Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Thu nhận N-Acetyl-Glucosamine bằng phương pháp thủy phân bởi enzyme

Glucosamine là một amino-monosaccharide tham gia vào quá trình tổng hopglycosaminoglycans tạo thành mô sun, tăng sản xuất chất nhay dịch khớp, kíchthích sinh sản mô liên kết của xương, g

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

NGUYEN THI NHAN BANG

THU NHAN N-ACETYL-GLUCOSAMINE

BANG PHUONG PHAP THUY PHAN BOI ENZYME

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩmMã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 07 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HỌC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : GS TS Đồng Thị Anh Đào

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS TS Lê Phi Nga

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Trịnh Khánh Sơn

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Truong Dai học Bách Khoa, DHQG Tp.HCM ngày II thang 07 năm 2017.

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học ham, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS TS Nguyễn Tiến Thang Chủ tịch

2.PGS TS Lê Phi Nga Phản biện 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯƠNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Nhân Băng MSHV: 1570417

Ngày, tháng, năm sinh: 09/11/1992 Nơi sinh: Vĩnh Long

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540101

L TEN DE TAI: THU NHAN N-ACETYL-GLUCOSAMINE BẰNG PHƯƠNG

PHÁP THỦY PHẦN BỞI ENZYME

Il NHIỆM VU VÀ NỘI DUNG:- Phan tích thành phan vỏ tôm thẻ chân trắng.- Khao sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân thu nhận N-acetyl-

glucosamine bang cellulase Tối ưu hóa các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình

thủy phân bởi cellulase.- Khao sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình thủy phân nâng cao hiệu quả

thu nhận N-acetyl-glucosamine bang glucoamylase Tối ưu hóa các yếu tốảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi glucoamylase.

- _ Kiểm tra chất lượng sản phẩm.

Ill NGÀY GIAO NHIỆM VU: 06/02/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017V CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: GS TS Đống Thị Anh Đảo

Tp HCM, ngày 04 tháng 07 năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN

CBSO

Trong quá trình làm để tài thì tôi đã nhận được nhiễu sự giúp đỡ, qua đây tôixin chân thành cam ơn Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Kỹ thuát hóa học -Trường Đại học Bách Khoa Thành phô Hồ Chí Minh đã hồ trợ phòng thí nghiệm,phòng thiết bị, máy móc giúp tôi thực hiện và hoang thành luận văn đúng tiễn độ

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến GS TS Đồng Thị Anh Đào, người luôntận tình giúp đỡ, tạo điêu kiện và hướng dan tôi trong suốt quá trình nghiên cứu vàhoàn thành luận văn Đông thời tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ mônCông nghệ Thực phẩm đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CH2015-1 và tập thé phòng thí nghiệm B10, đặcbiệt là bạn Nguyễn Thị Thảo Nguyên và Nguyễn Quang Sáu đã dong hành và hếtlòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã hỗ trợ về vật chất và luôn độngviên tinh than cho tôi trong suốt thời gian vừa qua

Tp HCM, ngày 04 tháng 07 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Nhân Băng

TÓM TAT

alles

Luận văn này tập trung khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và từ đó tìm chế độthủy phân chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng tối thích để thu nhận N-acetyl-

glucosamine bởi cellulase và nâng cao hiệu quả thu nhận N-acetyl-glucosamine

bang glucoamylase Tiến hành tối ưu các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình thủy phânbăng phương pháp bé mặt đáp ứng (RSM)

Từ nguyên liệu thô là vỏ tôm thẻ chân trang thu chitin bang cách tiến hànhxử lý protein băng dung dịch NaOH 5%, tỷ lệ 1/10 (w/v), ở 60°C trong 6 giờ ; xử lýkhoáng bằng dung dịch HCI 5%, tỷ lệ 1/15 (w/v), ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

Tiến hành thủy phân với điều kiện tối ưu bằng cellulase ở nhiệt độ 50°C, pH5, tỷ lệ E/S là 2.25% (118.13 U/g) trong 2.2 giờ, tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosaminelà 10.85% (tính trên hàm lượng chất khô tuyệt đối) Tiếp tục thủy phân ở điều kiệntối ưu băng glucoamylase ở 60°C, ph 5, tỷ lệ E/S là 1.3% (41.6U/g) trong 4.4 giờthu được 18.67% N-acetyl-glucosamine (tính trên hàm lượng chất khô tuyệt đối)

Dịch thủy phân được cô quay ở 60°C, tốc độ quay 50rpm, sau đó phối trộnmaltodextrin và say phun 6 140°C, lưu lượng 485ml/h Bột N-acetyl-glucosaminecó độ âm là 3.38%, độ tro 8.57% (tính trên ham lượng chat khô tuyệt đối), độ hòatan là 80% và khối lượng phân tử trung bình là 1.479 g/mol

va Le

The aim of this study is to research the influence of the hydrolysis factorsand to defind the optimal conditions for the chitin hydrolysis from the white legshrimp shells to get the highest yield of N-acetyl-glucosamine by cellulase andglucoamylase Optimizing the factors affect the hydrolysis by Response SurfaceMethods (RSM).

Chitin was prepared from the white leg shrimp shells by the following steps:the deproteinization is conveniently obtained in NaOH 5% with a solid-to-liquid

ratio of about 1/10 (w/v), at a temperature of 60°C within 6 hours; the

demineralization is completely achieved in HC] 5% with ratio of about 1/15 (w/v),within 2 hours at ambient temperature.

N-acetyl-glucosamine was produced from chitin by the optimal conditon

hydrolysis as following: cellulase 2.25% (118.125U/g) at 50°C, pH 5, within 2.2

hours for initial reaction, the yield of N-acetyl-glucosamine in the dried precipitate

was 10.85% (w/w) Continuous with glucoamylase 1.3% (41.6U/g) at 60°C, pH 5,

within 4.4 hours, the yield of N-acetyl-glucosamine in the dried precipitate was18.67%.

The N-acetyl-glucosamine hydrolyzate was increased concentration in a

vacuum rotary evaporator at 60°C, rotational speed about 50rpm, then mixedmaltodextrin and spray dried at 140°C, with flow about 485ml/h The moisture

content of N-acetyl-glucosamine powder is 3.38%, the ash content if 8.57% (driedprecitiate), the solubility is 80% and the average molecular weight is about 1.479g/mol.

LỜI CAM ĐOAN

C2)

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các sô liệu, kêt quảnên tong luận văn là trung thực và chưa từng được công bô ở bat cứ công trìnhnghiên cứu nào khác.

Học viên

Nguyễn Thị Nhân Băng

MỤC LỤC

CHUONG 1: TONG QUAN 0 2 |1.1 TONG QUAN VỀ NGUYEN LIEU 5 E2 E228 EeEsEsEeEeeeeEsesed |1.1.1 Tinh hình xau khâu tôm — nguồn phế liệu 5- 5 2552525552 |1.1.2 Vỏ tôm thẻ chân trắng -¿ - 5256 tSt 2323 2E 1 1211112111111 re 21.2 TONG QUAN VE CHITIN -G- + 6xx E91 SE eEgveegvreesed 41.2.l CẤu tẠO QQ TT n HH TH HT TT TT HT ngu 41.2.2 Tính chất của chitin 5-5-5652 E321 1515 1 1211111152511 112 xe, 61.3 TONG QUAN VE N-ACETYL-GLUCOSAMINE -5 - 555555: 61.3.1 Tinh hình sản xuất glucosamine c.c.ccccccscsessssesessssessesssesesseseseeseseeseseeeees 61.3.2 Cấu tC eecccccccsccccscscscsssscsescscsssscscscscsssscsesssssssscscsssssssessesssssesessesssseeeens 71.3.3 Ứng dụng glucosamine - - ¿©2552 2xx £EEeEEcEekrrkrkerrrrrerree 101.4 CÁC PHƯƠNG PHAP SAN XUẤT GLUCOSAMIINE 141.4.1 Quy trình sản XUẤT - ¿c2 S123 1 1E 1112111111111 111111111111 11 11c xe 141.4.2 Phương pháp sản xuất và các nghiên cứu về gølueosamine 171.5 TONG QUAN VE ENZYME SG tt 319128 E151 8151 1E Eekesrred 23

1.5.]I Cellulase -cc 1c S Q1 S011 H HH HH HH ng ch, 23

1.5.2 GlucOoarmyÏASe Họ 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG T11 12111 1910191111 11101111 T111 11 ng ng 292.1.1 Vỏ tôm thẻ chân trắng - + ¿2E + S2 SE2E£ES E311 E11 rErrre, 29

2.[.2 EnzVIme cọ Họ nọ nọ 29

2.1.3 Hóa chất -c-c-Sc c3 1 1E 1 1111111111111 0111111010111 1x1 re 292.2 DỤNG CỤ VÀ THIET BỊ - «E2 EsEE#E2EEEEsESEEESESEEEexeerersesed 302.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - ¿22-5 2 2+2 +E£E+EzEzErererrsree 322.3.1 Sơ đỗ nghiên CỨU ¿6 5222323 E121 2E1 1211111 re 322.3.2 Bồ trí thí nghiệm thủy phan chitin bằng enzyme cellulase 362.3.3 Bồ trí thí nghiệm nâng cao hiệu quả thủy phân chitin bằng enzyme

0069600 38

2.34 Phương pháp phân tich Ăn vn 40

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu - + 2 55E+E+ESEEE+E£ESEEEEEErErErrrrrrees 40

CHƯƠNG 3: KET QUA VA BAN LUẬN ¿ 5< ScSe 3E ESESESEEsEsErerseresee 4l3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN VO TÔM -G G1 3x2 Eseekekes Al3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN HÓA HOC CUA CHITIN 5<: Al3.3 XÁC ĐỊNH HOAT ĐỘ ENZYME ecccscssssesssssssssssesscscscsscsesesscsesesscsesesscseseees 42

4.2.1 C@lÏU[iaSG- G << c c9 010 42

3.2.2 GlUCOAMYLASE - - << c0 nọ re 42

3.3 KHAO SÁT CHỌN CHE ĐỘ THUY PHAN CHITIN THU

N-ACETYL-GLUCOSAMIINE QQ QQQ Gv re 42

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khao sát nhiệt độ thủy phân của enzyme cellulase 42

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát pH thủy phân cua enzyme cellulase 4

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ty lệ E/S của enzyme cellulase 45

3.34 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian thủy phan cua cellulase 46

3.3.5 Thi nghiệm 5: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủyphân của enzyme Cellulase << + 1999900 ng ve 463.4 KHAO SÁT CHỌN CHE ĐỘ NANG CAO HIỆU SUAT THUY PHANCHITIN BANG ENZYME GLUCOAMYLASE ¿555252 Secxsecezrsrered 5134.1 Thí nghiệm 6: Khao sát nhiệt độ thủy phân cua glucoamylase 52

3.4.2 Thí nghiệm 7: Khao sat pH thủy phân cua enzyme glucoamylase 53

3.4.3 Thí nghiệm 8: Khao sat ty lệ E/S của glucoamylase 54

3.44 Thí nghiệm 9: Khao sát thời gian thủy phan cua glucoamylase 55

3.4.5 Thí nghiệm 10: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy

phân của enzyme glucoaMylase - - << s0 ke 57

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, G- G- + E113 9128 x11 126 1111 rvrvei 61TAI LIEU THAM KHẢO - 6s 33% E56 9191 91 3E E112 112129 vn gi 646

PHU L[ÙC - s00 TT nọ re 70

sắc ky long hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

mật độ quang (optical density)

vòng/phút (revolutions per minute)

phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology)kính hiểu vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)pho hap thụ phân tử (Ultraviolet - Visible spectroscopy)thé tích/khối lượng (volume/weight)

khối lượng/thê tích (weight/volume)khối lượng/khối lượng (weighUweight)

Bảng 1 1 Thành phan hoá học của vỏ tôm thẻ chân trang - 2 55+: 4Bảng 1 2 Các điều kiện xử lý protein trong quá trình sản xuất chitin từ vỏ tôm 16Bảng 1 3 Các điều kiện xử lý khoáng trong sản xuất chitin từ vỏ tôm l6Bảng 1 4 Các điều kiện tay màu trong quá trình sản xuất chitin từ vỏ tôm 17Bang 2 1 Hóa chat sử dụng trong quá trình nghiên cứu - 5555: 29

Bang 2 2 Dung cụ sử dụng trong quá trình nghiên cỨU - << ««<<<<<++ 31

Bang 2 3 Thiết bi sử dụng trong quá trình nghiên cứu - - + 5552: 32Bảng 3 1 Thành phan hóa học của tôm thẻ ¿- + 255252 2*+E+££+s+Ee£++x+xzzscxez 41Bang 3 2 Thanh phan hóa học của Chitin c.ccccscscssessssssessesesessesesessssssesseseeesseseeeeees 41Bang 3 3 Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman - 46

Bang 3 4 Ma trận Plackett-Burman - 6< + 99900 ng re 46

Bảng 3 5 Ảnh hưởng của các biến trong ma trận Plackett-Burman 49Bảng 3 6 Các yếu tổ trong RSÌM ¿5-5-5222 3 E1 1211121111111 1 11 cyyeg 50Bang 3 7 Kết quả thực nghiệm theo RSM ceccccscscssessssssessesesessesssessesssessssssssseseeeeess 50Bang 3 8 Ảnh hưởng của các biến đến hàm mục tiêu 25-552 255252: 50Bảng 3 9 Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman - 57

Bang 3 10 Ma trận Plackett-Burman - - - << 1 1 119001 1 re 57

Bảng 3 11 Ảnh hưởng của các biến trong ma trận Plackett-Burman 58Bảng 3 12 Các yếu tố trong RSM - 5c 22222 t2 1121111111111 tre 58Bang 3 13 Kết quả thực nghiệm theo RSM cccccccssesssscsessesesessesesessssesessesssesseseeeeees 58Bảng 3 14 Anh hưởng của các biến đến hàm mục tiêu -. - + 2 25552: 59Bảng 3 15 Thành phan hóa học của N-acetyl-glucosamine dạng bột 60

PL Bảng 1 Hướng dẫn pha dung dịch đệm - ¿2-25-2522 2*+x+x+Eeeeeerereree 86

DANH MUC BANG

PL Bang 2 Anh huong cua nhiét do dén tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%)thủy phân bang cellulase

PL Bang 3 Ảnh hưởng của pH đến ty lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) thủyphân băng cellulase

PL Bảng 4 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%)thủy phân băng cellulase

PL Bảng 5 Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%)thủy phân băng cellulase ¿5° 6652 SE 2E9E2SE‡E#EEEEEEEEEE E121 21111 2311 xxee 90PL Bảng 6 Tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) thủy phân bằng glucoamylase

O CAC MHISt dO KHAC MhAaU 077 sa AÍAI.DpD 91

PL Bảng 7 Ty lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) thủy phân bằng glucoamylase

0Us8.9:lvii: 0n 92

PL Bảng 8 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%)thủy phân băng glucoamylase ¿- 5-5252 SE S393 SE‡EEE E321 E112 xe 934PL Bảng 9 Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%)thủy phân băng glucoamylase - ¿+ 5256 E9S2 SE E333 E311 21211112111 xee 94

