tiểu luận môn học kỹ thuật phân tích sinh hóa quy trình phân tích sinh học bằng quang phổ cơ bản trong thí nghiệm

ĐỊNH LƯỢNG DUNG DỊCH PROTEIN1.1 Phương pháp Biuret và Lowry1.1.1 Nội dung phương pháp Khi các chất chứa hai hoặc nhiều liên kết peptide phản ứng với thuốc thửbiuret, đồng sunfat kiềm, mộ

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP.HCM

KHOA SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TIỂU LUẬN

Môn học: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH SINH HỌC

BẰNG QUANG PHỔ CƠ BẢN TRONG THÍ NGHIỆM

GVHD: Hoàng Xuân Thế

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP.HCM

KHOA SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TIỂU LUẬN

Môn học: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH SINH HỌC

BẰNG QUANG PHỔ CƠ BẢN TRONG THÍ NGHIỆM

GVHD: Hoàng Xuân Thế

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Hiển - 2008221381

Phạm Nguyễn Thu Hường - 2008221859Nguyễn Quốc Huy - 2008221595

Họ và tênNhiệm vụ

Nguyễn Văn Hiển

Tìm tài liệu phần 1.1Thuyết trình Thiết kế Power Point

Tổng hợp tài liệu bài WordPhạm Nguyễn Thu Hường Tìm tài liệu phần 1.3

Tổng hợp tài liệu bài Word

Tổng hợp tài liệu bài Word

MỤC LỤC

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN i

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC ii

MỤC LỤC iii

I ĐỊNH LƯỢNG DUNG DỊCH PROTEIN 1

1.1 Phương pháp Biuret và Lowry 1

1.1.1 Nội dung phương pháp 1

Tài liệu tham khảo 12

Trả lời câu hỏi 13

iii

I ĐỊNH LƯỢNG DUNG DỊCH PROTEIN

1.1 Phương pháp Biuret và Lowry1.1.1 Nội dung phương pháp

Khi các chất chứa hai hoặc nhiều liên kết peptide phản ứng với thuốc thửbiuret, đồng sunfat kiềm, một phức hợp màu tím được hình thành Sản phẩm có màulà kết quả của sự phối hợp các nguyên tử nitơ peptide với lượng sản phẩm được hìnhthành phụ thuộc vào nồng độ protein

Trong thực tế, phải lập đường cong hiệu chuẩn bằng cách sử dụng dung dịchprotein chuẩn Protein tốt nhất để sử dụng làm chuẩn là chế phẩm tinh khiết củaprotein cần phân tích Vì hiếm khi có, nên người thử nghiệm phải chọn một proteinkhác làm chuẩn tương đối Phải chọn một chuẩn tương đối cung cấp hiệu suất màutương tự Dung dịch nước của albumin huyết thanh bò (BSA) là một chuẩn thườngđược sử dụng Các lượng dung dịch này đã biết được xử lý bằng thuốc thử biuret vàmàu được phép phát triển Đo độ hấp thụ ở 540 nm được thực hiện trên mẫu trắngchứa thuốc thử biuret và đệm hoặc nước Dữ liệu A540 được biểu diễn theo nồng độprotein (mg/mL) hoặc lượng protein (mg) Các mẫu protein chưa biết được xử lý bằngthuốc thử biuret và được đo sau khi phát triển màu Nồng độ protein được xác định từđường cong chuẩn Xét nghiệm biuret có một số ưu điểm, bao gồm tốc độ, màu sắcphát triển tương tự với các protein khác nhau và ít chất gây nhiễu Nhược điểm chínhcủa xét nghiệm này là độ nhạy kém [CITATION Boy121 \p 67-68 \l 1033 ]

Trường Đại học Công Thương TP.HCM Khoa Sinh học và Môi trường

Bảng 1.1 Phương pháp đo Protein

Quy trình Lowry có thể phát hiện mức protein thấp tới nguyên lý đằng sau quátrình phát triển màu sắc giống hệt với xét nghiệm biuret, ngoại trừ việc thêm thuốc thửthứ hai (Folin-Ciocalteu) để tăng lượng màu phát triển Hai phản ứng tạo nên màuxanh lam đậm phát triển: (1) phối hợp các liên kết peptide với đồng kiềm (phản ứngbiuret) và (2) khử thuốc thử Folin-Ciocalteu (phosphomolybdate-phosphotungstate)bằng các gốc tyrosine và tryptophan trong protein Quy trình này tương tự như xétnghiệm biuret Đường cong chuẩn được chuẩn bị bằng albumin huyết thanh bò hoặcprotein tinh khiết khác và nồng độ của các dung dịch protein chưa biết được xác địnhtừ đồ thị

Ưu điểm rõ ràng của xét nghiệm Lowry là độ nhạy của nó, cao hơn tới 100 lầnso với xét nghiệm biuret; tuy nhiên, xét nghiệm Lowry cần nhiều thời gian hơn Vìprotein có hàm lượng tyrosine và tryptophan khác nhau nên lượng màu phát triển thayđổi theo các protein khác nhau, bao gồm cả chuẩn albumin huyết thanh bò

Do đó, xét nghiệm protein Lowry chỉ nên được sử dụng để đo những thay đổivề nồng độ protein, chứ không phải giá trị tuyệt đối của nồng độ protein.[CITATIONBoy121 \p 68-69 \l 1033 ]

1.1.2 Ví dụ quy trình phân tích

Thí nghiệm phân lập, phân tách và phân tích enzyme của ty thể tim bò

a Tổng quát về thí nghiệm:

- Phân lập ty thể.- Xác định protein.- Chuẩn bị SMP.- Đo hoạt động của enzyme

Hình 1.1 Bảng thuốc thử cho các ống nghiệm

Trường Đại học Công Thương TP.HCM Khoa Sinh học và Môi trường

Bước 2: Thêm lượng thuốc thử của từng loại thích hợp trong bốn số thuốc thửđầu tiên (dung dịch sucrose, ty thể, natri deoxycholate và BSA) vào từng ống trongnăm ống nghiệm

Bước 3: Thêm đủ nước vào mỗi ống sao cho tổng thể tích tất cả các chất lỏnglà 1,5mL

Bước 4: Thêm 1,5mL thuốc thử biuret vào từng ống nghiệm và lắc đều bằngcách đảo đều vài lần nhưng vẫn giữ nguyên miếng giấy hydrocacbon trên miệng ống

Bước 5: Ủ các ống trong 15 phút ở 370C sau đó chuyển mẫu vào cuvet.Bước 6: Đo và ghi lại độ hấp thụ ở bước sóng 540nm của các ống từ 1-4, sửdụng ống số 5 để điều chỉnh độ hấp thụ ở A540 đến 0.0

Bước 7: Ống 1 phải có khoảng gấp đôi ở A540 của ống 2 Nếu số đọc độ hấp thụcủa ống 1 và ống 2 lớp hơn hai đến ba lần so với ống 3,4 thì hãy lặp lại xét nghiệmbằng cách sử dụng tỷ lệ tỷ thể ít hơn trong ống 1 và 2 để đảm bảo rằng các xét nghiệmmới chứa tống cộng 3mL chất lỏng trong từng ống nghiệm.[CITATION Rod00 \p364-365 \l 1033 ]

1.2 Phương pháp BradFord1.2.1 Nội dung phương pháp

Các hạn chế của phương pháp Biuret và Lowry đã thúc đẩy các nhà nghiên cứutìm kiếm những phương pháp tốt hơn để định lượng dung dịch protein Phương phápBradford, dựa trên sự liên kết của protein với chất nhuộm, cung cấp nhiều ưu điểmhơn so với các phương pháp khác Sự liên kết của chất nhuộm Coomassie BrilliantBlue (Hình 1.2) với protein trong dung dịch acid làm thay đổi bước sóng hấp thụ tốiđa (Amax) của chất nhuộm từ 465 nm đến 595 nm Sự hấp thụ ở 595 nm liên quantrực tiếp đến nồng độ protein Chất nhuộm phản ứng chủ yếu với các gốc acid aminmang điện tích dương (bazơ) (arginyl, lysyl và histidyl) trong protein Ngoài ra, có thểcó tương tác yếu hơn giữa các phân tử chất nhuộm và các gốc acid amin thơm kỵ nước(tyrosinyl, phenylalanyl và tryptophanyl) Các protein có số lượng các gốc acid amintương tác này cao hơn trung bình sẽ cho độ nhạy cao hơn và do đó có giá trị hấp thụcao hơn ở 595 nm

