(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin 3 0 rhamnoside ở vi khuẩn escherichia coli cải biến di truyền

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE Ở VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Thuần TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Thuần (hướng dẫn khoa học 1) TS Nguyễn Xuân Cảnh (hướng dẫn khoa học 2), người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô kỹ thuật viên Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm TS Nguyễn Minh Hùng, TS Nguyễn Thành Trung, TS Nguyễn Thị Hà, TS Lê Thành Đô, TS Hồ Viết Hiếu, TS Trần Thị Thanh Thỏa cử nhân Đặng Thị Kim Mai tạo điều kiện cho sử dụng trang thiết bị để tiến hành thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn tới bạn Võ Trần Khánh Huyền - học viên cao học Trung tâm Sinh học Phân tử, em Nguyễn Hồng Phong, sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân, tham gia trao đổi với tơi vấn đề thực hành thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập thể cán bộ, công nhân viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu Nhân dịp này, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, người tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Phạm Thị Uyên ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình, hiểu đồ vii Thesis abstract ix Phần Mởđầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học đề tài nghiên cứu 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài nghiên cứu Phần 2.Tổng quan tài liệu 2.1 Khái quát flavonoid 2.2 Giới thiệu rhamnetin số dẫn xuất rhamnetin glycoside thường gặp 2.3 Con đường sinh tổng hợp rhamnetin dẫn xuất rhamnetin-3-o-rhamnoside thực vật 2.4 Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp rhamnetin dẫn xuất rhamnetin glycoside 2.4.1 Vai trò enzyme 2.4.2 Một số phương pháp tổng hợp rhamnetin 13 2.5 Các hoạt tính sinh học rhamnetin 16 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.1.3 Nguyên vật liệu 18 3.1.4 Phương pháp nghiên cứu 20 iii download by : skknchat@gmail.com 3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 25 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 25 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 28 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 29 Phần Kết thảo luận 30 4.1 Kết thí nghiệm tổng hợp phát rhamnetin-3-o-rhamnoside 30 4.1.1 Kết nghiên cứu bổ sung chất rhamnetin tách chiết thu sản phẩm 30 4.1.2 Phân tích kết chuyển hóa sắc ký mỏng 30 4.1.3 Phân tích kết chuyển hóa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (hplc) 31 4.1.4 Phân tích kết chuyển hóa phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 4.2 Đánh giá bàn luận ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 33 4.2.1 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 33 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 35 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside 36 Phần Kết luận kiến nghị 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 Tài liệu tham khảo 42 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CC 4-coumaroyl-CoA 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase C4H Cinnamic 4-hydroxylase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate TLC Thin layer chromatography UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại số lớp flavonoid thường gặp thực vật Bảng 2.1 Một số hoạt tính sinh học rhamnetin 16 Bảng 3.1 Thành phần môi trường TB 25 Bảng 3.2 Thành phần môi trường LB 26 Bảng 3.3 Thành phần dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9 26 Bảng 3.4 Thành phần môi trường M9 27 Bảng 4.1 Kết đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside môi trường nuôi cấy khác 34 Bảng 4.2 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside nồng độ IPTG khác 35 Bảng 4.3 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside mức nhiệt độ khác 37 Bảng 4.4 So sánh hiệu chuyển hóa số loại chất