(Luận văn) nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin 3 0 rhamnoside ở vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ UYÊN lu an NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT va n RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN tn to p ie gh ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN d oa nl w Công nghệ sinh học 60 42 02 01 va Mã số: an lu Chuyên ngành: TS Nguyễn Huy Thuần ll u nf Người hướng dẫn khoa học: oi m TS Nguyễn Xuân Cảnh z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn lu an va n Phạm Thị Uyên p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn khoa học 1) TS Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn lu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô kỹ thuật viên Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm TS Nguyễn Minh Hùng, TS Nguyễn Thành Trung, TS Nguyễn Thị Hà, TS Lê Thành Đô, TS Hồ Viết Hiếu, TS Trần Thị Thanh Thỏa cử nhân Đặng Thị Kim Mai tạo điều kiện cho sử dụng trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm an n va ie gh tn to Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân, tham gia trao đổi với vấn đề thực hành thí nghiệm p Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập thể cán bộ, công nhân viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu nl w d oa Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, người ln tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn va an lu u nf Hà Nội, ngày… tháng… năm… ll Tác giả luận văn oi m z at nh z Phạm Thị Uyên m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình, hiểu đồ vii Thesis abstract ix Phần Mởđầu lu an n va Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học đề tài nghiên cứu ie gh tn to 1.1 Ý nghĩa thực tiễn đề tài nghiên cứu p 1.4.2 Phần 2.Tổng quan tài liệu w Khái quát flavonoid 2.2 Giới thiệu rhamnetin số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp 2.3 Con đường sinh tổng hợp rhamnetin dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside d oa nl 2.1 an lu Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin dẫn xuất rhamnetin u nf 2.4 va thực vật ll glycoside m Vai trò enzyme 2.4.2 Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin 13 2.5 Các hoạt tính sinh học rhamnetin 16 oi 2.4.1 z at nh z @ Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.1.3 Nguyên vật liệu 18 3.1.4 Phương pháp nghiên cứu 20 m co l gm 3.1 an Lu n va ac th iii si 3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 25 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 25 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 28 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 29 Phần Kết thảo luận 30 lu an 4.1 Kết thí nghiệm tổng hợp phát rhamnetin-3-o-rhamnoside 30 4.1.1 Kết nghiên cứu bổ sung chất rhamnetin tách chiết thu sản phẩm 30 4.1.2 Phân tích kết chuyển hóa sắc ký mỏng 30 4.1.3 Phân tích kết chuyển hóa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao va (hplc) 31 n tn to 4.1.4 Đánh giá bàn luận ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 33 p ie gh 4.2 Phân tích kết chuyển hóa phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside oa 4.2.2 nl w 33 d 35 lu Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 36 va an 4.2.3 u nf Phần Kết luận kiến nghị 41 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 ll 5.1 oi m z at nh Tài liệu tham khảo 42 z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT lu an n va Tên đầy đủ 4CC 4-coumaroyl-CoA 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase C4H Cinnamic 4-hydroxylase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth p IPTG ie gh tn to Từ viết tắt oa nl w Liquid Chromatography Electrospray Ionization d LC-ESI-MS/MS lu Optical density ll u nf O-methyltransferase oi m OMT nucleotide diphosphate va OD an NDP Tandem Mass Spectrometric phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate TLC Thin layer chromatography UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase z at nh PAL z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại số lớp flavonoid thường gặp thực vật Bảng 2.1 Một số hoạt tính sinh học rhamnetin 16 Bảng 3.1 Thành phần môi trường TB 25 Bảng 3.2 Thành phần môi trường LB 26 Bảng 3.3 Thành phần dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9 26 Bảng 3.4 Thành phần môi trường M9 27 Bảng 4.1 Kết đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside môi trường nuôi cấy khác 34 Bảng 4.2 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside nồng độ IPTG lu an khác 35 n va Bảng 4.3 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside mức nhiệt độ khác Bảng 4.4 So sánh hiệu chuyển hóa số loại chất với rhamnetin 40 p ie gh tn to 37 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ lu an Hình 2.1 Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B) Hình 2.2 Các cấu trúc khung số nhóm flavonoid thường gặp Hình 2.3 Phân bố rhamnetin số loài thực vật Hình 2.4 Rhamnetin số dẫn xuất chúng Hình 2.5 Tổng hợp rhamnetin glycoside thực vật Hình 2.6 Cơ chế phản ứng enzyme glycosyltransferases, (A) 10 Hình 2.7 Sản xuất rhamnetin từ quercetin thơng qua enzyme POMT7 15 Hình 3.1 Sơ đồ hệ thống E coli tái tổ hợp 19 Hình 3.2 Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside 20 Hình 4.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp va n rhamnetin-3-O-rhamnoside 28 Sản phẩm sau tinh đông khô 30 tn to Hình 4.4 Sắc ký đồ phân tích vị trí chất rhamnetin rhamnetin glycoside 31 Hình 4.6 Phân tích định tính tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside 32 Hình 4.7 Phân tích LC-ESI-MS/MS chế độ negative mode 32 p ie gh Hình 4.5 nl w Sơ đồ phân mảnh MS/MS rhamnetin rhamnoside 33 d oa Hình 4.8 an lu Biểu đồ 4.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3O-rhamnoside 34 va u nf Biểu đồ 4.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin- ll 3-O-rhamnoside 36 m oi Biểu đồ 4.3 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- z at nh rhamnoside 37 z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Uyên Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền” Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: lu Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside vi khuẩn E coli cải biến di truyền đánh giá ảnh hưởng số điều kiện ni cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất an n va Phương pháp nghiên cứu gh tn to Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E coli đĩa thạch ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp p ie Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi Đông khô mẫu máy sấy thăng hoa Định tính định lượng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS w oa nl Kết kết luận d Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa E coli tái tổ hợp có tính khả thi sản phẩm tạo thành kiểm tra phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS va an lu ll u nf Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới ni cấy chuyển hóa chất chủng loại môi trường, nồng độ IPTG nhiệt độ thu sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside cao đạt 12.6 mg/L oi m z at nh Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng sản phẩm flavonoid glycoside nói chung rhamnetin nói riêng lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v.v xây dựng sở cho nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có giá trị cao đời sống z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Uyen Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in genetically modified Escherichia coli” Major: Biotechnology Code: 60 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: lu Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically engineered E coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and temperature) to improve the production of target compounds an va n Materials and Methods: gh tn to Recombinant E coli was cultured in broth medium using antibiotics (streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations p ie Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside d oa nl w Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction using ethylacetate as solvent Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier va an lu The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS ll u nf Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside oi m z at nh Main findings and conclusions z The recombinant E coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data m co l gm @ Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production The highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12.6 mg/L an Lu Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc n va ac th ix si số tài liệu khác phân tích phổ khối lượng phân tử chất tương tự, nhận định tạo rhamnetin-rhamnoside thí nghiệm chuyển hóa Như thông qua phương pháp sắc ký, xác định xác sản phẩm tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside lu an n va p ie gh tn to Hình 4.3 Phân tích định tính tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ (Trong đó: (A): phổ sắc ký lỏng sản phẩm; (B): Các phân mảnh sản phẩm bị phá vỡ bao gồm an Lu 314,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside]) 299,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside-CH3]).) Hình 4.4 Phân tích LC-ESI-MS/MS chế độ negative mode n va ac th 32 si OH OH OH H3CO OH O H3CO O OH OH O O O OH O M = 314.10 HO OH OH CH3 M= 462.40 Rhamnose OH OH lu OH OH an - H3CO O O n va O to tn O- CH3 O OH M = 299.10 O M = 315.10 p ie gh OH O- nl w Hình 4.5 Sơ đồ phân mảnh MS/MS rhamnetin rhamnoside d oa 4.2 ĐÁNH GIÁ VÀ BÀN LUẬN ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỚI HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN-3-ORHAMNOSIDE va an lu ll rhamnoside u nf 4.2.1 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- m oi Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng, sinh lý vi z at nh khuẩn Có loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy vi khuẩn E coli LB, TB M9 Mỗi loại mơi trường có thành phần dinh dưỡng khác z nhau, LB, TB mơi trường tổng hợp có thành phần dinh dưỡng @ gm phức tạp chứa cao nấm men, tryptone, cịn M9 mơi trường có thành phần l xác định Chúng tơi sử dụng loại mơi trường cho thí nghiệm chuyển m co hóa điều kiện: 220 vịng/phút, 32oC, 0,8 mM IPTG Nồng độ chất 30 lại ba lần thí nghiệm cho bảng 4.1 an Lu µM thời gian ni chuyển hóa 24 sau bổ sung IPTG Kết đo lặp n va ac th 33 si Từ kết thể biểu đồ 4.1, ta thấy môi trường TB (terrific broth) có hàm lượng cao nấm men cao thích hợp cho sinh trưởng vi khuẩn, biểu protein ngoại lai nên cho sản lượng sản phẩm thu tốt đạt 22,3 µM (10,3 mg/L) Trong đó, mơi trường LB M9 +2% glucose cho suất đạt 15,4 17,5 µM Từ kết cho thấy lượng sản phẩm thu từ nuôi cấy môi trường TB cao gấp 1,4 lần so với môi trường LB gấp 1,2 lần so với môi trường M9, hiệu suất chuyển hóa đạt 74% Bảng 4.1 Kết đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside môi trường nuôi cấy khác lu an n va TB M9+2% glucose Lần (µM) 16,4 24,5 16,5 Lần (µM) 14,3 21,3 19,2 Lần (µM) 15,5 21,1 16,8 15,4 22.3 17,5 Độ lệch chuẩn 0,86 1,56 1,21 51,3 74,3 58,3 gh tn to LB w Số lần đo p ie Giá trị trung bình (µM) d oa nl Hiệu suất chuyển hóa (%) ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Biểu đồ 4.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside n va ac th 34 si Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đồng độ IPTG trình bày sau phần lý giải cho chênh lệch hiệu suất chuyển hóa hai nghiên cứu 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside IPTG chất kích thích biểu protein dị dịng (heterologous expression) thường sử dụng rộng rãi nghiên cứu biểu protein Chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp dùng thí nghiệm mang nhiều gen có nguồn gốc ngoại lai gen tham gia tổng hợp đường UDP-L-rhamnose, đặc biệt gen chuyển hóa nhóm đường tới chất nhận, rhamnosyltransferase (ArGT3) lu Bởi vậy, nồng độ IPTG khác sử dụng nhằm đánh