Gần đây, các trình tự 16S ribosomal DNA rDNA, là trình tự mã hóa cho thành phần chính 16S rRNA của ribosome - cơ quan chính yếu tham gia thực hiện quá trình dịch mã tạo các protein trong
GIỚI THIỆU 1
E coli và Shigella là các vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến hiện nay ở người và động vật, thường gây ra những triệu chứng giống nhau như viêm đường ruột, tiêu chảy ra máu, mất nước, …., và bệnh thường được điều trị cấp tốc bằng kháng sinh thích hợp Trên thực tế, vi khuẩn của một trong hai loài này có thể mẫn cảm với một số loại kháng sinh và kháng một số loại khác và loài kia có thể mẫn cảm và kháng ngược lại Việc xác định chính xác các tác nhân gây bệnh này hiện đang gặp khó khăn do tính gần gũi của chúng về mặt di truyền, vì thế việc điều trị bệnh bằng kháng sinh thường không đạt hiệu quả tốt Do đó, việc nghiên cứu tìm hiểu để đưa ra được một phương pháp xác định nhanh và chính xác các vi khuẩn gây bệnh này là quan trọng và cấp thiết cho việc điều trị bệnh đúng hướng và hiệu quả bằng kháng sinh
Theo cách truyền thống, Shigella thường được nhận biết bằng các test sinh hóa kết hợp với serotyping [1-3] Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp truyền thống này hiện đang gặp khó khăn vì một số chủng Shigella lại hiếu khí giống như E coli, trong khi một số chủng E coli lại âm tính với lên men lactose, yếm khí và không di động như Shigella [4] Mặt khác, một số chủng Shigella lại có các nhóm serotype giống như của E coli [4, 5]
Gần đây, các trình tự 16S ribosomal DNA (rDNA), là trình tự mã hóa cho thành phần chính 16S rRNA của ribosome - cơ quan chính yếu tham gia thực hiện quá trình dịch mã tạo các protein trong tế bào, được đưa vào sử dụng để xác định nhanh các loài vi khuẩn vì các trình tự này được biết đến là đặc trưng cho mỗi loài Tuy nhiên, phương pháp này lại không đặc hiệu cho việc phân biệt các loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi về mặt di truyền như E coli và Shigella [6]
Nghiên cứu này nhằm đưa ra và chứng minh rằng các trình tự 23S rDNA - cũng là một trình tự mã hóa cho một thành phần chính khác (23S rRNA) của ribosome - có thể được ứng dụng để phân biệt chính xác vi khuẩn E coli và Shigella, giúp cho việc điều trị các bệnh gây ra bởi các loài vi khuẩn này bằng kháng sinh đúng hướng và kịp thời Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp chi tiết về trình trạng đột biến trong các trình tự 16S và 23S rDNA Các chủng vi khuẩn của hai loài này có chung một số lớn các vị trí cũng như kiểu đột biến trong các trình tự 16S và 23S rDNA của chúng Tuy vậy, tỉ lệ các điểm đột biến trong các trình tự 23S rDNA thấp hơn nhiều so với trong các trình tự 16S rDNA Đồng thời, các đột biến trong các trình tự 23S xảy ra theo cách mang tính đặc trưng loài hơn so với trong các trình tự 16S
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 A VẬT LIỆU 2
Các trình tự 16S và 23S rDNA của các chủng E coli và Shigella (Bảng 1) được lấy từ ngân hàng gene NCBI
Bảng 1 Các chủng vi khuẩn chứa các trình tự được sử dụng cho nghiên cứu
Số RefSeq accession Tên vi khuẩn AC_000091 Escherichia coli str K-12 substr W3110
NC_000913 Escherichia coli str K-12 substr MG1655
NC_002695 Escherichia coli O157:H7 str Sakai
PHƯƠNG PHÁP 2 1 Phân tích đột biến 2
Phân tích mối quan hệ giữa các vi khuẩn 3
Mối quan hệ của các chủng vi khuẩn được phân tích ở mức độ DNA cho các trình tự 16S hoặc 23S Các trình tự được so sánh nhờ chương trình CLUSTALW Các phép phân tích về mối quan hệ loài và tiến hóa ở mức độ phân tử được thực hiện bằng phần mềm MEGA thế hệ thứ 4 [14] Cây hệ thống (phylogenetic tree) được xây dựng bằng phương pháp Neighbor – Joining, áp dụng mô hình thay thế nucleotide và khoảng cách giữa các trình tự (p-distance) tính theo transitions và transversions, với các vị trí trống được loại bỏ Cây hệ thống ban đầu, tức cây không có bootstrapping (là phương thức xây dựng lại các cây hệ thống bằng cách thay thế ngẫu nhiên các nucleotide trong các trình tự), được sử dụng để tính toán khoảng cách giữa các trình tự với nhau hoặc giữa các nhóm trình tự với nhau p-distance giữa hai trình tự được xác định bằng cách chia số vị trí tại đó nucleotide trong hai trình tự là khác nhau cho chiều dài được so sánh của hai trình tự Để tính khoảng cách giữa hai nhóm trình tự, p-distance giữa mỗi trình tự trong một nhóm với mỗi trình tự trong nhóm kia được xác định trước, sau đó tính khoảng cách trung bình từ các p-distance của các cặp trình tự này.
