nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột ở chuột và người sử dụng chế phẩm probiotic trên cơ sở phân tích dữ liệu giải trình tự gen 16s rdna metagenomics

Trên mô hình người thử nghiệm nhóm nghiên cứu thu thập các mẫu phân theo các thời điểm khác nhau trong suốt 8 ngày thử nghiệm nhằm đánh giá tính hiệu quả và toàn diện của dữ liệu giải t

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột ở chuột và người sử dụng chế phẩm probiotic trên cơ sở phân tích

dữ liệu giải trình tự gen 16S rDNA metagenomics

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, lời cảm ơn sâu sắc nhất đến

TS Hoàng Văn Vinh – Chủ nhiệm đề tài đã tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn

thành luận văn trong quá trình tôi làm việc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học,

Đại học quốc gia Hà Nội và PGS TS Quản Lê Hà – cô đã hướng dẫn, chỉ dạy tôi tận

tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lời cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Đại Học Bách Khoa Hà Nội

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện và các đồng nghiệp phòng Sinh Học Phân Tử Ứng Dụng, Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, ĐHQGHN đã tạo điều kiện giúp đỡ, truyền kinh nghiệm, đưa ra lời khuyên chân thành và góp ý bổ ích trong suốt thời gian tôi hoạt động nghiên cứu tại phòng

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập tại nhà trường

Kết quả của luận văn này được hoàn thành tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN phối hợp nghiên cứu cùng Trung tâm nghiên cứu y dược học Quân sự, Học viện Quân Y Luận văn được hỗ trợ kinh phí thực hiện và nằm trong khuôn khổ

đề tài khoa học và công nghệ cấp quốc gia "Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic”, mã

số ĐTĐL.CN-61/19

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN

Nghiên cứu này thực hiện trên mô hình động vật tiêu chảy và người là những bệnh nhân bị táo bón Trên mô hình động vật thử nghiệm được thiết kế theo phương pháp mô tả cắt ngang Trên mô hình người thử nghiệm nhóm nghiên cứu thu thập các

mẫu phân theo các thời điểm khác nhau trong suốt 8 ngày thử nghiệm nhằm đánh giá

tính hiệu quả và toàn diện của dữ liệu giải trình tự amplicon 16S rDNA metagenomic trong đánh giá sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột Bên cạnh đó đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic Bacimix, kết quả bước đầu có thể thấy chế phẩm Bacimix có

hiệu quả đáng kể trong việc cải thiện tình trạng tiêu chảy do kháng sinh trên mô hình chuột thử nghiệm Ngoài ra, chế phẩm cũng giúp cải thiện tình trạng táo bón và thiết lập trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột ở người như gia tăng các chi vi sinh vật có lợi và giảm tỉ lệ các chi vi sinh vật gây hại Bên cạnh đó thấy được phương pháp giải trình tự amplicon 16S rDNA metagenomics có một số hạn chế và chưa khám phá được nhiều khía cạnh sâu xa trong hệ vi sinh vật đường ruột song đã đem lại một bức tranh toàn cảnh về sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột và dự đoán các chỉ thị đại diện cho từng nhóm thử nghiệm

HỌC VIÊN

Nguyễn Hữu An

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮTDANH MỤC HÌNH ẢNHDANH MỤC BẢNG BIỂUMỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 1

TỔNG QUAN 1

1.1 Hệ vi sinh đường ruột 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Cấu trúc hệ vi sinh vật đường ruột 1

1.1.3 Vi sinh vật đường ruột và sức khỏe con người 2

1.2 Mối tương quan giữa sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột và bệnh tật 6

1.3 Các phương pháp duy trì trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột 8

1.3.1 Phương pháp trực tiếp 8

1.3.2 Phương pháp gián tiếp 9

1.4 Probiotic 10

1.4.1 Khái niệm probiotic 10

1.4.2 Vai trò của probiotic 10

1.4.3 Các chủng probiotic 11

1.4.4 Các tiêu chí đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic 12

1.5 Các phương pháp phân tích sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột 13

1.5.1 Phương pháp nuôi cấy 13

1.5.2 Phương pháp định danh bằng nhân gen đích 14

1.5.3 Phương pháp metagenomic 14

1.6 Các nghiên cứu metagenomic trên thế giới và Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 22

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.3 Hóa chất- thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 26

2.2.3 Phương pháp PCR xác định sự có mặt của 16S rDNA 27

2.2.4 Phương pháp giải trình tự 28

2.2.5 Phân tích tin sinh học 28

CHƯƠNG 3 32

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Kết quả thử nghiệm trên động vật 32

3.1.1 Kết quả tiền xử lý dữ liệu 32

3.1.2 Kết quả phân tích sự đa dạng alpha/beta 33

Hình 3.2 Kết quả phân tích alpha/beta Diversity 33

3.1.3 Kết quả định danh thành phần hệ vi sinh vật đường ruột trên chuột 34

3.1.4 Kết quả phân tích các chỉ thị khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm 36

3.2 Kết quả thử nghiệm trên người 40

3.2.1 Kết quả tiền xử lý dữ liệu 40

3.2.2 Phân tích sự đa dạng và đồng đều hệ vi sinh vật đường ruột 41

3.2.3 Phân tích thành phần hệ vi sinh vật trong các nhóm thử nghiệm trên người 42

3.2.4 Phân tích sự khác biệt vượt trội trong thành phần hệ vi sinh vật giữa nhóm sử dụng và nhóm không sử dụng probiotic 44

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

1 16S rDNA 16S ribosomal DNA DNA ribôxôm 16S

2 AAD Antibiotic associated

diarrhea Tiêu chảy do kháng sinh

3 ASVs Amplicon sequence

variants Biến thể các trình tự

5 CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

sequencing Giải trình tự thế hệ mới

14 PcoA Principal Coordinates

Analysis Phân tích tọa độ thành phần chính

Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

16 PT Probiotic taking Nhóm bệnh nhân táo bón sử dụng

21 SCFA Short-chain fatty acid Axít béo chuỗi ngắn

22 Water Nhóm chuột nghiên cứu ở trạng

thái bình thường (khỏe mạnh)

organization Tổ chức y tế thế giới

Hình 1.5 Sơ đồ mô tả các bước của phương pháp metagnenomic 15

Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của công nghệ giải trình tự Illumina 17

Hình 2.1 Chế phẩm BaciMix sử dụng trong nghiên cứu 23

Hình 2.2 Sơ đồ thử nghiệm trên chuột 23

Hình 2.3 Sơ đồ thử nghiệm trên người 23

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 23

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả quy trình thực hiện phân tích tin sinh học 31

Hình 3.1 Điểm chất lượng nucleotide tính theo Qscore 32

Hình 3.2 Kết quả phân tích alpha/beta Diversity……… 32

Hình 3.3 Phân tích thành phần hệ vi sinh vật đường ruột trên chuột………34

Hình 3.4 Phân tích thống kê 4 chỉ thị vi sinh vật đích……… 35

Hình 3.5 Các chỉ thị khác biệt giữa nhóm AAD và B……… 36

Hình 3.6 Các chỉ thị khác biệt giữa nhóm B và nhóm NR………37

Hình 3.7 Điểm chất lượng nucleotide tính theo Qscore………38

Hình 3.8 Phân tích sự đa dạng và đồng đều của hệ vi sinh vật đường ruột theo chỉ số Alpha Diversity……… 39

Hình 3.9 Các chi trội trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột của mỗi nhóm……40

Hình 3.10 Phân tích sự khác biệt thành phần hệ vi sinh vật……….42

Bảng 2.3 Danh mục máy móc và thiết bị 25

Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng để nhân dòng gen 16S rDNA bằng phương pháp PCR 27

