Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.4. Phương pháp nghiên cứu
3.1.4.1. Phương pháp nuôi cấy
-Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin nồng độ 100 µg/mL và Chloramphenicol nồng độ 30 µg/mL ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4mL môi trường TB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37°C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- 500µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang bình định mức 250mL chứa 50 mL môi trường TB (hoặc môi trường khác tùy theo thí nghiệm) nuôi ở 37°C và 220 vòng/phút.
- IPTG được thêm vào nồng độ cuối cùng là 0-1 mM (tùy theo thí nghiệm yêu cầu) khi đo mật độ quang học của dịch nuôi ở bước sóng 600nm (OD600) đạt 0,6.
-Hạ nhiệt độ xuống 32°C (hoặc mức nhiệt độ khác tùy thuộc yêu cầu thí nghiệm) và nuôi tiếp trong 3-5h tạo điều kiện cho các protein tái tổ hợp biểu hiện.
-Bổ sung rhamnetin đã hòa tan trong hỗn hợp methanol và DMSO (v/v = 9:1) với nồng độ cuối cùng là 30µM, nuôi tiếp trong 24h sau đó tiến hành tách chiết.
- Mẫu đối chứng được tiến hành nuôi đồng thời cùng mẫu thí nghiệm và không bổ sung cơ chất rhamnetin.
Hình 3.3. Nuôi cấy chủng giống gốc 3.1.4.2. Phương pháp cô quay chân không
Trong phương pháp cô quay chân không, bay hơi chân không giữ vai trò chủ đạo bởi trong một hệ kín, áp suất giảm dẫn tới làm giảm nhiệt độ sôi của các thành phần trong đó. Các thành phần trong mẫu dung dịch được cô quay bay hơi để loại bỏ dung môi mong muốn từ mẫu dịch chiết, nó được ứng dụng trong quá trình tách chiết một hợp chất tự nhiên. Dung môi hòa tan có thể được loại bỏ nếu nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ cho phép. Nhiệt độ cho phép phụ thuộc vào độ sôi của hợp chất, chất tan và dung môi. Phương pháp cô quay chân không có thể loại bỏ hầu hết các dung môi có nhiệt độ sôi thấp ngoại trừ các dung môi có nhiệt độ sôi cao như các dung môi có chứa liên kết hydro như nước thường được xem là dung môi cuối cùng còn lại trong dịch chiết. Vì vậy, để loại bỏ hết nước và dung môi còn sót lại của quá trình cô quay thì phương pháp đông khô là lựa chọn hiệu quả.
-Pha dung môi Ethyl acetate:Methanol = 9:1 (tỷ lệ tính theo thể tích, v/v). -Lấy 100mL dung môi đã pha cho vào bình chứa dịch nuôi, lắc đều ở 200 vòng/phút trong 2h.
-Thu dịch trên, ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. -Lọc qua màng lọc sartorius có đường kính 0,25µm thu dịch chiết. -Tiến hành cô quay chân không để loại bỏ dung môi.
Hình 3.4. Cô quay thu nhận dịch chiết thô 3.1.4.3. Phương pháp đông khô
Phương pháp đông khô giúp loại bỏ hoàn toàn nước ra khỏi sản phẩm đông lạnh nhờ quá trình thăng hoa. Sản phẩm đem sấy được đông lạnh ở thể rắn ở âm 70oC sau đó được chuyển trực tiếp sang thể hơi mà bỏ qua pha lỏng.
Quá trình sấy thăng hoa bao gồm ba giai đoạn: giai đoạn làm lạnh; giai đoạn sấy sơ cấp và giai đoạn sấy thứ cấp.
Giai đoạn 1 – Giai đoạn Tiền đông (prefreezing): Trong giai đoạn này,vật liệu sấy được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí, vật liệu đông khô trước tiên phải được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp. Phương pháp đông lạnh và nhiệt độ cuối của sản phẩm lạnh đông có thể ảnh hưởng đến khả năng đông khô thành công của vật liệu sấy.
Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy chủ yếu (giai đoạn sấy thăng hoa): Sau giai đoạn lạnh đông sản phẩm, cần thiết lập các điều kiện để tách loại băng nước khỏi
sản phẩm bằng cách thăng hoa, kết quả thu được là sản phẩm khô cấu trúc được bảo toàn. Cần điều khiển chính xác 2 thông số nhiệt độ và áp suất.
Giai đoạn 3 – Giai đoạn sấy thứ cấp (giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại): Sau khi kết thúc giai đoạn 2, và tất cả băng đã thăng hoa, tuy nhiên vẫn còn ẩm liên kết tồn tại bên trong vật sấy. Sản phẩm nhìn có vẻ khô, nhưng thực tế ẩm còn lại tương đối cao khoảng 7-8%. Giai đoạn sấy thứ cấp này tại nhiệt độ cao hơn là quá trình cần thiết để bốc hơi ẩm liên kết còn lại đạt hiệu suất tối đa nhất. Quá trình này được gọi là sự giải hấp đẳng nhiệt vì ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.
Sản phẩm sau khi đông khô được pha với 1mL methanol để tiến hành các thí nghiệm xác định chất.
3.1.4.4. Phương pháp định tính, định lượng
a. Phương pháp sắc ký bản mỏng
- Chuẩn bị bản mỏng sắc ký và đánh dấu vị trí của cơ chất, mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.
- Pha dung môi sử dụng theo tỷ lệ ethyl acetate : methanol : toluene : nước cất = 8 : 1: 0,5 : 1 (tính theo thể tích, v/v), lắc nhẹ sau khi pha và đổ ra bình có nắp đậy để 15 phút.
- Lần lượt đưa ống mao quản vào từng mẫu sau đó chấm lên các vị trí tương ứng trên bản mỏng sắc ký đã chuẩn bị. Sau mỗi lần chấm phải chờ cho vết chấm khô lại và chấm tiếp, chấm khoảng 5 – 8 lần tùy từng chất.
- Sau khi chấm xong đem sấy khô và đưa vào bình chứa dung môi và đậy nắp, chờ 15 phút, sau đó quan sát dưới đèn UV ở 280nm.
b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Dịch chiết thu được đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trong và tiến hành kiểm tra định tính bằng HPLC.
- Sử dụng hệ dung môi gồm: A: nước chứa 0,1% formic acid và B: acetonitrile 100%.
- Hệ chương trình chạy HPLC gồm. dung môi B: 10 % trong 0–5 phút, 10– 30% trong 5–15 phút, 30–80 % trong 15–25 phút, và 80–100% trong 25–30 phút.
- Cột chạy đảo pha C18 Zorbax extend (Agilent, Mỹ).
Hình 3.5. Máy phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Định lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside
Chất chuẩn rhamnetin-3-O-rhamnoside được mua từ hãng Sigma và pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 0,01; 0.05; 0,1; 0,5 và 1 mg/mL. Sau đó, chạy mẫu và xây dựng đường chuẩn. Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn được cho trong hình dưới đây:
Diện tích peak (trục tung) = 250125,2314 x hàm lượng (trục hoành) + 1123.2514 Phương trình chuẩn độ này là cơ sở để tính toán hàm lượng của sản phẩm sau này.
c. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-ESI-MS/MS)
Mẫu được đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ khối phổ là hệ thống bao gồm máy HPLC 20AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem (Trường đại học khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội).
3.2. ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỚI