2.3. Các phương pháp phá tế bào
2.3.2. Phương pháp không cơ học
Phương pháp không cơ học được ứng dụng ở quy mô giới hạn hơn so với phương pháp cơ học (Denis và cộng sự, 2009).
2.3.2.1. Phương pháp vật lý
Hai phương pháp vật lý thường được sử dụng để phá vỡ tế bào là sốc thẩm thấu và sốc nhiệt (Chen và cộng sự, 2004; Ren và cộng sự, 2007a, b). Đối với phương pháp sốc thẩm thấu, huyền phù tế bào được pha loãng sau khi làm cân bằng trong áp suất thẩm thấu cao. Phương pháp sốc nhiệt liên quan đến xử lý nhiệt tế bào vi sinh vật. Ngoài ra, còn có phương pháp làm giảm áp lực (decompression), dựa trên nguyên tắc đưa áp lực ở mức siêu tới hạn (supercritical gas) vào trong tế bào, khi áp
lực này giải phóng sẽ gây ra sự phá vỡ tế bào. Những phương pháp trên có đặc điểm là quá trình xử lý nhẹ nhàng, tế bào bị phá vỡ thành những mảnh lớn thuận lợi cho quá trình phân tách các dung dịch protein, enzyme hay các sản phẩm sinh học.
Nhược điểm của chúng là trong hầu hết trường hợp xử lý hiệu quả thu được không cao.
2.3.2.2. Phương pháp hóa học
Thành ngoài của vi sinh vật có thể được làm tăng tính thấm bằng các loại hóa chất khác nhau, các loại hóa chất này có tính chọn lọc và có hiệu quả khác nhau đối với từng loài. Quá trình tăng tính thấm được thực hiện bằng các loại kháng sinh, tác nhân kìm hãm (chelating agents), chất tẩy, dung môi, hydroxide, hypochlorite...
(Doolan và Wilkinson, 2009). Quá trình này xảy ra dựa trên phản ứng có chọn lọc của các loại hóa chất với các thành phần của tế bào, từ đó cho phép các protein thấm
qua thành tế bào.
Quá trình làm tăng tính thấm bằng các dung môi hay chất tẩy rửa được báo cáo là không hiệu quả trong việc thu nhận các enzyme nội bào. Hơn nữa, về mặt ứng dụng trong thực phẩm, xử lý bằng hóa chất thường dẫn đến các vấn đề không mong muốn.
Bảng 2.4. So sánh một số phương pháp xử lý tế bào bằng hóa chất (Geciova và cộng sự,
2002)
Loại hóa chất Ví dụ Tác động Chú ý
Kháng sinh -lactam antibiotics
(penicillin)
Cationic polypeptide (polymyxin)
Vi khuẩn Gram âm: thủy phân peptidoglycan
Liên kết và làm biến đổi màng tế bào chất
Hiệu quả phụ thuộc trạng thái của canh trường, giá thành cao
Hiệu quả phụ thuộc trạng thái của canh trường, giá thành cao, sử dụng kết hợp với lysozyme (Dean và Ward, 1992)
Tác nhân kìm hãm
EDTA Vi khuẩn Gram âm: liên kết
với Mg2+ và Ca2+ dẫn đến
Hiệu quả đối với một số loài đặc biệt, chịu ảnh
giải phóng phân tử lipopolysaccharide
hưởng bởi các loại dung dịch đệm, không tác động vào bên trong màng; sử dụng kết hợp với lysozyme (Dean và Ward, 1992)
Chaotropes Urea
Guanidine Ethanol
Làm giảm tương tác của các chất hòa tan, làm tan màng protein
Phá hủy liên kết hydro - ức chế sự tập hợp của các liên kết ngang trong peptidoglycan
Nồng độ khác nhau đối với các loài khác nhau
Sử dụng kết hợp với toluene
Sử dụng để tăng tính thấm cho canh trường
Streptococcus thermophilus (Somkuti và cộng sự, 1998)
Chất tẩy Triton X (100, 114);
non-ionic Sodium dodecyl sulphate (SDS); anionic Brij series (58); non-ionic Sodium lauryl sarcosinate
(Sarcosyl)-anionic
Tạo thành hỗn hợp các micell chứa lipid từ màng.