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng PCR 27

Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 28

Bảng 3.1 Thông lượng dữ liệu trước và sau bước tiền xử lý mô hình động vật 32

Bảng 3.2 So sánh tỉ lệ các chỉ thị chi vi sinh vật khác biệt giữa AAD và B 36

Bảng 3.3 So sánh tỉ lệ các chỉ thị vi sinh vật khác biệt giữa B và NR 38

Bảng 3.4 Thông lượng dữ liệu trước và sau bước tiền xử lý mô hình người 40

Bảng 3.5 So sánh các chỉ thị vi sinh vật khác biệt giữa nhóm PT và NR tại thời điểm kết thúc thử nghiệm 45

MỞ ĐẦU

Metagenomic là một ngành nghiên cứu không còn xa lạ, độc đáo được áp dụng rộng rãi trong nhiều khía cạnh nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Metagenomic kết hợp với một số kỹ thuật phân tích khác sẽ cho chúng ta những thông tin về các vi sinh vật mà trước đây chưa từng được biết tới bởi chúng khó nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Sự phát triển của các phương pháp giải trình tự đã tạo điều kiện cho các nghiên cứu metagenomic trên hệ vi sinh vật đường ruột của con người được thực hiện Các nghiên cứu về metagenomic giúp các nhà khoa học hiểu biết sâu sắc về mối tương quan giữa thành phần và tỉ lệ của các nhóm sinh vật trong hệ vi sinh vật đường ruột đến các bệnh khác nhau Mối tương quan ấy là tiền đề cho sự phát triển của men vi sinh nhằm điều chỉnh sự biến động của hệ vi sinh vật trên những người bị bệnh và đưa chúng về trạng thái cân bằng của những người khỏe mạnh Tuy nhiên, hiện nay, có rất ít các nghiên cứu trên thế giới tập trung vào đánh giá hiệu quả của probiotic bằng phương pháp metagenomic Vì vậy, trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung phân tích hiệu quả của chế phẩm probiotic Bacimix trong việc hỗ trợ thiết lập trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của động vật bị tiêu chảy do kháng sinh, và một số bệnh nhân bị táo bón dựa trên dữ liệu giải trình tự 16S rDNA metagenomic

Tính mới và tính cấp thiết của nghiên cứu này được thể hiện bởi các lý do sau:

Thứ nhất, đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước nhằm đánh giá sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật bị bệnh rối loạn tiêu hóa (liên quan đến sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột) trước và sau khi sử dụng chế phẩm probiotic thông qua dữ liệu metagenomic hệ vi sinh vật đường ruột

Thứ hai, đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước ứng dụng kỹ thuật hiện đại (giải trình tự gen thế hệ mới, NGS, metagenomic) nghiên cứu vai trò của probiotic cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột trên mô hình động vật (mô hình chuột) và người, tạo tiền đề để tiến hành nghiên cứu sâu xa hơn hiệu quả của chế phẩm probiotic trên người

Các nội dung trong nghiên cứu này bao gồm:

1- Tiền xử lý dữ liệu: Kiểm tra chất lượng trình tự, ghép nối trình tự giải hai đầu, khử

nhiễu dữ liệu Mapping bộ dữ liệu metagenome với cơ sở dữ liệu NCBI

2- Phân tích Alpha & Beta diversity: Sự đa dạng quần thể hệ vi sinh vật được tính toán

dựa trên các chỉ tiêu Shannon, Chao1, Pielou Evenness, Faith Phylogenetic Diveristy, PCoA theo Bray-Curtis,…

3- Định danh thành phần hệ vi sinh vật đường ruột: Bộ dữ liệu trình tự được đối

chiếu với bộ dữ liệu tham chiếu SILVA database 138.1

4- Phân tích các chỉ thị khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm: Thành phần hệ vi sinh

vật đường ruột giữa các nhóm được thống kê qua kiểm định ANCOMBC nhằm phân biệt các chỉ thị vi sinh vật giữa các nhóm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Hệ vi sinh đường ruột 1.1.1 Khái niệm

Hệ vi sinh vật đường ruột (gut microbiome/ gut microbiota) là tập hợp các nhóm vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, virut có mặt trong đường tiêu hóa Mặc dù các thuật ngữ “microbiome/microbiota” có thể thay thế được cho nhau, chúng vẫn có sự khác biệt đó là “microbiota” tập trung mô tả các vi sinh vật sống trong một môi trường xác định trong khi đó “microbiome” lại để cập đến tập hợp vật chất di truyền của các nhóm vi sinh vật cũng như các chất chuyển hóa của chúng trong các điều kiện môi trường [42]

1.1.2 Cấu trúc hệ vi sinh vật đường ruột

Phần lớn hệ vi sinh vật đường ruột được cấu thành bởi 6 ngành vi khuẩn đó là

Bacillota, Bacteroidia, Actinomycetota, Proteobacteria, Fusobacteriota và

Verucomicrobiota Trong đó hệ vi sinh vật chủ yếu bị chi phối bởi hai ngành là Bacteroidia và Bacillota (Firmicutes) chiếm đến 90% tổng số lượng hệ vi sinh đường

ruột [63] Ngoài vi khuẩn, một số nhóm nấm có vai trò quan trọng trong hệ vi sinh đường

ruột cũng được nghiên cứu rộng rãi là Candida, Saccharomyces, Malassezia và

Cladosporium [96] Và Methanobrevibacter smithii là nhóm vi khuẩn cổ được nghiên

cứu rộng rãi bởi chúng có vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn của con người [46]

Đường tiêu hóa là nơi có nhiều và đa dạng nhất về số lượng với hơn 100 nghìn tỉ vi sinh vật, phần lớn tập trung ở ruột già với mật độ của chúng có thể lên đến 1011 đến 1012 tế bào/ ml [85] Số lượng vi sinh vật chiếm tỷ trọng tương đương với 1% trọng lượng cơ thể và có vai trò đặc biệt với sức khỏe con người đặc biệt là đường tiêu hóa Người ta có thể coi hệ vi sinh vật đường ruột như là một bộ phận hay cơ quan của con người [104] Tuy nhiên chúng phân bố không đồng đều dọc theo chiều dài của đường tiêu hóa do các môi trường khác nhau Chiều dài ruột non ngắn, tốc độ di chuyển thức ăn chậm và nồng độ muối mật cao, trong khi ở đại tràng tốc độ di chuyển thức ăn chậm hơn, pH cao hơn, cộng đồng vi sinh vật lớn hơn nên chủ yếu sẽ bắt gặp các loài kị khí Sự khác biệt giữa các vị trí được thể hiện rõ trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thông tin về sự phân bố của vi sinh vật theo chiều dọc đường tiêu hóa

[98] Vị trí Dạ dày Ruột non Ruột già

Điều kiện pH: 1-5,0

Hiếu khí

pH: 5-5,5 Vi hiếu khí

pH: 5,5-7,0 Kị khí Số lượng vi

sinh vật

101-103 CFU/ml 104-107 CFU/ml 1011-1012 CFU/ml

Đại diện chính (chi)

Các vi khuẩn gram

dương :(Bacillus,

Enterococcus)

Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides, Streptococcus

Bacteroides, Fusobacterium, Lactobacillus, Bifidobacterium, Eubacterium

Cùng với sự không đồng nhất theo chiều dọc, hệ vi sinh vật đường ruột cũng không có sự đồng nhất theo mặt phẳng cắt ngang của ruột Thể hiện rõ thông qua sự khác

biệt về các nhóm vi sinh vật Cụ thể, các chi Bifidobacterium, Streptococcus,

Enterococcus, Clostridium, Lactobacillus và Ruminococcus thường được tìm thấy trong

mẫu phân đại diện cho thành phần vi sinh vật không bám vào ruột Trong khi đó các chi

Clostridium, Lactobacillus, and Enterococcus được tìm thấy tại lớp nhày và biểu mô của

ruột non [79]