KẾT QUẢ 3 1 Ứng dụng các trình tự 23S rDNA để phân biệt E coli và Shigella 3
a) Phân bi ệ t E coli và Shigella s ử d ụ ng các trình t ự 16S rDNA Ở cây hệ thống trình bày trong Hình 1, có thể thấy rằng không thể phân biệt các loài E coli và Shigella bằng cách sử dụng các trình tự 16S rDNA Ba trong số sáu nhóm của cây hệ thống chứa các trình tự của cả hai loài Bảng phụ 5 cho thấy khoảng cách trung bình giữa một nhóm chứa các trình tự của cả hai loài (Gp16_5) với một nhóm chỉ chứa các trình tự của Shigella (Gp16_4) thấp hơn khoảng cách trung bình giữa hai nhóm chỉ chứa các trình tự của Shigella
(Gp16_3 and Gp16_4) Như trình bày ở các Bảng phụ 6, 7 và 8, một số các trình tự từ các chủng cùng loài có khoảng cách với nhau xa hơn khoảng cách giữa các trình tự từ các chủng khác loài
Trình tự 16S rDNA cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa E coli và Shigella Tuy nhiên, trình tự 23S rDNA lại có thể phân biệt rõ ràng giữa hai loài này Điều này cho thấy trình tự 23S rDNA có độ phân giải cao hơn trình tự 16S rDNA trong việc phân biệt các loài vi khuẩn gần gũi nhau.
Hình 2 cho thấy mối quan hệ của các vi khuẩn trên cơ sở các trình tự 23S rDNA Một cách tương đối, cây hệ thống 23S được chia làm bảy nhóm, nhưng không có nhóm nào chứa các trình tự của các chủng của cả hai loài Các khoảng cách trung bình giữa các nhóm cũng đều hơn so với ở cây tiến hóa được xây dựng trên cơ sở các trình tự 16S Khoảng cách trung bình ngắn nhất giữa hai nhóm trong cây này là 0.0034 (Bảng phụ 9), trong khi khoảng cách trung bình ngắn nhất giữa hai nhóm trong cây 16S chỉ là 0.0013 (Bảng phụ 5)
Hình 2 Cây hệ thống biễu diễn mối quan hệ của các chủng vi khuẩn E coli và Shigella với nhau trên cơ sở các trình tự 23S rDNA
2 Chứng minh việc sử dụng các trình tự 23S rRNA trong phân biệt E coli và Shigella là đúng đắn và có cơ sở khoa học a) Xác đị nh t ỉ l ệ độ t bi ế n trong các trình t ự 16S và 23S rRNA c ủ a các ch ủ ng E coli và Shigella
Bảng 2 Tỉ lệ các điểm đột biến trong các trình tự 16S and 23S rDNA của E coli and Shigella
Chiều dài các trình tự (bp) Tỉ lệ các điểm transitions- transversions (%)
Tỉ lệ các điểm insertions (%) Tỉ lệ các điểm deletions (%)
E coli Shigella E coli Shigella E coli Shigella E coli Shigella
5 Sự khác nhau giữa các trình tự rDNA của các vi khuẩn trong Bảng 1 so với các trình tự chuẩn được trình bày trong các Bảng phụ 1, 2, 3 và 4 Có thể thấy từ các bảng phụ này rằng tại phần lớn các vị trí đột biến trong mỗi loại trình tự, không phải tất cả các trình tự được nghiên cứu đều bị đột biến
Như trình bày trong Bảng 2, Shigella có tỉ lệ các điểm đột biến trong các trình tự 16S và 23S thấp hơn nhiều so với E coli Đối với các trình tự 23S, E coli có insertions và deletions, trong khi Shigella thì không có (xem thêm các Bảng phụ 1, 2, 3 và 4) Hơn nữa, tỉ lệ các điểm đột biến transitions và transversions trong các trình tự 23S thấp hơn nhiều so với trong các trình tự 16S 7 trong số 42 trình tự 23S có nucleotide T bị xóa ở vị trí 1174, vì thế tỉ lệ các điểm bị xóa nucleotide là 0,03% Các kết quả cho thấy rằng các trình tự 23S rDNA tiến hóa chậm hơn so với các trình tự 16S rDNA b) Xác đị nh các độ t bi ế n chung và riêng trong các trình t ự 16S và 23S rDNA gi ữ a E coli và Shigella