Hình 1.2 Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 được sử dụng để đo nồng độ

protein trong xét nghiệm Bradford

Trong thực tế, một đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách vẽ biểu đồ µgprotein chuẩn so với độ hấp thụ ở 595 nm, sau đó được sử dụng để ước tính lượngprotein trong các mẫu chưa biết (Hình 1.3) Các protein chuẩn được khuyến nghị baogồm gamma globulin bò (IgG), lysozyme và ovalbumin vì chúng có số lượng gốc acidamin liên kết chất nhuộm gần với trung bình hoặc điển hình (xem ở trên) Mặc dùBSA thường được khuyến nghị trong tài liệu, nhưng nó không phải là lựa chọn tốt chotiêu chuẩn cho phương pháp Bradford vì nó có hàm lượng cao các gốc acid amin phảnứng Độ hấp thụ 595 nm của BSA gấp khoảng 2,1 lần so với IgG (Hình 1.3)

Hình 1.3 Đường cong hiệu chuẩn chuẩn do sinh viên tạo ra cho xét nghiệm proteinBradford sử dụng gamma globulin bò (IgG, •) và albumin huyết thanh bò (BSA,) làm

chuẩn protein

Trường Đại học Công Thương TP.HCM Khoa Sinh học và Môi trường

Phương pháp này chỉ yêu cầu một thuốc thử duy nhất, một dung dịch acid củaCoomassie Brilliant Blue G-250 Sau khi thêm dung dịch thuốc nhuộm vào mẫuprotein, sự phát triển màu hoàn tất trong 2 phút và màu sắc vẫn ổn định trong tối đa 1giờ Độ nhạy của phương pháp Bradford có thể sánh ngang hoặc vượt qua phươngpháp Lowry Với quy trình vi phân tích, phương pháp Bradford có thể được sử dụngđể xác định protein trong khoảng 1 đến 20 µg Phương pháp Bradford cho thấy sựbiến đổi đáng kể với các protein khác nhau, nhưng điều này cũng xảy ra với phươngpháp Lowry và có thể tránh được bằng cách sử dụng tiêu chuẩn protein phù hợp.Phương pháp Bradford không chỉ nhanh chóng mà còn có rất ít nhiễu bởi các thànhphần không phải protein Các chất nhiễu duy nhất được biết đến là chất tẩy rửa TritonX-100 và sodium dodecyl sulfate Nhiều ưu điểm của phương pháp Bradford đã dẫnđến việc áp dụng rộng rãi của nó trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh hóa.[ CITATION Boy121 \l 1033 ]

Bảng 1.2 Quy trình xét nghiệm protein Bradford

Bước 2: Ống 1 được sử dụng làm mẫu trắng và các ống từ 2 đến 6 dùng để xâydựng đường cong hiệu chuẩn chuẩn Các ống từ 7 đến 10 là các bản sao của hai nồngđộ khác nhau của dung dịch α-lactalbumin cô lập 1, và các ống 11 và 12 là hai nồngđộ váng sữa Thêm nước để có thể tích cuối cùng là 10mL trong mỗi ống

Bước 3: Thêm 5mL thuốc thử thuốc nhuộm Bradford pha loãng vào mỗi ống vàtrộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ nhàng

Bước 4: Sau ít nhất 5 phút, đọc A595 cho mỗi ống, sử dụng ống 1 làm mẫutrắng Các ống phải được đọc trong vòng một giờ sau khi thêm thuốc nhuộm.

Bước 5: Nếu chỉ số hấp thụ quá thấp (<0,05) hoặc quá cao (>1,0), hãy lặp lạiphép thử với nhiều hoặc ít phần protein hơn.[CITATION Rod00 \p 273-274 \l 1033 ]

1.3 Phương pháp quang phổ1.3.1 Nội dung phương pháp

Phương pháp quang phổ là một trong những phương pháp phổ biến và nhanhchóng để xác định nồng độ protein trong dung dịch Hầu hết các protein đều có độ hấpthụ tia cực tím tương đối mạnh ở bước sóng 280nm, vì do có sự hiện diện của dưlượng tyrosine thơm và tryptophan trong protein Tuy nhiên, acid amin dư lượng nàykhác nhau ở các loại protein khác nhau