1.1.3 Vi sinh vật đường ruột và sức khỏe con người

Vai trò của vi sinh vật đường ruột đối với sức khỏe của con người từ lâu đã trở thành chủ đề cho rất nhiều nghiên cứu, chủ yếu tập trung vào các quá trình trao đổi chất, dinh dưỡng, sinh lý và miễn dịch Cụ thể, đối với cơ chế trao đổi chất và dinh dưỡng, hệ vi sinh vật cung cấp các enzyme cho một số con đường sinh hóa xảy ra trong hệ tiêu hóa [85] Ngoài ra, quá trình tổng hợp nhiều phân tử sinh học có chức năng như vitamin, axit amin, chất béo,… phụ thuộc vào các vi sinh vật đường ruột [64] Về hệ thống miễn dịch, hệ vi sinh vật của con người không chỉ bảo vệ vật chủ khỏi mầm bệnh bên ngoài bằng cách tạo ra các chất kháng khuẩn mà còn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của

niêm mạc ruột và hệ thống miễn dịch Trong điều kiện khỏe mạnh, hệ vi sinh vật đường ruột thể hiện sự đa dạng phân loại cao, sự phong phú về gen, sự ổn định và tương tác cộng sinh với vật chủ

Hình 1.1 Mô tả các sản phẩm liên quan đến vi sinh vật tác động đến các mầm bệnh

[100]

1.1.3.1 Cơ chế kháng khuẩn

Axit béo chuỗi ngắn (SCFA)

SCFA chủ yếu được sản xuất bởi vi khuẩn thông qua quá trình lên men carbohydrate không tiêu hóa được với ba loại chính trong đường tiêu hóa là axetat, propionate và butyrate [45] Nồng độ SCFA đã được chứng minh là có mối tương quan với pH ở các vùng khác nhau của đường tiêu hóa, qua đó có thể làm giảm sự phát triển của vi khuẩn [17] Đặc biệt, trong nghiên cứu của O'Byrne C et al., họ đã chứng minh

rằng, sự có mặt của acetat ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của Escherichia coli

thông qua việc ức chế con đường sinh tổng hợp methionine, dẫn đến tích tụ homocysteine gây độc và ức chế sự tăng sinh của loài này [66]

Axit mật thứ cấp

Axit mật, có đặc tính kháng khuẩn, được sản xuất bởi gan và bài tiết qua đường ruột để hỗ trợ tiêu hóa chất béo trong chế độ ăn uống Tại ruột kết, một phần axit mật sẽ được chuyển hoá thành axit mật thứ cấp với hai loại chính là axit deoxycholic và axit

lithocholic thông qua vi khuẩn, chủ yếu là các loài thuộc chi clostridium [62] Axit

deoxycholic có tác dụng diệt khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus

aureus, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostridioides difficile, bifidobacteria và lactobacilli bằng cách phá vỡ màng tế bào của chúng [37, 70, 81, 88]

Bacteriocin

Bacteriocin là những peptide ngắn, gây độc được sản xuất bởi một số nhóm vi khuẩn có thể ức chế sự xâm nhập và phát triển của các loài khác [59] Cơ chế hoạt động của chúng rất đa dạng, chúng gây rối loạn chuyển hóa RNA, DNA và giết chết tế bào thông qua hình thành lỗ trên màng tế bào [15, 20, 52, 56] Bacteriocin được sản xuất bởi

vi khuẩn Gram dương (chủ yếu là nhóm vi khuẩn lactic như Lactococcus, Lactobacillus và Streptococcus) và vi khuẩn Gram âm (chủ yếu là Enterobacteriaceae) Cụ thể, lantibiotic nisin sản xuất bởi Lactococcus lactis có khả năng ức chế nhiều nhóm vi khuẩn Gram dương [73], bacteriocin Abp118 tiêu diệt trực tiếp Listeria monocytogenes (mầm

bệnh từ thực phẩm) [13], hay bacteriocin thuricin có khả năng tác động lên một số chủng

C difficile mà không gây mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [58]

Cạnh tranh chất dinh dưỡng

Các vi sinh vật luôn phải cạnh tranh để nhận chất dinh dưỡng trong hệ tiêu hóa Đặc biệt, những chủng vi khuẩn trong cùng một loài thì sự cạnh tranh này càng trở nên gay gắt hơn do chúng thường sử dụng chất dinh dưỡng tương tự nhau Vai trò của cạnh tranh chất dinh dưỡng trong quá trình đề kháng làm tổ (colonization resistance) được chỉ

ra trong nhiều nghiên cứu sử dụng chủng E coli [19, 24, 48, 103] Cụ thể, các chủng E

coli trong hệ tiêu hóa sẽ cạnh tranh axit amin proline, đường, các phân tử thiết yếu khác

với chủng E coli O157:H7 (chủng gây bệnh) Qua đó ức chế sự phát triển của E coli gây bệnh và giúp duy trì trạng thái khỏe mạnh của con người

1.1.3.2 Thiết lập hàng rào bảo vệ hệ tiêu hóa

Hàng rào bảo vệ đường tiêu hóa bao gồm các lớp chất nhầy, hàng rào biểu mô và hàng rào miễn dịch Lớp chất nhầy sẽ giữ lại các vi sinh vật có hại ngăn chặn sự tương tác trực tiếp của chúng với lớp biểu mô Do đó hệ vi sinh vật đường ruột cũng là một yếu tố góp phần duy trì tính toàn vẹn của lớp hàng rào vật lý này Không chỉ vậy, sự bám dính của các vi khuẩn có lợi lên các thụ thể trên tế bào ruột còn có thể gây ra những kích thích cho hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng Việc này giúp cho hệ thống

miễn dịch luôn trong trạng thái hoạt động tiêu diệt các vi khuẩn có hại

Hình 1.2 Cơ chế các tế bào biểu mô và tế bào miễn dịch ở màng nhầy ruột tham gia

vào đáp ứng miễn dịch [95]

1.1.3.3 Cơ chế trao đổi chất và dinh dưỡng

Vi khuẩn đường ruột không chỉ mang lại lợi ích cho vật chủ bằng cách góp phần vào hệ thống bảo vệ đường ruột của vật chủ, mà chúng còn giúp hệ tiêu hóa duy trì và thực hiện tốt các chức năng của mình Vi khuẩn đường ruột có lợi cho vật chủ theo nhiều cách khác nhau, chẳng hạn như điều hòa nhu động ruột, sản xuất vitamin, chuyển hóa axit mật và steroid, chuyển hóa các chất xenobiotic, phân giải chất xơ và polyphenol, hấp thụ khoáng chất, kích hoạt và tiêu diệt độc tố, và chất gây đột biến (genotoxin) thông qua các quá trình trao đổi chất phức tạp [47] Cụ thể, quá trình lên men carbohydrate không tiêu hóa được của vi khuẩn đại tràng tại vùng ruột kết tạo ra một lượng lớn axit béo chuỗi ngắn (axit axetic, propionic và butyric) là nguồn năng lượng cung cấp cho niêm mạc đại tràng và các mô ngoại vi của cơ thể Ngoài ra, vi khuẩn đường ruột đóng vai trò rất quan trọng cho quá trình biến đổi các hợp chất tự nhiên (lignan, isoflavone)

tạo nên các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học cao hơn, phục vụ cho quá trình trao đổi chất trong cơ thể vật chủ [12, 38]

1.2 Mối tương quan giữa sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột và bệnh tật

Những nghiên cứu trong vòng hai thập kỷ gần đây đang củng cố mối tương quan giữa hệ vi sinh vật đường ruột và sức khỏe con người Đặc biệt là sự thay đổi của thành phần vi sinh vật với khả năng trao đổi chất của vật chủ liên quan đến nhiều bệnh lý trên người Nhiều cơ chế rối loạn chuyển hóa phổ biến ở người như béo phì, tiểu đường loại 2, bệnh gan, bệnh tim mạch và suy dinh dưỡng được chứng minh có liên quan với sự biến động hệ vi sinh vật được thể hiện tại hình 1.3

Hình 1.3 Sự biến động của một số nhóm vi sinh vật tương quan với cơ chế bệnh lý trên

người [26]