Hình 3 Sự phân bố của các vị trí đột biến trong các trình tự 16S rDNA của E coli và Shigella Màu đỏ và màu xanh lần lượt là % số trình tự của 16S rDNA của E coli và Shigella
Chứng minh sự tiến hóa của 23S rDNA mang tính đặc trưng loài hơn sự tiến hóa của 16S
Ở cả E coli và Shigella, bộ gene của mỗi chủng có bảy rDNA operon Mỗi operon chứa một phiên bản 16S và một phiên bản 23S Trong mỗi chủng, chúng tôi tìm thấy rằng số phiên bản 23S có chung các đột biến mang tính đặc trưng loài, tức là các đột biến riêng biệt cho mỗi loài, cao hơn số phiên bản 16S có chung các đột biến riêng biệt cho mỗi loài (Bảng 3 và 4, Hình 3 và 4) Các bảng 3 và 4 chỉ trình bày các đột biến transitions và transversions
Bảng 3 Đột biến riêng biệt ở các trình tự 16S và 23S rDNA của E coli
16S rDNA E coli 23S rDNA E coli Đột biến * % số trình tự Đột biến * % số trình tự Đột biến * % số trình tự
Hướng dẫn phân lập các trình tự 23S rDNA từ các mẫu xét nghiệm 9 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 10 V PHỤ LỤC 11 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
Hình 5 cho thấy một phần kết quả so sánh các trình tự rDNA operon đầu tiên của ba chủng
E coli và hai chủng Shigella
Có thể thấy rằng ở hai đầu của trình tự 23S có sự tương đồng nucleotide ở hai loài Vì thế, có thể thiết kế các primer để phân lập các trình tự 23S rDNA từ các mẫu xét nghiệm nghi vấn có
E coli hoặc Shigella bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Các trình tự sau khi phân lập cần được giải mã nucleotide Các trình tự 23S sau khi giải mã có thể được sử dụng để nhận biết mẫu có chứa vi khuẩn E coli hoặc Shigella dựa theo phương pháp đã trình bày trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu, với các trình tự 23S đã biết làm đối chứng
Hình 5 Sự tương đồng nucleotide ở hai đầu các trình tự 23S rDNA Các operon rDNA đầu tiên của ba chủng E coli và hai chủng Shigella được so sánh bằng phần mềm CLUSTALW [7] Các số RefSeq accession chỉ bộ gene của từng chủng vi khuẩn Các con số trên đầu các nucleotide chỉ vị trí của các nucleotide tương ứng trong operon rDNA sau khi so sánh Hai dấu mũi tên thẳng đứng (màu đen) lần lượt là vị trí bắt đầu và kết thúc các trình tự 23S rDNA Hai dấu mũi tên nằm ngang (màu đỏ) lần lượt là vị trí an toàn để thiết kế primer xuôi và primer ngược cho phản ứng phân lập trình tự 23S rDNA từ mẫu xét nghiệm bằng phương pháp PCR
I V KChúng tôi vừa trình bày tình trạng đột biến trong các trình tự 16S và 23S rDNA của hai loài ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ vi khuẩn có quan hệ gần gũi E coli và Shigella Các trình tự rDNA của hai loài này có chung một số các vị trí đột biến So với E coli, các trình tự rDNA của Shigella ít bị đột biến hơn Ở cả hai loài, tỉ lệ các điểm đột biến trong các trình tự 23S thấp hơn trong các trình tự 16S Đồng thời, các trình tự 23S của mỗi loài có chung nhiều đột biến riêng biệt mang tính đặc trưng loài hơn so với các trình tự 16S Các kết quả này cho thấy trong các loài này các trình tự 23S