với rhamnetin 40 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH, HIỂU ĐỒ Hình 2.1 Phân loại flavonoid dựa vào gốc aryl (vòng B) Hình 2.2 Các cấu trúc khung số nhóm flavonoid thường gặp Hình 2.3 Phân bố rhamnetin số loài thực vật Hình 2.4 Rhamnetin số dẫn xuất chúng Hình 2.5 Tổng hợp rhamnetin glycoside thực vật Hình 2.6 Cơ chế phản ứng enzyme glycosyltransferases, (A) 10 Hình 2.7 Sản xuất rhamnetin từ quercetin thông qua enzyme POMT7 15 Hình 3.1 Sơ đồ hệ thống E coli tái tổ hợp 19 Hình 3.2 Sơ đồ chuyển hóa tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside 20 Hình 4.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside 28 Hình 4.4 Sản phẩm sau tinh đông khô 30 Hình 4.5 Sắc ký đồ phân tích vị trí chất rhamnetin rhamnetin glycoside 31 Hình 4.6 Phân tích định tính tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside 32 Hình 4.7 Phân tích LC-ESI-MS/MS chế độ negative mode 32 Hình 4.8 Sơ đồ phân mảnh MS/MS rhamnetin rhamnoside 33 Biểu đồ 4.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3O-rhamnoside 34 Biểu đồ 4.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin3-O-rhamnoside 36 Biểu đồ 4.3 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside 37 vii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Uyên Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin-3-O-rhamnoside vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền” Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside vi khuẩn E coli cải biến di truyền đánh giá ảnh hưởng số điều kiện ni cấy để tối ưu hóa sản xuất hợp chất Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi cấy vi khuẩn E coli đĩa thạch ống nghiệm có sử dụng kháng sinh với nồng độ phù hợp Tách chiết hoạt chất rhamnetin glycoside phương pháp chiết pha lỏng-pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi Đông khô mẫu máy sấy thăng hoa Định tính định lượng phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS Kết kết luận Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa E coli tái tổ hợp có tính khả thi sản phẩm tạo thành kiểm tra phương pháp TLC, HPLC, LC-ESI-MS/MS Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới ni cấy chuyển hóa chất chủng loại môi trường, nồng độ IPTG nhiệt độ thu sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside cao đạt 12.6 mg/L Tìm hiểu, đánh giá tầm quan trọng sản phẩm flavonoid glycoside nói chung rhamnetin nói riêng lĩnh vực y dược, mỹ phẩm, v.v xây dựng sở cho nghiên cứu phục vụ nhu cầu thực tiễn tạo sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có giá trị cao đời sống viii download by : skknchat@gmail.com THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Uyen Thesis title: “Study on the biosynthesis of the bioactive rhamnetin-3-O-rhamnoside in genetically modified Escherichia coli” Major: Biotechnology Code: 60 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Investigation the biosynthesis of rhamnnetin-3-O-rhamnoside using genetically engineered E coli by supplementation of methylated flavonol, rhamnetin, and evaluating the effect of culture conditions (medium, IPTG concentration and temperature) to improve the production of target compounds Materials and Methods: Recombinant E coli was cultured in broth medium using antibiotics (streptomycin, kanamycin and chloramphenicol) at appropriate concentrations Rhamnetin was supplemented into culture broth as substrate and the culture was mainted to proceed whole cell bioconversion to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside Extraction of rhamnetin glycoside was carried out by liquid-liquid extraction using ethylacetate as solvent Crude extract was obtained by the vacuum rotary drier The formation of product was confirmed by chromatographical methods such as TLC, HPLC, LC-ESI-MS / MS Culture conditions such as type of medium, IPTG concentration and temperature those effect to bacterial growth were screened