Nghiên cứu biểu hiện Đồng thời gene o methyltranferase và s adenosylmethionine synthetase trong vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

Nghiên cứu biểu hiện Đồng thời gene o methyltranferase và s adenosylmethionine synthetase trong vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

Quyền Mỹ Linh

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ĐỒNG THỜI GENE

O-METHYLTRANFERASE VÀ S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE

TRONG VI KHUẨN Escherichia coli CẢI BIẾN DI

TRUYỀN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINHHỌC

Quyền Mỹ Linh

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN ĐỒNG THỜI GENE

O-METHYLTRANFERASE VÀ S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE

TRONG VI KHUẨN Escherichia coli CẢI BIẾN DI

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Chử Lương Luân (Trường Đại học Phenikaa) và PGS.TS Nguyễn Quang Huy (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN), những người Thày đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu cũng như giúp đỡ em thực hiện Luận văn Thạc sĩ Thời gian học tập và nghiên cứu cùng Thày và thành viên trong nhóm là khoảng thời gian rất quý giá và nhiều ý nghĩa đối với em

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thày cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình hướng dẫn và giảng dạy cho em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Sáng, ThS Nguyễn Thị Thu Huyền, ThS Nguyễn Thị Uyên, ThS Vũ Hà Phương cùng các học viên, sinh viên, đồng nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học; phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình em thực hiện Luận văn

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn

Em xin chân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2023

Học viên

Quyền Mỹ Linh

1.1 Tổng quan về SAM và quá trình methyl hoá 2

1.1.1 Giới thiệu chung 2

1.1.2 Chức năng sinh học và ứng dụng của SAM 3

1.2 Tổng quan về enzyme S-Adenosylmethionine synthetase 5

1.2.1 Phân loại và giới thiệu về gen metK 5

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của MAT và con đường tổng hợp SAM 6

1.4.2 Vector biểu hiện pCDFDuet-1 và pRSFDuet-1 17

1.5 Các tác nhân có thể gây ảnh hưởng đến biểu hiện 19

1.5.1 Nhiệt độ 19

1.5.2 Nồng độ chất cảm ứng 20

1.5.3 Thời gian biểu hiện 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu và hoá chất 23

2.1.1 Vật liệu 23

2.1.2 Hoá chất 24

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp nhân bản gen metK bằng phản ứng PCR 25

2.2.3 Phương pháp đưa đoạn gen metK vào vector pRSFDuet-SaOMT2 và vector pCDFDuet-1 27

2.2.4 Phương pháp biến nạp các vector tái tổ hợp vào E coli BL21 (DE3) 29

2.2.5 Phương pháp sàng lọc, tách chiết và kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp 302.2.6 Biểu hiện protein tái tổ hợp 32

2.2.7 Tối ưu nhiệt độ biểu hiện 32

2.2.8 Tối ưu nồng độ chất cảm ứng 32

2.2.9 Tối ưu thời gian cảm ứng 33

2.2.10 Phương pháp điện di SDS-PAGE 33

2.2.11 Phân tích hình ảnh điện di SDS-PAGE 34

2.2.12 Phương pháp HPLC 34

2.2.13 Các bước thực hiện chính 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tạo vector tái tổ hợp pRSFDuet-SaOMT2-metK và pCDF-metK 36

3.1.1 Nghiên cứu nhân bản và tinh sạch gen metK 36

3.1.2 Nghiên cứu chuyển gen metK vào vector pCDFDuet-1 và SaOMT2 37

pRSF-3.1.3 Đánh giá kết quả PCR khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mang gen metK 39

3.1.4 Kết quả tách chiết và kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp 41

3.2 Biểu hiện protein tái tổ hợp 43

3.3 Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sự đồng biểu hiện của 2 gen metK và SaOMT2 46

3.3.1 Tối ưu nhiệt độ 46

3.3.2 Tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG 48

3.3.3 Tối ưu thời gian cảm ứng 50

3.4 Kết quả xác định khả năng chuyển hoá cơ chất của E coli L bằng HPLC 52KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Vai trò và chức năng của SAM 4

Hình 2 Cấu trúc của MAT 7

Hình 3 Phản ứng của L-methionine với ATP với xúc tác của MAT tạo ra SAM 8

Hình 4 Phản ứng của SAM với hợp chất phenolic với xúc tác của SaOMT2 để tạo ra O-methoxides và SAH 10

Hình 5 Cấu trúc của enzyme MT nhóm I 13

Hình 6 Hoạt động của OMT trong phản ứng với SAM và cơ chất 14

Hình 7 Cơ chế biểu hiện gen ở tế bào E coli BL21 16

Hình 8 Cấu trúc của vector biểu hiện pRSFDuet-1 và pCDFDuet-1 18

Hình 9 Các bước thực hiện chính 35

Hình 10 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của gen metK 36

Hình 11 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng BglII và XhoI và tinh sạch của gen metK, vector pCDFDuet-1 và pRSF-SaOMT2 trên gel agarose 0,5% 37

Hình 12 Kết quả biến nạp sản phẩm lai pCDF-metK và pRSF-SaOMT2-metK vào E coli BL21 (DE3) 39

Hình 13 Kết quả PCR khuẩn lạc của E coli BL21 (DE3) chứa sản phẩm gắn gen metK vào vector pCDFDuet-1 40

Hình 14 Kết quả PCR khuẩn lạc của E coli BL21 (DE3) chứa sản phẩm gắn gen metK vào vector pRSF-SaOMT2 40

Hình 15 Kết quả kiểm tra vector pCDF-metK bằng enzyme cắt giới hạn 42

Hình 16 Kết quả kiểm tra vector pRSF-SaOMT2-metK bằng enzyme cắt giới hạn 43

Hình 17 Kết quả biểu hiện enzyme MAT và SaOMT2 45

Hình 18 Kết quả tối ưu biểu hiện enyme MAT và SaOMT2 ở các mức nhiệt độ cảm ứng khác nhau 47

Hình 19 Kết quả tối ưu biểu hiện enzyme MAT và SaOMT2 ở các nồng độ IPTG khác nhau 48

Hình 20 Tối ưu biểu hiện MAT và SaOMT2 với thời gian cảm ứng khác nhau 51

Hình 21 Đồ thị biểu hiện sự phụ thuộc của diện tích đỉnh vào nồng độ của Resveratrol 53

Hình 22 Sắc ký đồ của resveratrol và phản ứng của resveratrol in vivo 53

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BRENDA bộ sưu tập các dữ liệu về chức năng

enzyme sẵn có cho cộng đồng khoa học

Được duy trì và phát triển tại Viện Hóa sinh và Tin sinh học Đại học Kỹ thuật

Braunschweig, Đức DMSO Dimethylsulfoxide

HPLC High Performance Liquid

LDS Lithium dodecel sulfate NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân MAT S-adenosylmethionine synthetase

OD600 Optical density at 600 nm Mật độ quang tại bước sóng

600nm OMT O-methyltransferase

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

SAH S-adenosyl-L-homocysteine SAM S-adenosylmethionine SDS Sodium docecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophorensis with

MỞ ĐẦU

Quá trình methyl hoá, chuyển nhóm methyl từ phân tử này sang phân tử khác, là một trong những phản ứng sinh hóa phổ biến và quan trọng nhất trong tế bào Quá trình này tham gia thực hiện các chức năng khác nhau của tế bào như kiểm soát phiên mã, chuyển hóa lipid và truyền tín hiệu Trong nghiên cứu phát triển các hợp chất có hoạt tính sinh học và dược phẩm, các nhóm methyl thường được sử dụng để cải thiện các đặc tính dược lý, dược động học

Các phương pháp methyl hóa thường được quan tâm xem xét ở góc độ hoá học, thông qua các phản ứng hữu cơ Tuy nhiên, gần đây, người ta cho rằng các xúc tác sinh học có thể trở thành một giải pháp thay thế hiệu quả do tiềm năng cũng như các ứng dụng của nó Quá trình xúc tác sinh học của enzyme methyltransferase (MT) giúp đưa các nhóm methyl vào các phân tử có cấu trúc phức tạp với tính chọn lọc hóa học cao Quá trình xúc tác này phụ thuộc nhiều vào S-adenosylmethionine (SAM), một chất cho methyl quan trọng trong quá trình methyl hoá Đã có rất nhiều các nghiên cứu tổng hợp và tăng cường sinh tổng hợp SAM từ methionine và ATP thông qua việc biểu hiện các enzyme xúc tác S-adenosylmethionine synthetase