rDNA tiến hóa chậm hơn các trình tự 16S rDNA, và các trình tự 23S cũng tiến hóa theo cách mang tính đặc trưng loài hơn Với việc ứng dụng phương pháp Neighbor – Joining and p-distance trong phân tích mối quan hệ của các loài, chúng tôi chỉ ra rằng các trình tự 23S rDNA của E coli và Shigella có thể được sử dụng để phân biệt hai loài này với nhau, điều mà từ trước đến nay vẫn chưa được giải quyết để định hướng đúng việc sử dụng kháng sinh trị bệnh gây ra bởi từng loài Các trình tự 23S rDNA đã được giải mã và các đột biến đã được phân tích là nguồn tham khảo tốt cho việc phân biệt hai loài vi khuẩn này
Bảng phụ 1 Tình trạng đột biến trong các trình tự 16S rDNA của vi khuẩn E coli Dòng đầu tiên là số RefSeq accession của các bộ gene E coli ở ngân hàng gene GeneBank Nucleotide đứng trước mỗi con số là của trình tự 16S rDNA chuẩn của vi khuẩn E coli tại vị trí chỉ định bởi con số đó Đứng sau mỗi con số là nucleotide của trình tự 16S rDNA của vi khuẩn E coli tại vị trí được chỉ định bởi con số Nucleotide trong ngoặc móc {} là insertion sau vị trí chỉ định bởi con số đứng phía trước Y, R, W, K và M tương ứng là C hoặc T, A hoặc G, A hoặc T, G hoặc T và A hoặc C Dấu / chỉ các đột biến thay thế tại các vị trí chỉ định bởi các con số Các số từ 1 đến 7 từ cột thứ hai trở đi chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene Các con số trong ngoặc đơn (), ngoặc đơn kép (()) từ cột thứ hai trở đi chỉ số phiên bản rDNA có nucleotide nằm trong các ngoặc tương ứng ở cột thứ nhất
NC_000091 NC_000913 NC_002655 NC_002695 NC_004431 NC_008563
Shigella ở ngân hàng gene GeneBank Đứng trước mỗi con số là nucleotide của trình tự 16S rDNA chuẩn của vi khuẩn E coli tại vị trí chỉ định bởi con số đó Nucleotide đứng sau mỗi con số là của trình tự 16S rDNA của vi khuẩn Shigella tại vị trí được chỉ định bởi con số Nucleotide trong ngoặc móc {} là insertion sau vị trí chỉ định bởi con số đứng phía trước Các số từ 1 đến 7 từ cột thứ hai trở đi chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene Các con số trong ngoặc đơn () ở cột thứ sáu chỉ số phiên bản rDNA có nucleotide nằm trong các ngoặc đơn tương ứng ở cột thứ nhất
NC_004337 NC_007384 NC_008258 NC_004741 NC_007613
17 ở ngân hàng gene GeneBank Nucleotide đứng trước mỗi con số là của trình tự 23S rDNA chuẩn của vi khuẩn E coli tại vị trí chỉ định bởi con số đó Nucleotide đứng sau mỗi con số là của trình tự 23S rDNA của vi khuẩn E coli tại vị trí được chỉ định bởi con số Nucleotide trong ngoặc móc {} là insertion sau vị trí chỉ định bởi con số đứng phía trước ∆ nghĩa là nucleotide đứng sau nó đã bị xóa tại vị trí được chỉ định bởi con số đứng sau nucleotide Y, R, W, B, S, K và M tương ứng là C hoặc T, A hoặc G, A hoặc T, C hoặc G hoặc T, C hoặc G, G hoặc T và A hoặc C
Dấu / chỉ các đột biến thay thế tại các vị trí chỉ định bởi các con số Các số từ 1 đến 7 từ cột thứ hai trở đi chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene Các con số trong ngoặc đơn (), ngoặc đơn kép (()) và ((())) từ cột thứ hai trở đi chỉ số phiên bản rDNA có nucleotide nằm trong các ngoặc đơn tương ứng ở cột thứ nhất
