Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-o-rhamnoside
RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE
4.1.1. Kết quả nghiên cứu bổ sung cơ chất rhamnetin và tách chiết thu sản phẩm phẩm
Sản phẩm sinh tổng hợp được hòa tan trong 100ml dung môi ethyl acetate: methanol = 9:1 sau đó được tiến hành cô quay chân không để loại bỏ dung môi và đông khô để bay hơi hoàn toàn nước thu được 25mg sản phẩm có màu vàng nhạt. Sản phẩm thu được sau đó được hòa tan với 1mL methanol và tiến hành các thí nghiệm xác định rhamnetin-3-O-rhamnoside.
Hình 4.1. Sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô 4.1.2. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng
Dịch chiết chứa sản phẩm chuyển hóa được tách chiết như mô tả ở trên. Sự có mặt của rhamnetin-3-O-rhamnoside và cơ chất dư thừa được nhận biết thông qua sử dụng sắc ký bản mỏng TLC.
Kết quả phân tích TLC của dịch chiết được trình bày trong hình 4.2. Trong đó, cột 1 là mẫu dịch chiết, cột 2 là mẫu rhamnetin chuẩn. Các điểm (pot) chỉ thị cơ chất rhamnetin và sản phẩm glycoside của nó có giá trị Rf (retention factor) lần lượt là 0,75 và 0,35. Sản phẩm có màu vàng nhạt giống với màu của cơ chất rhamnetin còn mẫu đối chứng không tạo sản phẩm có màu như rhamnetin.
Hình 4.2. Sắc ký đồ phân tích vị trí của cơ chất rhamnetin và rhamnetin glycoside
4.1.3. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) năng cao (HPLC)
Mẫu thí nghiệm tiếp tục được đưa vào phân tích sắc ký HPLC để phát hiện peak của sản phẩm và cơ chất tương ứng. Kết quả thu được cho thấy cơ chất và sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside được tìm thấy trong sắc ký đồ HPLC có thời gian lưu (retention time) lần lượt là 17,5 và 13,4 phút (hình 4.3). Theo quy luật chung, do cơ chất rhamnetin có độ phân cực nhỏ hơn rhamnetin-3-O- rhamnoside (vì có thêm phân tử đường rhamnose gắn vào) nên trong sắc ký lỏng đảo pha, peak của sản phẩm sẽ luôn ra muộn hơn.
4.1.4. Phân tích kết quả chuyển hóa bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ khối phổ
Dịch thô sau khi phân tích HPLC đã được gửi đi phân tích dữ liệu phổ khối. Dữ liệu phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ hợp chất rhamnetin ở chế độ negative mode được thể hiện qua hình 4.4 và 4.5. Nguyên lý của LC-MS/MS là bắn phá phân tử chất hữu cơ để tạo ra các phân mảnh đặc trưng cho chất trong những điều kiện xác định. Rhamnetin-3-O-rhamnoside có khối lượng phân tử là 462,40 bị khử gốc đường rhamnose (M=146,95) tạo ra phân mảnh có KLPT là: [M-rham] =315,10 (phân mảnh lần 1, MS1). Tiếp theo phân mảnh này bị loại bỏ gốc methyl (-CH3) ở vị trí C-7 để tạo thành phân mảnh có KLPT là [M-rham- CH3] = 299,10 (phân mảnh lần 2, MS2). Nhóm CH3 là cấu trúc đặc trưng của rhamnetin so với các flavonol khác như quercetin, kaempferol, v.v. So sánh với
một số tài liệu khác phân tích phổ khối lượng phân tử của chất tương tự, chúng tôi nhận định rằng đã tạo ra được rhamnetin-rhamnoside trong thí nghiệm chuyển hóa của mình.
Như vậy thông qua các phương pháp sắc ký, chúng tôi đã xác định chính xác sản phẩm tạo thành là rhamnetin-3-O-rhamnoside.
Hình 4.3. Phân tích định tính sự tạo thành rhamnetin-3-O-rhamnoside bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(Trong đó: (A): phổ sắc ký lỏng của sản phẩm; (B): Các phân mảnh của sản phẩm bị phá vỡ bao gồm 314,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside]) và 299,10 (ứng với khối lượng [M-rhamnoside-CH3]).)