Trong thực tế , dung dịch protein được chuyển vào cuvet thạch anh và kết quảA được đọc trên cuvet tham chiếu chỉ chứa trong chất đệm đó Đối với protein trungbình, nồng độ 1 mg/mL sẽ có độ hấp thụ ở bước sóng 280nm khoảng 1

Dịch chiết tế bào chứa nhiều hợp chất khác hấp thụ vào cơ thể của nó ở bướcsóng 280nm Ví dụ acid nucleic có thể là chất gây ô nhiễm phổ biến trong proteinchiết, nó hấp thụ mạnh ở bước sóng 280nm (λ= 260) Nhà nghiên cứu đã phát hiện ramột phương pháp để khắc phục sự giao thoa này bằng acid nucleic Phương trình thựcnghiệm sau đây có thể được sử dụng cho dung dịch protein chứa 20% acid nucleic:

Nồng độ protein (mg/mL)= 1,55A280 – 0,76A260.Mặc dù xét nghiệm đo quang phổ của protein chỉ cần một lượng mẫu nhỏ nhưngnó vẫn chỉ là ước tính về nồng độ protein trừ khi biết được hệ số tuyệt chủng của nó.Nó có những ưu điểm nhất định so với các xét nghiệm đo màu ở chỗ hầu hết các chấtđệm và ammontum sulfate không cần can thiệp và quy trình này không phá hủy mẫuprotein

Quy trình xét nghiệm đo quang phổ được sử dụng để đo nhanh và liên tục trongquá trình rửa giải protein từ cột sắc ký khi chỉ cần thay đổi nồng độ protein là được.[ CITATION Boy121 \l 1033 ]

Trường Đại học Công Thương TP.HCM Khoa Sinh học và Môi trường

1.3.2 Ví dụ quy trình phân tích

Quy trình đo hoạt tính enzyme.Bước 1: Bật máy đo quang phổ và đèn UV 15 phút trước khi đo.Bước 2: Thêm các thuốc thử trong bảng bên dưới vào hai cuvet thạch anh

Bảng 1.3 Thuốc thử quy trình đo hoạt tính enzyme

Bước 3: Nếu cần, pha loãng phần ty thể thành nồng độ protein 1mg/mL Thêm0.1mL (0.1mg protein) ty thể đã pha loãng vào cuvet 1 Đậy cuvet bằng giấyhydrocacbon và nhẹ nhàng lắc ngược hai đến ba lần

Bước 4: Đưa cuvet vào tia mẫu của máy đo quang phổ và điều chỉnh độ hấp thụước bước sóng 340nm về 0.00

Bước 5: Thêm 0.1mL (0.1mg protein) ty thể đã pha loãng vào cuvet 2, trộn nhưđã làm với cuvet 1 và đặt ngay vào máy đo quang phổ

Bước 6: Nếu có sẵn máy ghi, hãy theo dõi độ hấp thụ bước sóng 340nm trong 5phút Nếu không có máy ghi, hãy đọc và ghi vào sổ A340 mỗi 30 giây trong 5 phút Nếuphản ứng xảy ra quá chậm hay quá nhanh, hãy lặp lại xét nghiệm với lượng enzymenhiều hoặc ít Thể tích cuối của phản ứng phải bằng 3.0mL

Bước 7: Lập đồ thị với A340 (trục y) và thời gian (trục x).[CITATION Rod00 \p366-367 \l 1033 ]

II ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC

2.1 Phương pháp Quang phổ2.1.1 Nội dung phương pháp

Dung dịch acid nucleic hấp thụ mạnh tia cực tím ở bước sóng 260nm, chủ yếulà do sự hiện diện của các vòng thơm trong các bazơ purin và pyrimidin Nồng độ acidnucleic trong dung dịch có thể được xác định dựa trên giá trị độ hấp thụ quang (A).Chẳng hạn, dung dịch DNA sợi đôi ở nồng độ 50 µg/mL trong cuvet thạch anh cóchiều dài 1 cm sẽ có giá trị A khoảng 1,0 Đối với RNA hoặc DNA sợi đơn, giá trị Alà 1,0 trong cùng điều kiện sẽ tương ứng với nồng độ khoảng 40 µg/mL

Phương pháp quang phổ để định lượng acid nucleic đơn giản, nhanh chóng,không phá hủy mẫu và rất nhạy