(MAT) trên vi sinh vật như Saccharomyces cerevisiae hay Escherichia coli

Tuy vậy, đến nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có nghiên cứu kết hợp

đồng biểu hiện 2 enzyme MT và MAT ở E coli để tạo nên 1 chủng E coli cải biến

di truyền có khả năng methyl hoá Do vậy, việc đồng biểu hiện cả hai gen

methyltransferase và S-adenosylmethionine synthetase có tác động lên khả năng

methyl hoá của vi khuẩn hay không vẫn chưa được biết đến Hơn thế nữa, việc tạo ra chủng vi khuẩn có khả năng methyl hoá cơ chất với tính chọn lọc hoá học cao mang lại nhiều lợi ích, đặc biệt trong lĩnh vực sản xuất, nghiên cứu dược phẩm nhờ vào tính ổn định, độ chính xác và tinh sạch cao, khả năng sản xuất với khối lượng lớn, cũng như các đặc tính kinh tế khác

Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu biểu hiện đồng thời gen O-Methyltranferase và S-adenosylmethionine synthetase trong vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền” với mục tiêu hướng tới là biểu hiện được đồng thời hai gen metK và SaOMT2 trong chủng vi

khuẩn E coli BL21 (DE3)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về SAM và quá trình methyl hoá

1.1.1 Giới thiệu chung

S-adenosylmethionine (SAM), được sinh tổng hợp từ L-methionine và ATP trong tế bào SAM cũng là một chất cho nhóm chức methyl (-CH3) quan trọng, tham gia vào các phản ứng chuyển hóa methyl và các quá trình sinh tổng hợp cũng như các quá trình biến đổi tạo sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein, lipids, đường và nuleic acid cũng như các chất chuyển hoá thứ sinh khác [79] SAM là tiền chất của các nhóm aminopropyl trong quá trình sinh tổng hợp polyamine và glutathione bằng con đường chuyển hóa lưu huỳnh [77]

SAM được tổng hợp trong vi sinh vật bằng cách tăng sinh trong môi trường chứa L-methionine Các công bố cho thấy nồng độ SAM nội bào có thể đạt mức cao

trong Saccharomyces cerevisiae tới 6,1 g/L khi được lên men ở bình 15 L trong 36

giờ [5] Tuy nhiên để đạt được mức cao này, cần phải can thiệp bằng các phương pháp gây đột biến để cải thiện khả năng sản xuất SAM trong vi sinh vật mà ở đây là sử dụng phương pháp chiếu xạ tia cực tím kết hợp với quy trình sàng lọc kháng ethionine Do vậy, rất khó để sàng lọc chủng tạo ra SAM với năng suất cao để cải thiện và được di truyền qua các thế hệ Ở trong một nghiên cứu khác của Ren và cộng sự [54], thay vì tác động trực tiếp làm biến đổi chủng vi sinh vật để tạo ra SAM, tác giả đã bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào chất methionine và kết hợp với phương pháp lên men để thu sinh khối lớn để tạo ra SAM với khối lượng lên tới 13,74 g/L (trong 5 L) và 10,45 g/L (trong 300 L) Mặc dù vậy, điều này khiến cho chi phí để sản xuất ra SAM trở nên đắt đỏ hơn do cần phải cung cấp thêm nguyên liệu đầu vào cũng như phải kiểm soát nồng độ các chất được thêm vào môi trường nuôi cấy một cách thích hợp để tránh khả năng bị ức chế ngược

Hiện nay, thay vì trực tiếp sử dụng các biện pháp như gây đột biến để tăng sản lượng của SAM, người ta sử dụng các phương pháp nghiên cứu gián tiếp như sử dụng các enzyme trong con đường sinh tổng hợp SAM trong vi khuẩn, đặc biệt

là E coli, từ đó giúp tạo ra các dòng vi khuẩn có khả năng tạo ra SAM với khối lượng lớn cũng như có khả năng duy trì được qua các thế hệ [41]

1.1.2 Chức năng sinh học và ứng dụng của SAM

SAM tham gia vào nhiều phản ứng của tế bào, đóng vai trò là hợp chất cho nhóm methyl cho các chuỗi bên amino acid của protein, nucleotide trong DNA, RNA, đường và nhiều phân tử nhỏ khác SAM còn tham gia vào hai con đường điều hoà là: (1) quá trình chuyển hoá lưu huỳnh, trong đó nguyên tử lưu huỳnh của SAM được chuyển đổi thành cysteine (tiền chất của taurine và glutathione, những chất chống oxy hóa chính của tế bào); (2) quá trình aminopropyl hóa trong đó SAM được sử dụng để khử carboxyl và sau đó là aminopropyl hóa, dẫn đến tổng hợp polyamine [26] (hình 1)

SAM được vận chuyển tự do từ tế bào chất vào nhân thông qua các phức hợp lỗ màng nhân và đóng vai trò điều tiết trong nhân Ở trong nhân, SAM chủ yếu tham gia vào quá trình chuyển hoá methyl, đây là các phản ứng methyl hóa được xúc tác bởi các enzyme như lysine melthyltransferase, arginine methyltransferase và DNA methyltransferase Đặc biệt, SAM tham gia trong quá trình methyl hoá DNA bất thường có thể dẫn đến sự biểu hiện gen liên quan đến các bệnh lý ở các mô ung thư khác nhau SAM được chứng minh là nguồn cung cấp methyl chính, có tác dụng chống tăng sinh ở các tế bào ung thư khác nhau, làm chậm quá trình apoptosis ở tế bào [59] Vậy nên việc sản xuất và tăng nồng độ của SAM có ý nghĩa quan trọng không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn trong các lĩnh vực ứng dụng như hoá trị liệu hay công nghiệp dược phẩm

Hiện nay SAM đã được nghiên cứu và sử dụng trong các liệu pháp để điều trị các bệnh về thần kinh, rối loạn gan, đau cơ xơ hoá, viêm xương khớp, trầm cảm và bệnh Alzheimer [38] Trong nghiên cứu của Chawla và cộng sự [9], các bệnh nhân mắc bệnh xơ gan, quá trình chuyển đổi methionine sang SAM ở trong cơ thể thường bị tắc nghẽn dẫn đến sự suy giảm nồng độ cysteine và choline Trong trường hợp này SAM trở thành chất dinh dưỡng thiết yếu để có thể khôi phục khả năng

chuyển hoá lưu huỳnh trong gan do SAM có thể dễ dàng được hấp thụ thông qua đường uống hay đường tiêm Bên cạnh việc sử dụng để khôi phục chức năng gan đối với các bệnh gan mãn tính thì SAM cũng được dùng để phòng ngừa và hoặc giảm tình trạng nhiễm độc gan [18]

Hình 1 Vai trò và chức năng của SAM [27]

Đối với bệnh nhân rối loạn cảm xúc hay trầm cảm, SAM được sử dụng như một chất giúp nâng cao và cải thiện tâm trạng Nhờ vào khả năng methhyl hoá và tham gia vào quá trình gồm nhiều bước để tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau như dopamine, norepinephrine và serotonin, SAM được công nhận là chất có đặc tính chống trầm cảm [45,69] Theo nghiên cứu của Coumo và cộng sự [13], khi so sánh giữa SAM và các loại thuốc chống trầm cảm khác như imipramine và escitalopram đều cho thấy giữa chúng không có sự khác biệt đáng kể trên nhóm đối tượng gồm trên 1000 bệnh nhân bị rối loạn trầm cảm nặng

1.2 Tổng quan về enzyme S-Adenosylmethionine synthetase

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung về enzyme SAM synthetase (MAT, EC 2.5.1.6), một enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa L- methionine với sự tham gia của ATP để tạo ra sản phẩm SAM

1.2.1 Phân loại và giới thiệu về gen metK

MAT tồn tại phổ biến trong các sinh vật sống bao gồm vi khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật và động vật có vú [27] Trong tất cả các sinh vật được nghiên cứu

cho đến nay đều cho thấy sự tương đồng cao về trình tự metK Gen metK có tính

bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa, chọn lọc tự nhiên Khi nghiên cứu về các gen

MAT, người ta thường tập trung phân lập gen từ các vi sinh vật như E coli và S cerevisiae [41,76], hay các loài thực vật, chẳng hạn như Arabidopsis thaliana [50]