to improve yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside Main findings and conclusions The recombinant E coli was proved to produce rhamnetin-3-O-rhamnoside by TLC, HPLC and LC-ESI-MS/MS data Effect of culture medium, IPTG and temperature was investigated and resulted in TB, 0.8 mM IPTG and 32ºC are the best parameters to enhance the production The highest yield of rhamnetin-3-O-rhamnoside was 12.6 mg/L Understanding and evaluating the importance of flavonoid glycoside as well as and rhamnetin in particular in the fields of medicine, cosmetics, etc ix download by : skknchat@gmail.com số tài liệu khác phân tích phổ khối lượng phân tử chất tương tự, nhận định tạo rhamnetin-rhamnoside thí nghiệm chuyển hóa Như thơng qua phương pháp sắc ký, xác định xác sản phẩm tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside Hình 4.3 Phân tích định tính tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (Trong đó: (A): phổ sắc ký lỏng sản phẩm; (B): Các phân mảnh sản phẩm bị phá vỡ bao gồm 314,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside]) 299,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside-CH3]).) Hình 4.4 Phân tích LC-ESI-MS/MS chế độ negative mode 32 download by : skknchat@gmail.com OH OH OH H3CO OH O H3CO O OH OH O O O OH O M = 314.10 HO OH OH CH3 M= 462.40 Rhamnose OH OH OH OH - O H3CO O O OOH O O- CH3 OH M = 299.10 O M = 315.10 Hình 4.5 Sơ đồ phân mảnh MS/MS rhamnetin rhamnoside 4.2 ĐÁNH GIÁ VÀ BÀN LUẬN ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỚI HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN-3-ORHAMNOSIDE 4.2.1 Ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng, sinh lý vi khuẩn Có loại mơi trường thường sử dụng nuôi cấy vi khuẩn E coli LB, TB M9 Mỗi loại mơi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau, LB, TB mơi trường tổng hợp có thành phần dinh dưỡng phức tạp chứa cao nấm men, tryptone, M9 mơi trường có thành phần xác định Chúng sử dụng loại môi trường cho thí nghiệm chuyển hóa điều kiện: 220 vịng/phút, 32oC, 0,8 mM IPTG Nồng độ chất 30 µM thời gian ni chuyển hóa 24 sau bổ sung IPTG Kết đo lặp lại ba lần thí nghiệm cho bảng 4.1 33 download by : skknchat@gmail.com Từ kết thể biểu đồ 4.1, ta thấy môi trường TB (terrific broth) có hàm lượng cao nấm men cao thích hợp cho sinh trưởng vi khuẩn, biểu protein ngoại lai nên cho sản lượng sản phẩm thu tốt đạt 22,3 µM (10,3 mg/L) Trong đó, mơi trường LB M9 +2% glucose cho suất đạt 15,4 17,5 µM Từ kết cho thấy lượng sản phẩm thu từ nuôi cấy môi trường TB cao gấp 1,4 lần so với môi trường LB gấp 1,2 lần so với mơi trường M9, hiệu suất chuyển hóa đạt 74% Bảng 4.1 Kết đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside môi trường nuôi cấy khác Số lần đo LB TB M9+2% glucose Lần (µM) 16,4 24,5 16,5 Lần (µM) 14,3 21,3 19,2 Lần (µM) 15,5 21,1 16,8 Giá trị trung bình (µM) 15,4 22.3 17,5 Độ lệch chuẩn 0,86 1,56 1,21 Hiệu suất chuyển hóa (%) 51,3 74,3 58,3 Biểu đồ 4.1 Đánh giá ảnh hưởng môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside 34 download by : skknchat@gmail.com Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đồng độ IPTG trình bày sau phần lý giải cho chênh lệch hiệu suất chuyển hóa hai nghiên cứu 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside IPTG chất kích thích biểu protein dị dịng (heterologous expression) thường sử dụng rộng rãi nghiên cứu biểu protein Chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp dùng thí nghiệm mang nhiều gen có nguồn gốc ngoại lai gen tham gia tổng hợp đường UDP-L-rhamnose, đặc biệt gen chuyển hóa nhóm đường tới chất nhận, rhamnosyltransferase (ArGT3) Bởi vậy, nồng độ IPTG khác sử dụng nhằm đánh giá mức độ chuyển hóa chất rhamnetin Chúng tơi sử dụng mức nồng độ IPTG cuối khác bao gồm: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mM Điều kiện nuôi cấy bao gồm môi trường TB, 220 vòng/phút, nhiệt độ 32oC Nồng độ rhamnetin đưa vào 30 µM Kết đo thí nghiệm lặp lại ba lần cho bảng 4.2 Kết thể hình sau: Bảng 4.2 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside nồng độ IPTG khác Số lần đo mM 0,2 mM 0,4 mM 0,6 mM 0,8 mM mM Lần (µM) 6,8 11,3 14,5 16,5 26,3 22,0 Lần (µM) 7,9 10,1 13,2 14,2 24,5 21,3 Lần (µM) 7,8 10,1 12,8 16,4 25,7 24,2 Giá trị trung bình 7,5 10,5 13,5 15,7 25,5 22.5 0,50 0,57 0,73 1,06 0,75 1,24 25 35 45 52 85 75 (µM) Độ lệch chuẩn Hiệu suất chuyển hóa (%) 35 download by : skknchat@gmail.com Biểu đồ 4.