giá mức độ an va chuyển hóa chất rhamnetin n Chúng sử dụng mức nồng độ IPTG cuối khác bao tn to gồm: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mM Điều kiện nuôi cấy bao gồm mơi trường TB, ie gh 220 vịng/phút, nhiệt độ 32oC Nồng độ rhamnetin đưa vào 30 µM Kết p đo thí nghiệm lặp lại ba lần cho bảng 4.2 Kết thể nl w hình sau: oa Bảng 4.2 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside d nồng độ IPTG khác an lu mM 0,2 mM 0,6 mM 0,8 mM mM 14,5 16,5 26,3 22,0 13,2 14,2 24,5 21,3 12,8 16,4 25,7 24,2 15,7 25,5 22.5 Lần (µM) 6,8 Lần (µM) 7,9 10,1 Lần (µM) 7,8 10,1 Giá trị trung bình 7,5 10,5 13,5 0,50 0,57 0,73 1,06 0,75 1,24 25 35 45 52 85 75 ll 11,3 0,4 mM l u nf va Số lần đo oi m z at nh z gm @ (µM) an Lu Hiệu suất chuyển hóa (%) m co Độ lệch chuẩn n va ac th 35 si lu an n va Từ đồ thị biểu diễn kết ta thấy tăng hàm lượng IPTG p ie gh tn to Biểu đồ 4.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside w hàm lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside tăng dần từ mức thấp oa nl 7,5 (không bổ sung IPTG) cực đại 25,5 µM (11,8 mg/L) ứng với hàm d lượng IPTG = 0,8 mM Tuy nhiên, tăng hàm lượng IPTG đến mM hàm an lu lượng sản phẩm khơng tăng mà có xu hướng giảm chút ít, đạt 22,5 µM va Lý giải điều này, cho ngưỡng IPTG = 0,8 mM thích hợp tối ưu u nf cho biểu protein ngoại lai vi khuẩn tái tổ hợp E coli ArGT3 ll chúng hoạt động xúc tác tối ưu cho chuyển hóa chất oi m z at nh 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới q trình sinh lý, sinh hóa z @ vi khuẩn ảnh hưởng trực tiếp tới khả sinh trưởng, phát triển hoạt gm tính enzyme tái tổ hợp Chúng tơi, đó, thiết lập điều kiện ni cấy bao m co l gồm: môi trường TB, 220 vịng/phút, vi khuẩn ni 37oC vịng 3-4h để đạt tới ngưỡng phát triển có OD600= 0,6 bổ sung IPTG nồng độ an Lu mM Sau chúng ni chế độ ni cấy khác bao gồm 25, 27, 32 37oC thời gian 3-7h Thời gian nuôi cấy nhằm kích thích sinh n va ac th 36 si trưởng vi khuẩn biểu protein, thời gian dài ngắn tùy thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy Khi mật độ vi khuẩn đạt ngưỡng OD = 1,3 chúng tơi bổ sung chất 30µM rhamnetin Nhiệt độ ni cấy trì ổn định, thời gian ni cấy kéo dài 24h Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến chuyển hóa chất thể thông qua biểu đồ đây: Bảng 4.3 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside mức nhiệt độ khác Số lần đo lu an n va 27ºC 32ºC 37ºC Lần (µM) 13,5 15,6 28,5 24,3 Lần (µM) 11,8 17,5 25,6 23,1 Lần (µM) 12,2 14,3 27,5 23,1 Giá trị trung bình (µM) 12,5 15,8 27,2 23,5 Độ lệch chuẩn 0,73 1,31 1,20 0,57 42 53 90 78 p ie gh tn to 25ºC Hiệu suất chuyển hóa (%) d oa nl w Từ bảng kết đo ảnh hưởng mức nhiệt độ khác ta có biểu đồ sau (biểu đồ 4.3) ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Biểu đồ 4.3 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside n va ac th 37 si Từ biểu đồ chuyển hóa nhận thấy tăng nhiệt độ nuôi cấy hàm lượng sản phẩm thu tăng dần từ mức 12,5 µM (25ºC) đạt ngưỡng cực đại 27,2 µM (32ºC) sau giảm dần tới 23,5 µM 37ºC Bàn luận: Trước kia, người ta thường sử dụng phương pháp tách chiết, tinh xác định cấu trúc hợp chất glycoside từ thực vật xạ khuẩn (Vosgen et al., 1980; Andreeva et al., 1998; Preiss et al., 2010) Sau tiến hành thí nghiệm vi sinh, hóa sinh, dược lý để tìm hiểu, sàng lọc đặc tính dược học mong muốn Cuối người ta tiến hành tách chiết quy mô lớn để thu lượng lớn sản phẩm phục vụ nhu cầu thực tiễn Khi cơng nghệ hóa học hữu phát triển, lu phương pháp bán tổng hợp áp dụng phổ biến để sản xuất glycoside an Tuy nhiên phương pháp tương đối đắt đỏ, tốn thời gian có thành n va phần hóa chất thải gây độc cho môi trường, người (Oyama et al., 2004; lượng lớn flavonoid để phục vụ nhu cầu thương mại vừa đảm bảo tính tự gh tn to Wang et al., 2012) Vì câu hỏi đặt làm để thu ie nhiên, giảm thiểu chi phí khơng gây hại tới môi trường người Phương p pháp sử dụng vi khuẩn tái tổ hợp nhằm tổng hợp glycoside phương pháp ứng w dụng thành tựu kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp kết hợp với cải oa nl biến trao đổi chất để tạo hệ thống tổng hợp theo thiết kế in vitro in d vivo có tính đặc hiệu cao, suất tốt, tiết kiệm thời gian giảm chi phí vận lu an hành (Thuan et al., 2013) u nf va Trong nghiên cứu trước đây, thiết kế vi khuẩn E coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp đường hoạt hóa gen mã hóa cho enzyme ll oi m glycosyltransferase Glycosyltransferase (GT) enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm phân tử đường sang phân tử chất nhận để tạo sản phẩm z at nh đường hóa Cho tới nay, người ta biết cấu trúc mối liên hệ hoạt tính cấu trúc nhiều loại GT Thực nghiệm cho thấy hầu hết enzyme z @ có trình tự đặc trưng nằm đầu C (C-terminal) gọi hộp PSPG (plant gm secondary product glycosyltransferase) bao gồm 44 amino acid có chứa túi gắn l phân tử đường (Offen et al., 2006; Brazier-Hicks et al., 2007) Sau đó, số m co loại flavonoid myricetin, apigenin baicalein sử dụng làm chất an Lu cho trình cải biến sinh học thơng qua phản ứng in-vivo nhằm thu nhận sản phẩm tương ứng (flavonoid glycoside) (Thuan et al., 2013a; Thuan et al., 2013b) n va ac th 38 si Flavonoid sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đặc trưng thực vật bậc cao Cho tới nay, dựa trình tự giải mã hệ gen vi khuẩn E coli người ta biết chắn chúng khơng có sẵn gen tổng hợp flavonoid dẫn xuất Bởi vi khuẩn sử dụng làm vật chủ cung cấp ưu điểm khơng tạo flavonoid nội sinh, có sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, chu trình sống ngắn, tốc độ sinh trưởng cao đặc biệt người ta hiểu rõ chế trao đổi chất, kỹ thuật di truyền protein tái tổ hợp Do đó, có nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid E coli (Simkhada et al., 2010; Ren et al., 2012; Malla et al., 2013) Hợp chất rhamnetin, mô tả trên, thuộc loại flavonol methyl hóa lu vị trí C7 chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng ý Bởi vậy, an việc cải biến cấu trúc phân tử chất thơng qua chuyển hóa sinh học (gắn thêm n va nhóm đường, methyl hydroxyl) nhờ sử dụng enzyme xúc tác đặc hiệu giúp tn to tạo nhiều dẫn xuất cung cấp nguyên liệu cho thử nghiệm dược lý Quá trình chuyển hóa chất rhamnetin xảy vi khuẩn E coli tái tổ hợp gh ie mô tả hình 3.1 Cụ thể, vi khuẩn E coli tái tổ hợp nuôi điều kiện p đầy đủ chất dinh dưỡng, sinh trưởng tốt protein tái tổ hợp biểu nl w đầy đủ oa Enzyme glycosyltransferase tái tổ hợp sinh làm nhiệm vụ xúc d tác cho phản ứng gắn phân tử đường UDP-L-rhamnose vào chất nhận để tạo lu an sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside Chúng tiến hành sàng lọc ảnh u nf va hưởng môi trường, nồng độ IPTG nhiệt độ nuôi cấy phù hợp cho q trình chuyển hóa thu hàm lượng sản phẩm tối đa đạt 27,2 µM (12,6 mg/L) So ll oi m với nghiên cứu trước chúng tơi tổng hợp myricetin-rhamnoside (25,8 z at nh mg/L) (Thuan et al., 2013b), quercitrin (24 mg/L) afzelin (12,9 mg/L) (Simkhada et al., 2010), astilbin (22,23 mg/L) (Thuan et al., 2017), quercetin 3-O- z (N-acetyl) quinovosamin(158,8 mg/L),luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic gm @ acid (172,5 mg/L ) (Cho et al., 2016) sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside thấp đáng kể Kết so sánh cho bảng 4.4 Chúng tơi cho l có chệnh lệch kết lớn tính xúc tác đặc hiệu enzyme m co loại chất khác điều kiện tiến hành thí nghiệm Do an Lu đó, để tiếp tục cải tiến suất chúng tơi phải tiến hành số công việc gây tạo đột biến enzyme glycosyltransferase nhằm tăng n va ac th 39 si cường hoạt tính xúc tác tác động lên đường trao đổi chất để tăng sinh tổng hợp UDP-L-rhamnose Bảng 4.4 So sánh hiệu chuyển hóa số loại chất với rhamnetin lu an Cơ chất Quercetin Kaempferol Myricetin Taxifolin Quercetin gh tn to 24 (Simkhada et al., 2010) 12,9 (Simkhada et al., 2010) 25,8 (Thuan et al., 2013a) 22,23 (Thuan et al., 2017) 23,78 (Pandey et al., 2013) quercetin 3-O-(N-acetyl) quinovosamine 158,8 (Cho et al., 2016) luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic acid 172,5 (Cho et al., 2016) Afzelin Myricitrin Astilbin Quercetin-3-O-xyloside p Luteolin d oa nl w Tài liệu tham khảo Quercitrin Quercetin ie Hiệu suất tổng hợp (mg/L) Sản phẩm n va STT ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 40 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết bàn luận rút số kết luận sau: - Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa E coli tái tổ hợp có tính khả thi sản phẩm tạo thành kiểm tra phương pháp sắc ký mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-ESI-MS/MS) lu - Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới ni cấy chuyển hóa chất cho thấy số loại môi trường thử nghiệm TB, LB M9 mơi trường TB phù hợp cho sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside đạt 22,3 an n va µM; nồng độ IPTG = 0,8 nhiệt độ 32ºC thích hợp - Tiếp tục nghiên cứu nhằm tăng lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside rút ngắn thời gian chuyển hóa chất thành sản phẩm Tiến hành mở rộng phạm vi đánh giá ảnh hưởng, từ rút quy trình chuyển hóa đem lại hiệu p ie gh tn to 5.2 KIẾN NGHỊ w lớn d oa nl - Tiến hành nghiên cứu thăm dị, đánh giá hoạt tính sinh học rhamnetin ức chế khối u, ức chế enzyme kháng khuẩn nhằm chứng minh vai trò to lớn rhamnetin việc điều trị số bệnh người động vật Chứng minh khả ức chế khối u, mối quan tâm hàng đầu ll u nf va an lu sức khỏe người oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 41 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trường Đại học Thành Đô – Khoa Y Dược (2015) Dược liệu học; tập Sách lưu hành nội Tiếng Anh: Andreeva OA, Ivashev MN, Ozimina II, Maslikova G V (1998) Diosmetin glycosides from caucasian vetch: Isolation and study of biological activity Pharmaceutical Chemistry Journal 32 Pp 595–597 Brazier-Hicks M, Offen WA, Gershater MC, Revett TJ, Lim E-K, Bowles DJ, Davies GJ, Edwards R (2007) Characterization and engineering of the lu an bifunctional N- and O-glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolism in va plants Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States n of America 104 pp 20238–20143 Cho AR, Lee SJ, Kim BG, Ahn J-H (2016) Biosynthesis of three N- gh tn to acetylaminosugar-conjugated flavonoids using engineered Escherichia coli p ie Microbial Cell Factories 15:182 Dong C, Major LL, Srikannathasan V, Errey JC, Giraud M-F, Lam JS, w oa nl Graninger M, Messner P, McNeil MR, Field RA, Whitfield C, Naismith JH d (2007) RmlC, a C3’ and C5’ carbohydrate epimerase, appears to operate via an lu an intermediate with an unusual twist boat conformation Journal of molecular u nf va biology 365 pp 146–159 Ertekin T, Bozkurt O, Eroz R, Nisari M, Bircan D, Nisari M, Unur E (2016) May ll oi m argyrophilic nucleolar organizing region-associated protein synthesis be used for selecting the most reliable dose of drugs such as rhamnetin in cancer treatments? z at nh Bratislavske lekarske listy 117 pp 653–658 Griffith BR, Langenhan JM, Thorson JS (2005) “Sweetening” natural products via z gm @ glycorandomization Current opinion in biotechnology 16 pp 622–630 Igarashi K, Ohmuma M (1995) Effects of Isorhamnetin, Rhamnetin, and l Quercetin on the Concentrations of Cholesterol and Lipoperoxide in the Serum m co and Liver and on the Blood and Liver Antioxidative Enzyme Activities of Rats an Lu Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 59 pp.595–601 n va ac th 42 si Jia H, Yang Q, Wang T, Cao Y, Jiang Q, Ma H, Sun H, Hou M, Yang Y, Feng F (2016) Rhamnetin induces sensitization of hepatocellular carcinoma cells to a small molecular kinase inhibitor or chemotherapeutic agents Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1860 pp 1417–1430 10 Kang J, Kim E, Kim W, Seong KM, Youn H, Kim JW, Kim J, Youn B (2013) Rhamnetin and cirsiliol induce radiosensitization and inhibition of epithelialmesenchymal transition (EMT) by miR-34a-mediated suppression of Notch-1 expression in non-small cell lung cancer cell lines The