Việc lựa chọn những loài vi sinh vật và thực vật để nghiên cứu gen MAT dựa trên

việc hệ gen của những đối tượng này được tìm hiểu khá đầy đủ và công bố rộng rãi

Hiện nay, việc tìm ra các gen MAT mới cũng như tối ưu khả năng hoạt động

của chúng đã trở thành một trong những vấn đề được các nhà khoa học trên thế giới

quan tâm Trong nghiên cứu của He và cộng sự [25] trên dưa chuột (Cucumis sativus L.), hai loại gen mã hoá cho MAT là CsSAMS1 và CsSAMS2 đã được xác định và

cho thấy khả năng cải thiện tính chịu mặn trên thực vật của chúng Trong một

nghiên cứu khác về họ gen MAT trên các cây thực vật khác nhau như cà chua, cà

tím, hoa hướng dương, và nhiều giống thực vật khác, các tác giả cũng tìm thấy các chức năng và các cấp độ biểu hiện khác nhau của các gen này nhằm đáp ứng với các tác động của môi trường cũng như để phù hợp với khả năng sinh sống và phát triển của các loài thực vật khác nhau [27]

Ngoài thực vật, vi sinh vật cũng là nguồn nguyên liệu dồi dào trong việc

nghiên cứu các gen MAT, không chỉ trên E coli hay S cerevisiae, mà còn trên nhiều loài vi sinh vật khác như Sulfolobus solfataricus [53], B subtilis [31], P

aeruginosa PA01 [77] và thậm chí trong cả nhóm vi khuẩn cổ như Methanococcus jannaschii [40] cũng như nhiều loại vi sinh vật khác Nổi bật là gen mã hoá cho

enzyme MAT ở E coli, thường được gọi là metK (Mã số trên GenBank ECK2937, GenID 945389) (phụ lục 1), được tách từ hệ gen của chủng E coli K-12 [71] Khi so sánh đặc tính của enzyme MAT E coli với các MAT có nguồn gốc từ các loài

khác, người ta tìm thấy các đặc tính ưu việt như tính đặc hiệu cao hơn, khi biểu hiện cho sản phẩm có tính hoà tan tốt hơn các chủng vi khuẩn tái tổ hợp khác [70]

Điều thú vị là với E coli, người ta không tìm được thấy bất kì gen nào có chức năng tương đồng nên việc tìm hiểu chức năng của metK cũng như enzyme MAT là rất quan trọng Trong các nghiên cứu về MAT và SAM, gen metK thường

được biểu hiện quá mức và sự có mặt của gen này là cần thiết cho sự phát triển của

E coli K12 Khi sự biểu hiện gen metK bị ức chế thì sẽ dẫn đến sự methyl hoá DNA

bị suy giảm và quá trình phân chia tế bào cũng vì thế mà bị cản trở [72] 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của MAT và con đường tổng hợp SAM

MAT được biết đến là một trong số các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp SAM từ L-methionine và ATP Từ năm 1984, Markham và cộng sự [43] đã tìm

ra trình tự đoạn gen metK mã hoá cho enzyme MAT ở trong E coli K12 Đến năm 1990, vị trí của gen metK trong bản đồ gen của E coli được tìm thấy bởi nghiên cứu

của Satishchandran và cộng sự [57] Sau đó đến năm 1996, cấu trúc tinh thể cũng như sự tương tác giữa MAT và các cơ chất cũng được làm rõ [65,67] Tới năm 1997,

trình tự bộ gen của chủng E coli K-12 MG1655 đã được giải toàn bộ [4], qua đó giúp việc nghiên cứu và kiểm soát gen metK được thuận lợi hơn

Các nghiên cứu về cấu trúc của enzyme MAT được mã hoá bởi gen metK trong E coli cho thấy gen có vị trí khởi đầu ở -140 trong bộ gen của E coli K12

Các nghiên cứu đã làm rõ cách các domain của enzyme này tương tác với nhau và với các phân tử khác, từ đó hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động trong việc sinh tổng hợp SAM Theo nghiên cứu của Takusagawa và cộng sự [66,67],cấutạo của MAT bao gồm 4 tiểu đơn vị (A, B, C và D) xếp đối xứng nhau và tương tác chặt chẽ (A với B và C với D) để tạo thành hai dimer hình cầu Những dimer này kết hợp với nhau để tạo thành enzyme MAT có hoạt tính [67] (Hình 2a)

Hình 2 Cấu trúc của MAT

(a) Cấu trúc tetrametric của MAT Các tiểu đơn vị A, B, C và D có liên quan với nhau

theo cấu hình 222 được đánh dấu bằng các chữ cái ở mỗi đầu carboxyl tương ứng Hai ion Pi, hai ion Mg2+ và một ion K+ được tìm thấy ở vị trí hoạt động giữa các tiểu đơn vị A và B được

minh họa bằng liên kết que và dấu hoa thị (b) Mô phỏng cấu trúc 3D của enzyme MAT mã

hoá bởi gen metK [67]

Mỗi tiểu đơn vị của enzyme MAT đều chứa 3 domain chính: domain terminal (từ vị trí amino acid 1-12 và 129-233), domain trung tâm (từ vị trí amino acid 13-101 và 234-268), và domain carboxyl-terminal (từ vị trí amino acid 108-128 và 269-383) Các domain này tạo với nhau theo cấu trúc pseudo-3-fold Mỗi domain lại có cấu trúc phụ bao gồm các chuỗi xoắn-α và gấp nếp-β Đáng chú ý, sự tương tác giữa một số chuỗi gấp nếp β và các vùng liền kề có thể tạo thành các yếu tố cấu trúc phụ Nhờ vào những cấu trúc và sự tương tác này mà vùng trung tâm hoạt động của enzyme MAT có một bộ khung vững chắc [67]

amino-Trung tâm hoạt động của MAT (từ vị trí amino acid 13-101 và 234-268) được xác định là vùng giữa hai tiểu đơn vị, nơi xảy ra tương tác giữa hai ion orthophosphate (Pi) và ba ion kim loại (một K+ và hai ion Mg2+/Co2+) Dựa trên cơ sở cấu trúc tinh thể có thể tìm thấy các tương tác giữa enzyme MAT và phối tử và

giải thích cho hoạt động của enzyme MAT Trong đó, nhóm triphosphate của phân tử ATP tiếp xúc với trung tâm hoạt động của enzyme qua các tương tác phân cực với gốc amino acid tạo thành tripolyphosphate (PPPi), sau đó amino acid Lys ở vị trí 269 (Lys269) của enzyme có thể hình thành liên kết hydro với O-5ʹ của ATP và chuyển proton ammonium (Nζ) sang vị trí O-5ʹ của ATP Trong khi đó, phân tử methionine có thể di chuyển vào trung tâm hoạt động của enzyme và đưa nhóm - SCH3 tiếp cận với C-5ʹ của ATP Cuối cùng, liên kết C-5′- O-5′ của ATP bị phân cắt và liên kết C-5′-S được hình thành tạo nên SAM [65] Bước cuối cùng, các tương tác yếu (của adenine và của ribose trong ATP) với enzyme được hình thành và tạo điều kiện giải phóng SAM ra khỏi trung tâm hoạt động sau phản ứng xúc tác

Hình 3 Phản ứng của L-methionine với ATP với xúc tác của MAT tạo ra SAM

[64] Như vậy, trong quá trình sinh tổng hợp SAM, L-methionine phản ứng với ATP dưới sự xúc tác của MAT để tạo thành phức hợp SAM và tripolyphosphate (PPPi) Sau đó PPPi bị thuỷ phân thành pyrophosphate (PPi), orthophosphate (Pi) và giải phóng SAM như trong hình 3 [64]

1.3 Enzyme O-Methyltransferase

1.3.1 Giới thiệu chung Nếu SAM được biết đến là nguồn cung cấp nhóm chức methyl trực tiếp cho các quá trình methyl hoá thì để đưa các gốc methyl đó đến các vị trí của chất nhận, cần có các enzyme xúc tác Methyltransferase (MT, EC 2.1.1.-) là nhóm các enzyme có khả năng chuyển gốc methyl vào chất nhận nucleophilic như nitơ, oxy, lưu huỳnh hoặc carbon để tạo ra các phân tử methyl hoá