O OH OH O OH H3CO OH O OH OH O OH H3CO O O HO CH3 OHOH M = 314.10 M= 462.40 Rhamnose O O O- OH OH OH H3CO M = 315.10 CH3 O O -O OH OH OH O- M = 299.10
Hình 4.5. Sơ đồ phân mảnh MS/MS của rhamnetin rhamnoside 4.2. ĐÁNH GIÁ VÀ BÀN LUẬN ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỚI HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP RHAMNETIN-3-O- RHAMNOSIDE
4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng, sinh lý của vi khuẩn. Có 3 loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn E. coli là LB, TB và M9. Mỗi loại môi trường này có thành phần dinh dưỡng khác nhau, trong đó LB, TB là các môi trường tổng hợp có thành phần dinh dưỡng phức tạp do chứa cao nấm men, tryptone, còn M9 là môi trường có thành phần xác định. Chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường trên cho thí nghiệm chuyển hóa trong điều kiện: 220 vòng/phút, 32oC, 0,8 mM IPTG. Nồng độ cơ chất là 30 µM và thời gian nuôi chuyển hóa là 24 giờ sau khi bổ sung IPTG. Kết quả đo lặp lại ba lần thí nghiệm được cho trong bảng 4.1.
Từ kết quả thể hiện trong biểu đồ 4.1, ta thấy rằng môi trường TB (terrific broth) có hàm lượng cao nấm men cao thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn, sự biểu hiện của protein ngoại lai nên cho sản lượng sản phẩm thu được là tốt nhất đạt 22,3 µM (10,3 mg/L). Trong khi đó, môi trường LB và M9 +2% glucose chỉ cho năng suất lần lượt đạt 15,4 và 17,5 µM. Từ kết quả trên cho thấy lượng sản phẩm thu được từ nuôi cấy bởi môi trường TB cao gấp 1,4 lần so với môi trường LB và gấp 1,2 lần so với môi trường M9, hiệu suất chuyển hóa đạt 74%.
Bảng 4.1. Kết quả đo thử nghiệm hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside ở các môi trường nuôi cấy khác nhau
Số lần đo LB TB M9+2% glucose Lần 1 (µM) 16,4 24,5 16,5 Lần 2 (µM) 14,3 21,3 19,2 Lần 3 (µM) 15,5 21,1 16,8 Giá trị trung bình (µM) 15,4 22.3 17,5 Độ lệch chuẩn 0,86 1,56 1,21
Hiệu suất chuyển hóa (%) 51,3 74,3 58,3
Biểu đồ 4.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Kết quả của nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và đồng độ IPTG được trình bày sau đây đã phần nào lý giải cho sự chênh lệch về hiệu suất chuyển hóa giữa hai nghiên cứu trên.
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
IPTG là chất kích thích biểu hiện protein dị dòng (heterologous expression) và thường được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu biểu hiện protein. Chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp dùng trong thí nghiệm này mang nhiều gen có nguồn gốc ngoại lai như gen tham gia tổng hợp đường UDP-L-rhamnose, đặc biệt là gen chuyển hóa nhóm đường này tới cơ chất nhận, rhamnosyltransferase (ArGT3). Bởi vậy, các nồng độ IPTG khác nhau được sử dụng nhằm đánh giá mức độ chuyển hóa cơ chất rhamnetin.
Chúng tôi đã sử dụng các mức nồng độ IPTG cuối cùng khác nhau bao gồm: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mM. Điều kiện nuôi cấy bao gồm môi trường TB, 220 vòng/phút, nhiệt độ 32oC. Nồng độ của rhamnetin đưa vào là 30 µM. Kết quả đo thí nghiệm lặp lại ba lần được cho trong bảng 4.2. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
Bảng 4.2. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG khác nhau Số lần đo 0 mM 0,2 mM 0,4 mM 0,6 mM 0,8 mM 1 mM Lần 1 (µM) 6,8 11,3 14,5 16,5 26,3 22,0 Lần 2 (µM) 7,9 10,1 13,2 14,2 24,5 21,3 Lần 3 (µM) 7,8 10,1 12,8 16,4 25,7 24,2 Giá trị trung bình (µM) 7,5 10,5 13,5 15,7 25,5 22.5 Độ lệch chuẩn 0,50 0,57 0,73 1,06 0,75 1,24
Hiệu suất chuyển hóa (%)
Biểu đồ 4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Từ đồ thị biểu diễn kết quả trên ta thấy rằng khi tăng hàm lượng IPTG thì hàm lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside tăng dần từ mức thấp nhất là 7,5 (không bổ sung IPTG) cho đến cực đại là 25,5 µM (11,8 mg/L) ứng với hàm lượng IPTG = 0,8 mM. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng IPTG đến 1 mM thì hàm lượng của sản phẩm không tăng mà có xu hướng giảm chút ít, chỉ đạt 22,5 µM. Lý giải điều này, chúng tôi cho rằng ngưỡng IPTG = 0,8 mM là thích hợp tối ưu cho biểu hiện protein ngoại lai ở vi khuẩn tái tổ hợp E. coli ArGT3 và do đó chúng hoạt động xúc tác tối ưu cho chuyển hóa cơ chất.
