3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside được thực hiện bởi chủng vi khuẩn biến đổi gen E. coli BL21(DE3) cải biến di truyền mang gen mã hóa cho UDP- glycosyltransferase tách dòng từ Arabidopsis thaliana (ArGT3, At1g30530) và cụm gen mã hóa tăng cường tổng hợp thymidine diphosphate (TDP)-α-L- rhamnose. Hai gen liên quan đến việc sản xuất NDP-glucose trong E. coli là D- glucose-phosphate isomerase (pgi) và D-glucose-6-phosphate dehydrogenase (zwf) đã được loại bỏ nhằm mục đích tăng cường tổng hợp tích lũy glucose -1- phosphate là tiền chất để sản xuất TDP-L-rhamnose nội bào. Cơ chất sử dụng là rhamnetin. Sơ đồ thiết kế vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.1. 3.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Thí nghiệm tổng hợp và phát hiện rhamnetin-3-O-rhamnoside Nội dung 2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường, nồng độ IPTG và nhiệt độ lên hiệu suất sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside.
3.1.3. Nguyên vật liệu 3.1.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.1.3.1. Mẫu thí nghiệm
Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3)/Δpgi/Δzwf (chủng M3G3) tái tổ hợp được sử dụng làm vật chủ (hình 3.1) (Thuan et al., 2013a).
3.1.3.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí nghiệm
Các loại máy móc dùng khuấy mẫu, cô quay, đông khô và chai lọ làm thí nghiệm, v.v thuộc Trung tâm Sinh học Phân tử, Đại học Duy Tân.
Màng lọc Sartorius 0,25 µm (Sartorius, Mỹ). Bản mỏng sắc ký (Merck, Đức) và máy phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC 1260, Agilent, Mỹ). Mẫu được gửi đi phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc Gia Hà Nội).
Các hóa chất rhamnetin (Sigma, Mỹ), IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) (Merck, Đức), kháng sinh ampicilin, chloramphenicol, streptomycin (biobasics, Canada). Dung môi dùng cho tách chiết bao gồm ethyl acetate, methanol, ethanol, v.v. mua từ Đài Loan, Hàn Quốc.
Hình 3.1. Sơ đồ hệ thống E. coli tái tổ hợp
(Chú thích:TGS: TDP glucose synthase, DH: dehydrogenase, EP: epimerase, KR: ketoreductase; ArGT3: glycosyltransferase. Vector biểu hiện pET28a mang gen ArGT3 và gen kháng kanamycin, vector pCDF-
Duet mang hai gen TGS, DH và gen kháng streptomycin, vector pACYC-Duet mang hai gen EP, KR và gen kháng chloramphenicol)
3.1.4. Phương pháp nghiên cứu 3.1.4.1. Phương pháp nuôi cấy 3.1.4.1. Phương pháp nuôi cấy
-Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin nồng độ 100 µg/mL và Chloramphenicol nồng độ 30 µg/mL ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4mL môi trường TB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37°C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- 500µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang bình định mức 250mL chứa 50 mL môi trường TB (hoặc môi trường khác tùy theo thí nghiệm) nuôi ở 37°C và 220 vòng/phút.
- IPTG được thêm vào nồng độ cuối cùng là 0-1 mM (tùy theo thí nghiệm yêu cầu) khi đo mật độ quang học của dịch nuôi ở bước sóng 600nm (OD600) đạt 0,6.
-Hạ nhiệt độ xuống 32°C (hoặc mức nhiệt độ khác tùy thuộc yêu cầu thí nghiệm) và nuôi tiếp trong 3-5h tạo điều kiện cho các protein tái tổ hợp biểu hiện.
-Bổ sung rhamnetin đã hòa tan trong hỗn hợp methanol và DMSO (v/v = 9:1) với nồng độ cuối cùng là 30µM, nuôi tiếp trong 24h sau đó tiến hành tách chiết.
- Mẫu đối chứng được tiến hành nuôi đồng thời cùng mẫu thí nghiệm và không bổ sung cơ chất rhamnetin.