Cần lưu ý rằng phương pháp này không phân biệt được giữa DNA và RNA.Nồng độ acid nucleic thấp nhất mà phương pháp này có thể xác định chính xác là từ2,5 đến 5,0 µg/mL

Ngoài ra, việc đo độ hấp thụ tia cực tím của dung dịch DNA và RNA còn cungcấp thông tin về cấu trúc và độ tinh khiết của mẫu Các thay đổi về cấu trúc như quátrình tháo xoắn DNA có thể được phát hiện thông qua sự thay đổi trong độ hấp thụ tại260 nm Tỷ lệ A260/A280 thường được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của dungdịch acid nucleic DNA tinh khiết, không chứa hoặc chứa rất ít protein, sẽ có tỷ lệ hấpthụ khoảng 1,8 trong khi RNA tinh khiết có tỷ lệ khoảng 2 Nếu tỷ lệ này thấp hơn cácgiá trị trên, điều đó cho thấy dung dịch có khả năng bị nhiễm protein.[ CITATIONBoy121 \l 1033 ]

2.1.2 Ví dụ quy trình phân tích

Bước 1: Pha loãng 0.5mL dung dịch DNA với 4,5mL dung dịch đệm Tris I.Bước 2: Đưa một ít dung dịch vào cuvet thạch anh và xác định A260 Sử dụng cuvet chỉchứa dung dịch đệm Tris I làm đối chiếu (Nếu A260 lớn hơn 1 thì pha loãng mẫu định lượng cho tới khi chỉ số hấp thụ nằm trong khoảng 0,5 đến 1,0.) Xác định và ghi lại A280 trên cùng một mẫu DNA

Bước 3: Tính toán các thông số.[CITATION Rod00 \p 409-410 \l 1033 ]

Trường Đại học Công Thương TP.HCM Khoa Sinh học và Môi trường

2.2 Phương pháp khác để định lượng acid nucleic

Ngoài định lượng acid nucleic bằng phương pháp quang phổ, còn có một sốphương pháp khác để định lượng acid nucleic:

- Phương pháp điện di (Electrophoresis): Sử dụng agarose hoặc polyacrylamidegel để phân tách các đoạn acid nucleic theo kích thước, sau đó có thể ước lượng lượngacid nucleic dựa trên cường độ của vệt DNA/RNA trên gel khi nhuộm bằng ethidiumbromide hoặc các chất nhuộm khác [CITATION Rod00 \p 440 \l 1033 ]

+Các bước thực hiện:

 Bước 1:Chuẩn bị huyền phù đặc agarose 1% (w/v) trong dung dịch đệm huyền phù agarose Lượng dung dịch thực tế sử dụng phụ thuộc vào kích thước của tấm gel được chuẩn bị Thực hiện theo các hướng dẫn được đưa ra bởi người hướng dẫn của bạn

 Bước 2: Đun nóng hỗn hợp trong nồi cách thủy cho đến khi agarose tan

 Bước 3:Sau khi dung dịch agarose nguội đến 50°C, thêm dung dịch ethidium bromide để có nồng độ thuốc nhuộm cuối cùng là 0,5 µg/mL

 Bước 4:Đổ nhanh dung dịch agarose lên tấm kính đến độ sâu từ 2 đến 4 mm Chèn lược để tạo giếng mẫu

 Bước 5: Để gel đông lại trong khoảng 30 phút và cẩn thận loại bỏ lược

 Bước 6:Kẹp tấm agarose vào buồng điện di và để yên trong 30 phút

 Bước 7:Nạp mẫu vào mỗi giếng mẫu. Bước 8:Thêm đệm điện di vào bình chứa và nối nguồn

điện. Bước 9: Tiến hành điện di ở điện áp khoảng 3 V/cm hoặc

tổng điện áp khoảng 50 đến 70 volt. Bước 10:Tắt nguồn điện khi thuốc nhuộm theo dõi đã di

chuyển đến mép dưới của gel. Bước 11:Lấy gel ra khỏi buồng và tấm kính rồi kiểm tra

dưới đèn UV Các đoạn DNA sẽ xuất hiện dưới dạng dải huỳnh quang màu đỏ cam

 Bước 12: Chụp ảnh hoặc vẽ hình tấm gel, thể hiện vị trí của từng dải DNA Đọc kết quả và so với đường chuẩn của DNA để xác định nồng độ các mẫu