DANH MỤC HÌNHHình 1 1 Tôm thẻ chân trắng - ¿2 525629 SE£E#EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrkrrrrree 2Hình 1 2 Cầu trúc hóa học của ChifiTn - - - - se E612 E382 eEgvgvsvg ge reo 5Hình 1 3 Sự sắp xếp của chuỗi polime của ơ-chitin, B-chitin, y-chitin 6Hình 1 4 Cau tạo của Khớp - + + S6 1E 1 1211151151111 11111151111 1111111111111 10Hình 1 5 Cau trúc proteoglycans ccccccscssssessesssesscsesesscsesessesssesscsesessesesessescseseeseses 12Hình 1 6 Quy trình tong quát sản xuất øluceosamine - - 2+ s2 s+s+see: 14Hình 1 7 Phương trình thủy phân protein bằng NaOH 55-52: 15Hình 1 8 Quy trình sản xuất glucosamine hydrochloride của Đỗ Dinh Rang 19Hình 1 9 Quy trình san xuất glucosamine hydrochloride của Tran Thi Luyén 20Hình 1 10 Quy trình sản xuất N-acetyl-glucosamine của Charles A Haynes 22Hình 1 11 Nẵm sợi Trichoderma F€€S©Ï -c- te SE SE ESESEEEEESEEEESEEEEkskrkreesees 24Hình 1 12 Cau tạo trung tâm hoạt động của enzyme cellulase -. - 24Hình 1 13 Cơ chế hoạt động của CellUlase << 5c S11 113 9911111 gi 25Hình 1 14 Nam mốc Aspergillus Nig€Fr c5: 5c SE SE 2E E111 cv, 26Hình 1 15 Cau tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase 27Hình 1 16 Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase - 25 +5 2x5: 28Hình 1 17 Cơ chế hoạt động của glucoamylase ¿5-5 252552552 ce+evzecxcxee 28Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cỨU - ¿2E SE +E+E£SE£E#EEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrkrkrreee 33Hình 2 2 Sơ đồ quy trình làm VIỆC ¿- - ¿2 52 SE+E+E£E£E+EEEEEeEErErkerrrererreee 34Hình 3 1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi cellulase đến tỷ lệ thu hồi

N-acetyl-ølucosamine ((Ÿ%) - - << «c0 re 43

Hình 3 2 Ảnh hưởng của pH đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) từ quá

trình thủy phân bởi cellulase - << + 1 11999300111 99 9000 re 44

Hình 3 3 Anh hưởng của ty lệ E/S đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) từ

quá trình thủy phân bởi cellulase - - <5 5 S00 19990 ng ng re 46

Hình 3 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi cellulase đến tỷ lệ thu hồi

N-acetyl-glUCOSAMINE 8020080 ::455434 47

Hình 3 5 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân bởi cellulase đến tỷ lệthu hồi N-acetyl-glu€OSaimine ¿+ - ¿56+ E293 E33 E221 211112111 cx xe 51

Hình 3 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi glucoamylase đến tỷ lệ thu hồi

N-acetyl-ølucOsamine (() «c9 0 họ và 52

Hình 3 7 Anh hưởng của pH đến ty lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) từ quá

trình thủy phân bởi glucoamylase - - - - << 5G S000 ng re 34

Hình 3 8 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine (%) từ

quá trình thủy phân bởi glucoamylase << 1 900 ng re 55

Hình 3 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi glucoamylase đến ty lệ thu hồi

N-acetyl-ølucOsamine (() «c9 0 họ và 56

Hình 3 10 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân băng enzymeglucoamylase đến tỷ lệ thu hồi N-acetyl-glucosamine -. - + 2 2 25s+sc5+2 60Hình 3 11 Khối lượng phân tử của dịch N-acetyl-glucosamine - 61Hình 3 12 Pho mẫu san phẩm bột N-acetyl-glucosamine - 55-52: 62Hình 3 13 Quy trình sản xuất bột N-acetyl-glucosamine 25552: 64PL Hình 1 Phương trình đường chuẩn N-acetyl-glucosamine - 72PL Hình 2 Phương trình đường chuẩn BSA 25-55255252 cs+eezecscsee 81

MỞ ĐẦUBệnh xương khớp có hơn 200 loại, là một van dé lớn của nhân loại Các vị tríkhớp thường bị thoái hóa là: khớp cột sống (cổ, that lưng), khớp gót chân, khớp gối.khớp hang Tổ chức Y tế Thế giới đã chọn thập niên đầu tiên của thé kỷ 21 là “Thập

niên xương khớp”.

Glucosamine là một amino-monosaccharide tham gia vào quá trình tổng hopglycosaminoglycans tạo thành mô sun, tăng sản xuất chất nhay dịch khớp, kíchthích sinh sản mô liên kết của xương, giảm quá trình mat calci của xương, đồng thờiức chế các enzyme phá hủy sụn khớp (collagenase, phospholinase A) và giảm cácgốc tự do (những chat phá hủy các tế bào sinh sụn) Trong cơ thé, glucosamineđược cau tạo từ glucose và aminoacide glutamic, việc sản xuất glucosamine sẽ giảmdan theo độ tuổi Vì vậy việc bố sung glucosamine là điều cần thiết

Bên cạnh đó, ngành thủy sản đã và đang phát triển nhăm đáp ứng nhu cầutiêu dùng trong nước cũng như xuất khâu Tôm là ngành xuất khẩu chính mang lạithu nhập đáng kế cho nền kinh tế quốc dân đặc biệt là tôm thẻ chân trăng Trongquá trình chế biến, đông lạnh các sản phẩm thủy sản sẽ thải ra một lượng lớn phếliệu gây ô nhiễm môi trường Vì thế, việc sản xuất chitin, điều chế glucosamine vừahạn chế ô nhiễm môi trường, vừa tạo ra sản phẩm có ứng dụng cao trong bệnh viêm

khớp.

Tuy nhiên, hiện nay các công ty ở Việt Nam thường sử dụng phương pháp

hóa học để sản xuất ølucosamine, công đoạn sản xuất nguy hiểm và thải ra mộtlượng lớn hóa chất gây hại cho môi trường Vì vậy, van dé nghiên cứu, ứng dụngcác phương pháp sinh học hoặc kết hop sinh học và hóa học đang được thúc đây désản xuất N-acetyl-glucosamine có chất lượng cao hơn đồng thời giảm lượng hóachất thải ra môi trường và đảm bảo an toàn trong quá trình sản xuất

Chính vì thế, tôi chọn phương pháp ứng dụng enzyme cellulase kết hợpglucoamylase vào quy trình sản xuất N-acetyl-glucosamine từ vỏ tôm thẻ chân trangnhằm tận dụng một lượng lớn nguồn phế liệu đồng thời tạo ra một loại sản phẩm cógiá trị dược liệu cao là N-acetyl-glucosamine, góp phan hình thành và phát triểnngành công nghiệp xử lý phế liệu thủy sản theo hướng bên vững

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN1.1 TONG QUAN VE NGUYÊN LIEU

1.1.1 Tinh hình xấu khẩu tôm — nguồn phé liệuSản lượng nuôi trồng thủy san tháng 3 năm 2017: ước đạt 107 ngàn tan, tăng9.6% so với cùng kì năm trước, đưa tong sản lượng nuôi trồng thủy sản 3 tháng daunăm ước đạt 570 ngàn tấn, tăng 2.7 % so với cùng kỳ năm 2016 Diện tích nuôi tômnước lợ của cả nước 3 tháng đầu năm ước đạt 535.6 ngàn ha, tăng 1.7% so với cùngkỳ năm trước, sản lượng ước đạt 68.3 ngàn tan, tăng 14.14% Diện tích tôm théchân trang tại các tinh đồng bằng sông Cửu Long ước dat 17.5 ngàn ha (15.6%), sảnlượng ước đạt 21 ngàn tan (+10.8%) [1]

Ngay trong tháng đầu tiên của năm 2017, xuất khẩu tôm đã giảm 12.6% sovới cùng kỳ năm 2016 Sang tháng 2/2017, xuất khẩu tôm lại tăng 18.7% và giảm0.2% trong tháng 3/2017 Do vậy, giá trị xuất khẩu trong 3 tháng đầu năm nay giảm

Quy 1/2017, trong tổng xuất khẩu tôm của Việt Nam, tôm chân trangsống/tươi/đông lạnh là sản phẩm xuất khẩu chiếm giá trị cao nhất với 208.4 triệu

USD.