AC_000091 NC_000913 NC_002655 NC_002695 NC_004431 NC_008563
Shigella ở ngân hàng gene GeneBank Nucleotide đứng trước mỗi con số là của trình tự 23S rDNA chuẩn của vi khuẩn E coli tại vị trí chỉ định bởi con số đó Nucleotide đứng sau mỗi con số là của trình tự 23S rDNA của vi khuẩn Shigella tại vị trí được chỉ định bởi con số Từ cột thứ hai trở đi, các số từ 1 đến 7 chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene
NC_004437 NC_004741 NC_007384 NC_007613 NC_008258
23 Hình 3 Các con số với các ký hiệu † và ‡ ở phía trên bên phải tương ứng là khoảng cách gần nhất giữa một nhóm chỉ chứa các trình tự của
Shigella (Gp16_4) với một nhóm chứa các trình tự của cả hai loài (Gp16_5) và với một nhóm chỉ chứa các trình tự của Shigella (Gp16_3)
Gp16_1 Gp16_2 Gp16_6 Gp16_5 Gp16_3
24 RefSeq accession tương ứng chỉ các trình tự của E coli và Shigella Các con số đứng sau các số RefSeq accession chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene của mỗi chủng vi khuẩn Có thể thấy rằng các trình tự 16S rDNA từ các chủng vi khuẩn của cùng loài có khoảng cách ít nhiều xa nhau hơn so với khoảng cách giữa các trình tự từ các vi khuẩn của hai loài
Bảng phụ 7 Khoảng cách giữa các trình tự 16S rDNA trong nhóm Gp16_2 ở Hình 3 Các chữ số E và S đứng trước số RefSeq accession tương ứng chỉ các trình tự của E coli và Shigella Các con số đứng sau các số RefSeq accession chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene của mỗi chủng vi khuẩn
S_NC_004337_1 0.0019 0.0026 0.0019 0.0026S_NC_004337_2 0.0019 0.0026 0.0019 0.0026 0.0000S_NC_004741_2 0.0019 0.0026 0.0019 0.0026 0.0013 0.0013S_NC_004741_3 0.0026 0.0006 0.0026 0.0006 0.0019 0.0019 0.0019S_NC_007384_5 0.0013 0.0019 0.0013 0.0019 0.0006 0.0006 0.0006 0.0013S_NC_007613_1 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0032S_NC_007613_2 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0000S_NC_007613_3 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0032 0.0000 0.0000S_NC_007613_5 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0032 0.0000 0.0000 0.0000S_NC_007613_6 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0032 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000S_NC_007613_7 0.0032 0.0039 0.0032 0.0039 0.0039 0.0039 0.0039 0.0032 0.0032 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
26 trước số RefSeq accession tương ứng chỉ các trình tự của E coli và Shigella Các con số đứng sau các số RefSeq accession chỉ các phiên bản rDNA theo thứ tự vị trí của chúng trong bộ gene của mỗi chủng vi khuẩn
E_AC_000091_6 E_NC_000913_4 S_NC_004337_4 S_NC_007384_4 S_NC_007384_6 S_NC_007384_7
E_NC_000913_4 0.0000 S_NC_004337_4 0.0019 0.0019 S_NC_007384_4 0.0013 0.0013 0.0019 S_NC_007384_6 0.0013 0.0013 0.0019 0.0000 S_NC_007384_7 0.0013 0.0013 0.0019 0.0000 0.0000 S_NC_007613_4 0.0019 0.0019 0.0000 0.0019 0.0019 0.0019
Nhóm Gp23_2, Gp23_3, Gp23_4 và Gp23_7 chỉ gồm trình tự của vi khuẩn E coli, trong khi nhóm Gp23_1, Gp23_5 và Gp23_6 chỉ gồm trình tự của vi khuẩn Shigella Khoảng cách gần nhất giữa nhóm trình tự E coli và nhóm trình tự Shigella được biểu thị bằng số có ký hiệu § ở góc trên bên phải.
