy tinh đường kính 0.1 mm, 90
giây)
MRS broth, 16 giờ >99.9
Shah và Lankaputhra
(1997)
L.delbrueckii subsp.
bulgaricus
Sóng siêu âm (Sonic dismembrator 300 -
(16 kHz, 4 phút)
Môi trường chứa 12% sữa hoàn nguyên, 18 giờ
>99.9 Shah và
Jelen (1991)
Hiệu suất được tính dựa trên số lượng tế bào đếm được trước và sau quá trình phá vỡ (cfu/ml)