Trong giai đoạn này, giá trị xuất khâu các sản phẩm tôm chân trăng của ViệtNam tăng 10.6% so với quý I/2016 đạt 391.7 triệu USD trong khi xuất khẩu các sảnphẩm tôm st giảm 21% đạt 168.7 triệu USD Xuất khẩu tôm biến tăng 12.3% dat

57.9 triệu USD.

Trong quý 1/2017, Việt Nam xuất khẩu tôm sang 68 thị trường, tăng so với64 thị trường của cùng kỳ năm 2016 Top 10 thị trường chính bao gồm Nhật Bản,

EU, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Canada, Australia, ASEAN, Đài Loan và ThụySỹ, chiếm 95.4% tổng xuất khẩu tôm Việt Nam.

Từ quá trình tìm hiểu về tình hình sản xuất và xuất khẩu như trên thấy đượcrang có một lượng lớn phé liệu tôm được thải ra và cần có biện pháp xử lý một cáchkhoa học, tạo nền móng cho công nghiệp sản xuất N-acetyl-glucosamine và các

ngành công nghiệp khác.

1.1.2 Vỏ tôm thẻ chân trắng

a GIỚI thiệu

Tôm thẻ chân trang [2] hay còn gọi là tôm bạc Thái Bình Duong, có tên khoa

học là Litopenaeus vannamei hay Penaeus vannamei [3], thuộc ngành Arthropoda

(Chân khớp), lớp Crustacea (Giáp xác), bộ Decapoda (Mười chan), họ Penaeidae

(Tôm he), giống Litopenaeus, loài Litopenaeus vannamei Tên tiếng Anh là White

leg shrimp.

Hình 1 1 Tôm thé chân trắngb Đặc điểm hình thái và phân bố

Đặc điểm hình tháiTôm chân trắng vỏ mỏng có màu trăng đục nên có tên là tôm bạc, bìnhthường có màu xanh lam, chân bò có màu trang ngà nên gọi tôm chân trang

Chùy là phần kéo dài tiếp với bụng Dưới chùy có 2 - 4 răng cưa, đôi khi cótới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng Những răng cưa đó kéo dài, đôi khi tới đốt thứ hai

Phân boTôm Litopenaeus vannamei [3] là tôm nhiệt đới, phân bố vùng ven bờ phíaĐông Thái Bình Dương, từ biển Peru đến Nam Mexico, vùng biển Ecuado Hiệntôm chân trăng đã được di giống ở nhiều nước Đông Á và Đông Nam Á như TrungQuốc, Thái Lan, Philippines, Indonesia, Malaysia và Việt Nam

c Thành phan của vỏ tôm thẻCau tạo vỏ tôm

Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính là: lớp biểu bì, lớp màu, lớp calci hóa và lớp

không bị calci hóa [4]

Lớp biểu bì: có chứa lipid vì thế nó cản trở tác động của acid ở nhiệt độthường trong công đoạn khử khoáng bằng acid hơn là các lớp bên trong Màu củalớp này thường vàng rất nhạt, có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởipuinone-tanin Lớp biểu bì liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòatan, ngay cả trong môi trường acid đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratinmạch thăng

Lớp màu: tính chất của lớp này do sự có mặt của những thé hình hạt của vậtchất mang màu giống dạng melanin Chúng gdm những túi khí hoặc không bào.Một vài vùng xuất hiện những rãnh thăng đứng có phân nhánh, là con đường chocalci thâm thấu vào

Lớp calci hóa: lớp này chiếm phan lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp,

chitin ở trang thái tạo phức với calci.

Lớp không bị calci hóa: vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một

phan tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin-protein bên

vững không có calci.

Thành phan hóa học của vó tôm [5]Protein: trong phế liệu tôm protein thường tôn tại ở 2 dạng tự do và phứchợp Dạng tự do ton tại 6 phan thịt tôm lẫn vào phế liệu và nội tạng của tôm Dạngphức hợp là dạng protein liên kết với chitin, calci carbonate, liên kết với lipid tạothành lipoprotein, liên kết với sắc tố tạo thành proteincarotenoit như một phanthống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết với những liên kết đồng hóa trị với cácprotein dưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và cáchợp chất hữu cơ khác gây khó khăn trong việc tách chiết chúng

Khoáng: chủ yếu là muối calci carbonate, hàm lượng calci phosphate khôngnhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO, không tan

trong HCI gây khó khăn cho quá trình khử khoáng.

Sắc tố: trong vỏ tôm chủ yếu là astaxanthin Astaxanthin liên kết với cácphân tử protein tạo thành phức carotenoprotein hap thụ ánh sáng Amax = 628nm, tạonên mảu xanh đặc trưng Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết này bị phá hủy và giảiphóng astaxanthin trở lại dạng tự do hap thu mạnh bức xạ trong vùng ^ = 470-

Bang 1 1 Thành phan hoá học của vỏ tôm thé chân trắng [4]

Thành phần hoá học Hàm lượng (%)Chitin 294+14

Trong tự nhiên chitin được tôn tại trong nhiều nguồn nguyên liệu khác nhaubao gồm vỏ các loài giáp xác, côn trùng và vi sinh vật Trong các loài giáp xác nhưtôm, cua, ghe, loài chân đầu như mực, vỏ tôm hùm có hàm lượng chitin caochiếm 60-75% Từ côn trùng thi có ở vỏ các loai như muỗi, gián, ong mật, nhộng

tăm, Chitin cũng tôn tại phô biên trong giới vi sinh vật như: vi nam, nâm mộc,

nắm men, một số loài tảo và một số loài xạ khuẩn Streptomyces Nhưng nguồn khaithác chính là từ phế liệu thủy sản, vỏ của các loài giáp xác đặc biệt là từ tôm và cua.

Công thức phân tử là (CgH¡zOsN)ạ Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loại

nguyên liệu (nam the = 400+500, nam ham = 7002800, neu = 500600).

Chitin la poly (B-1,4- N-acetyl-D-glucosamine), một polisaccharide mach

thăng không phân nhánh, được cấu tạo bởi các monosaccharide glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết B-1,4-glucoside, tạo nên một mạng lướicác sợi có tổ chức, có cầu trúc tương tự như cellulose, ở cellulose thì carbon C-2chứa nhóm hydroxyl (-OH), còn đối với chitin thì chứa nhóm acetyl (-COCHH:)

N-acetyl-B-D-(Hình 1.2) [5,7]

HOH2C NHCOCH;

HO` O “

Chitin được chia thành 3 dạng cau trúc: a-chitin, B-chitin, y-chitin xuat phattừ nguồn gốc tách chiết chitin Ba dang chitin này khác nhau về tinh hydrate hoá,kích thước của mỗi đơn vị cau trúc và cách sắp xếp các mach trong mỗi đơn vị cau

trúc.

- -chitin: là phố biến nhất, được tim thấy trong thành tế bào nam men, nammốc, VI nắm, nhuyễn thé, gân, trong vỏ tôm, tôm hum, cua, và lớp biểu bì của côntrùng, có độ rắn phân tử cao nhất và ở dạng rắn chắc và các mạch chitin sắp xếpsong song ngược chiều nhau

- §-chitin: hiếm gặp hon, thường có trong xương mực, bao gồm các machchitin song song cùng chiều nhau, có độ ran chắc thấp, tinh hydrate hóa cao

- y-chitin: là biến thé của a-chitin, sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều

thì có một mạch ngược chiêu.

œ-chitin B-chitin y-chitinHình 1 3 Sự sắp xếp cua chuoi polime cua ơ-chitin, j-chitin, y-chitin

1.2.2 Tính chất của chitinChitin có màu trắng, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp phụ tốt, dễ tạo

mang Chitin là polime ky nước (hydrophobic polime) đặc biệt là a-chitin, không

tan trong nước, môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete,

rượu

Chitin tan trong dung dich acid đậm đặc như HCl, H;PO¿,

dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride, trong dung dich đặc nóng của muối

tioxianat Liti (LISCN) và thioxianat calci Ca(SCN)» tạo thành dung dịch keo.

Chitin tương đối 6n định với các chất oxy hóa khử, như thuốc tím (KMnO,),

HO», nước Javen (NaC1O) hay Ca(C1O)s,

Khi đun nóng trong dung dich HCI đậm đặc thi chitin sẽ bị thuỷ phân thành

các phan tử glucosamine có hoạt tính sinh học cao.

Chitin có độ deacetyl thấp Chitin tự nhiên có độ deacetyl dao động trong

khoảng từ 8-12% Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thi chitin bị khử

mat gốc acetyl tạo thành chitosan.13 TONG QUAN VE GLUCOSAMINE

1.3.1 Tinh hinh san xuat glucosaminea Thé gidi

Từ những năm 1990, người ta đã chế tao được glucosamine từ vỏ tôm, cua,sò Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng sản xuấtglucosamine, chủ yếu là glucosamine sulfate, glucosamine hydrochloride Tuynhiên, N-acetyl-D-glucosamine không phố biến rộng rãi trên thị trường và có giáthành rất dat

b Việt Nam

Tình hình sản xuất ølucosamine ở Việt Nam còn khá hạn chế, một số ít cáccông ty sản xuất glucosamine (chủ yếu là glucosamine sulfate, glucosaminehydrochloride) xuất khẩu qua Mỹ, Nhật như AFCP, VN Organic,

Năm 2004, các cán bộ giảng dạy thuộc Đại học Khoa Học Huế đã điều chếølucosamine từ vỏ tôm đạt tiêu chuẩn Dược dụng được Viện Kiểm nghiệm thuốcTrung ương công nhận đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ số 28 Thủ tướng Chính phủđã ra Quyết định số 61/2007 ngày 7/5/2007 phê duyệt Chương trình Nghiên cứukhoa học trọng điểm quốc gia phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020, trongđó ghi: “Nghiên cứu chiết tách glucosamine sulfate từ vỏ tôm làm nguyên liệu sảnxuất thuốc chữa bệnh viêm khớp”

1.3.2 Cau trúc

Glucosamine có tên gọi khác là deoxy-D-glucose;

2-amino-2-deoxy-B-D-glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)-glucosamine.

Cong thức phan tử: CzH;zOzN.

Glucosamine là một amino-monosaccharide, có trọng lượng phan tu 179.17,

đó là một thành phan của gan như tat cả các mô của con người, bao gồm cảcartilage Là thành phan chủ yếu của liên kết O và liên kết N glycosaminoglycans(GAGs), tạo thành mạng lưới của tất cả các mô liên kết Glucosamine được sản xuấttrong cơ thé băng việc b6 sung các nhóm amin vào glucose; phân tử này sau đó

được acetyl hóa tạo acetyl ølucosamine Hyaluronan, keratin sulfate và heparan

sulfate được cấu tạo từ một phan của các đơn vi thuộc acetyl glucosamine lặp đi lặp

lại Trong keratan sulfate va heparin sulfate, sulfat được thêm vào ở các vi trí 4 hoặc

Khi thủy phan chitin trong môi trường acid HCI đậm đặc, dưới tác dụng cua

nhiệt độ cao các mối nối amid và oside đều bị phá hủy do đó thu được glucosamine.Yếu tố nông độ acid và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của acidkhông thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deoside chỉ dừng lại giới hạn nhấtđịnh, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamine có thé bị

giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn.

Một số phản ứng của glucosamine:

- Phan ứng trang bạc.

- Phan ứng với Cu(OH),: san phẩm có màu xanh.- Phan ứng với C¿HzCH=O: Phản ứng nhận biết sự có mặt của NH> Sản phẩm

dạng keo sánh màu nâu.

Hau hết glucosamine được thu nhận từ vỏ giáp xác hoặc cua bang cách khửchitin Glucosamine thương mại thường kết hợp với thảo dược, vitamin, creatine,chondroitin sulfate, acid ascorbic, mangan, hoặc dimethylsulfone, phố biến nhấtkết hợp với chondroitin sulfate

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamine được sử dụng làm nguyênliệu làm thuốc như:

Glucosamine hydrochloride

Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride;

chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine

hydrochloride.

Cong thức phan tử: CsH);305N.HCI

Công thức cau tạo: HO

Phân tử lượng: Motucosamine Hc! = 215.63.

Glucosamine hydrochloride là chat rắn dạng tinh thé màu trang, không mii.Điểm nóng chảy 190-194°C hoặc 300°C

Tan được trong nước 0.1 g/ml.

Glucosamine hydrochloride được sản xuất băng phương pháp thủy phânchitin/chitosan bang HCl đậm đặc dưới tac dung của nhiệt độ cao.

Glucosamine sulfate

Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine

sulfate.

Cong thức phan tử: C¿H;zOszN.H›SOx

Công thức cấu tạo:

OH

Phan tử lượng: Motucosamine H2804 = 277.24.

Tan được trong nước: 0.1 g/ml.

Glucosamine sulfate thường được sản xuất bang phương pháp sử dung HCIđậm đặc dưới tác dụng của nhiệt độ cao để thủy phân chitin/chitosan, sau đó đồngkết tinh với muối sulfate Vì khi sử dụng H»SO, đậm dé thủy phân chitin/chitosanthì sản phẩm glucosamine rat dé bị oxi hóa [8.9]

N-acetyl-glucosamine (GlcNAc)

Tén goi khoa hoc: 2-acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose;

N-acetyl-D-(+)-glucosamine; N-acetyl-B-D-glucosamineide; N-acetyl-chitosamine.

Cong thức phan tử: CsH;zO¿N

Công thức cau tạo: ‘CH,

Phân tử lượng: Macetyigtucosamine = 221.21.

Điểm nóng chảy: 201-210°C

Tan được trong nước: 0.1 g/ml.

GlcNAc được sản xuất băng phương pháp sử dung enzyme đặc hiệu

(chitinase, chitobiase, ) [10,11] va enzyme không đặc hiệu (cellulase, œ-amylase,

B-amylase, gluco-amylase, ) [12,13,14] thủy phân chitin/chitosan.

1.3.3 Ung dụng của glucosamineGlucosamine là thành phan co bản của sụn, tham gia quá trình chuyển hóatong hợp nên thành phan của sụn khớp, giúp làm tăng sản xuất chất nhây dịch khớp,nên tăng độ nhớt, tăng khả năng bôi trơn của dịch khớp Vì thé glucosamine không

những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn

chặn quá trình thoái hóa khớp, năng chặn bệnh tiễn triển, phục hồi cau trúc sụnkhớp [15,16] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng glucosamine có thé giúp phục hôi vàduy trì sự toàn vẹn của sụn đồng thời kích thích sự phát triển tế bào sụn

a Cầu tạo khớp xương ngườiCơ thé người có trên 200 xương các loại Nơi nối giữa các đầu xương gọi là

khớp [17.18]

Cơ a

Khoanghoat

dich

Tuihoat

- Sun khớp là lớp mô bao lấy đầu xương dé ngăn các xương tiếp xúc trực tiếp

với nhau, giúp khớp vận động dễ dàng.- Bao khớp và dịch khớp.