Các MT đóng vai trò xúc tác cho quá trình chuyển gốc methyl các phân tử sinh học, từ các phân tử nhỏ đến các đại phân tử sinh học gồm lipid, protein và nucleic acid [73] Do đó, MT tham gia vào nhiều quá trình thiết yếu của tế bào gồm sinh tổng hợp, truyền tín hiệu, sửa chữa protein, điều hòa chất nhiễm sắc và làm bất hoạt gen [61] Trong đó, O-Methyltransferase (OMT) là loại MT có sẵn trong tự nhiên và đóng một vai trò quan trọng trong việc vô hiệu hóa các nhóm hydroxyl của chất nhận và thay đổi khả năng hòa tan cùng với sự phân chia nội bào [47] Thông thường, các OMT được sử dụng để xúc tác phản ứng O-methyl hoá để tạo thành nhiều loại O-methosides khác nhau, qua đó làm tăng tính linh hoạt và đa dạng của các chất chuyển hoá [47] Các hợp chất phenolic chứa nhóm hydroxyl gồm các dẫn xuất flavone, isoflavone, stilbene là một trong số những cơ chất phổ biến nhất cho OMT [1]

Bên cạnh đó, nhiều OMT có nguồn gốc từ vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học nhờ khả năng giúp tăng hoạt tính một số các chất như flavonoid, alkaloid và kháng sinh Tuy nhiên, không giống như ở thực vật, OMT từ nguồn vi sinh vật chưa được tìm hiểu và nghiên cứu còn hạn chế [1,34]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Cho đến nay, theo hệ thống thông tin dữ liệu enzyme của Đại học Kỹ thuật Braunschweig, Viện Hóa sinh và Tin sinh học (BRENDA) có 412 enzymes MT đã được xác định [7] còn trong danh sách phân loại và danh pháp enzyme của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử quốc tế (ExplorEnz) [44] thì con số này là 387

MT Trong số các MT, có khoảng 95% là các MT phụ thuộc vào SAM

(adenosylmethionine-dependent methyltransferases) và chuyển SAM thành adenosyl-L-homocysteine (SAH, AdoHcy – một sản phẩm có tác dụng ức chế MT) sau khi gắn nhóm methyl từ SAM vào cơ chất [52] (hình 4) Theo nghiên cứu của Schubert và cộng sự năm 2003 [61], dựa trên hơn 100 cấu trúc của 50 MT khác nhau trên Ngân hàng dữ liệu (Protein Data Bank, PDB), họ đã phân các MT thành 5 nhóm (I-V) Trong đó, MT nhóm I đều có nếp gấp Rosmann để liên kết với SAM là nhóm MT phổ biến nhất và đa dạng nhất

S-Hình 4 Phản ứng của SAM với hợp chất phenolic với xúc tác của SaOMT2 để

tạo ra O-methoxides và SAH [52]

Trong tổng số 412 enzymes MT được liệt kê theo danh sách của BRENDA [7], có khoảng 104 enzymes OMT, chiếm khoảng 25% cũng tương tự trên ExplorEnz [44] Điều này cho thấy tính đa dạng cũng như sự thu hút của các enzyme OMT trong nghiên cứu Hầu hết các enzyme OMT đều thuộc MT nhóm I và là các enzyme có sẵn trong tự nhiên, có khả năng sửa chuyển nhóm methyl do SAM cung cấp sang nhóm hydroxyl của cơ chất và tạo ra dẫn xuất methyl ethers Hiện nay, các OMT có nguồn gốc từ thực vật được nghiên cứu và biết đến rộng rãi hơn [1] Trong thực vật, các OMT thường có nhiều trung tâm hoạt động khác nhau nên có khả năng xúc tác quá trình methyl hoá nhiều loại alkaloid, flavonoid, lignols, phenylpropanoid,

terpenoid và cũng như nhiều chất chuyển hoá khác [34] Tuỳ theo từng cặp enzyme và cơ chất cụ thể thì tính chọn lọc hoá học cũng như vị trí đưa gốc methyl vào chất nhận của OMT ở thực vật sẽ thay đổi và mang tính đa dạng Ví dụ LrOMT

(EC2.1.1.336), một OMT được tìm thấy trong cây Lycoris radiata có thể nhận các

hợp chất thơm có ít nhất hai nhóm hydroxyl liền kề nhau làm cơ chất Dựa trên nghiên cứu về cấu trúc của các cơ chất, LrOMT đã cho thấy khả năng gắn gốc methyl vào các vị trí khác nhau tuỳ thuộc vào tính chất của các nhóm liên kết [36] Trong khi đó, các OMT từ vi sinh vật lại có tính chọn lọc hoá học cao hơn ở thực vật khi chỉ có thể đưa nhóm methyl vào một vị trí nhất định của cơ chất Điều đó có nghĩa là với các OMT từ vi sinh vật, tuy sản phẩm methyl hoá không đa dạng bằng các OMT thực vật nhưng lại giúp các nhà nghiên cứu có thể đưa nhóm methyl vào vị trí mong muốn và xác định được sản phẩm methyl hoá một cách chính xác

1.3.3 Giới thiệu về gen SaOMT2 và enzyme SaOMT2

Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2016), gen SaOMT2 mã hoá cho một enzyme MT tự nhiên thuộc nhóm I là 7-O-methyltransferase SaOMT2 (EC2.1.1.B75) được phân lập từ Streptomyces avermitilis MA-4680 và được biểu hiện ở E coli dưới dạng protein dung hợp His-tag [33] (phụ lục 2) Gen SaOMT2

có kích thước 1080 bp bao gồm khung đọc mở và enzyme SaOMT2 được mã hoá bởi gen này có kích thước 39,96 kDa

Enzyme SaOMT2 được phân vào nhóm flavonoid MT nhưng trên thực tế qua nghiên cứu cho thấy SaOMT2 có tính chọn lọc cao và có khả năng tham gia vào quá trình methyl hóa vị trí 7-hydroxy của nhiều loại cơ chất Không chỉ vậy, theo Tang và cộng sự [68], enzyme SaOMT2 còn được xếp vào nhóm các OMT có trọng lượng phân tử từ 40 đến 43 kDa, không phụ thuộc vào cation hóa trị hai và chấp nhận phenylpropanoid, flavonoid, isoflavonoid hoặc chalcone làm cơ chất

Ngoài SaOMT2 được tìm thấy trong vi sinh vật, 7-OMT còn có thể được tìm

thấy ở trong thực vật, tuy nhiên với số lượng rất thấp và không ổn định Khi so sánh,

các 7-OMT từ thực vật cũng không có khả năng methyl hoá cơ chất đa dạng như là

SaOMT2 Chẳng hạn như isoflavone 7-OMT từ Medicago sativa chỉ có tính đặc

hiệu đối với isoflavone daidzein và genistein chứ không thể methyl hoá flavone apigenin hay flavanone naringenin như SaOMT2 Do vậy, SaOMT2 có phạm vi sử

dụng cơ chất rộng hơn 7-OMT từ thực vật và 7-OMT đầu tiên được tìm thấy có khả

năng methyl hoá cả isoflavone, flavone và flavanone [33] Việc sử dụng và biểu

hiện gen SaOMT2 của vi sinh vật sẽ mang lại tiềm năng lớn trong việc sửa đổi các

cơ chất, đặc biệt là với các chất chuyển hoá thứ sinh như flavonoid và isoflavonoid 1.3.4 Đặc điểm và cấu trúc

SaOMT2 là enzyme MT thuộc nhóm I, vậy nên trình tự và cấu trúc có mang

các đặc điểm đặc trưng của MT nhóm I [68] Các MT nhóm I có trình tự chuỗi α/β xen kẽ, trong đó các chuỗi gấp nếp β được xếp thành 7 hàng và được kẹp bởi các

chuỗi xoắn α ở mỗi bên [61] SAM liên kết với đầu C-terminal của chuỗi β1 và β2, và là vùng mang nhiều đặc điểm đặc trưng của nhóm MT Cấu hình GxGxG nằm giữa β1 và αA là vị trí của adenine– gốc liên kết hydro được tạo ra giữa β2 và αB để gắn kết đường ribose với gốc acid trong β1 (hình 5) Ngoài ra acid còn lại trong β1 cũng có thể tạo ra liên kết hydro dưới tác động của nước và methionine [1] Tuy nhiên, các vùng liên kết cơ chất và xúc tác lân cận có sự khác biệt đáng kể giữa các MT Khả năng chọn lọc cơ chất có thể dựa vào các domain bổ sung chèn vào các nếp gấp của MT hoặc được gắn vào vùng Rossmann [61] Điều này cũng cho thấy khả năng lựa chọn cơ chất đa dạng của các MT trong việc methyl hoá các phân tử khác nhau [1]

