Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Đánh giá và bàn luận ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới hiệu suất sinh
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ iptg tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.
rhamnoside
IPTG là chất kích thích biểu hiện protein dị dòng (heterologous expression) và thường được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu biểu hiện protein. Chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp dùng trong thí nghiệm này mang nhiều gen có nguồn gốc ngoại lai như gen tham gia tổng hợp đường UDP-L-rhamnose, đặc biệt là gen chuyển hóa nhóm đường này tới cơ chất nhận, rhamnosyltransferase (ArGT3). Bởi vậy, các nồng độ IPTG khác nhau được sử dụng nhằm đánh giá mức độ chuyển hóa cơ chất rhamnetin.
Chúng tôi đã sử dụng các mức nồng độ IPTG cuối cùng khác nhau bao gồm: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mM. Điều kiện nuôi cấy bao gồm môi trường TB, 220 vòng/phút, nhiệt độ 32oC. Nồng độ của rhamnetin đưa vào là 30 µM. Kết quả đo thí nghiệm lặp lại ba lần được cho trong bảng 4.2. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
Bảng 4.2. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các nồng độ IPTG khác nhau Số lần đo 0 mM 0,2 mM 0,4 mM 0,6 mM 0,8 mM 1 mM Lần 1 (µM) 6,8 11,3 14,5 16,5 26,3 22,0 Lần 2 (µM) 7,9 10,1 13,2 14,2 24,5 21,3 Lần 3 (µM) 7,8 10,1 12,8 16,4 25,7 24,2 Giá trị trung bình (µM) 7,5 10,5 13,5 15,7 25,5 22.5 Độ lệch chuẩn 0,50 0,57 0,73 1,06 0,75 1,24
Hiệu suất chuyển hóa (%)
Biểu đồ 4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Từ đồ thị biểu diễn kết quả trên ta thấy rằng khi tăng hàm lượng IPTG thì hàm lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside tăng dần từ mức thấp nhất là 7,5 (không bổ sung IPTG) cho đến cực đại là 25,5 µM (11,8 mg/L) ứng với hàm lượng IPTG = 0,8 mM. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng IPTG đến 1 mM thì hàm lượng của sản phẩm không tăng mà có xu hướng giảm chút ít, chỉ đạt 22,5 µM. Lý giải điều này, chúng tôi cho rằng ngưỡng IPTG = 0,8 mM là thích hợp tối ưu cho biểu hiện protein ngoại lai ở vi khuẩn tái tổ hợp E. coli ArGT3 và do đó chúng hoạt động xúc tác tối ưu cho chuyển hóa cơ chất.
4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới các quá trình sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn do đó ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính của enzyme tái tổ hợp. Chúng tôi, do đó, thiết lập điều kiện nuôi cấy bao gồm: môi trường TB, 220 vòng/phút, vi khuẩn được nuôi ở 37oC trong vòng 3-4h để đạt tới ngưỡng phát triển có OD600= 0,6 và tiếp theo bổ sung IPTG nồng độ 1 mM. Sau đó chúng được nuôi các chế độ nuôi cấy khác nhau bao gồm 25, 27, 32 và 37oC trong thời gian 3-7h. Thời gian nuôi cấy này nhằm kích thích sinh
trưởng của vi khuẩn và biểu hiện protein, thời gian dài ngắn tùy thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy. Khi mật độ vi khuẩn đạt ngưỡng OD = 1,3 thì chúng tôi bổ sung cơ chất là 30µM rhamnetin. Nhiệt độ nuôi cấy được duy trì ổn định, thời gian nuôi cấy kéo dài 24h tiếp theo.
Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến chuyển hóa cơ chất được thể hiện thông qua biểu đồ dưới đây:
Bảng 4.3. Kết quả đo hàm lượng rhamnetin-3-O-rhamnoside tại các mức nhiệt độ khác nhau Số lần đo 25ºC 27ºC 32ºC 37ºC Lần 1 (µM) 13,5 15,6 28,5 24,3 Lần 2 (µM) 11,8 17,5 25,6 23,1 Lần 3 (µM) 12,2 14,3 27,5 23,1 Giá trị trung bình (µM) 12,5 15,8 27,2 23,5 Độ lệch chuẩn 0,73 1,31 1,20 0,57
Hiệu suất chuyển hóa (%) 42 53 90 78
Từ bảng kết quả đo ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau ta có biểu đồ sau (biểu đồ 4.3).
Biểu đồ 4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
Từ biểu đồ chuyển hóa trên có thể nhận thấy rằng khi tăng nhiệt độ nuôi cấy thì hàm lượng của sản phẩm thu được tăng dần từ mức 12,5 µM (25ºC) và đạt ngưỡng cực đại 27,2 µM (32ºC) nhưng sau đó giảm dần tới 23,5 µM ở 37ºC. Bàn luận:
Trước kia, người ta thường sử dụng phương pháp tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất glycoside từ thực vật hoặc xạ khuẩn (Vosgen et al., 1980; Andreeva et al., 1998; Preiss et al., 2010). Sau đó tiến hành các thí nghiệm vi sinh, hóa sinh, dược lý để tìm hiểu, sàng lọc đặc tính dược học mong muốn. Cuối cùng người ta sẽ tiến hành tách chiết quy mô lớn để thu lượng lớn sản phẩm phục vụ nhu cầu thực tiễn. Khi công nghệ hóa học hữu cơ phát triển, phương pháp bán tổng hợp cũng được áp dụng phổ biến để sản xuất glycoside. Tuy nhiên phương pháp này tương đối đắt đỏ, tốn thời gian và có những thành phần hóa chất thải gây độc cho môi trường, con người (Oyama et al., 2004; Wang et al., 2012). Vì vậy một câu hỏi được đặt ra là làm thế nào để thu được lượng lớn các flavonoid để phục vụ nhu cầu thương mại vừa đảm bảo tính tự nhiên, giảm thiểu chi phí và không gây hại tới môi trường và con người. Phương pháp sử dụng vi khuẩn tái tổ hợp nhằm tổng hợp glycoside là phương pháp ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp và kết hợp với cải biến trao đổi chất để tạo ra các hệ thống tổng hợp theo thiết kế in vitro hoặc in vivo có tính đặc hiệu cao, năng suất tốt, tiết kiệm thời gian và giảm chi phí vận hành (Thuan et al., 2013).
Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã thiết kế vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp đường hoạt hóa và gen mã hóa cho enzyme glycosyltransferase. Glycosyltransferase (GT) là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm phân tử đường sang các phân tử chất nhận để tạo ra các sản phẩm đường hóa. Cho tới nay, người ta đã biết được cấu trúc và mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của nhiều loại GT. Thực nghiệm cho thấy hầu hết các enzyme này có một trình tự đặc trưng nằm ở đầu C (C-terminal) gọi là hộp PSPG (plant secondary product glycosyltransferase) bao gồm 44 amino acid có chứa túi gắn phân tử đường (Offen et al., 2006; Brazier-Hicks et al., 2007). Sau đó, một số loại flavonoid như myricetin, apigenin và baicalein đã được sử dụng làm cơ chất cho quá trình cải biến sinh học thông qua phản ứng in-vivo nhằm thu nhận sản phẩm tương ứng (flavonoid glycoside) (Thuan et al., 2013a; Thuan et al., 2013b).
Flavonoid là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đặc trưng của thực vật bậc cao. Cho tới nay, dựa trên trình tự giải mã hệ gen ở vi khuẩn E. coli người ta biết chắc chắn rằng chúng không có sẵn các gen tổng hợp flavonoid và dẫn xuất. Bởi vậy vi khuẩn này được sử dụng làm vật chủ sẽ cung cấp các ưu điểm như không tạo ra flavonoid nội sinh, có ít sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, chu trình sống ngắn, tốc độ sinh trưởng cao và đặc biệt người ta đã hiểu rất rõ về các cơ chế trao đổi chất, các kỹ thuật di truyền và protein tái tổ hợp. Do đó, cho tới nay có rất nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid ở E. coli (Simkhada et al., 2010; Ren et al., 2012; Malla et al., 2013).
Hợp chất rhamnetin, như đã mô tả ở trên, thuộc loại flavonol methyl hóa ở vị trí C7 và đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý. Bởi vậy, việc cải biến cấu trúc phân tử cơ chất thông qua chuyển hóa sinh học (gắn thêm nhóm đường, methyl hoặc hydroxyl) nhờ sử dụng enzyme xúc tác đặc hiệu giúp tạo ra nhiều dẫn xuất mới và cung cấp nguyên liệu cho các thử nghiệm dược lý. Quá trình chuyển hóa cơ chất rhamnetin xảy ra ở vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được mô tả ở hình 3.1. Cụ thể, vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được nuôi trong điều kiện đầy đủ chất dinh dưỡng, sinh trưởng tốt và các protein tái tổ hợp được biểu hiện đầy đủ.
Enzyme glycosyltransferase tái tổ hợp được sinh ra sẽ làm nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng gắn phân tử đường UDP-L-rhamnose vào cơ chất nhận để tạo ra sản phẩm là rhamnetin-3-O-rhamnoside. Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc ảnh hưởng của môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ nuôi cấy phù hợp cho quá trình chuyển hóa và thu được hàm lượng sản phẩm tối đa đạt 27,2 µM (12,6 mg/L). So với các nghiên cứu trước đó của chúng tôi về tổng hợp myricetin-rhamnoside (25,8 mg/L) (Thuan et al., 2013b), quercitrin (24 mg/L) và afzelin (12,9 mg/L) (Simkhada et al., 2010), astilbin (22,23 mg/L) (Thuan et al., 2017), quercetin 3-O- (N-acetyl) quinovosamin(158,8 mg/L),luteolin 7-O-(N-acetyl) glucosaminuronic acid (172,5 mg/L ) (Cho et al., 2016) thì sản lượng của rhamnetin-3-O-rhamnoside thấp hơn đáng kể. Kết quả so sánh được cho trong bảng 4.4. Chúng tôi cho rằng có sự chệnh lệch kết quả lớn như vậy là do tính xúc tác đặc hiệu của enzyme trên mỗi loại cơ chất là khác nhau và còn do điều kiện tiến hành thí nghiệm. Do đó, để tiếp tục cải tiến năng suất thì chúng tôi sẽ phải tiến hành một số công việc tiếp theo như gây tạo đột biến trên enzyme glycosyltransferase nhằm tăng
cường hoạt tính xúc tác và tác động lên con đường trao đổi chất để tăng sinh tổng hợp UDP-L-rhamnose.
Bảng 4.4. So sánh hiệu quả chuyển hóa một số loại cơ chất với rhamnetin
STT Cơ chất Sản phẩm Hiệu suất tổng hợp (mg/L)
Tài liệu tham khảo
1 Quercetin Quercitrin 24 (Simkhada al., 2010) et
2 Kaempferol Afzelin 12,9 (Simkhada al., 2010) et
3 Myricetin Myricitrin 25,8 (Thuan 2013a) et al.,
4 Taxifolin Astilbin 22,23 (Thuan et al.,
2017)
5 Quercetin Quercetin-3-O-xyloside 23,78 (Pandey et al., 2013)
6 Quercetin quercetin 3-O-(N-acetyl) quinovosamine 158,8 (Cho 2016) et al.,