Gp23_4 Gp23_3 Gp23_2 Gp23_1 Gp23_6 Gp23_5
Gp23_3 0.0067 Gp23_2 0.0049 0.0049Gp23_1 0.0063 0.0055 0.0034 § Gp23_6 0.0044 0.0079 0.0058 0.0055Gp23_5 0.0041 0.0067 0.0074 0.0072 0.0052Gp23_7 0.0047 0.008 0.0067 0.0059 0.0039 0.0056
VI TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Lan, R., Reeves, P.R (2002) Escherichia coli in disguise: molecular origins of Shigella
[2] Pupo, G.M., Lan, R., Reeves, P.R (2000) Multiple independent origins of Shigella clones of Escherichia coli and convergent evolution of many of their characteristics PNAS 97, 10567–
[3] Lan, R., Alles, M.C., Donohoe, K., Martinez M.B., Reeves, P.R (2004) Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella spp Infect Immun 72, 5080–5088
[4] Nataro, J.P., Kaper, J.B (1998) Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11, 142-201
[5] Guide to Surveillance (2006) Shiga toxin-producing organisms, reporting and control
Massachusetts department of public health, Bureau of communicable disease control, 787-794
[6] Kehl, K.S., Havens P., Behnke, C.E., Acheson, D.W.K (1997) Evaluation of the premier EHEC assay for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli J Clin Microbiol 35, 2051–2054
[7] Tsuji, A., Sasaki, M., Kanemitsu, T., Uehara, N., Ito, H., Honda, M (1996) Hemolytic uremic syndrome following hemorrhagic colitis caused by verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7: early signs of hemolytic uremic syndrome, The Keio J Med 45, 44-47
[8] Ahmed, A.M., Furuta, K., Shimomura, K., Kasama, Y., Shimamoto, T (2006) Genetic characterization of multidrug resistance in Shigella spp from Japan J Med Microbiol 55, 1685–1691
[9] Coimbra, R.S., Lefevre, M., Grimont, F., Grimont, P.A.D (2005) Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b J Antimicrobial Chemotherapy 49, 801–803
[10] Dubois, V., Parizano M.P., Arpin, C., Coulange, L., Bezian, M.C., Quentin, C (2007) High genetic stability of integrons in clinical isolates of Shigella spp of worldwide origin, J
[11] Hartman, A.B., Essiet, I.I., Isenbarger, D.W., Lindler, L.E (2003) Epidemiology of tetracycline resistance determinants in Shigella spp and enteroinvasive Escherichia coli: characterization and dissemination of tet(A)-1 J Clin Microbiol 41, 1023–1032
[12] Pan, J.C., Ye, R., Meng, D.M., Zhang, W., Wang, H.Q., Liu, K.Z (2006) Molecular characteristics of class 1 and class 2 integrons and their relationships to antibiotic resistance in clinical isolates of Shigella sonnei and Shigella flexneri J Antimicrobial Chemotherapy 58, 288–
[13] Nguyen T.V., Le, P.V., Le, C.H., Weintraub A (2005) Antibiotic Resistance in Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in Hanoi, Vietnam J
[14] Putnam, S.D., Riddle, M.S., Wierzba, T.F., Pittner, B.T., Elyazeed, R.A., El-Gendy, A., Rao, M.R., Clemens, J.D., et al (2004) Antimicrobial susceptibility trends among Escherichia coli and Shigella spp isolated from rural Egyptian paediatric populations with diarrhoea between
[15] Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T (1994) Bergey’s Manual of determinative bacteriology, 9th ed Williams & Wilkins, Baltimore
[16] Manual for the laboratory investigations of acute enteric infections Geneva: World Health Organization, 1987; publication no WHO/CDD/83.3 rev 1