Sử dụng chủ yếu đối với vi
khuẩn Gram âm, ít hiệu quả đối với nấm men; đã được
kiểm chứng với
Streptococcus thermophilus
(Somkuti và Steinberg, 1994)
Sử dụng kết hợp với EDTA, chaotropes, có thể
làm biến tính protein (bởi SDS), tác động không chắc chắn (Triton X-100);
chủ yếu sử dụng thu nhận những protein màng đặc biệt
Dung môi Toluene
Chloroform Acetone
Hòa tan các thành phần kỵ nước ở vi khuẩn Gram âm
(phospholipid trong màng);
được hỗ trợ bởi EDTA Trích ly các protein periplasmic ở vi khuẩn Gram âm
Hiệu quả phụ thuộc vàp điều kiện, nồng độ, loài vi sinh vật, độc, giá thành cao
Kết hợp với SDS; trích ly các protein tế bào chất
(cytoplasmic) ở vi khuẩn Gram dương
Hydroxide và hypochlorite
Sodium hydroxide và sodium hypochlorite
Xà phòng hóa lipid trong thành tế bào
Rẻ và hiệu quả, sản phẩm có thể bị biến tính ở pH cao
2.3.2.3. Phương pháp enzyme
Thủy phân thành tế bào bằng enzyme là phương pháp phá tế bào đặc hiệu và nhẹ nhàng (Ablain và cộng sự, 2009). Tự phân hoặc sử dụng các enzyme thủy phân từ bên ngoài là hai phương pháp thường được sử dụng nhất.
a- Tự phân
Kỹ thuật tự phân thường sử dụng đối với nấm men, mặc dù vậy tỷ lệ tự phân có thể chấp nhận chỉ xuất hiện trong những điều kiện xử lý đặc biệt. Để khởi động quá trình tự phân ở những vi sinh vật khác như E. coli, phải sử dụng kháng sinh để làm thoái hóa cấu trúc peptidoglycan, tăng trạng thái xốp của thành tế. Tuy nhiên, để sử dụng sản phẩm cho các ứng dụng trong thực phẩm thì quá trình xử lý kháng sinh lại gây ra nhiều vấn đề không mong muốn.
b- Enzyme thủy phân
Enzyme lysozyme (EC 3.2.1.17) có khả năng phân giải liên kết -1,4-glycoside nên được sử dụng để thủy phân lớp peptidoglycan trên thành tế bào vi sinh vật trong quá trình thu nhận các sản phẩm nội bào. Nguồn lysozyme thương mại với giá cả phù hợp được sản xuất từ lòng trắng trứng. Khi sử dụng lysozyme, vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng hơn so với Gram dương vì lớp lipopolysaccharide bên ngoài sẽ bảo vệ lớp peptidoglycan khỏi tác động của enzyme. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa lysozyme và EDTA khi xử lý vi khuẩn Gram âm cho phép phá vỡ lớp
lipopolysaccharide, từ đó tấn công vào lớp peptidoglycan.
Nhược điểm của các phương pháp xử lý enzyme là chi phí cao khi áp dụng ở quy mô lớn.
Để quá trình phá tế bào đạt hiệu quả tối đa, có thể kết hợp hai hay nhiều phương pháp xử lý với nhau (Anand và cộng sự, 2007; Chaves-Lopez và cộng sự, 2009;
Shynkaryk và cộng sự, 2009). Hầu hết các nghiên cứu đã được công bố tập trung
vào quá trình phá tế bào E. coli (vi khuẩn Gram âm), Bacillus subtilis (vi khuẩn
Gram dương, sinh bào tử), hay nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis), những tài liệu về các vi sinh vật khác còn tương đối ít (Ren và cộng sự,
2007a; Anand và cộng sự, 2007; Ho và cộng sự, 2008; Chaves-Lopez và cộng sự, 2009; Shynkaryk và cộng sự, 2009)