Trong nghiên cứu của Khalil và cộng sự, một số cấu trúc tinh thể được sử dụng để mô phỏng lại cấu hình của SaOMT2 khi có xúc tác với một số cơ chất nhất định (noraucuparin, 5-hydroxyferulic acid, và noreriobofuran) để là cơ sở phân tích dữ liệu (Hình 6) [32] Theo các tác giả, His ở vị trí 269 (His269) và Glam ở vị trí 329 (Glam329) của SaOMT2 tham gia vào quá trình xúc tác giữa SAM và cơ chất Cơ chế chuyển hoá methyl xảy ra dưới dạng phản ứng SN2, là phản ứng hoá học hữu cơ, khi liên kết bị phá vỡ (liên kết giữa oxy và hydro trong nhóm hydroxyl phenolic của

cơ chất) và liên kết mới được hình thành (liên kết giữa oxy của nhóm hydroxyl phenolic với nhóm methyl từ SAM)

Hình 5 Cấu trúc của enzyme MT nhóm I [61]

Phiến gấp β được minh hoạ bằng hình tam giác màu xanh lá và đánh số bắt đầu từ phía gần nhất với N-terminal cho đến C-terminal, chuỗi xoắn kép α được minh hoạ bằng hình tròn màu tím,

SAM được minh hoạ bằng dải băng vàng, C và N lần lượt là C-terminal và N-terminal

Trong đó, His269 sẽ lấy một proton từ một trong các nhóm hydroxyl ở vị trí meta của cơ chất và đồng thời tấn công nhóm methyl không bền của SAM Đây cũng là quá trình khử proton và methyl hóa nhóm 3-hydroxyl của cơ chất noraucuparin Glam336 hoạt động như chất nhận liên kết hydro, nhóm carboxylate của Asp270 sẽ ổn định nhóm 4-hydroxyl của cơ chất noraucuparin bằng cách hình thành liên kết hydro, từ đó cô lập cơ chất và định hướng nhóm 3-hydroxyl tiến gần đến SAM (Hình 6A) Nhóm methoxyl của noraucuparin và 5-hydroxyferulic acid được ổn định nhờ tương tác kỵ nước với Phe-176 và Ile-316 (Hình 6A, B)

Các mô hình docking đã minh họa sự khác biệt trong dữ liệu động học của noraucuparin và 5-hydroxyferulic acid Vòng B của noraucuparin được ổn định nhờ tương tác kỵ nước với các amino acid Met180, Ile316, Ile319 và Leu127, trong khi nhóm carboxylate phân cực của 5-hydroxyferulic acid chỉ được ổn định bằng liên kết hydro với Asn131 (Hình 6A, B) Tuy nhiên, nhờ vào quá trình xúc tác, 5-hydroxyferulic acid có cấu trúc ổn định nhờ liên kết ion của carboxylate với chuỗi

bên His-183 Việc methyl hoá 5-hydroxyferulic acid cho thấy tính hiệu quả cao hơn so với noraucuparin Phản ứng của SAM với cơ chất noreriobofuran dưới sự xúc tác của SaOMT2 để tạo ra eriobofuran cũng được mô phỏng trên hình 6C Nhờ liên kết hydro giữa oxy của furan và chuỗi bên của Asn131mà noreriobofuran sau khi được methyl hoá thành eriobofuran có sự ổn định cao trong cấu trúc Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc sản phẩm methyl hoá có thành công và ổn định hay không phụ thuộc rất lớn vào cấu trúc của các cơ chất cũng như khả năng tạo ra các liên kết với các amino acid trong SaOMT2

Hình 6 Hoạt động của OMT trong phản ứng với SAM và cơ chất [32]

Gắn (A) noraucuparin; (B) 5-hydroxyferulic acid; (C) noreriobofuran trong vị trí hoạt động của

SaOMT2 Các nguyên tử carbon của cơ chất và SAM lần lượt có màu xanh lá cây và hồng Vị trí hoạt động của các dư lượng còn lại có màu xám nhạt Nguyên tử oxy và nitơ lần lượt có màu đỏ và xanh lam Liên kết hydro được biểu diễn dưới dạng đường đứt nét màu đen Sự tương tác giữa nhóm methyl của SAM và nhóm hydroxyl phenolic của cơ chất được thể hiện bằng một đường đứt nét màu đỏ Khoảng cách giữa CH3 của SAM với O2 của cơ chất từ 2,8 đến 3,1 Å đối với tất cả các cơ chất được gắn vào.

1.4 Lựa chọn hệ thống biểu hiện

1.4.1 Vật chủ biểu hiện

Các nghiên cứu hiện nay về SaOMT2 và MAT thường lựa chọn hệ thống

biểu hiện ở vi sinh vật, đặc biệt là trên E coli [12,14,23,33] Hệ thống biểu hiện ở

E coli có các ưu điểm:

- E coli là hệ thống được sử dụng phổ biến để sinh tổng hợp các protein nhờ

vào các đặc tính di truyền, sự đơn giản trong cấu trúc, hệ gen đã được công bố rõ ràng, thiết kế thí nghiệm không phức tạp, kinh tế và dễ nuôi cấy trong thời gian ngắn với hiệu suất chuyển đối cao [24]

- Gen mã hoá cho protein SaOMT2 và MAT được sử dụng trong nghiên cứu đều được chứng minh là không gây độc cho tế bào và cũng không yêu cầu quá trình biến đổi sau dịch mã

- Việc lựa chọn E coli BL21 (DE3) để biểu hiện gen metK của E coli K-12 do so với chủng E coli K–12, E coli BL21 (DE3) thuộc nhóm E coli B có khả năng

đạt được lượng sinh khối lớn hơn với tốc độ tăng trưởng cao hơn [8]

Năm 1986, E coli BL21 (DE3) (Genbank: CP001509.30) được công bố

trong nghiên cứu của Studier và Moffatt [63], và từ đó được sử dụng trong nhiều ứng dụng, đặc biệt là trong sản xuất protein tái tổ hợp Năm 2009, trình tự bộ gen

của vi khuẩn E coli BL21 (DE3) đã được hoàn thiện và công bố [63] Kết quả

nghiên cứu của Kim và cộng sự, 2017 [35] đã giải trình tự bộ gen và cấu trúc phiên

mã cũng như xác định vị trí chính xác của các khung đọc mở (ORF) của E coli BL21 (DE3) Về cơ bản, E coli BL21 (DE3) thuộc chủng E coli B và có khiếm

khuyết về gen mã hoá cho Lon protease (ở tế bào chất) và OmpT protease (ở màng ngoài), có lysogen λDE3 chứa gen T7 RNA polymerase dưới sự kiểm soát của promoter LacUV5

Hình 7 Cơ chế biểu hiện gen ở tế bào E coli BL21 [3]

Để biểu hiện gen ở tế bào E coli BL21 (DE3), ngoài sự kiểm soát của promoter lac trên hệ gen của E coli còn có sự tham gia của T7 promoter của vector

biểu hiện, sự phối hợp của 2 cơ chế này giúp kiểm soát hiệu quả sự biểu hiện của

gen (Hình 7) Trong quá trình này, T7 RNA polymerase có trong E coli BL21 (DE3) sẽ nhận biết vùng khởi động T7 và mở đầu quá trình phiên mã Tuy nhiên, trong E

coli BL21 (DE3) có chứa lac repressor, chất ức chế này sẽ bám vào vị trí của lacO

và ngăn chăn RNA polymerase của E coli lẫn T7 RNA polymerase lần lượt bám vào lac promoter lẫn T7 promoter Điều này dẫn đến việc E coli BL21 (DE3) không

thể sản xuất T7 RNA polymerase và T7 RNA polymerase cũng không thể bám vào vùng khởi động T7 trên vector biểu hiện để biểu hiện gen mong muốn Việc này giúp kiểm soát được sự biểu hiện của gen, giúp quá trình biểu hiện gen không xảy ra sớm hơn mong muốn, nhất là với những gen có khả năng gây độc cho tế bào Để

gen có thể được biểu hiện tốt hơnvới E coli BL21 (DE3) chất cảm ứng IPTG thường

được bổ sung trong quá trình nuôi vi khuẩn IPTG sẽ gắn vào lac repressor, khiến

nó không thể bám vào lacO promoter và từ đó giúp cả RNA polymerase của E coli

lẫn T7 RNA polymerase bám vào được vị trí khởi đầu quá trình phiên mã 1.4.2 Vector biểu hiện pCDFDuet-1 và pRSFDuet-1