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside Từ đồ thị biểu diễn kết ta thấy tăng hàm lượng IPTG hàm lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside tăng dần từ mức thấp 7,5 (không bổ sung IPTG) cực đại 25,5 µM (11,8 mg/L) ứng với hàm lượng IPTG = 0,8 mM Tuy nhiên, tăng hàm lượng IPTG đến mM hàm lượng sản phẩm khơng tăng mà có xu hướng giảm chút ít, đạt 22,5 µM Lý giải điều này, cho ngưỡng IPTG = 0,8 mM thích hợp tối ưu cho biểu protein ngoại lai vi khuẩn tái tổ hợp E coli ArGT3 chúng hoạt động xúc tác tối ưu cho chuyển hóa chất 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-Orhamnoside Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới q trình sinh lý, sinh hóa vi khuẩn ảnh hưởng trực tiếp tới khả sinh trưởng, phát triển hoạt tính enzyme tái tổ hợp Chúng tơi, đó, thiết lập điều kiện ni cấy bao gồm: mơi trường TB, 220 vịng/phút, vi khuẩn ni 37oC vòng 3-4h để đạt tới ngưỡng phát triển có OD600= 0,6 bổ sung IPTG nồng độ mM Sau chúng ni chế độ nuôi cấy khác bao gồm 25, 27, 32 37oC thời gian 3-7h Thời gian nuôi cấy nhằm kích thích sinh 36 download by : skknchat@gmail.com trưởng vi khuẩn biểu protein, thời gian dài ngắn tùy thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy Khi mật độ vi khuẩn đạt ngưỡng OD = 1,3 chúng tơi bổ sung chất 30µM rhamnetin Nhiệt độ ni cấy trì ổn định, thời gian nuôi cấy kéo dài 24h Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến chuyển hóa chất thể thông qua biểu đồ đây: Bảng 4.3 Kết đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside mức nhiệt độ khác Số lần đo 25ºC 27ºC 32ºC 37ºC Lần (µM) 13,5 15,6 28,5 24,3 Lần (µM) 11,8 17,5 25,6 23,1 Lần (µM) 12,2 14,3 27,5 23,1 Giá trị trung bình (µM) 12,5 15,8 27,2 23,5 Độ lệch chuẩn 0,73 1,31 1,20 0,57 42 53 90 78 Hiệu suất chuyển hóa (%) Từ bảng kết đo ảnh hưởng mức nhiệt độ khác ta có biểu đồ sau (biểu đồ 4.3) Biểu đồ 4.3 Đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside 37 download by : skknchat@gmail.com Từ biểu đồ chuyển hóa nhận thấy tăng nhiệt độ ni cấy hàm lượng sản phẩm thu tăng dần từ mức 12,5 µM (25ºC) đạt ngưỡng cực đại 27,2 µM (32ºC) sau giảm dần tới 23,5 µM 37ºC Bàn luận: Trước kia, người ta thường sử dụng phương pháp tách chiết, tinh xác định cấu trúc hợp chất glycoside từ thực vật xạ khuẩn (Vosgen et al., 1980; Andreeva et al., 1998; Preiss et al., 2010) Sau tiến hành thí nghiệm vi sinh, hóa sinh, dược lý để tìm hiểu, sàng lọc đặc tính dược học mong muốn Cuối người ta tiến hành tách chiết quy mô lớn để thu lượng lớn sản phẩm phục vụ nhu cầu thực tiễn Khi cơng nghệ hóa học hữu phát triển, phương pháp bán tổng hợp áp dụng phổ biến để sản xuất glycoside Tuy nhiên phương pháp tương đối đắt đỏ, tốn thời gian có thành phần hóa chất thải gây độc cho mơi trường, người (Oyama et al., 2004; Wang et al., 2012) Vì câu hỏi đặt làm để thu lượng lớn flavonoid để phục vụ nhu cầu thương mại vừa đảm bảo tính tự nhiên, giảm thiểu chi phí khơng gây hại tới mơi trường người Phương pháp sử dụng vi khuẩn tái tổ hợp nhằm tổng hợp glycoside phương pháp ứng dụng thành tựu kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp kết hợp với cải biến trao đổi chất để tạo hệ thống tổng hợp theo thiết kế in vitro in vivo có tính đặc hiệu cao, suất tốt, tiết kiệm thời gian giảm chi phí vận hành (Thuan et al., 2013) Trong nghiên cứu trước đây, thiết kế vi khuẩn E coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp đường hoạt hóa gen mã hóa cho enzyme glycosyltransferase Glycosyltransferase (GT) enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm phân tử đường sang phân tử chất nhận để tạo sản phẩm đường hóa Cho tới nay, người ta biết cấu trúc mối liên hệ hoạt tính cấu trúc nhiều loại GT Thực nghiệm cho thấy hầu hết enzyme có trình tự đặc trưng nằm đầu C (C-terminal) gọi hộp PSPG (plant secondary product glycosyltransferase) bao gồm 44 amino acid có chứa túi gắn phân tử đường (Offen et al., 2006; Brazier-Hicks et al., 2007) Sau đó, số loại flavonoid myricetin, apigenin baicalein sử dụng làm chất cho q trình cải biến sinh học thơng qua phản ứng in-vivo nhằm thu nhận sản phẩm tương ứng (flavonoid glycoside) (Thuan et al., 2013a; Thuan et al., 2013b) 38 download by : skknchat@gmail.com Flavonoid sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đặc trưng thực vật bậc cao Cho tới nay, dựa trình tự giải mã hệ gen vi khuẩn E coli người ta biết chắn chúng khơng có sẵn gen tổng hợp flavonoid dẫn xuất Bởi vi khuẩn sử dụng làm vật chủ cung cấp ưu điểm khơng tạo flavonoid nội sinh, có sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, chu trình sống ngắn, tốc độ sinh trưởng cao đặc biệt người ta hiểu rõ chế trao đổi chất, kỹ thuật di truyền protein tái tổ hợp Do đó, có nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid E coli (Simkhada et al., 2010; Ren et al., 2012; Malla et al., 2013) Hợp chất rhamnetin, mô tả trên, thuộc loại flavonol methyl hóa vị trí C7 chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng ý Bởi vậy, việc cải biến cấu trúc phân tử chất thơng qua chuyển hóa sinh học (gắn thêm nhóm đường, methyl hydroxyl) nhờ sử dụng enzyme xúc tác đặc hiệu giúp tạo nhiều dẫn xuất cung cấp nguyên liệu cho thử nghiệm dược lý Q trình chuyển hóa chất rhamnetin xảy vi khuẩn E coli tái tổ hợp mơ tả hình 3.1 Cụ thể, vi khuẩn E coli tái tổ hợp nuôi điều kiện đầy đủ chất dinh dưỡng, sinh trưởng tốt protein tái tổ hợp biểu đầy đủ Enzyme glycosyltransferase tái tổ hợp sinh làm nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng gắn phân tử đường UDP-L-rhamnose vào chất nhận để tạo sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside Chúng tiến hành sàng lọc ảnh hưởng môi trường, nồng độ IPTG nhiệt độ ni cấy phù hợp cho q trình chuyển hóa thu hàm lượng sản phẩm tối đa đạt 27,2 µM (12,6 mg/L) So với nghiên cứu trước tổng hợp myricetin-rhamnoside (25,8 mg/L) (Thuan et al., 2013b), quercitrin (24 mg/L) afzelin (12,9 mg/L) (Simkhada et al., 2010), astilbin (22,23 mg/L) (Thuan et al., 2017), quercetin 3-O(N-acetyl) quinovosamin(158,8 mg/L),luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic acid (172,5 mg/L ) (Cho et al., 2016) sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside thấp đáng kể Kết so sánh cho bảng 4.4 Chúng tơi cho có chệnh lệch kết lớn tính xúc tác đặc hiệu enzyme loại chất khác điều kiện tiến hành thí nghiệm Do đó, để tiếp tục cải tiến suất chúng tơi phải tiến hành số công việc gây tạo đột biến enzyme glycosyltransferase nhằm tăng 39 download by : skknchat@gmail.com cường hoạt tính xúc tác tác động lên đường trao đổi chất để tăng sinh tổng hợp UDP-L-rhamnose Bảng 4.4 So sánh hiệu chuyển hóa số loại chất với rhamnetin STT Cơ chất Quercetin Kaempferol Myricetin Taxifolin Quercetin Quercetin Luteolin Hiệu suất tổng hợp (mg/L) Tài liệu tham khảo 24 (Simkhada et al., 2010) 12,9 (Simkhada et al., 2010) 25,8 (Thuan et al., 2013a) 22,23 (Thuan et al., 2017) 23,78 (Pandey et al., 2013) quercetin 3-O-(N-acetyl) quinovosamine 158,8 (Cho et al., 2016) luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic acid 172,5 (Cho et al., 2016) Sản phẩm Quercitrin Afzelin Myricitrin Astilbin Quercetin-3-O-xyloside 40 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết bàn luận rút số kết luận sau: - Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa E coli tái tổ hợp có tính khả