- Co bắp co dudi để làm khớp chuyển động

- Gan nồi xương với cơ đê chuyên sức co của cơ vào xương.

Khi khớp bị thoái hóa, mạng lưới collagen bị ton thuong khiến cấu trúc sunkhớp mat tính bền vững, dễ bién dang Bao khớp (màng hoạt dịch) là lớp mang baobọc quanh khớp Lớp lót trong của bao khớp tiết ra dịch khớp để bôi tron, giúpkhớp hoạt động dễ dàng và cung cấp chất b6 dưỡng cho sun.

Sun là một mô liên kết tham gia vào cau tạo bộ xương, cấu tạo bởi 3 thànhphan là tế bào sụn, chất căn bản sụn và sợi liên kết Chất căn ban sun và sợi liên kếtđược gọi chung là chất nên sụn, chất này chứa các loại sợi liên kết khác nhau tùytheo loại sụn Tế bào sụn chiếm không quá 10% trọng lượng Sụn tươi chứa khoảng70-80% nước, 10-15% chất hữu cơ và 4-7% chất khoáng Sun khô có sợi collagenchiếm khoảng 50-70% Sụn tăng trưởng băng cách sinh sản đắp thêm hoặc sinh sản

gian bào.

Sun ít thay đối cau trúc theo lứa tuổi Khi già, hàm lượng proteoglycan giảm

nên tính ưa nước giảm Các bào quan và hoạt tính men giảm, nhưng hàm lượng

glycogen tăng Trong 6 sụn, các tế bào sụn đã chết có hiện tượng xâm nhập chất cănbản và sợi tạo keo Khi già, sụn có hiện tượng ngắm calci vai nơi, nên sun trở nênđục, cứng nhưng giòn hơn Do rối loạn dinh dưỡng ở vùng giữa miếng sụn, có théxuất hiện mạch máu và cốt hóa từng vùng

Có 3 loại sụn: sụn trong, sụn chum và sụn xơ, tên gọi khác nhau là do thành

phân sợi liên kết

Sụn khớp là sụn trong không có màng sụn Đặc điểm của lớp sụn khớp là lớpmô trong suốt vừa cứng vừa dai và đàn hỏi tốt, cau tạo từ hai thành phan chính là tếbào sụn và chất căn bản:

- Tế bào sụn: không có khả năng sinh sản và không có khả năng tái tạo sautudi trưởng thành và do đó không có tế bào mới thay thé tế bào chết

- Chat căn bản: có nhiều thành phan khác nhau như: nước, proteoglycan và sợicollagen (quan trọng nhất là collagen type II) Proteoglycans: phân tử này có cácglycosamineglycans (GAGs — chuỗi dài có nhiều đơn vi disaccharide lặp lại) bámvào protein lõi và chủ yếu là chondroitin sulfate và keratan sulfate Các théproteoglycans kết nối với acid hyaluronic, các GAGs và protein liên kết với cau trúc

này đảm bảo tính ôn định và bên vững của sụn.

Sun khớp đóng vai trò như lớp đệm bảo vệ, giúp giảm chan động và tránh sựcọ xát giữa hai đầu xương khi khớp cử động Tuy vậy, sụn lại không chứa mạchmáu hay dây thần kinh nên không được máu nuôi trực tiếp, chỉ tiếp nhận dinhdưỡng thâm thấu nhờ tô chức xương dưới sụn, màng hoạt dịch, dịch khớp Chính vivậy mà sụn rất dễ bị thoái hóa dân theo thời gian Ở người trưởng thành các tế bàosụn không có khả năng sinh sản và tái tạo, mặt khác khi tuổi càng cao, cùng với sựlão hóa của cơ thé, các tế bào sụn cũng dan dan giảm chức năng tong hợp các chat

căn bản.

b Tác dụng cua glucosamine với bệnh xương khớp

Glucosamine là thành phan chính của proteoglycans — là một trong ba thànhphan (proteoglycans, collagen, tế bào sun) cùng với nước cau tạo nên sụn khớp.Proteoglycans như sợi dây thừng xâu chuỗi với collagen, có vai trò giữ nước dé làm

trơn và nuôi dưỡng collagen (Hình 1.5).

= Proteoglycans

e coo? cHz0m Disaccharide units

10a i |UNM =——¬ So FA Vo Uronicacid ~ Amino sugar

-OH H NY ms H Sp CH OM

le H Ơn HARE Oy Ca a 4) °~ Dermatan

Hyaluronate 6 N¥ewte h: sulfate

* t 1 ee H HX~C—CHạ

h

„=> =) Core pretein IduUA GaiNAc ®

ot ” cod? H;C—0-SOPne ~G ycosam no- M}—~qw HÌ—qw

|~c.u 5 i

Ribosome & GalNAc =N-Acetyl- Ko HÀ € 4) on

for galactosamine N 1H HH sc

comparison GIcNAc * N-Acetyl- HA LỆ »2y7Z y9 2v.

glucosamine GICUA GaiNAc®

Hình 1 5 Cau trúc proteoglycansKhi sụn bi phá hủy, proteoglycan mat kha năng gan chặt với collagen, khônggiữ được nước, còn collagen bị mat chất nuôi dưỡng Kết cục là sụn bị thoái hóa,mat khả năng đệm với những va chạm, những cú nhảy, vặn xoăn Glucosamine bốsung sẽ cung cấp nguyên liệu làm tăng khả năng tổng hợp proteoglycans và do vậycó tác dụng phục hồi sụn khớp, bình thường hóa quá trình chuyển hóa sụn

Lợi thế của ølucosamine là có cầu trúc hóa học xác định, khối lượng phân tửnhỏ, độ tinh khiết cao va glucosamine cũng là một thành phan tự nhiên có trong cơthé con người, trong cơ thé có cơ chế xử lý, kết hợp hoặc phá hủy hợp chat này nên

Ít gây ra tác dụng phụ.

Trong các nghiên cứu trên chuột, bằng kỹ thuật tự chụp bằng phóng xạchứng minh sự xuất hiện của C đánh dau glucosamine trong sụn sau khi uống 4 giờ.Glucosamine có một ái lực đặc biệt với sụn và được kết hợp với tế bào sụn tạothành proteoglycans, được tiết vào mạng lưới ngoại bao Hơn nữa có thé sử dụngkết hợp với hợp chất chứa sulfate (chonroitine sulfate) đóng một vai tro quan trọngtrong việc tong hop proteoglycans

Tac động cua glucosamine khi được uống vào cơ thể: [17]- Glucosamine tham gia quá trình chuyển hóa tổng hợp nên thành phan củasụn khớp: là nguyên liệu dé tong hợp proteoglycans, khi vào trong cơ thé nó kíchthích tế bào ở sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycans Kếtquả của quá trình trùng hợp là thành phân cơ bản cấu tạo nên đầu sụn khớp và tăngsản xuất mucopolysaccharide Glucosamine ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen sụncủa con người, sự gia tăng gấp đôi về mức độ 6n định của mRNA perlecan vàaggrecan Trong tế bào sun của bào thai của con người, glucosamine làm tăng tong

hop collagen type II.