Hệ vi sinh vật đường ruột với bệnh tiểu đường

Tiểu đường là bệnh gây ra do ảnh hưởng bởi quá trình điều hòa glucose Tiểu đường có thể được phân loại thành tiểu đường loại 1, tiểu đường loại 2 và tiểu đường thai kỳ Mối tương giữa sự rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tiểu đường đã được nghiên cứu rộng rãi Đối với bệnh tiểu đường loại 1 và tiểu đường thai kỳ, sự sụt giảm tỉ lệ của

nhóm vi khuẩn sản xuất butyrate SCFA (R faecis , F prausnitzzi , Intestinimonas), và

streptococcus trong đường ruột là những biến động được ghi nhận [50] [14] Bên cạnh

đó, mối tương quan về sự đa dạng hệ vi sinh vật đường ruột và sự tăng mức độ biểu hiện cytokine cũng được thể hiện trong nhiều nghiên cứu [40] Tương tự với tiểu đường loại 2, sự đa dạng về thành phần loài Firmicutes, Clostridia, Facalibacterium, Roseburia giảm

đáng kể [2, 33] Ngoài ra, tỉ lệ nhóm Bacteroidetes so với Firmicutes, nhóm Bacteroides - Prevotella so với nhóm C coccoides – E rectale có mối tương quan với nồng độ đường

huyết [39] Những nghiên cứu này đã chứng minh được mối liên kết sâu sắc giữa sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột với căn bệnh tiểu đường

Trục hệ vi sinh vật ruột và não (The microbiota-gut-brain axis)

Hình 1.4 Các yếu tố tác động lên mối liên hệ giữa hệ vi sinh đường ruột và não bộ

[32]

Nhiều con đường trung gian đã được đề xuất cho việc liên kết giữa hệ vi sinh vật đường ruột ảnh hưởng đến não bộ và hành vi Vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ thần kinh thông qua các chất trung gian điều hòa hệ thàn kinh như tryptophan, serotonin, GABA và catecholamine [16] Và ngược lại, hệ thần kinh kiểm soát các chức năng của hệ tiêu hóa bao gồm sản xuất chất nhầy, điểu hòa hoạt động của các cơ quan, đảm bảo tính ổn định của hệ tiêu hóa và sức khỏe con người [32] Những bằng chứng cho thấy được mối quan hệ giữa não bộ và hệ vi sinh vật đường ruột phải kể đến như: Sự khác biệt giữa hệ vi sinh vật trên chuột được cấy từ những bệnh nhân mắc bệnh Parkinson và người khỏe mạnh ảnh hưởng đến hoạt động thể chất của chúng [68] Hay, sự khác biệt đáng kể về thành phần vi khuẩn trong ruột của trẻ mắc và không mắc chứng rối loạn phổ tự kỷ [83] Những ví dụ này càng cho thấy được tầm quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột với sức khỏe con người

Hệ vi sinh vật đường ruột với cơ chế hình thành ung thư đường ruột

Vai trò của vi sinh vật đường ruột liên quan đến ung thư được biết điến bởi nghiên

cứu vào năm 1994, chỉ ra rằng sự khởi phát bệnh ung thư dạ dày có liên quan đến H

plyori [32] Những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng sự biến động hệ vi sinh vật

đường ruột có mối tương quan đến khả năng phát sinh ung thư, đặc biệt là ung thư đại trực tràng bởi ảnh hưởng của chúng đến sự tăng sinh và chết theo chu kỳ của tế bào, ảnh hưởng đến hoạt động của hệ thống miễn dịch và ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất Cụ thể, theo Grivennikov et al., sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột có thể gây suy giảm hàng rào biêu mô, gây nên tình trạng viêm, thúc đẩy tăng sinh khối u khởi phát căn bệnh này [28] Những nhóm vi khuẩn chính góp phần gây ra ung thư đại trực tràng là là

E faecalis, E coli, B fragilis, S bovis, F nucleatum và H pylori

Hệ vi sinh vật đường ruột với với bệnh tiêu chảy do kháng sinh

Tiêu chảy do kháng sinh [2] là kết quả của sự phá vỡ sự cân bằng hệ vi sinh của

ruột do tác động của kháng sinh Sự mất cân bằng này tạo điều kiện cho Clostridium

difficile phát triển mạnh mẽ, và là tác nhân chính cho 10-25% số ca bệnh tiêu chảy do

kháng sinh [5] C difficile gây bệnh bằng cách tiết ra hai loại chất độc mạnh gây tổn thương niêm mạc ruột và gây viêm ruột kết Ngoài C difficile, Các nhóm vi khuẩn khác

được báo cáo là nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy liên quan đến kháng sinh bao gồm

C perfringens, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca và Salmonella spp [31]

1.3 Các phương pháp duy trì trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

1.3.1 Phương pháp trực tiếp

Với sự phát triển vượt trội của ngành công nghệ sinh học trong những năm gần đây, các sản phẩm của liệu pháp gen đã được ra đời với mục tiêu tạo ra những phương pháp có thể tác động trực tiếp lên một, hay một số nhóm vi sinh vật đặc thù có mối liên quan đến một số bệnh lý trên người Một số thành tựu đạt được của phương pháp này

có thể kể đến như sử dụng E coli đã qua biến đổi gen nhằm biểu hiện quá mức yếu tố

tạo cảm giác no trên chuột giúp làm giảm tình trạng béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo,

kháng insulin và gan nhiễm mỡ [101] Hay một chủng Lactobacillus gasseri biến đổi

gen có khả năng biểu hiện và tiết ra peptide tương tự glucagon 1 (GLP-1) làm tăng giải phóng insulin giúp giảm đường huyết ở nhóm chuột bị tiểu đường [99] Tuy nhiên, do việc đưa các sản phẩm đã qua chỉnh sửa gen vào hệ tiêu hóa của con người ruột người vẫn đang là chủ đề gây tranh cãi đối với các cơ quan quản lý y tế, dược phẩm và người tiêu dùng Vì thế phương pháp này vẫn có nhiều rào cản để có thể áp dụng một cách phổ biến và rộng rãi

1.3.2 Phương pháp gián tiếp

Phương pháp gián tiếp tập trung chủ yếu vào cải thiện và duy trì trạng thái ổn định của các nhóm vi sinh vật đường ruột nói chung Các phương pháp gián tiếp giúp duy trì và cải thiện hệ vi sinh vật bao gồm duy trì chế độ ăn uống, lối sống lành mạnh và sử dụng các sản phẩm probiotics, prebiotics và postbiotics giúp bổ sung chất dinh dưỡng hay các vi khuẩn có lợi vào hệ tiêu hóa Do phương pháp này an toàn và thân thiện với con người và có hiệu quả tốt nên được áp dụng một cách rộng rãi Có nhiều nghiên cứu chỉ ra tầm quan trọng của lối sống và chế độ ăn uống ảnh hưởng đến sự biến động hệ vi sinh đường ruột Cụ thể, trong một nghiên cứu điều tra về tác động của chất béo trong chế độ ăn uống ảnh hưởng đến hệ vi sinh đường ruột, các nhà khoa học đã nhận định rằng chế độ ăn nhiều chất béo bão hòa (Saturated Fat) và chất béo không bão hòa đơn (Monounsaturated Fat) ảnh hưởng tiêu cực đến sự đa dạng hệ vi sinh vật trong khi chế độ ăn nhiều chất béo không bão hòa đa (Polyunsaturated Fat) tác động trung tính lên hệ vi sinh vật đường ruột [110] Trong khi đó, chế độ ăn nhiều polisaccharide tự nhiên giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột do bản thân chúng là các carbohydrate cao phân tử và chất xơ có thể lên men bởi vi sinh vật đường ruột tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học quan trọng với độc tính thấp (axit béo chuỗi ngắn và succinate) [10] Việc tăng những hoạt động thể chất giúp duy trì trạng thái ổn định hệ vi sinh vật đường ruột và được cho là có liên quan đến một số cơ chế như tăng khả năng phân giải lactate, tăng sản xuất axit béo chuỗi ngắn trong đường tiêu hóa