Journal of biological chemistry 288 pp 27343–27357 11 Kim BG, Jung BR, Lee Y, Hur HG, Lim Y, Ahn JH (2006) Regiospecific lu Flavonoid 7-O-Methylation with Streptomyces avermitilis O-Methyltransferase an Expressed in Escherichia coli American Chemical Society pp 823–828 va 12 Kim B-G, Sung SH, Jung NR, Chong Y, Ahn J-H (2010) Biological synthesis n tn to of isorhamnetin 3-O-glucoside using engineered glucosyltransferase Journal of gh Molecular Catalysis B: Enzymatic 63 pp 194–199 Kosina P, Kren V, Gebhardt R, Grambal F, Ulrichová J, Walterová D (2002) p ie 13 Antioxidant properties of silybin glycosides Phytotherapy research : PTR 16 Kosina P, Maurel P, Ulrichová J, Dvořák Z (2005) Effect of silybin and its oa 14 nl w Suppl pp 33-39 d glycosides on the expression of cytochromes P450 1A2 and 3A4 in primary lu va an cultures of human hepatocytes Journal of Biochemical and Molecular Kr Kren V, Martínková L (2001) Glycosides in medicine: “The role of glycosidic ll 15 u nf Toxicology 19 pp 149–153 Lee KP, Kim J-E, Park W-H, Gautam N, Dhiman M, Mantha A, Kim B, Shin z at nh 16 oi m residue in biological activity” Current medicinal chemistry pp 1303–1328 H, Ikami K, Zhang J, Matoba S, Jin D, Takai S, Matsubara H, Matsuda N, z Yabe-Nishimura C (2015) Cytoprotective effect of rhamnetin on miconazole- @ Lee S, Shin SY, Lee Y, Park Y, Kim BG, Ahn J-H, Chong Y, Lee YH, Lim Y l 17 gm induced H9c2 cell damage Nutrition Research and Practice pp 586 m co (2011) Rhamnetin production based on the rational design of the poplar Omethyltransferase enzyme and its biological activities Bioorganic & medicinal an Lu chemistry letters 21 pp 3866 – 3870 n va ac th 43 si 18 Li X-C, Liu C, Yang L-X, Chen R-Y (2011) Phenolic compounds from the aqueous extract of Acacia catechu Journal of Asian Natural Products Research 13 pp 826–830 19 Lutz JA, Kulshrestha M, Rogers DT, Littleton JM (2014) A nicotinic receptormediated anti-inflammatory effect of the flavonoid rhamnetin in BV2 microglia Fitoterapia 98 pp 11–21 20 Ma Y, Pan F, McNeil M (2002) Formation of dTDP-rhamnose is essential for growth of mycobacteria Journal of bacteriology 184 pp 3392–3395 21 Malla S, Pandey RP, Kim B-G, Sohng JK (2013) Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli Biotechnology and bioengineering 110 pp 2525–2535 lu an 22 Marczak L, Kawiak A, Lojkowska E, Stobiecki M (2005) Secondary va metabolites in in vitro cultured plants of the genus Drosera Phytochemical n analysis : PCA 16: pp 143–149 Martinez V, Ingwers M, Smith J, Glushka J, Yang T, Bar-Peled M (2012) gh Biosynthesis of UDP-4-keto-6-deoxyglucose and UDP-rhamnose in pathogenic tn to 23 p ie fungi Magnaporthe grisea and Botryotinia fuckeliana The Journal of biological chemistry 28 :pp 879–92 w Novo Belchor M, Hessel Gaeta H, Fabri Bittencourt Rodrigues C, Ramos da Cruz oa nl 24 d Costa C, de Oliveira Toyama D, Domingues Passero L, Dalastra Laurenti M, an lu Hikari Toyama M (2017) Evaluation of Rhamnetin as an Inhibitor of the Oak C, Bhaskaran N, Gupta S, Shukla S (2014) Abstract 1232: u nf 25 va Pharmacological Effect of Secretory Phospholipase A2 Molecules 22 pp 1441 ll Antiproliferative, antioxidant and antiapoptotic effect of rhamnetin in human m oi prostate cancer cells Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 26 z at nh 2014; San Diego, CA Oak C, Bhaskaran N, Gupta S, Shukla S (2015) Abstract 1913 Rhamnetin z inhibits prostate cancer progression in an autochthonous mouse prostate cancer @ Offen W, Martinez-Fleites C, Yang M, Kiat-Lim E, Davis BG, Tarling CA, l 27 gm model Proceedings: AACR 106th Annual Meeting 2015 m co Ford CM, Bowles DJ, Davies GJ (2006) Structure of a flavonoid glucosyltransferase reveals the basis for plant natural product modification The an Lu EMBO journal 25 pp 1396–405 n va ac th 44 si 28 Oyama K, Kondo T (2004) Total synthesis of apigenin 7,4′-di-O-βglucopyranoside, a component of blue flower pigment of Salvia patens, and