Hình 3.3. Nuôi cấy chủng giống gốc 3.1.4.2. Phương pháp cô quay chân không
Trong phương pháp cô quay chân không, bay hơi chân không giữ vai trò chủ đạo bởi trong một hệ kín, áp suất giảm dẫn tới làm giảm nhiệt độ sôi của các thành phần trong đó. Các thành phần trong mẫu dung dịch được cô quay bay hơi để loại bỏ dung môi mong muốn từ mẫu dịch chiết, nó được ứng dụng trong quá trình tách chiết một hợp chất tự nhiên. Dung môi hòa tan có thể được loại bỏ nếu nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ cho phép. Nhiệt độ cho phép phụ thuộc vào độ sôi của hợp chất, chất tan và dung môi. Phương pháp cô quay chân không có thể loại bỏ hầu hết các dung môi có nhiệt độ sôi thấp ngoại trừ các dung môi có nhiệt độ sôi cao như các dung môi có chứa liên kết hydro như nước thường được xem là dung môi cuối cùng còn lại trong dịch chiết. Vì vậy, để loại bỏ hết nước và dung môi còn sót lại của quá trình cô quay thì phương pháp đông khô là lựa chọn hiệu quả.
-Pha dung môi Ethyl acetate:Methanol = 9:1 (tỷ lệ tính theo thể tích, v/v). -Lấy 100mL dung môi đã pha cho vào bình chứa dịch nuôi, lắc đều ở 200 vòng/phút trong 2h.
-Thu dịch trên, ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. -Lọc qua màng lọc sartorius có đường kính 0,25µm thu dịch chiết. -Tiến hành cô quay chân không để loại bỏ dung môi.
Hình 3.4. Cô quay thu nhận dịch chiết thô 3.1.4.3. Phương pháp đông khô
Phương pháp đông khô giúp loại bỏ hoàn toàn nước ra khỏi sản phẩm đông lạnh nhờ quá trình thăng hoa. Sản phẩm đem sấy được đông lạnh ở thể rắn ở âm 70oC sau đó được chuyển trực tiếp sang thể hơi mà bỏ qua pha lỏng.
Quá trình sấy thăng hoa bao gồm ba giai đoạn: giai đoạn làm lạnh; giai đoạn sấy sơ cấp và giai đoạn sấy thứ cấp.
Giai đoạn 1 – Giai đoạn Tiền đông (prefreezing): Trong giai đoạn này,vật liệu sấy được chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí, vật liệu đông khô trước tiên phải được làm lạnh đến nhiệt độ thích hợp. Phương pháp đông lạnh và nhiệt độ cuối của sản phẩm lạnh đông có thể ảnh hưởng đến khả năng đông khô thành công của vật liệu sấy.
Giai đoạn 2 – Giai đoạn sấy chủ yếu (giai đoạn sấy thăng hoa): Sau giai đoạn lạnh đông sản phẩm, cần thiết lập các điều kiện để tách loại băng nước khỏi
sản phẩm bằng cách thăng hoa, kết quả thu được là sản phẩm khô cấu trúc được bảo toàn. Cần điều khiển chính xác 2 thông số nhiệt độ và áp suất.
Giai đoạn 3 – Giai đoạn sấy thứ cấp (giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại): Sau khi kết thúc giai đoạn 2, và tất cả băng đã thăng hoa, tuy nhiên vẫn còn ẩm liên kết tồn tại bên trong vật sấy. Sản phẩm nhìn có vẻ khô, nhưng thực tế ẩm còn lại tương đối cao khoảng 7-8%. Giai đoạn sấy thứ cấp này tại nhiệt độ cao hơn là quá trình cần thiết để bốc hơi ẩm liên kết còn lại đạt hiệu suất tối đa nhất. Quá trình này được gọi là sự giải hấp đẳng nhiệt vì ẩm liên kết sẽ được bay hơi khỏi sản phẩm.
Sản phẩm sau khi đông khô được pha với 1mL methanol để tiến hành các thí nghiệm xác định chất.