Vector sử dụng trong kĩ thuật sinh học phân tử là một phân tử DNA có kích thước nhỏ, mang trình tự gen cho phép chúng tồn tại được trong tế bào chủ và có thể vận chuyển một đoạn DNA cụ thể vào trong tế bào chủ Vector thường hỗ trợ sao chép và giúp biểu hiện trình tự DNA được chèn vào bên trong tế bào chủ Một vector lý tưởng cần đạt được những tiêu chuẩn như dễ dàng đưa vào tế bào chủ, có các trình tự cho phép chúng sao chép tự động trong tế bào chủ cũng như độc lập với sự phân chia của tế bào, có vùng nhận biết đối với enzyme giới hạn và có thể được phân lập và tinh sạch Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại vector chẳng hạn như plasmid, phagemid, cosmid, phage, bacteriophage, artificial chromosome,…

Thông thường, đối với vật chủ là vi khuẩn E coli, vector sử dụng chủ yếu là plasmid

Vector có thể chia thành hai loại chính, một là vector nhân dòng, và hai là vector biểu hiện Vector nhân dòng về cơ bản là vector thông thường có kích thước nhỏ và có nhiệm vụ chính đưa gen quan tâm vào tế bào chủ và nhân bản gen Một vector nhân dòng thông tường sẽ có các vùng chính như điểm khởi đầu sao chép, vùng chọn lọc và MCS Mỗi vùng này đều có ý nghĩa đặc biệt giúp vector nhân dòng có thể tồn tại, duy trì và nhân lên trong tế bào chủ mà không biểu hiện gen trong vật chủ Hiện nay, đối với các gen đã biết trình tự và được xác định là mã hoá cho protein không gây độc cho vật chủ, thông thường vector biểu hiện sẽ được sử dụng trực tiếp để nhân dòng gen thay cho vector nhân dòng

Để biểu hiện thành công gen quan tâm, việc lựa chọn đúng vector biểu hiện là rất quan trọng vì nó giúp giải quyết hoặc hạn chế các vấn đề trong quá trình biểu hiện gen ở vi khuẩn chẳng hạn như mức độ biểu hiện protein thấp, protein không tan, hay protein không được cuộn gập đúng cách Hiện nay trên thị trường có rất nhiều hệ thống vector plasmid phục vụ cho những mục đích khác nhau

Hình 8 Cấu trúc của vector biểu hiện pRSFDuet-1 và pCDFDuet-1 [15]

Năm 2003, Novagen công bố 2 loại vector Duet mới là pRSFDuet-1 và pCDFDuet-1 được thiết kế để nhân dòng và biểu hiện hai gen mục tiêu [15] (hình 8) Cặp đôi vector này được tạo ra để khắc phục những hạn chế của cặp vector pETDuet-1 và pACYCDuet-1 được thiết kế trước đó [46] Trong đó, vector pRSFDuet-1 chứa RSF1030 replicon (>100 bản sao) và gen kháng kháng sinh Km, còn vector pCDFDuet-1 là sự kết hợp của CloDF13 replicon (tạo ra 20-40 bản sao)

và gen aadA mã hoá streptomycin/kháng spectinomycin Sự khác nhau trong số

lượng bản sao plasmid dựa trên sự khác nhau của replicon có thể tác động đến mức

độ biểu hiện gen Cả hai vector đều có chứa lacI promoter, gen lacI và hai khung

đọc mở (ORF-open reading frame), mỗi khung đều có riêng một T7 promoter cùng với trình tự liên kết ribosome, lacO và MCS Điều này giúp cả 2 vector pCDFDuet-

1 và pRSFDuet-1 có thể sử dụng T7 RNA polymerase của tế bào E coli BL21 (DE3)

với sự tham gia của chất cảm ứng IPTG để biểu hiện hai gen quan tâm cùng một lúc Ngoài ra để chèn 2 gen vào được cùng 1 vector, thì các vector duet phải có hai MCS với các vị trí cắt của các enzyme cắt giới hạn khác nhau Hơn thế nữa, để dễ dàng nhận ra và tinh sạch các protein trong các vector này một cách riêng rẽ, cả 2 vector này còn dung hợp với các tag là His-tag và S-tag, các tag này lần lượt nằm ở MCS1 và MCS2 của vector (Hình 8)

1.5 Các tác nhân có thể gây ảnh hưởng đến biểu hiện

Mức độ biểu hiện của gen không chỉ dựa vào hệ thống biểu hiện, khả năng phiên mã mà còn có thể liên quan đến nhiều yếu tố tác động từ môi trường bên ngoài như nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng, môi trường nuôi cấy, thời gian biểu hiện, Do vậy nếu có hệ thống biểu hiện kèm vector phù hợp thì việc sản xuất protein tái tổ

hợp ở E coli vẫn còn một số vấn đề và thách thức như việc protein bị hình thành ở

dạng thể vùi, tế bào có quá trình trao đổi chất hoặc sự vận chuyển protein kém hiệu quả,…[39] Do vector biểu hiện pRSFDuet-1 được dùng trong nghiên cứu là vector có khả năng sao chép cao dẫn đến tốc độ biểu hiện của gen sẽ nhanh hơn và có thể khiến protein tạo thành cuộn gập không chính xác như mong muốn Chính vì vậy những điều kiện nuôi cấy và biểu hiện gen cần được kiểm tra và tối ưu [55] 1.5.1 Nhiệt độ

Thông thường, E coli có thể tăng trưởng trong nhiệt độ không vượt quá 40oC và tối ưu trong khoảng 21 đến 37oC Khi nhiệt độ giảm xuống dưới 21 hay trên 37oC

thì tốc độ tăng trưởng cũng như nhiều điều kiện sinh lý khác của E coli sẽ bị thay đổi [19] Sự thay đổi nhiệt độ thường được thực hiện trong quá trình nuôi cấy E

coli để giảm sự hình thành chất chuyển hóa không mong muốn và tối đa hóa quá

trình tổng hợp protein đích, giúp protein được cuộn gấp chính xác Việc giảm nhiệt độ nuôi cấy còn giúp tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ở pha tan, điều này đã có trong nhiều nghiên cứu khác nhau như nghiên cứu vể interferon α-2 ở người [58], β lactamase [6], kanamycin nucleotidyltransferase [37], protein kháng nguyên của virus viêm gan C [30]

Tuy nhiên việc giảm nhiệt độ có thể tăng biểu hiện của protein hay không còn tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố cũng như đặc tính, cấu trúc và chức năng của từng protein Trong nghiên cứu về biểu hiện hơn 133 protein trong thang nhiệt độ từ 13,5 đến 46oC của Herendeen và cộng sự [29], chỉ có 11 protein thay đổi mức độ biểu hiện, còn 83 protein còn lại không cho thấy sự khác biệt Tuy nhiên, nghiên cứu này được thực hiện từ năm 1979 và còn nhiều khía cạnh chưa được xem xét kĩ lưỡng

trong khi những nghiên cứu gần đây về biểu hiện của protein ở các nhiệt độ khác nhau lại cho thấy sự khác biệt đáng kể Nghiên cứu của Gadgil và cộng sự [19] đã cho thấy sự khác biệt rõ ràng trong khả năng phiên mã và biểu hiện gen liên quan

trong quá trình sản xuất protein rDNA khi giảm nhiệt độ nuôi cấy E coli K12 từ 37

xuống 33 và 28oC Việc giảm nhiệt độ không chỉ giúp tăng khả năng biểu hiện mà nhiều khi còn làm giảm biểu hiện của các protein khác nhau, từ đó cho thấy tầm quan trọng của nhiệt độ cảm ứng đối với việc biểu hiện gen Những gen có biểu hiện tăng lên là những gen liên quan đến vận chuyển choline, proline, putrescine, sulfate, thiosulfate, leucine, uracil, α-ketoglutarate permease và lipid A/glycerophospholipid Trong khi đó, các gen có biểu hiện giảm hầu hết là các gen liên quan đến amino acid hay các gen mã hoá enzyme trong con đường histidine và arginine, và gen liên quan đến vận chuyển amino acid và đường như vận chuyển arginier, glutamine, serine, glucokinase [19]