seven chiral analogues Tetrahedron 60 pp 2025–2034 29 Pandey RP, Malla S, Simkhada D, Kim B-G, Sohng JK (2013) Production of 3O-xylosyl quercetin in Escherichia coli Applied microbiology and biotechnology 97 pp 1889–901 30 Pandey RP, Parajuli P, Koffas MAG, Sohng JK (2016) Microbial production of natural and non-natural flavonoids: Pathway engineering, directed evolution and systems/synthetic biology Biotechnology Advances 34 pp 634–662 lu 31 Preiss J (2010) Comprehensive Natural Products II Elsevier 32 Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang L, Wang PG (2012) Synthesis of an va flavonol 3-O-glycoside by UGT78D1 Glycoconjugate journal 29 pp 425–32 n 33 Simkhada D, Lee HC, Sohng JK (2010) Genetic engineering approach for the to tn production of rhamnosyl and allosyl flavonoids from Escherichia coli 34 Simkhada D, Lee HC, Sohng JK (2010) Genetic engineering approach for the p ie gh Biotechnology and bioengineering 107 pp 154–62 production of rhamnosyl and allosyl flavonoids from Escherichia coli w Sung SH, Kim B-G, Ahn J-H (2011a) Optimization of rhamnetin production in d 35 oa nl Biotechnology and bioengineering 107 pp 154–62 lu Sung SH, Kim BG, Ahn JH (2011b) Optimization of rhamnetin production in u nf va 36 an Escherichia coli Journal of microbiology and biotechnology 21 pp 854–857 Escherichia coli Journal of Microbiology and Biotechnology 21: pp 854–857 ll Thuan NH, Malla S, Trung NT, Dhakal D, Pokhrel AR, Chu LL, Sohng JK oi m 37 z at nh (2017) Microbial production of astilbin, a bioactive rhamnosylated flavanonol, from taxifolin World Journal of Microbiology and Biotechnology pp 33-36 Thuan NH, Malla S, Trung NT, Dhakal D, Pokhrel AR, Chu LL, Sohng JK z 38 gm @ (2017) Microbial production of astilbin, a bioactive rhamnosylated flavanonol, from taxifolin World Journal of Microbiology and Biotechnology pp 33-36 l Thuan NH, Pandey RP, Thuy TTT, Park JW, Sohng JK (2013a) Improvement m co 39 of regio-specific production of myricetin-3-O-L- rhamnoside in engineered an Lu Escherichia coli Applied Biochemistry and Biotechnology 171 pp 1956–1967 n va ac th 45 si 40 Thuan NH, Park JW, Sohng JK (2013b) Toward the production of flavone-7-Oβ-d-glucopyranosides using Arabidopsis glycosyltransferase in Escherichia coli Process Biochemistry 48:1744–1748 doi: 10.1016/j.procbio.2013.07.005 41 Thuan NH, Park JW, Sohng JK (2013b) Toward the production of flavone-7O-β-d-glucopyranosides using Arabidopsis glycosyltransferase in Escherichia coli Process Biochemistry 48 pp 1744–1748 42 Thuan NH, Sohng JK (2013) Recent biotechnological progress in enzymatic synthesis of glycosides Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 40 pp 1329–1356 43 Vosgen B, Herrmann K (1980) Flavonol glycosides of pepper (Piper lu nigrum), clove (Syzygium aromaticum) and allspice (Pimenta dioica) an Phenolics of spices Zeitschrift fur Lebensmittel- Untersuchung und – va Forschung Vol 170 pp 204–207 n Wang J, Zhou R-G, Wu T, Yang T, Qin Q-X, Li L, Yang B, Yang J (2012) Total tn to 44 gh synthesis of apigenin Journal of Chemical Research Vol 36 pp 121–122 Watt G, Leoff C, Harper AD, Bar-Peled M (2004) A Bifunctional 3,5- p ie 45 Reductase Epimerase/4-Keto for Nucleotide-Rhamnose Synthesis in nl w Arabidopsis PLANT PHYSIOLOGY 134 pp 1337–1346 Williams CA, Harborne JB (1993) The Flavonoids Harborn Press pp 337-385 47 Zhang C, Griffith B.R , Fu, Q., Albermann C, Fu X, Lee I K, Li L, Thorson J S d oa 46 lu va an (2006) Exploiting the reversibility of natural product glycosyltransferaseZhang Wei, Li Ben, Guo Yan, Bai Y, Wang T, Fu Kun, Sun G (2015) ll 48 u nf catalyzed reactions Science 313 pp 1291–1294 oi m Rhamnetin attenuates cognitive deficit and inhibits hippocampal inflammatory z at nh response and oxidative stress in rats with traumatic brain injury Central European Journal of Immunology 40 pp 35–41 m co l gm https://en.wikipedia.org/wiki/Flavonols @ 49 z Nguồn Internet: an Lu n va ac th 46 si