thi sản phẩm tạo thành kiểm tra phương pháp sắc ký mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-ESI-MS/MS) - Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới ni cấy chuyển hóa chất cho thấy số loại môi trường thử nghiệm TB, LB M9 mơi trường TB phù hợp cho sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside đạt 22,3 µM; nồng độ IPTG = 0,8 nhiệt độ 32ºC thích hợp 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu nhằm tăng lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside rút ngắn thời gian chuyển hóa chất thành sản phẩm Tiến hành mở rộng phạm vi đánh giá ảnh hưởng, từ rút quy trình chuyển hóa đem lại hiệu lớn - Tiến hành nghiên cứu thăm dò, đánh giá hoạt tính sinh học rhamnetin ức chế khối u, ức chế enzyme kháng khuẩn nhằm chứng minh vai trò to lớn rhamnetin việc điều trị số bệnh người động vật Chứng minh khả ức chế khối u, mối quan tâm hàng đầu sức khỏe người 41 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trường Đại học Thành Đô – Khoa Y Dược (2015) Dược liệu học; tập Sách lưu hành nội Tiếng Anh: Andreeva OA, Ivashev MN, Ozimina II, Maslikova G V (1998) Diosmetin glycosides from caucasian vetch: Isolation and study of biological activity Pharmaceutical Chemistry Journal 32 Pp 595–597 Brazier-Hicks M, Offen WA, Gershater MC, Revett TJ, Lim E-K, Bowles DJ, Davies GJ, Edwards R (2007) Characterization and engineering of the bifunctional N- and O-glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolism in plants Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104 pp 20238–20143 Cho AR, Lee SJ, Kim BG, Ahn J-H (2016) Biosynthesis of three Nacetylaminosugar-conjugated flavonoids using engineered Escherichia coli Microbial Cell Factories 15:182 Dong C, Major LL, Srikannathasan V, Errey JC, Giraud M-F, Lam JS, Graninger M, Messner P, McNeil MR, Field RA, Whitfield C, Naismith JH (2007) RmlC, a C3’ and C5’ carbohydrate epimerase, appears to operate via an intermediate with an unusual twist boat conformation Journal of molecular biology 365 pp 146–159 Ertekin T, Bozkurt O, Eroz R, Nisari M, Bircan D, Nisari M, Unur E (2016) May argyrophilic nucleolar organizing region-associated protein synthesis be used for selecting the most reliable dose of drugs such as rhamnetin in cancer treatments? Bratislavske lekarske listy 117 pp 653–658 Griffith BR, Langenhan JM, Thorson JS (2005) “Sweetening” natural products via glycorandomization Current opinion in biotechnology 16 pp 622–630 Igarashi K, Ohmuma M (1995) Effects of Isorhamnetin, Rhamnetin, and Quercetin on the Concentrations of Cholesterol and Lipoperoxide in the Serum and Liver and on the Blood and Liver Antioxidative Enzyme Activities of Rats Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 59 pp.595–601 42 download by : skknchat@gmail.com Jia H, Yang Q, Wang T, Cao Y, Jiang Q, Ma H, Sun H, Hou M, Yang Y, Feng F (2016) Rhamnetin induces sensitization of hepatocellular carcinoma cells to a small molecular kinase inhibitor or chemotherapeutic agents Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1860 pp 1417–1430 10 Kang J, Kim E, Kim W, Seong KM, Youn H, Kim JW, Kim J, Youn B (2013) Rhamnetin and cirsiliol induce radiosensitization and inhibition of epithelialmesenchymal transition (EMT) by miR-34a-mediated suppression of Notch-1 expression in non-small cell lung cancer cell lines The Journal of biological chemistry 288 pp 27343–27357 11 Kim BG, Jung BR, Lee Y, Hur HG, Lim Y, Ahn JH (2006) Regiospecific Flavonoid 7-O-Methylation with Streptomyces avermitilis O-Methyltransferase Expressed in Escherichia coli American Chemical Society pp 823–828 12 Kim B-G, Sung SH, Jung NR, Chong Y, Ahn J-H (2010) Biological synthesis of isorhamnetin 3-O-glucoside using engineered glucosyltransferase Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 63 pp 194–199 13 Kosina P, Kren V, Gebhardt R, Grambal F, Ulrichová J, Walterová