- Glucosamine làm tăng sản xuất chat nhây dịch khớp do đó tăng độ nhớt, tăngkhả năng bôi trơn của dịch khớp Glucosamine được sử dụng dé sản xuất acidhyaluronic (là một mucopolysaccharide), xuất hiện một cách tự nhiên trong khắp CƠthể người, nhưng đặc biệt cần thiết cho chất nhờn bôi trơn cho sụn và khớp, chứcnăng của nó trong cơ thể là liên kết nước và bôi trơn các bộ phận chuyển động đượccủa cơ thể, như khớp và cơ

- Tác dụng chong viêm: ức chế phospholipase A2 va cyclooxygenases —enzyme chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2 — chất trunggian hóa học của hiện tượng viêm và nhận cảm đau) Màng tế bào chứa nhiềuphospholipid, khi màng bị ton thương dưới tác dụng của phospholipase A2 của

màng sẽ giải phóng ra các acid béo tự do không bão hoà, chứa 20 nguyên tử C là

acid arachidonic Acid arachidonic khi được giải phóng ra sẽ trở thành cơ chat choenzyme cyclooxygenases tạo ra các chất chuyền hoá trung gian nham tao PGH2 gâyviêm và dau Glucosamine kích thích sinh tổng hợp proteoglycans, cácproteoglycans được tong hợp mới có thé 6n định màng tế bào và ức chế các enzymephospholinase A2 dẫn đến tác dụng chống viêm Ngoài ra, còn làm giảm sự tạothành các gốc tự do superoxide phá hủy các tế bào sinh sụn bằng các đại thực bàovà ức chế enzyme lysosome (enzyme tiêu thé được tạo ra từ tế bào bị viêm).

1.4 CÁC PHƯƠNG PHAP SAN XUẤT GLUCOSAMINE1.4.1 Quy trinh san xuat

Do tinh chất khó hòa tan của chitin, thay vì hòa tan chitin từ nguyên liệu vàodung dịch và thu hồi nó thì nguyên tắc chung là phải sử dụng các biện pháp côngnghệ để khử bỏ các tạp chat phi chitin và thủy phân chitin thu glucosamine

Trong vỏ tôm, các hợp chất phi chitin bao gồm protein, chất khoáng, chatmàu, lipid và các hợp chất khác với hàm lượng biến đổi tùy theo loại nguyên liệu.Có nhiều phương pháp sản xuất khác nhau và quá trình sản xuất chitin -glucosamine tổng quát được thé hiện theo sơ đồ Hình 1.6

a Quá trình xu ly protein

Bước đầu tiên của quy trình tách chiết chitin là xử lý protein có trong nguyênliệu Trong vỏ tôm protein liên kết với chitin thành từng lớp xen kẽ, ngoài ra cònliên kết với các thành phần khác như CaCOs, astaxanthin, lipid rat chặt chẽ tao nêntính bền vững của vỏ Việc khử protein cũng sẽ góp phân loại bỏ một phần khoáng,lipid và chất màu, tăng tính thắm tạo điều kiện thuận cho các bước xử lý tiếp theovà giảm sai số trong việc xác định hàm lượng protein hòa tan trong bán thành phẩmbăng phương pháp so mảu

Các hóa chất có thể được sử dụng để xử lý protein từ nguyên liệu như:NaOH, Na;COx, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH);, Trong môi trường kiềm,

protein bị thủy phan tạo ra acid amin và peptide hòa tan.

Ngoài ra có thé sử dụng chế phẩm enzyme protease, enzyme thô từ vi sinh

vật sinh (Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Lactobacillus plantarum), bromelin

trong dịch ép vỏ dứa, papain trong quả đu du,

Hiện nay NaOH được sử dụng pho bién nhat

_ NaOH

HN CH CÓ CO- NH- Ha co- SN H- COOH + H.N-(H-C0-NH -

CH-cad’ : |R, Ra Rị Rạ Ra

Polypeptid Acid amin Peptid

Bang 1 2 Các điều kiện xứ lý protein trong quá trình sản xuất chitin

Có thé xử lý khoáng bằng các hóa chất sau: acid vô cơ (HCI, HNO3, H»SOu,

) hay acid hữu co (acid lactic, acid acetic, ) Hiện nay thường sử dụng dung

dịch HCl loãng ở nhiệt độ phòng dé xử lý khoáng Phan ứng hóa học của quá trình

xử lý khoáng như sau:

2 H* + CaCO; — Ca“! + CO, † + HạOHàm lượng khoáng giảm đến 90% ở thời gian đầu của quá trình xử lýkhoáng (trong vòng 30 phút), sau đó quá trình diễn ra rất chậm

Sản phẩm chitin đạt chất lượng cao khi hàm lượng khoáng còn lại dưới 1%.Bang 1 3 Các điều kiện xử lý khoáng trong san xuất chitin từ vó tôm [5] [19]

Nguyên liệu

Chế độ xử lý khoángNồng độ HCI | Nhiệt độ (°C) | Thời gian (h) | Tý lệ (w/v)

5% Nhiệt độ phòng 2 1:15-20

5% Nhiệt độ phòng 1 1:20Tôm thé

1.25N Nhiệt độ phòng 1 _

IN Nhiệt độ phòng 2 1:15

C Tay mauTrong phế liệu tôm có chứa một lượng lớn các chất màu, chủ yếu thuộc

nhóm carotenoid: astacene, astaxanthin, canthaxanthin, lutein và B-carotene.

Trong quá trình sản xuất chitin, dé chitin có màu trang dep thi cần có côngđoạn tay màu Việc tay màu này có thé thực hiện bằng cách phơi dưới ánh sáng mặttrời hoặc xử lý bang các chất tây màu thông dụng như KMnO¿, H;O›;, NaOCl,NaHSO3 Thông thường H;Os và NaOCI được sử dụng nhiều nhất

Bang 1 4 Các điều kiện tay màu trong quá trình sản xuất chitin từ

dém

Tôm thẻ NaOCl Lanh 30 1:10

Acetone +

Nhiệt độ phòng 15 1:20NaOCl

d Thuy phan

Tiến hành thủy phân chitin thu glucosamine bang HCl, H;SOx đậm đặc hay

enzyme (chitinase, cellulase, amylase và glucoamylase, ).

Tuy theo phương pháp thủy phân thu được các loại glucosamine khác nhau:

glucosamine hydrochloride (dùng HCI đậm đặc), glucosamine sulfate (dùng H;SOx

đậm đặc hoặc HCI đậm đặc sau đó đồng kết tỉnh với muối sulfate),

a Phương pháp hóa học: (sản xuất glucosamine sulfate, glucosamine

hydro-chloride)

Phé liệu tôm được rửa sạch, loại bỏ tap chất trước khi xử lý khoáng Sau đóthực hiện quá trình xử lý khoáng bang dung dich acid (HCl, H;SO¿ ), xử lýprotein băng nhiệt hay ngâm trong dung dịch kiểm (NaOH hoặc NazCOz, ), sau đóđược tay màu băng NaOCl hoặc H;Os, và cuối cùng là thủy phân bang phương phápđun sôi chitin với HCI hoặc H;SOx đậm đặc Các bước tiễn hành điều được thựchiện trong điều kiện xử lý thích hợp cho từng loại nguyên liệu đưa vào

Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô lớn.Nhược điểm: Dư lượng hóa chất lớn, ô nhiễm môi trường, ăn mòn thiết bị,điều kiện sản xuất nguy hiểm

Một số nghiên cứu về glucosamine sản xuất bằng phương pháp hóa học:- _ Nghiên cứu về glucosamine hydrochloride của Dé Dinh Rang (Hình 1.8).- _ Nghiên cứu về glucosamine hydrochloride của Trần Thị Luyén (Hình 1.9).- Nghiên cứu của Martha Benavente về sản xuất glucosamine hydrochloridebang công nghệ hỏi lưu acid HCl (reflux technology) [20]