Tuy nhiên, để duy trì được lối sống và chế độ ăn uống lành mạnh là điều không hề dễ dàng đối với nhiều người Tại Việt Nam, uống rượu, bia là một nét văn hóa đã có từ lâu đời, là nét đặc trưng trong các buổi tụ họp bạn bè, người thân, đối tác Đáng chú ý, theo tổ chức WHO, Việt Nam có mức tiêu thụ rượu bia khá cao trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương với 8.3 lít trên bình quân đầu người (WHO, 2018) Chính vì thế, duy trì lối sống lành mạnh là phương pháp khó tiếp cận với nhiều bộ phận người dân Vì vậy, một phương pháp khác, đang là xu thế trên thế giới là sử dụng chế phẩm probiotic đã được ra đời Nhiều nghiên cứu đã khẳng định tính hiệu quả của probiotic trong việc hỗ trợ cải thiện sức khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý của con người Phương pháp này đem lại nhiều ưu thế bởi khả năng tiếp cận tốt với phần lớn người dân và tính tiện dụng của chúng

1.4 Probiotic

1.4.1 Khái niệm probiotic

Probiotic: bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, theo FAO/WHO (2001) gồm các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ Con người biết đến probiotic bắt đầu từ nghiên cứu của Heny Tisser (1899) khi làm việc tại Viện Pasteur Pari tại Pháp đã phát hiện thấy vi khuẩn có dạng chạc ba hình chữ Y Lúc đó nhà khoa học đã có báo cáo rằng những người có nhiều vi khuẩn này trong đường tiêu hóa thì ít bị bệnh tiêu chảy Nhưng có lẽ những nghiên cứu đầy đủ nhất và có cơ sở khoa học nhất mở đầu cho nghiên cứu phát hiện ra probiotic phải kể đến công trình nghiên cứu của nhà động vật học người Nga là Metchnikoff (1845-1916) nhận giải thưởng Nobel năm 1908 khi làm việc tại viện Pasteur Pari Pháp Vai trò của vi khuẩn lactic trong nghiên cứu của ông có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Clostridium sinh ra các chất độc là ammonia, phenol và một số thành phần độc chất cho

cơ thể khác trong hệ tiêu hóa của người

1.4.2 Vai trò của probiotic

Probiotic có thể có nhiều tác dụng trong cơ thể và các chủng vi sinh khác nhau có thể hoạt động theo những cơ chế khác nhau Tựu chung lại, Probiotic giúp cơ thể duy trì tính ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột, hoặc giúp khôi phục hệ vi sinh vật sau khi trải qua biến động Thêm vào đó, probiotic hỗ trợ sản xuất các phân tử quan trọng như enzyme, chất kháng khuẩn, axit hữu cơ tham gia vào nhiều con đường chuyển hóa và miễn dịch trong đường tiêu hóa Đồng thời, chúng cũng cải thiện các hàng rào bảo vệ, tăng cường hệ thống miễn dịch, giúp bảo vệ sức khỏe cho con người [67, 82]

Probiotic trong điều trị bệnh tiêu chảy do kháng sinh

Tiêu chảy là tác dụng phụ phổ biến sau khi sử dụng kháng sinh vì hệ vi sinh vật bình thường có xu hướng bị ức chế, kích thích sự phát triển quá mức của các chủng vi

khuẩn cơ hội và vi khuẩn có hại Một số nghiên cứu lâm sàng sử dụng probiotic (L

rhamnosus và S boulardii) để điều trị và kết quả cho thấy rằng việc sử dụng men vi sinh

giúp giảm nguy cơ tiêu chảy liên quan đến kháng sinh [51, 71]

Probiotic trong điều trị bệnh tiêu chảy cấp

Tiêu chảy cấp ở người gây ra do nhiễm virus, vi khuẩn, và ít gặp hơn do ký sinh trùng tại khu vực dạ dày-ruột Trong đó, rotavirus là tác nhân phổ biến nhất nhất gây tiêu

chảy cấp ở trẻ sơ sinh trên thế giới Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng các chế phẩm

sinh học như L rhamnosus GG, L reuteri, L casei Shirota và B animalis Bb12 có thể giảm thời gian bị bệnh tiêu chảy cấp do rotavirus, trong đó L rhamnosus GG và B

animalis Bb12 cho thấy hiệu quả rõ rệt nhất trong việc cải thiện tình trạng tiêu chảy cấp

ở trẻ sơ sinh [34, 80]

Probiotic trong việc cải thiện tình trạng không dung nạp lactose

Tình trạng không dung nạp Lactose gây ra bởi sự thiếu hụt beta-galactosidase (yếu tố di truyền) dẫn đến không có khả năng phân giải lactose thành glucose và galactose Vì vậy, những người không có khả năng dung nạp lactose khi tiêu thụ các sản phẩm từ sữa thường sẽ bị tiêu chảy thẩm thấu do sự thay đổi về nồng độ chất tan gây ra

bởi lactose Một số chủng vi sinh vật có hoạt tính beta-galactosidase như S thermophilus và L delbrueckii ssp Bungaricus Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy việc những bệnh

nhân không dung nạp lactose sử dụng chế phẩm probiotic sẽ làm giảm tình trạng bệnh lý gây ra bởi hội chứng này [18, 41]

Probiotic trong phòng ngừa vào điều trị một số bệnh lý khác

Ngoài những vai trò của probiotic đã nêu trên, có bằng chứng cho thấy việc sử

dụng chế phẩm probiotic có thể làm giảm tỷ lệ mắc bệnh ung thư Cụ thể, Lactobacillus spp và Bifidobacterium spp trong probiotic có thể giảm mức độ tạo ra các enzym gây

ung thư từ các quá trình chuyển hóa phức tạp của hệ vi sinh vật đường ruột Thêm nữa, men vi sinh phòng ngừa bệnh ung thư bởi cơ chế sản xuất các axit hữu cơ giúp phòng ngừa đột biến và tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ [30, 36] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng ghi nhận việc sử dụng probiotic trong việc phòng ngừa và điều trị một số bệnh khác như tim mạch và viêm âm đạo [69]

1.4.3 Các chủng probiotic

Tùy thuộc vào nhũng đặc trưng khác nhau của các chủng probiotic mà chúng sẽ được phân loại Ta có thể phân loại chúng dựa trên yếu tố dinh dưỡng, phổ biến nhất là các chủng thuộc nhóm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là các chủng gram dương, catalase âm tính và có khả năng tạo ra axit lactic là sản phẩm cuối cùng chính của quá trình lên men carbohydrate Hai chi phổ biến nhất trong nhóm này và được áp dụng thành chế

phẩm probiotic đó là Lactobacillus spp và Bifidobacterium spp [112] Ngoài ra, đặc

trưng về khả năng hình thành bào tử của một số nhóm vi sinh vật có lợi cũng đang là

trọng tâm của nhiều nghiên cứu về probiotic như Bacillus spp và Clostridium spp do

khả năng sinh bào tử của những lợi khuẩn này giúp chúng có cơ hội sống sót cao hơn khi đi qua những môi trường khắc nghiệt trong hệ tiêu hóa và phát triển, cải thiện thành phần hệ vi sinh vật đường ruột [7, 22] Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra hiệu quả của chế phẩm đa chủng so với sử dụng chế phẩm đơn chủng thông thường bởi khả năng tương tác giữa các chủng có lợi với nhau tạo nên hiệu quả cải thiện tích cực cho hệ vi sinh đường ruột trước những sự biến động của chúng [51]

1.4.4 Các tiêu chí đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic

Theo WHO/FAO (2002), có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic là: (i) an toàn; [60] chủng vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; [60] ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; (iv) chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ

An toàn

Một trong những yêu cầu tiên quyết của vi sinh vật probiotic là phải an toàn cho vật chủ Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới [75], vi sinh vật an toàn cho sản xuất probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng với một số yêu cầu cụ thể như: (i): thuộc nhóm GRAS (General Recornized as Safe) Theo yêu cầu này, tổ chức FDA của Mỹ khuyến cáo các chủng vi sinh vật được xếp vào GRAS là các chủng vi sinh vật được xem là an toàn và đã được sử dụng từ trước cho đến ngày 1/1/1958; [60] Các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từ ruột người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men và được định danh thuộc đối tượng an toàn và [60] là nhóm các vi sinh vật được các tổ chức khoa học có năng lực bảo quản trong bộ sưu tập vi sinh vật có tên khoa học, nguồn gốc và kết quả nghiên cứu đảm bảo an toàn sinh học (Bio Safety level 1)

Tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ

Sự tồn tại và phát triển của các chủng vi sinh vật được bổ sung vào hệ tiêu hóa vật chủ là một tiêu chí không thể thiếu trong việc đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic Các nghiên cứu chỉ ra rằng, lượng vi sinh vật probiotic đưa vào cơ thể dao động 108-1010/ngày trong khi đó quần xã vi sinh vật dao động từ 108-1011/ml/g (tùy thuộc vào vị trí trong hệ tiêu hóa vật chủ), như vậy để probiotic có tác dụng thì các chủng lựa chọn phải thích ứng với môi trường sinh thái trong hệ tiêu hóa vật chủ như pH thấp (2-4), chịu enzyme tiêu hóa (pepsin, chimotripsin), axít và muối mật (0,1-0,3%), và có mặt của kháng sinh

Ức chế vi sinh vật có hại

Các chủng probiotic có thể sản xuất các chất kháng khuẩn (bacteriocin như: nisin, acidophilin, plataricin, enterocin, lactococin v.v.); sinh axít hữu cơ như lactic, acetic làm thay đổi pH môi trường nhằm ức chế vi sinh vật gây bệnh và trung hòa độc tính, phân giải muối mật, giảm cholesterol Đây được xem những đặc tính quan trọng của probiotic

có tác dụng trực tiếp ức chế nhóm vi sinh vật có hại như Escherichia coli, Staphylococcus spp., Clostridium spp., Listeria monocytogenes,

Tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ

Khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc tại thành ruột được xem là một đặc tính quan trọng có tác dụng kích thích miễn dịch cũng như ức chế vi sinh vật gây hại thông qua cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột và khả năng loại vi sinh vật gây hại và độc tố thông qua cơ chế hấp phụ Vi khuẩn probiotic còn sinh các enzyme tiêu hóa và vitamin (B12, K, B5, B2, B3) và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn: các enzyme tiêu hóa như β-galactosidase, protease, lipase, amylase, cellulose có tác dụng tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật chủ

Ngoài các tiêu chí được đề cập ở trên, để đánh giá được đúng đắn sự cải thiện của sức khỏe vật chủ nói chung và hệ vi sinh vật đường ruột nói riêng Ta cần phải có một phương pháp để đánh giá tổng thể sự thay đổi của thành phần và số lượng loài vi sinh vật trong đường tiêu hóa Vì vậy, cách tiếp cận tốt nhất để thiết lập các đặc tính của probiotic và hiệu quả của chế phẩm này là nghiên cứu cấu trúc quần thể hệ vi sinh vật đường ruột để đánh giá sự biến động của chúng trong từng điều kiện bệnh lý cụ thể

1.5 Các phương pháp phân tích sự biến động hệ vi sinh vật đường ruột

Trong nhiều tiêu chí đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic, tiêu chí về khả năng phục hồi hệ vi sinh vật là một tiêu chí quan trọng, giúp đánh giá được việc đưa những chủng vi khuẩn sống có lợi vào trong vật chủ có thể thay đổi như thế nào đến thành phần vi sinh vật trong hệ tiêu hóa Có nhiều phương pháp khác nhau để có thể đánh giá sự biến động của hệ vi sinh vật đường ruột Mỗi phương pháp đều sẽ có những ưu và nhược điểm riêng

1.5.1 Phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy là phương pháp cổ điển để xác định một hay nhiều vi sinh vật dựa trên các kết quả về hình thái khuẩn lạc, đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua việc nuôi chúng trong môi trường thích hợp Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp

trong phân tích microbiome bởi lẽ hệ vi sinh vật đường ruột là tổ hợp của rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau, việc xác định từng môi trường phù hợp cho từng loài là bất khả thi Chưa kể đến việc, nhiều nhóm vi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng trong những điều kiện đặc biệt Theo các nhà khoa học ước tính, có ít hơn 2% số vi sinh vật trên thế giới có thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm [90] Đặc biệt, con số này còn thấp hơn nữa đối với hệ vi sinh vật trong đại tràng do điều kiện yếm khí nghiêm ngặt ở khu vực này [93]

1.5.2 Phương pháp định danh bằng nhân gen đích

Với sự phát triển của kỹ thuật di truyền, đặc biệt là sự phát triển của công nghệ PCR, việc xác định các vi sinh vật càng trở nên dễ dàng hơn với tính chính xác cao hơn Với phương pháp định danh bằng nhân gen đích, ta sử dụng các đầu dò đặc hiệu cho từng nhóm vi sinh vật, tiến hành PCR và phân tích kết quả dựa trên phân tích băng điện di hay các tín hiệu đầu dò huỳnh quang [77] Trên thị trường, sản phẩm Androflor® REAL-TIME PCR Detection Kit của Nga có thể giúp phát hiện được cùng lúc rất nhiều nhóm vi sinh vật đường ruột Tuy nhiên, con số này vẫn còn khoảng cách rất xa so với số lượng loài thực tế trong hệ tiêu hóa Vì thế, phương pháp này chưa phù hợp để phân tích sự biến động hệ vi sinh đường ruột

1.5.3 Phương pháp metagenomic

1.5.3.1 Giới thiệu về công nghệ metagenomic

Thuật ngữ “Metagenomic” lần đầu tiên được mô tả vào năm 1998 bởi Handelsman và Rodon [29] và trở thành một trong những phương pháp nghiên cứu hệ vi sinh vật phức tạp Phương pháp này với mục đích xác định thành phần loài trong hệ vi sinh vật dựa trên gen thu được từ phương pháp giải trình tự [27] Metagenomic là kĩ thuật cho phép khai thác được tối đa thông tin dựa trên các gen của vi sinh vật trong các quần thể sinh vật Metagenomic nghiên cứu metagenome quần xã sinh vật thông qua bốn bước gồm thu thập mẫu, tách chiết axít nuclêic trong mẫu thu thập, giải trình tự và xử lý đoạn trình tự dựa trên nhằm thiết lập hồ sơ đa dạng loài dựa trên một hoặc một đoạn gen, nhiều gen hay toàn bộ hệ gen, sử dụng các công cụ tin sinh học để phân tích và khai thác dữ liệu từ vật liệu di truyền [108]

Hình 1.5 Sơ đồ mô tả các bước của phương pháp metagenomic

1.5.3.2 Ưu và nhược điểm của công cụ metagenomic

Công cụ metagenomic là phương pháp hiệu quả trong việc nghiên cứu toàn diện hệ vi sinh vật đường ruột của con người bởi chúng có độ nhạy cao; không bị phụ thuộc vào việc đặt giả thiết (do công cụ này xây dựng với mục tiêu dự đoán, tìm kiếm các mối tương quan thông qua dữ liệu trình tự); khai thác thông tin toàn diện về các mầm bệnh mới, các tác nhân gây bệnh; và khai thác được thông tin về các cơ chế chuyển hóa liên quan đến hệ vi sinh vật nhằm thiết kế các môi trường nuôi cấy cho các vi sinh vật chưa thể nuôi cấy được trong điều kiện phòng thí nghiệm Tuy nhiên, công cụ này vẫn có một số hạn chế Đầu tiên, công cụ này có thể không xác định được một số vi sinh vật có mật độ thấp có mặt trong môi trường Thứ hai, vì metagenomic yêu cầu phân tích lượng trình tự lớn nên chi phí giải trình tự DNA metagenomic của hệ vi sinh vật đường ruột là tương đối lớn Thứ ba, để phản ánh được chính xác nhất thành phần hệ vi sinh vật, công cụ này yêu cầu phải có đủ số lượng DNA trong mẫu cũng như chất lương DNA cần được đảm bảo (loại bỏ yếu tố nhiễu) Cuối cùng, để đảm bảo quá trình này diễn ra thành công, thông tin về cơ sở dữ liệu tham chiếu là vô cùng quan trọng, và có rất nhiều nghiên cứu thực tế chỉ ra rằng có hơn 80% các đoạn trình tự được giải ra không được gán với bất kỳ thông tin nào trên dữ liệu tham chiếu [61]