D (2002) Antioxidant properties of silybin glycosides Phytotherapy research : PTR 16 Suppl pp 33-39 14 Kosina P, Maurel P, Ulrichová J, Dvořák Z (2005) Effect of silybin and its glycosides on the expression of cytochromes P450 1A2 and 3A4 in primary cultures of human hepatocytes Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 19 pp 149–153 15 Kr Kren V, Martínková L (2001) Glycosides in medicine: “The role of glycosidic residue in biological activity” Current medicinal chemistry pp 1303–1328 16 Lee KP, Kim J-E, Park W-H, Gautam N, Dhiman M, Mantha A, Kim B, Shin H, Ikami K, Zhang J, Matoba S, Jin D, Takai S, Matsubara H, Matsuda N, Yabe-Nishimura C (2015) Cytoprotective effect of rhamnetin on miconazoleinduced H9c2 cell damage Nutrition Research and Practice pp 586 17 Lee S, Shin SY, Lee Y, Park Y, Kim BG, Ahn J-H, Chong Y, Lee YH, Lim Y (2011) Rhamnetin production based on the rational design of the poplar Omethyltransferase enzyme and its biological activities Bioorganic & medicinal chemistry letters 21 pp 3866 – 3870 43 download by : skknchat@gmail.com 18 Li X-C, Liu C, Yang L-X, Chen R-Y (2011) Phenolic compounds from the aqueous extract of Acacia catechu Journal of Asian Natural Products Research 13 pp 826–830 19 Lutz JA, Kulshrestha M, Rogers DT, Littleton JM (2014) A nicotinic receptormediated anti-inflammatory effect of the flavonoid rhamnetin in BV2 microglia Fitoterapia 98 pp 11–21 20 Ma Y, Pan F, McNeil M (2002) Formation of dTDP-rhamnose is essential for growth of mycobacteria Journal of bacteriology 184 pp 3392–3395 21 Malla S, Pandey RP, Kim B-G, Sohng JK (2013) Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli Biotechnology and bioengineering 110 pp 2525–2535 22 Marczak L, Kawiak A, Lojkowska E, Stobiecki M (2005) Secondary metabolites in in vitro cultured plants of the genus Drosera Phytochemical analysis : PCA 16: pp 143–149 23 Martinez V, Ingwers M, Smith J, Glushka J, Yang T, Bar-Peled M (2012) Biosynthesis of UDP-4-keto-6-deoxyglucose and UDP-rhamnose in pathogenic fungi Magnaporthe grisea and Botryotinia fuckeliana The Journal of biological chemistry 28 :pp 879–92 24 Novo Belchor M, Hessel Gaeta H, Fabri Bittencourt Rodrigues C, Ramos da Cruz Costa C, de Oliveira Toyama D, Domingues Passero L, Dalastra Laurenti M, Hikari Toyama M (2017) Evaluation of Rhamnetin as an Inhibitor of the Pharmacological Effect of Secretory Phospholipase A2 Molecules 22 pp 1441 25 Oak C, Bhaskaran N, Gupta S, Shukla S (2014) Abstract 1232: Antiproliferative, antioxidant and antiapoptotic effect of rhamnetin in human prostate cancer cells Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 2014; San Diego, CA 26 Oak C, Bhaskaran N, Gupta S, Shukla S (2015) Abstract 1913 Rhamnetin inhibits prostate cancer progression in an autochthonous mouse prostate cancer model Proceedings: AACR 106th Annual Meeting 2015 27 Offen W, Martinez-Fleites C, Yang M, Kiat-Lim E, Davis BG, Tarling CA, Ford CM, Bowles DJ, Davies GJ (2006) Structure of a flavonoid glucosyltransferase reveals the basis for plant natural product modification The EMBO journal 25 pp 1396–405 44 download by : skknchat@gmail.com 28 Oyama K, Kondo T (2004) Total synthesis of apigenin 7,4′-di-O-βglucopyranoside, a component of blue flower pigment of Salvia patens, and seven chiral analogues Tetrahedron 60 pp 2025–2034 29 Pandey RP, Malla S, Simkhada D, Kim B-G, Sohng JK (2013) Production of 3O-xylosyl quercetin in Escherichia coli Applied microbiology and biotechnology 97 pp 1889–901 30 Pandey RP, Parajuli P, Koffas MAG, Sohng JK (2016) Microbial production of natural and non-natural flavonoids: Pathway engineering, directed evolution and systems/synthetic biology Biotechnology Advances 34 pp 634–662 31 Preiss J (2010) Comprehensive Natural Products II Elsevier 32 Ren G, Hou J, Fang Q, Sun H, Liu X, Zhang L, Wang PG (2012) Synthesis of flavonol 