- _ Nghiên cứu của Nguyen Tan Man về sản xuất glucosamine sulfate bang cáchđồng kết tinh glucosamine hydrochloride [21]

- Nghiên cứu của Young Ho Lee về tác dụng của glucosamine sulfate và

chondroitin sulfate với bệnh viêm khớp [22]

Rửa sạch, say khô, nghiền

)

Dun sôi với nước, 2 giờ, gan bỏ protein, say khô

Dun trong HCI 5% khử khoáng, rửa trung tinh, say khô

Thủy phân bang HCI 36%, t° = 95-100°C

V

Tay mau bang than hoat tinh

Kết tinh, lọc, say khô

Glucosaminehydrochloride

Hình 1 8 Quy trình sản xuất glucosamine hydrochloride của Đỗ Dinh Rang

Khử khoáng bang HCI 10%, w/v = 1/10, t° phòng, 5 giờ

Rửa trung tinh, say khô

Hình 1 9 Quy trình sản xuất glucosamine hydrochloride của Trần Thị Luyén

b Phương pháp sinh học

Vỏ tôm được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, nghiền nhỏ Sau đó thực hiện quátrình xử lý khoáng và protein, tây màu thu nhận chitin, chuẩn bị chitin huyền phù vàsau cùng là thủy phân chitin băng cách lên men vi sinh vật tạo hỗn hợp chitinase vàchitobiase hoặc sử dụng các chế phẩm enzyme (chitinase, cellulase, amylase,glucoamylase, ) Các bước tiễn hành điều được thực hiện trong điều kiện xử lý

thích hợp cho từng loại nguyên liệu đưa vào.

Ưu điểm: Thân thiện với môi trường, giảm áp lực cho quá trình tinh sạch.Nhược điểm: Đắc tiền, tốn thời gian

Một số nghiên cứu về N-acetyl-glucosamine:- Nghiên cứu của Charles A Haynes về kết hop chủng vi sinh vat Serratia

marcescens, Lividans streptomyces và Liquefaciens enterobacter lên men thu nhận

Rửa sạch, nghiền nhỏ

Dun sôi với nước và H;SOx I% hay DMA 1%

Vv

Loc ly tâm, rửa trung tính (2 lần)

Tay màu bằng KMnO, 2%, rửa lại bang acid oxalic 1%

V

Rửa bang acetone, thêm vào HCI 7-9%, làm lạnh 4°C tạo dang paste

Lọc bỏ hat, kết tủa dịch lọc bang ethanol 50%

Ỷ

Ly tâm, rửa bằng đệm phosphate, sau đó duy trì trong đệm pH 5-6

V

Lén men Serratia marcescens, Lividans streptomyces va

Liquefaciens enterobacter, ở 30°C sinh tông hợp hon hợp chitinase

va chitobiase thuy phan thu nhan N-acetyl-D-glucosamine

N-acetyl-glucosamine

Hình 1 10 Quy trình sản xuất N-acetyl-glucosamine của Charles A Haynes

(US)

1.5 TONG QUAN VE ENZYMEBan chất hoá hoc của enzyme là protein Enzyme tan trong nước, khi tan taothành dung dich keo, ching cũng tan trong dung dich nước muối loãng, trong các

dung môi hữu co phan cực, nhưng không hoà tan trong các dung môi hữu cơ không

phân cực Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước Khi hoà tanenzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc

các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate.

Enzyme không bên và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao,mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính protein.Enzyme còn bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của tác nhân gây biến tính protein khácnhư acid, kiềm hoặc muối kim loại nặng

1.5.1 Cellulase

Cellulase là enzyme da cau tử gdm: exoglucanase hay 1,4-B-D-glucan

cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay 1,4-B-D-glucan 4

glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) và B-glucosidase hay B-D-glucoside glucohydrolase

(EC 3.2.1.21) hoạt động phối hop để thủy phân liên kết B-1,4-glucoside củacellulose hay một số polysaccharide khác [26]

Có thể thu nhận cellulase từ vi khuẩn như Bacillus, Clostridium,Cellulomonas, hay từ các loài nắm sợi như Trichoderma reesei, Trichoderma

koningii, Alternaria, Pinicillium pinophilentum, Talaromyces emersonii, trong đó

Trichoderma được chú ý nhiều nhất vì khả năng sinh cellulase số lượng lớn và hoạt

tính cao.

a Nấm sợi Trichoderma reeseiElwyn T.Reese là người dau tiên khám phá ra Trichoderma reesei sau hon20 năm nhằm lẫn với Trichoderma viride Cuỗi thập niên 60, việc nguyên cứu sinhtong hop, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chat polysaccharide khác của chủngTrichoderma reesei và thê đột biễn của chúng trở nên mạnh mẽ hơn

Trichoderma reesei thuộc giới Fungi, lớp Ascomycetes, bộ Hypocreales, ho

Hypocreaceae, loài Trichoderma reesei.

Trichoderma là những soi nam (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bêntrong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động Chiều dài của chúng có thể sinhtrưởng vô hạn, đường kính chỉ thay đổi trong khoảng 1-30m (thường là 5-10m).

Hình 1 11 Nam sợi Trichoderma reesei

Trichoderma reesei i sinh sản vô tính bang đính bao tử khuẩn ty, chúng có tốc

độ sinh trưởng va phát triển nhanh chống, có thé đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9em

sau 4 ngày nuôi cay ở 20°C Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 25-30°C, chậm ở 37C, tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mépbất thường Trong khi ở 37°C bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy.Trichoderma reesei là vi nam ưa âm

35-b Cầu tạo của enzyme cellulaseCellulase có ban chất là protein được cầu tạo từ các đơn vị là acid amin nhưasparagine, lysine, alanine, threonine, các acid amin được nối với nhau bởi liênkết peptide -CO-NH- và các thành phân phần phụ khác

l " `

Lys2% oR `

Asn12s

Thr122

Asp126

Asp469 Als465

Hình 1 12 Cau tạo trung tâm hoạt động của enzyme cellulase

Trong hệ cellulase của nầm sợi, câu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme

nhóm endoglucanase và exoglucanase giông nhau, gồm một trung tâm xúc tác và

một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gan thêm

vùng glycosidic hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose, vùng này có vai trò tạoliên kết với cellulose tinh thé [27]

c Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

endo-1,4-B-D-Glucanase

I "| cHon OH

Cellobiosidase Il CH:0H loi =

& OHCH2OH OH

OHOH

Hình 1 13 Co chế hoạt động của cellulaseCellulase là enzyme đa cau tử gồm:

1,4-B-D-ølucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

lên gọi khác: exoglucanase; cellobiosidase; exo-B-l,‡-glucanase

cellobiohydrolase; exocellobiohydrolase; exo-B-1glucan cellobiohydrolase; 1

,4-B-D-glucan cellobiosidase; CBH 1; Cl cellulase; Avicelase.

Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-B-D-glucoside từ dau không khử củachuỗi cellulose, polysaccharide dé tạo thành celllobiose

1,4-B-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Tên gọi khác: endoglucanase; endo-1 ,4-B-D-glucanase; endo-1 4 glucanase;

B-1.4-endoglucan hydrolase; carboxymethyl cellulase; celludextrinase; cellulase A;

cellulosin AP; Alkali cellulase; cellulase A3; 9,5 cellulase; Pancellase SS.

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-B-D-glucoside giữa mạch của

chuỗi cellulose, lichenin và các B-D-glucan

B-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

lên gọi khác: glucosidase; ÿƒ-D-glucosidase; [-1,6-glucosidase;

ÿ-glucoside slucohydrolase; p-nitrophenyl -glucosidase; aryl-B-glucosidase;

gentiobiase; emulsion; elaterase; arbutinase; amygdalinase; primeverosidase;

amygdalase; limarase; salicilinase.