1.5.3.3 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu metagenomic

Các thế hệ giải trình tự trên thế giới

Ngày nay, các công ty thương mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới theo 2 nguyên lý chính bao gồm giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (sequencing by synthesis) và phương pháp giải trình tự gắn nối (sequencing by ligation) [49, 102, 106] SBS liên quan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTP được biến đổi tại vị trí 2’OH bao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang Quá trình xác định trình tự sẽ diễn ra tương tự như phản ứng PCR SBL là một phương pháp giải trình tự DNA thay vì sử dụng enzyme polymerase như hầu hết các phương pháp, chúng sử dụng enzyme DNA ligase để xác định nucleotide có mặt tại một vị trí nhất định trong trình tự DNA với một chu trình tuần hoàn gồm 4 bước Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hướng tới làm tăng dung lượng (throughput), làm giảm thời gian và giá thành [72] Ngoài ra, phương pháp giải trình tự cổ điển Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) vẫn được thực hiện xen kẽ với các phương pháp giải trình tự thế hệ mới khi cần thiết [105]

Mặc dù NGS thường được dùng để chỉ các công nghệ giải trình tự thế hệ hai Tuy nhiên, với sự phát triển vượt trội của ngành công nghệ giải trình tự, các công nghệ giải trình tự thế hệ ba và bốn được ra đời với kỳ vọng khắc phục được các hạn chế tồn tại của công nghệ giải trình tự thế hệ hai Một trong những công nghệ đó là nanopore, có thể giải trình tự với nồng độ DNA rất thấp và không yêu cầu PCR [87] Công nghệ này sử dụng một lỗ protein có kích thước nano (nanopore), hoạt động như một bộ cảm biến sinh học và được gắn vào một màng polyme kháng điện Trong dung dịch điện phân, một điện áp không đổi được đưa vào để tạo ra dòng ion qua lỗ có kích thước nano sao cho các phân tử DNA hoặc RNA chuỗi đơn tích điện âm di chuyển qua lỗ nano từ phía “cis” (tích điện âm) sang phía “trans” (tích điện dương) Những thay đổi của dòng ion trong quá trình dịch mã tương ứng với trình tự nucleotide có trong vùng cảm biến và đoạn trình tự này được giải bằng các thuật toán khác nhau Yếu tố này cũng cho phép phương pháp này có thể giải trình tự của từng phân tử (DNA/RNA) theo thời gian thực Tuy nhiên, các kỹ thuật giải trình tự nanopore hiện tại có một số hạn chế, trong đó tỷ lệ lỗi tương đối cao ở mức 1–15% đối với nanopore R9.4 (so vói NGS Illumina 0,1–1%) vẫn là điểm mà các nhà phát triển công nghệ này cần cải tiến để đưa công nghệ này ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu

Công nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing

Công nghệ giải trình tự của Illumina hoạt động bằng cách xác định các dNTP được đánh dấu huỳnh quang được thêm vào chuỗi axit nucleic thông qua việc sử dụng các array đơn dòng và công nghệ độc quyền của Illumina (reversible terminator technology) cho phép giải trình tự trên quy mô lớn với độ chính các cao Nhìn chung,

phương pháp này bao gồm 4 bước cơ bản bao gồm: (i) Tạo thư viện: DNA cần giải trình

tự được tách chiết và cắt thành các mảnh nhỏ (nếu cần) và gắn các adapter cần thiết cho

quá trình giải trình tự, [60] Tạo cluster: mỗi sợi DNA được giữ lại trên bề mặt thiết bị

giải trình tự (flowcell) bằng adapter đã được gắn trước đó Mỗi sợi DNA sau khi được khuếch đại sẽ tạo thành một cụm DNA (cluster) có trình tự giống hệt nhau để sử dụng

cho quá trình giải trình tự [60] Giải trình tự: dNTP có gắn các tín hiệu huỳnh quang

tương ứng với 4 loại nucleotide, Tín hiệu huỳnh quang của từng nulceotide được ghi lại

trong quá trình tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung trên sợi DNA khuôn (iv) Phân tích

kết quả: Kết quả từ quá trình giải trình tự được phân tích tùy theo mục đích sử dụng

Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của công nghệ giải trình tự Illumina [1]

Ưu điểm của phương pháp đặc trưng bởi việc giải trình tự của Illumina dựa trên số lượng cực lớn các đoạn đọc trình tự đồng thời khiến cho khối lượng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất Cơ sở này giúp đảm bảo độ tin cậy cao trong việc xác định các biến dị di truyền và cho điểm chúng dựa trên các công cụ thống kê Mỗi base đọc thô đều có điểm chất lượng (quality score), điểm này dựa trên việc xác định thể đồng hợp, dị hợp

và phân biệt các lỗi trong quá trình giải trình tự Ngoài ra, hệ thống giải trình tự này có quy trình chạy theo một chiều, khả năng tự đông hóa cao yêu cầu thời gian cho từng thao tác ngắn Với khả năng thu thập hàng triệu dữ liệu DNA trong một lần chạy, ngay cả các hệ gen lớn của các động vật có vú có thể giải trình tự trong một vài tuần thay vì một vài năm như trước kia do công nghệ này có khả năng chạy nhiều mẫu trên 1 flow cell (đồng nghĩa với việc có thể thực hiện nhiều ứng dụng trong một lần chạy)

Tuy nhiên, giải trình tự Illumina gặp phải hạn chế về chiều dài đọc (khoảng 250bp, đảm bảo chính xác tối đa 99%) Hơn nữa, công nghệ này yêu cầu việc sử dụng các hóa chất và các thiết bị có giá thành ở mức cao Tuy nhiên, với những nghiên cứu chỉ yêu cầu giải các đoạn trình tự ngắn thì đây là công nghệ tối ưu cho những nghiên cứu này

200-1.5.3.4 Các đoạn trình tự cho nghiên cứu metagenomic

Tùy thuộc vào từng mục tiêu nghiên cứu cụ thể, mà ta lựa chọn các đoạn trình tự khác nhau Nhiều nghiên cứu về sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột sử dụng gen 16S rDNA hoặc một phần đoạn trình tự gen này Trong đó, v3-v4 amplicon trên gen 16S RNA hoặc DNA là vùng được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu, bởi lẽ đây là vùng bảo thủ, có sự đa dạng về số lượng nucleotide của vùng này trên các loài cao nhất Vì vậy, vùng này có khả năng phân loại loài tốt nhất [97] Những ưu nhược điểm của lựa

chọn thông tin di truyền khác nhau được thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Ưu nhược điểm của các đoạn trình tự cho nghiên cứu metagenomic

1.6 Các nghiên cứu metagenomic trên thế giới và Việt Nam

Những nghiên cứu đầu tiên tạo tiền đề cho phương pháp metagenomic trên thế giới tập trung phân tích trình tự 16S rRNA bởi những trình tự này thường ngắn, mang tính bảo thủ cao, khác nhau giữa các loài [6, 109] Cũng trong những nghiên cứu này, các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình tự 16S rRNA thu được từ các kết quả phân tích không thuộc về bất kỳ loài nào đã được phân lập trước đây Điều này cho thấy rằng đã có rất nhiều loài vi sinh vật bị bỏ sót, không được nghiên cứu đến Công nghệ metagenomic ra đời với mục tiêu giải quyết những hạn chế của phương pháp nuôi cấy truyền thống, hướng sự tập trung vào các nhóm vi sinh vật chưa được khám phá thông qua phân lập và nghiên cứu trực tiếp hệ gen của toàn bộ các vi sinh vật tồn tại trong môi trường cụ thể Bằng cách này, ta có thể có thông tin di truyền của hệ vi sinh vật tồn tại trong khu vực đó mà không cần phải nuôi cấy từng tế bào riêng lẻ