Nhìn chung, việc điều chỉnh như giảm nhiệt độ nuôi cấy E coli khi biểu hiện có thể giảm tỷ lệ trao đổi chất tổng thể và khả năng phiên mã của E coli mà không

cần sử dụng đến việc hạn chế dinh dưỡng để hạn chế tốc độ tăng trưởng của tế bào Các gen có chức năng và cấu trúc khác nhau sẽ có sự thay đổi khác nhau trong khả năng biểu hiện khi thay đổi nhiệt độ nuôi cấy của vật chủ biểu hiện

1.5.2 Nồng độ chất cảm ứng

Nồng độ chất cảm ứng cũng là một điều kiện không thể thiếu trong việc kiểm

soát biểu hiện của gen trong E coli Quá trình trao đổi chất do DNA plasmid và

protein ngoại lai có thể làm giảm tốc độ tăng trưởng của tế bào, gây ra sự mất ổn định về cấu trúc và phân chia plasmid cũng như những thay đổi về trao đổi chất, di truyền và sinh lý dẫn đến giảm khả năng tạo ra protein tái tổ hợp [10] Các nghiên

cứu về ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện của gen ở E coli cho thấy nồng độ IPTG có ảnh hưởng đến biểu hiện và khả năng hoà tan của protein Chủng E coli BL21

(DE3) là chủng có khả năng cho phép IPTG xâm nhập vào tế bào LacY-, tạo khả năng cảm ứng đồng nhất [55]

Nghiên cứu của Zhang và cộng sự [78], khi nghiên cứu về việc biểu hiện

protein màng ở E coli BL21 (DE3), đã đưa ra kết quả đáng lưu ý khi cho thấy việc

không sử dụng IPTG lại có thể giúp việc biểu hiện protein màng cao hơn so với khi sử dụng Điều này được giải thích là do các protein màng được tạo ra ở trong màng tế bào chất, khi không có IPTG, các protein này được tổng hợp một cách ổn định với tốc độ thấp hơn, cũng như không phải cạnh tranh với các protein khác có sẵn

trong tế bào [78] Ngược lại, hầu các nghiên cứu biểu hiện gen ở tế bào E coli BL21

(DE3) đều cho thấy sự có mặt của IPTG trong môi trường nuôi cấy là một điều cần

thiết, thậm chí nếu không có IPTG thì kể cả khi BL21 (DE3) là chủng E coli có sự

rò rỉ gen thì protein tái tổ hợp cũng vẫn không được biểu hiện [2,10,42] Nghiên cứu của Choi và Geletu [10], khi kiểm tra ảnh hưởng của IPTG đến khả năng biểu hiện

của gen fGH, với dải nồng độ từ 0,05 đến 10 mM IPTG và cho thấy với nồng độ

IPTG cao hơn 1 mM thì mức độ biểu hiện gen thấp so với nồng độ khoảng từ 1 đến 0,05 mM

Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc tìm hiểu và kiểm soát ảnh hưởng

của chất cảm ứng IPTG lên khả năng biểu hiện gen ở E coli là điều cần thiết, nhất

là khi IPTG không phải là chất cảm ứng hoàn toàn an toàn mà có thể gây hại nghiêm trọng cũng như tạo áp lực sinh tổng hợp cho tế bào trong một số trường hợp [16] 1.5.3 Thời gian biểu hiện

Khi biểu hiện gen trong tế bào E coli, một yếu tố có thể gây ảnh hưởng lớn

đến khả năng biểu hiện là thời gian biểu hiện sau khi cho chất cảm ứng Sở dĩ coi đây là điều kiện cần kiểm soát khi biểu hiện gen là bởi vì sự tăng trưởng quá mức cũng có thể gây chết tế bào và khiến protein ngoại lai bị phân huỷ và ngược lại nếu thời gian biểu hiện quá ngắn thì sản phẩm protein được tạo ra sẽ không cao

Trong nghiên cứu về tăng khả năng biểu hiện của protein thì thời gian sau cảm ứng thường có độ rộng và khoảng cách khác nhau tuỳ vào thiết kế thí nghiệm cũng như cấu trúc và thời gian đóng xoắn của protein cần biểu hiện Đặc biệt khi nhiệt độ nuôi cấy sau cảm ứng giảm thì tốc độ tổng hợp protein sẽ giảm, và do đó

thời gian cảm ứng cần kéo dài hơn thông thường để thu được đủ lượng protein cần thiết [17] Kết quả nghiên cứu của Abedi và cộng sự [2], khi tối ưu biểu hiện của

gen phaC mã hoá cho poly (3-hydroxyalkanoate) synthetase từ P aeruginosa PTCC 1310 ở E coli BL21 (DE3) ở 37oC và 1,0 mM IPTG, nhóm nghiên cứu đã thử

nghiệm việc biểu hiện gen này với các mốc thời gian biểu hiện là 1, 2, 3 giờ và cho thấy ở mốc 2 h thì biểu hiện của gen là tốt nhất Nghiên cứu khác của Peng và cộng sự [51] về thời gian tối ưu để biểu hiện β-defensin-2 của người sau cảm ứng được xác định bằng cách phân tích mẫu theo từng thời điểm 2 giờ/mẫu và tối đa trong 12 giờ và đã tìm được thời gian tối ưu ở mốc 8 giờ sau biểu hiện ở 28oC nồng độ 0,08 mM IPTG Điều này cũng cho thấy ở nồng độ IPTG thấp hơn thì thời gian nuôi cấy tế bào sau khi cho chất cảm ứng cũng có thể kéo dài hơn so với thông thường Tuy nhiên còn một số yếu tố khác cần phải xem xét như cấu trúc và chức năng của protein cần biều hiện có phức tạp hay không, yêu cầu thời gian đóng xoắn dài hay ngắn, thường được biểu hiện ở pha tan hay pha không tan, có dễ bị ảnh hưởng bởi những protein khác có sẵn trong tế bào hay không, … Chính vì thế mà điều kiện biểu hiện của các gen là khác nhau và cần phải nghiên cứu tối ưu để có thể thu được lượng sản phẩm protein mong muốn

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hoá chất

2.1.1 Vật liệu

Chủng vi khuẩn, các vector được sử dụng trong nghiên cứu cũng như nguồn gốc được trình bày trên Bảng 1

Bảng 1 Danh sách các chủng vi sinh vật, vectors, và plasmids

Plasmids

pCDFDuet-1 Hai T7 promoter, CloDF13 ori, SmR Novagen,

Germany piBR181-SAM Vector đa cistron biến đổi từ pET28a+ , f1

pBR322 ori, KmR, mang gen metK

[48] pRSF-SaOMT2 Vector pRSFDuet-1 mang gen SaOMT2 [11]

Chủng E coli BL21 (DE3) ompT hsdT hsdS(rB−mB−) gal(DE3) Novagen,

Germany

Trình tự gen metK và SaOMT2 mã hoá cho enzyme SAM và SaOMT2 được thể hiện trong phần phụ lục 1 và 2 Gen metK phân lập từ chủng E.coli K12 sử dụng

trong nghiên cứu được khuếch đại từ vector piBR181-SAM trong nghiên cứu của

Parajuli và cộng sự [48], gen metK được giữ nguyên trình tự gốc với kích thước

1155 bp (phụ lục 1) Vector pRSF-SaOMT2 được cung cấp theo công bố của Chử

Lương Luân và cộng sự [11], gen SaOMT2 được chèn vào giữa vị trí cắt của BamHI và EcoRI trên khung đọc mở đầu tiên của vector pRSFDuet-1

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tổng hợp từ công ty TNHH MTV Phusa Biochem (Việt Nam) Trình tự các mồi trong nghiên cứu được trình bày trên Bảng 2

Bảng 2 Trình tự mồi

* vùng gạch chân in nghiêng là vùng trình tự cắt của enzyme giới hạn tương ứng

nghiên cứu là DNA 1 Kb BioFACTTM DNA ladder (Hàn Quốc) và DNA HyperLadderTM 1kb meridianBIOSCIENCETM (Mỹ) Thang chuẩn protein là Thermo Scientific™ PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Mỹ) với các băng từ 10 đến 180 kDa