3-O-glycoside by UGT78D1 Glycoconjugate journal 29 pp 425–32 33 Simkhada D, Lee HC, Sohng JK (2010) Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyl flavonoids from Escherichia coli Biotechnology and bioengineering 107 pp 154–62 34 Simkhada D, Lee HC, Sohng JK (2010) Genetic engineering approach for the production of rhamnosyl and allosyl flavonoids from Escherichia coli Biotechnology and bioengineering 107 pp 154–62 35 Sung SH, Kim B-G, Ahn J-H (2011a) Optimization of rhamnetin production in Escherichia coli Journal of microbiology and biotechnology 21 pp 854–857 36 Sung SH, Kim BG, Ahn JH (2011b) Optimization of rhamnetin production in Escherichia coli Journal of Microbiology and Biotechnology 21: pp 854–857 37 Thuan NH, Malla S, Trung NT, Dhakal D, Pokhrel AR, Chu LL, Sohng JK (2017) Microbial production of astilbin, a bioactive rhamnosylated flavanonol, from taxifolin World Journal of Microbiology and Biotechnology pp 33-36 38 Thuan NH, Malla S, Trung NT, Dhakal D, Pokhrel AR, Chu LL, Sohng JK (2017) Microbial production of astilbin, a bioactive rhamnosylated flavanonol, from taxifolin World Journal of Microbiology and Biotechnology pp 33-36 39 Thuan NH, Pandey RP, Thuy TTT, Park JW, Sohng JK (2013a) Improvement of regio-specific production of myricetin-3-O-L- rhamnoside in engineered Escherichia coli Applied Biochemistry and Biotechnology 171 pp 1956–1967 45 download by : skknchat@gmail.com 40 Thuan NH, Park JW, Sohng JK (2013b) Toward the production of flavone-7-Oβ-d-glucopyranosides using Arabidopsis glycosyltransferase in Escherichia coli Process Biochemistry 48:1744–1748 doi: 10.1016/j.procbio.2013.07.005 41 Thuan NH, Park JW, Sohng JK (2013b) Toward the production of flavone-7O-β-d-glucopyranosides using Arabidopsis glycosyltransferase in Escherichia coli Process Biochemistry 48 pp 1744–1748 42 Thuan NH, Sohng JK (2013) Recent biotechnological progress in enzymatic synthesis of glycosides Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 40 pp 1329–1356 43 Vosgen B, Herrmann K (1980) Flavonol glycosides of pepper (Piper nigrum), clove (Syzygium aromaticum) and allspice (Pimenta dioica) Phenolics of spices Zeitschrift fur Lebensmittel- Untersuchung und – Forschung Vol 170 pp 204–207 44 Wang J, Zhou R-G, Wu T, Yang T, Qin Q-X, Li L, Yang B, Yang J (2012) Total synthesis of apigenin Journal of Chemical Research Vol 36 pp 121–122 45 Watt G, Leoff C, Harper AD, Bar-Peled M (2004) A Bifunctional 3,5Epimerase/4-Keto Reductase for Nucleotide-Rhamnose Synthesis in Arabidopsis PLANT PHYSIOLOGY 134 pp 1337–1346 46 Williams CA, Harborne JB (1993) The Flavonoids Harborn Press pp 337-385 47 Zhang C, Griffith B.R , Fu, Q., Albermann C, Fu X, Lee I K, Li L, Thorson J S (2006) Exploiting the reversibility of natural product glycosyltransferasecatalyzed reactions Science 313 pp 1291–1294 48 Zhang Wei, Li Ben, Guo Yan, Bai Y, Wang T, Fu Kun, Sun G (2015) Rhamnetin attenuates cognitive deficit and inhibits hippocampal inflammatory response and oxidative stress in rats with traumatic brain injury Central European Journal of Immunology 40 pp 35–41 Nguồn Internet: 49 https://en.wikipedia.org/wiki/Flavonols 46 download by : skknchat@gmail.com ... sinh tổng hợp hoạt chất rhamnetin- 3- O -rhamnoside vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền? ?? nhằm áp dụng phương pháp đường hóa chất tự nhiên vi khuẩn cải biến di truyền để tạo sản phẩm rhamnetin. .. số: 60 42 02 01 Cơ sở đào tạo: Học Vi? ??n Nơng Nghiệp Vi? ??t Nam Mục đích nghiên cứu: Thiết lập quy trình sinh tổng hợp rhamnetin- 3- O -rhamnoside vi khuẩn E coli cải biến di truyền đánh giá ảnh hưởng... LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3. 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3. 1.1 Đối tượng nghiên cứu Tổng hợp rhamnetin- 3- O -rhamnoside thực chủng vi khuẩn biến đổi gen E coli BL21(DE3) cải biến di truyền mang gen mã