4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới các quá trình sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn do đó ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính của enzyme tái tổ hợp. Chúng tôi, do đó, thiết lập điều kiện nuôi cấy bao gồm: môi trường TB, 220 vòng/phút, vi khuẩn được nuôi ở 37oC trong vòng 3-4h để đạt tới ngưỡng phát triển có OD600= 0,6 và tiếp theo bổ sung IPTG nồng độ 1 mM. Sau đó chúng được nuôi các chế độ nuôi cấy khác nhau bao gồm 25, 27, 32 và 37oC trong thời gian 3-7h. Thời gian nuôi cấy này nhằm kích thích sinh
trưởng của vi khuẩn và biểu hiện protein, thời gian dài ngắn tùy thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy. Khi mật độ vi khuẩn đạt ngưỡng OD = 1,3 thì chúng tôi bổ sung cơ chất là 30µM rhamnetin. Nhiệt độ nuôi cấy được duy trì ổn định, thời gian nuôi cấy kéo dài 24h tiếp theo.
Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến chuyển hóa cơ chất được thể hiện thông qua biểu đồ dưới đây:
Bảng 4.3. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác nhau Số lần đo 25ºC 27ºC 32ºC 37ºC Lần 1 (µM) 13,5 15,6 28,5 24,3 Lần 2 (µM) 11,8 17,5 25,6 23,1 Lần 3 (µM) 12,2 14,3 27,5 23,1 Giá trị trung bình (µM) 12,5 15,8 27,2 23,5 Độ lệch chuẩn 0,73 1,31 1,20 0,57
Hiệu suất chuyển hóa (%) 42 53 90 78
Từ bảng kết quả đo ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau ta có biểu đồ sau (biểu đồ 4.3).
Biểu đồ 4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Từ biểu đồ chuyển hóa trên có thể nhận thấy rằng khi tăng nhiệt độ nuôi cấy thì hàm lượng của sản phẩm thu được tăng dần từ mức 12,5 µM (25ºC) và đạt ngưỡng cực đại 27,2 µM (32ºC) nhưng sau đó giảm dần tới 23,5 µM ở 37ºC. Bàn luận:
Trước kia, người ta thường sử dụng phương pháp tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất glycoside từ thực vật hoặc xạ khuẩn (Vosgen et al., 1980; Andreeva et al., 1998; Preiss et al., 2010). Sau đó tiến hành các thí nghiệm vi sinh, hóa sinh, dược lý để tìm hiểu, sàng lọc đặc tính dược học mong muốn. Cuối cùng người ta sẽ tiến hành tách chiết quy mô lớn để thu lượng lớn sản phẩm phục vụ nhu cầu thực tiễn. Khi công nghệ hóa học hữu cơ phát triển, phương pháp bán tổng hợp cũng được áp dụng phổ biến để sản xuất glycoside. Tuy nhiên phương pháp này tương đối đắt đỏ, tốn thời gian và có những thành phần hóa chất thải gây độc cho môi trường, con người (Oyama et al., 2004; Wang et al., 2012). Vì vậy một câu hỏi được đặt ra là làm thế nào để thu được lượng lớn các flavonoid để phục vụ nhu cầu thương mại vừa đảm bảo tính tự nhiên, giảm thiểu chi phí và không gây hại tới môi trường và con người. Phương pháp sử dụng vi khuẩn tái tổ hợp nhằm tổng hợp glycoside là phương pháp ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp và kết hợp với cải biến trao đổi chất để tạo ra các hệ thống tổng hợp theo thiết kế in vitro hoặc in vivo có tính đặc hiệu cao, năng suất tốt, tiết kiệm thời gian và giảm chi phí vận hành (Thuan et al., 2013).
Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã thiết kế vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp đường hoạt hóa và gen mã hóa cho enzyme glycosyltransferase. Glycosyltransferase (GT) là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm phân tử đường sang các phân tử chất nhận để tạo ra các sản phẩm đường hóa. Cho tới nay, người ta đã biết được cấu trúc và mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của nhiều loại GT. Thực nghiệm cho thấy hầu hết các enzyme này có một trình tự đặc trưng nằm ở đầu C (C-terminal) gọi là hộp PSPG (plant secondary product glycosyltransferase) bao gồm 44 amino acid có chứa túi gắn phân tử đường (Offen et al., 2006; Brazier-Hicks et al., 2007). Sau đó, một số loại flavonoid như myricetin, apigenin và baicalein đã được sử dụng làm cơ chất cho quá trình cải biến sinh học thông qua phản ứng in-vivo nhằm thu nhận sản phẩm tương ứng (flavonoid glycoside) (Thuan et al., 2013a; Thuan et al., 2013b).