Các hoá chất cơ bản sử dụng cho sinh học phân tử như môi trường LB, LB agar, agarose, các kháng sinh, Bis-Acrylamide, NuPAGE™ LDS Sample Buffer, DMSO và một số hoá chất thông dụng khác có nguồn gốc từ các hãng uy tín như BioBasic (Canada), Bio-rad (Mỹ), Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức), ThermoFisher scientific (Mỹ) và đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết cần thiết cho sinh học phân tử IPTG được mua từ hãng AK Scientific (Mỹ) Hoá chất để chạy HPLC như Acetonitril, Methanol, nước có nguồn gốc từ hãng Merk (Đức) với hàm lượng nguyên trạng  99,80% Chất chuẩn Resveratrol có nguồn gốc từ hãng Wako Pure Chemicals, Tokyo, Nhật Bản

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Các thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu được thực hiện tai Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Thí nghiệm trọng điểm

Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN (Bảng 3)

Bảng 3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Máy điện dị Mini-Sub® Cell GT Bio-Rad, Mỹ

Máy quang phổ nanodrop Thermo Scientific, Mỹ

Pipet 1000, 200, 100, 10, 2,5 μL Eppendorf, Đức Ống falcon 50, 15 mL, ống eppendorf

Biologix, Mỹ Đầu tip 1000, 100, 10 μL

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nhân bản gen metK bằng phản ứng PCR

NEB OneTaq Hot Start DNA Polymerase 2X Master Mix được sử dụng với

thành phần (bảng 4) cho phản ứng PCR nhằm khuếch đại gen metK từ vector

piBR181 – SAM

Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR

Primers được thiết kế dựa trên trình tự đã biết của gen metK bao gồm mồi

xuôi và mồi ngược (bảng 2), vùng được gạch chân và in nghiêng trong các mồi lần lượt là vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI, được sử dụng để tạo vị trí cắt và nối trong quá trình nhân dòng

Các thông số về nhiệt độ gắn mồi, thời gian trong mỗi chu kì được sử dụng

và tối ưu dựa trên các cặp mồi thiết kế, enzyme xúc tác DNA polymerase Gen metK

được khuếch đại bằng phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 5)

Bảng 5 Chu trình nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

Nhiệt độ (ºC) Thời gian Chu kỳ

40 45- 50 30 giây

2.2.2 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR gen MetK

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (NEB, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất với các bước gồm:

- Sản phẩm PCR được đưa vào ống eppendorf 1,5 ml và được bổ sung thêm đệm bám theo tỉ lệ 5:1 (5 μL đệm: 1 μL mẫu)

- Hỗn hợp dung dịch được chuyển qua cột silica, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút Phần dung dịch chảy qua cột được loại bỏ, cột chứa DNA được rửa hai lần với 200 μL đệm rửa và được ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút mỗi lần

- 20 μL đệm đẩy được bổ sung chính giữa lớp màng sillica matrix của cột, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút thu sản phẩm DNA tinh sạch

- Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra và đánh giá mức độ tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 0,5% và được bảo quản ở -20oC

2.2.3 Phương pháp đưa đoạn gen metK vào vector pRSFDuet-SaOMT2 và vector

tái tổ hợp với gen metK Cả hai vector đều được cắt bằng 2 enzyme BglII và XhoI để mở vòng và tạo vị trí gắn cho gen metK với thành phần trong bảng 6

Bảng 6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn

Thành phần phản ứng

Thể tích (µL)

Gen metK

Vector pRSF-SaOMT2

Vector pCDFDuet-1

2.2.3.2 Tinh sạch DNA từ gel agarose

Các sản phẩm sau khi được điện di trên gel agarose được cắt và tinh sạch bằng Monarch® DNA Gel Extraction Kit, được tiến hành theo các bước:

- Băng DNA quan tâm được cắt chính xác từ bản gel agarose và đưa vào ống eppendof 1,5 ml và bổ sung đệm để hoà tan gel vào ống eppendof theo tỉ lệ 1:4 (1 mg gel : 4 μL đệm)

- Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt trong 10 phút ở 50oC đến khi gel tan hoàn toàn - Dung dịch gel agarose chứa DNA đã hoà tan được chuyển lên cột và ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 2 phút

- Sau khi ly tâm, phần dung dịch chạy qua cột được loại bỏ, cột giữ lại DNA được rửa 2 lần với 200 μl đệm rửa và ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 2 phút

- Bổ sung 20 μL đệm đẩy vào chính giữa lớp màng sillica matrix của cột để thu DNA qua ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút trong 2 phút

2.2.3.3 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp

Sản phẩm sau khi tinh sạch được kiểm tra và đánh giá bằng điện điện di trên gel agarose 0,5% và chọn lọc các DNA phù hợp để thực hiện phản ứng ligation với các thành phần tương ứng trong 2h ở nhiệt độ 25oC (bảng 7)

Bảng 7 Thành phần phản ứng ligation

Sản phẩm sau khi được gắn xong tạo thành 2 vector tái tổ hợp pCDF-metK và pRSF-SaOMT2-metK được dùng cho phản ứng biến nạp

2.2.4 Phương pháp biến nạp các vector tái tổ hợp vào E coli BL21 (DE3)

E coli BL21 (DE3) được sử dụng để tạo tế bào khả biến để biến nạp với các

vector tái tổ hợp pCDF-metK và pRSF-SaOMT2-metK được nuôi cấy lắc trong 5 mL dung dịch LB ở nhiệt độ 37oC, 160 vòng/phút trong vòng 3h để đạt được giá trị OD600 khoảng 0,4 Dung dịch nuôi cấy lắc được chuyển vào nhiệt độ 4oC trong 30 phút trước khi ly tâm nhiệt độ 4oC, 10 phút, 3.000 vòng/phút để thu lấy cặn tế bào

Tế bào E coli BL21 (DE3) tiếp tục được rửa 2 lần với dung dịch CaCl2 1M và ly tâm 4oC trong vòng 10 phút, 3000 vòng/phút để thu tế bào khả biến 20 µL sản

phẩm ligation trước đó được đưa vào tế bào khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút

Sau đó 300 µL dung dịch LB được thêm vào mẫu và tế bào được nuôi lắc ở nhiệt độ 37oC, 160 vòng/phút trong 1 giờ trước khi được cấy lên đĩa thạch môi trường LB được bổ sung 50 μg/ml kháng sinh thích hợp và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC

2.2.5 Phương pháp sàng lọc, tách chiết và kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp

2.2.5.1 PCR khuẩn lạc

Kỹ thuật PCR được sử dụng sàng lọc khuẩn lạc E coli để tìm ra được vector

tái tổ hợp có chứa gen quan tâm Theo phương pháp của Sambrook và cộng sự [22], khi sàng lọc khuẩn lạc để tìm gen quan tâm, primer được sử dụng trong phản ứng nhân bản gen có thể được sử dụng để sàng lọc

Sau khi biến nạp thành công, một số khuẩn lạc to, rõ ràng được phân lập sang sang đĩa thạch LB chứa 50 μg/ml Kanamycin khác rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 oC Các khuẩn lạc sau đó được tách bằng phương pháp PCR khuẩn lạc để chọn ra chủng

chứa gen metK đã được gắn thành công vào vector pRSFDuet-SaOMT2 và vector

pCDFDuet-1 theo thành phần ở bảng 8 và chu kỳ ở bảng 5

Kết quả sản phẩm PCR khuẩn lạc, được kiểm tra và đánh giá bằng điện di trên gel agarose 0,5%

2.2.5.2 Tách chiết DNA plasmid từ E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp

Các chủng mang gen metK được nuôi cấy lắc (160 vòng/phút) qua đêm trong

5mL môi trường LB với hàm lượng kháng sinh 50 μg/ml ở 37oC Tế bào được thu lại bằng ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút, trong 2 phút ở 4oC.Kit DNA plasmid

GeneAll® Exprep™ Plasmid SV được sử dụng để phá vỡ tế bào cũng như tinh sạch

vector tái tổ hợp pRSF-SaOMT2-metK (vector pRSF-SaOMT2 chứa gen metK) và pCDF-metK (vector pCDFDuet-1 chứa gen metK) theo quy trình của hãng

Hai vector tái tổ hợp mới được tạo ra được kiểm tra với 3 enzyme giới hạn

khác nhau gồm BamHI, BglII và XhoI (bảng 9) với thời gian cắt là 30 phút ở 37oC

trên bể ổn nhiệt để kiểm tra chiều gắn cũng như vị trí gắn của gen metK trong vector

tái tổ hợp pRSF-SaOMT2-metK và vector pCDF-metK Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra và đánh giá trên gel agarose 0,5%

Bảng 9 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra vector

Thành phần phản ứng

Thể tích (µL)

Cắt bằng 2 enzyme