Sau khoảng 5 năm kể từ khi thuật ngữ “Metagenomic” lần đầu tiên được mô tả, các nghiên cứu về metagenomic chuyển hướng sang một giai đoạn mới, kỷ nguyên mới của áp dụng metagenomic trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen đặc trưng cho từng hệ vi sinh vật cụ thể Bắt đầu với nghiên cứu của Tyson et al vào năm 2004, nhấn mạnh rằng họ đã xây dựng được cơ sử dữ liệu hệ gen của hệ vi sinh vật có trong nước thải nhiễm axít [86] Đây là một bước tiến quan trọng xác định được bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần như hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trước đây chưa nuôi cấy thành công Theo sau đó là hàng loạt những công trình nghiên cứu xây dựng các thư viện gen cho các vi sinh vật của nhiều môi trường khác nhau sử dụng metagenomic [53, 55, 107] Tiêu biểu là dự án Tara Oceans (với mục tiêu xây dựng được cơ sở dữ liệu hệ gen hệ vi sinh vật sống ở đại dương dựa trên công cụ metagenomic), đã trích xuất được xấp xỉ 1000 MAG (metagenomic assembled genomics) [78]

Ngoài những nghiên cứu về xây dựng MAG, những nghiên cứu ứng dụng metagenomic để đánh giá sự biến động hệ vi sinh vật với sức khỏe vật chủ hay sự biến động hệ vi sinh vật với môi trường cũng ngày càng dược đẩy mạnh Song song với việc khám phá những hệ gen mới, các nghiên cứu này tập trung tìm hiểu thành phần vi sinh vật với các cơ chế chuyển hóa, sản xuất các phân tử quan trọng, tìm kiếm những vi sinh vật chủ đạo tương quan với sức khỏe con người hoặc tương quan với những yếu tố môi trường [108, 111] Một trong số những nghiên cứu đã và đang được quan tâm đó là nghiên cứu đánh giá về hiệu quả của việc sử dụng các chế phẩm probiotic dựa trên sự biến động hệ vi sinh đường ruột

Cụ thể, những nghiên cứu về khía cạnh này có thể kể đến như Haiyan Xu cùng đồng nghiệp nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm probiotic chứa tổ hợp các chủng

Lactobacillus casei Zhang, Lactobacillus plantarum P-8, và Bifidobacterium animalis

subsp lactis V9 trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy do kháng sinh ở chó [91] Các kết quả trong nghiên cứu này có thể kể đến như tăng mức độ đa dạng vi sinh vật đường ruột ở nhóm sử dụng probiotic Ngoài ra, ở nhóm này, có sự tăng cường của các vi khuẩn

có lợi (Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus,

Butyricicoccus pullicaecorum) và giảm sự đa dạng các vi khuẩn có hại (Clostridium perfringens, Stenotrophomonas maltophilia) Ngoài những khác biệt về thành phần hệ

vi sinh vật giữa nhóm sử dụng và không sử dụng chế phẩm probiotic Nghiên cứu này cũng chỉ ra mức độ biểu hiện của một số con đường chuyển hóa, như tăng cường các con đường liên quan đến quá trình chuyển hóa axit amin và sinh tổng hợp các chất thứ cấp, và giảm mức độ biểu hiện của các con đường liên quan đến độc lực của vi khuẩn gây bệnh Các kết quả trên cho thấy hiệu quả của chế phẩm probiotic trong việc cải thiện sức khỏe của chó bị tiêu chảy, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hiệu quả của chế phẩm probiotic trên người bằng phương pháp metagenomic

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột đến sức khỏe của vật chủ bằng phương pháp metagenomic có thể kể đến như: Trần Trung Thành cùng đồng nghiệp nghiên cứu so sánh cấu trúc hệ vi khuẩn đường ruột của tôm thẻ chân

trắng (Litopenaeus vannamei) giữa tôm khoẻ mạnh và tôm bị bệnh tại Sóc Trăng, Việt

Nam [84] Kết quả nghiên cứu chỉ ra thành phần và mức độ đa dạng của hệ vi khuẩn trong ruột tôm thẻ chân trắng giữa ba đầm nuôi tôm thẻ chân trắng sau 3 tháng nuôi Các ngành chiếm ưu thế Proteobacteria, Firmicutes và Bacteroidetes Ở mức độ chi,

Rhizobium, Vibrio và Spongiimonas là các chi chiếm ưu thế trên các mẫu nghiên cứu

Đồng thời, họ cũng dư đoán được sử có mặt của một số tác nhân có khả năng gây bệnh trên mẫu ruột tôm bị bênh (ST4) là Vibrio

Việc áp dụng công nghệ metagenomic vào nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột đã, đang và sẽ đóng vai trò to lớn trong nhiều nghiên cứu liên quan đến sức khỏe vật chủ Tuy nhiên, tại Việt Nam, rất ít những bài báo nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật metagenomic trên hệ vi sinh vật đường ruột nói chung và hệ vi sinh vật người nói riêng Đặc biệt ít đối với các nghiên cứu đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic bằng phương pháp metagenomic Vì vậy, nghiên cứu này tập trung “Nghiên cứu sự biến động hệ vi

khuẩn đường ruột ở chuột và người sử dụng chế phẩm probiotic trên cơ sở phân tích dữ liệu giải trình tự gen 16S rDNA metagenomics.”

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm BaciMix là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic”, cấp quốc gia do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN, mã số ĐTĐL.CN 61/19 Chế phẩm có số lô sản xuất 0121 DL, ngày sản xuất 10/11/22, hạn sử dụng 10/01/2024 và được gia công sản xuất tại Nhà máy đạt tiêu chuẩn GMP – Công ty CP Công nghệ Sinh phẩm Nam Việt Chế phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở và được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội Chế phẩm được sử dụng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả trên mô hình chuột Chế phẩm BaciMix là chế phẩm đa

chủng dạng bột chứa Bacillus subtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304.06 Hiện

nay, hai chủng này đang được lưu trữ và bảo quản tại Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội Hai chủng là kết quả quá trình phân lập, nuôi cấy và định danh bằng sinh học phân tử dựa trên trình tự 16S rADN và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) Ngoài ra, hai chủng đã được nuôi cấy, thử nghiệm các đặc tính an toàn và đặc tính

probiotic in vitro trước khi nghiên cứu phối trộn chế phẩm

Bảng 2.1 Thông tin chủng có trong chế phẩm BaciMix Thông tin chủng Bacillus subtilis BS

Hình 2.1 Chế phẩm Bacimix sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

*Nhóm thử nghiệm trên động vật gồm 40 con chuột được chia làm 2 nhóm: - 10 con chuột (Control – C): Nuôi trong 4 tuần

- 30 con chuột: Được tiêm kháng sinh trong 2 tuần Sau đó: + 10 con chuột (Bacimix - B): Được uống probiotic trong 2 tuần + 10 con chuột (Water – NR): Uống nước trong 2 tuần

+ 10 con chuột [2]: Dùng tiếp kháng sinh trong 2 tuần Các con chuột sau đó được mổ lấy manh tràng

*Nhóm thử nghiệm trên người gồm 20 bệnh nhân bị táo bón được chia làm 2 nhóm: - Nhóm sử dụng chế phẩm probiotic trong 8 ngày (PT, n=10)

- Nhóm Không dùng chế phẩm (NR, n=10) Các bệnh nhân này được trải qua thử nghiệm trong 9 ngày, được thu thập mẫu phân tại các thời điểm ngày 1, ngày 4, ngày 7, ngày 9

Thử nghiệm trên động vật Thử nghiệm trên người

Hình 2.2 Sơ đồ thử nghiệm trên chuột Hình 2.3 Sơ đồ thử nghiệm trên người

2.1.3 Hóa chất- thiết bị

Tất cả các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê dưới đây Các hóa chất và thiết bị này đã được sự đồng ý sử dụng bởi phòng sinh học phân tử ứng thuộc viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

Bảng 2.2: Danh mục phần mềm/tool Tên phần mềm/tool Ứng dụng