Flavonoid là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đặc trưng của thực vật bậc cao. Cho tới nay, dựa trên trình tự giải mã hệ gen ở vi khuẩn E. coli người ta biết chắc chắn rằng chúng không có sẵn các gen tổng hợp flavonoid và dẫn xuất. Bởi vậy vi khuẩn này được sử dụng làm vật chủ sẽ cung cấp các ưu điểm như không tạo ra flavonoid nội sinh, có ít sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, chu trình sống ngắn, tốc độ sinh trưởng cao và đặc biệt người ta đã hiểu rất rõ về các cơ chế trao đổi chất, các kỹ thuật di truyền và protein tái tổ hợp. Do đó, cho tới nay có rất nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid ở E. coli (Simkhada et al., 2010; Ren et al., 2012; Malla et al., 2013).
Hợp chất rhamnetin, như đã mô tả ở trên, thuộc loại flavonol methyl hóa ở vị trí C7 và đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý. Bởi vậy, việc cải biến cấu trúc phân tử cơ chất thông qua chuyển hóa sinh học (gắn thêm nhóm đường, methyl hoặc hydroxyl) nhờ sử dụng enzyme xúc tác đặc hiệu giúp tạo ra nhiều dẫn xuất mới và cung cấp nguyên liệu cho các thử nghiệm dược lý. Quá trình chuyển hóa cơ chất rhamnetin xảy ra ở vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được mô tả ở hình 3.1. Cụ thể, vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được nuôi trong điều kiện đầy đủ chất dinh dưỡng, sinh trưởng tốt và các protein tái tổ hợp được biểu hiện đầy đủ.
Enzyme glycosyltransferase tái tổ hợp được sinh ra sẽ làm nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng gắn phân tử đường UDP-L-rhamnose vào cơ chất nhận để tạo ra sản phẩm là rhamnetin-3-O-rhamnoside. Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc ảnh hưởng của môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ nuôi cấy phù hợp cho quá trình chuyển hóa và thu được hàm lượng sản phẩm tối đa đạt 27,2 µM (12,6 mg/L). So với các nghiên cứu trước đó của chúng tôi về tổng hợp myricetin-rhamnoside (25,8 mg/L) (Thuan et al., 2013b), quercitrin (24 mg/L) và afzelin (12,9 mg/L) (Simkhada et al., 2010), astilbin (22,23 mg/L) (Thuan et al., 2017), quercetin 3-O- (N-acetyl) quinovosamin(158,8 mg/L),luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic acid (172,5 mg/L ) (Cho et al., 2016) thì sản lượng của rhamnetin-3-O-rhamnoside thấp hơn đáng kể. Kết quả so sánh được cho trong bảng 4.4. Chúng tôi cho rằng có sự chệnh lệch kết quả lớn như vậy là do tính xúc tác đặc hiệu của enzyme trên mỗi loại cơ chất là khác nhau và còn do điều kiện tiến hành thí nghiệm. Do đó, để tiếp tục cải tiến năng suất thì chúng tôi sẽ phải tiến hành một số công việc tiếp theo như gây tạo đột biến trên enzyme glycosyltransferase nhằm tăng
cường hoạt tính xúc tác và tác động lên con đường trao đổi chất để tăng sinh tổng hợp UDP-L-rhamnose.
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin
STT Cơ chất Sản phẩm Hiệu suất tổng hợp (mg/L)
Tài liệu tham khảo
1 Quercetin Quercitrin 24 (Simkhada al., 2010) et
2 Kaempferol Afzelin 12,9 (Simkhada al., 2010) et
3 Myricetin Myricitrin 25,8 (Thuan 2013a) et al.,
4 Taxifolin Astilbin 22,23 (Thuan et al.,
2017)
5 Quercetin Quercetin-3-O-xyloside 23,78 (Pandey et al., 2013)
6 Quercetin quercetin 3-O-(N-acetyl) quinovosamine 158,8 (Cho 2016) et al.,
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả và bàn luận trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Việc tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside dựa trên E. coli tái tổ hợp có tính khả thi và sản phẩm tạo thành được kiểm tra bằng các phương pháp như sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-ESI-MS/MS).
- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới nuôi cấy và chuyển hóa cơ chất cho thấy trong số 3 loại môi trường thử nghiệm là TB, LB và M9 thì môi trường TB là phù hợp nhất cho sản lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside đạt 22,3