3.1.4.4. Phương pháp định tính, định lượng
a. Phương pháp sắc ký bản mỏng
- Chuẩn bị bản mỏng sắc ký và đánh dấu vị trí của cơ chất, mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.
- Pha dung môi sử dụng theo tỷ lệ ethyl acetate : methanol : toluene : nước cất = 8 : 1: 0,5 : 1 (tính theo thể tích, v/v), lắc nhẹ sau khi pha và đổ ra bình có nắp đậy để 15 phút.
- Lần lượt đưa ống mao quản vào từng mẫu sau đó chấm lên các vị trí tương ứng trên bản mỏng sắc ký đã chuẩn bị. Sau mỗi lần chấm phải chờ cho vết chấm khô lại và chấm tiếp, chấm khoảng 5 – 8 lần tùy từng chất.
- Sau khi chấm xong đem sấy khô và đưa vào bình chứa dung môi và đậy nắp, chờ 15 phút, sau đó quan sát dưới đèn UV ở 280nm.
b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Dịch chiết thu được đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trong và tiến hành kiểm tra định tính bằng HPLC.
- Sử dụng hệ dung môi gồm: A: nước chứa 0,1% formic acid và B: acetonitrile 100%.
- Hệ chương trình chạy HPLC gồm. dung môi B: 10 % trong 0–5 phút, 10– 30% trong 5–15 phút, 30–80 % trong 15–25 phút, và 80–100% trong 25–30 phút.
- Cột chạy đảo pha C18 Zorbax extend (Agilent, Mỹ).
Hình 3.5. Máy phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Định lượng sản phẩm rhamnetin-3-O-rhamnoside
Chất chuẩn rhamnetin-3-O-rhamnoside được mua từ hãng Sigma và pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 0,01; 0.05; 0,1; 0,5 và 1 mg/mL. Sau đó, chạy mẫu và xây dựng đường chuẩn. Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn được cho trong hình dưới đây:
Diện tích peak (trục tung) = 250125,2314 x hàm lượng (trục hoành) + 1123.2514 Phương trình chuẩn độ này là cơ sở để tính toán hàm lượng của sản phẩm sau này.
c. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-ESI-MS/MS)
Mẫu được đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ khối phổ là hệ thống bao gồm máy HPLC 20AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem (Trường đại học khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội).
3.2. ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỚI HIỆU SUẤT TỔNG HỢP RHAMNETIN-3-O-RHAMNOSIDE
Trong nghiên cứu sinh tổng hợp để quá trình chuyển hóa đạt hiệu quả cao thì việc đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy là rất cần thiết. Việc kết hợp các điều kiện tối ưu sẽ giúp sản xuất ra một lượng lớn sản phẩm, từ đó rút ngắn thời gian thực hiện, giảm chi phí cho sản phẩm. Trong quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside, nhóm chúng tôi đã tiến hành đánh giá 3 điều kiện được xem như có ảnh hưởng lớn đối với hiệu suất chuyển hóa đó là: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ IPTG bổ sung. Bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3- O-rhamnoside được tiến hành trên 3 loại môi trường: TB (Terrific Broth), LB (Lysogeny Broth) và M9 có bổ sung glucose hàm lượng 4 g/L (nguồn cung cấp carbon).
3.2.1.1. Thành phần các môi trường
Môi trường TB
Thành phần các chất được sử dụng trong môi trường TB được thể hiện trong bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Thành phần môi trường TB
Thành phần Hàm lượng các chất
Tryston 12 g/L
Dịch chiết nấm men 24 g/L
Glycerol 4 mL/L
Ngoài ra, chuẩn bị riêng 100 mL nước cất có chứa 2,31 g KH2PO4 và 12,54 g K2HPO4 và khử trùng song song với thành phần trên. Sau khi trử trùng, để nguội tới 60 ºC hoặc thấp hơn rồi bổ sung đệm phosphate này (pH 7,5) vào môi trường cho đủ 1L. Bảo quản ở 4 ºC.
Môi trường LB Bảng 3.2. Thành phần môi trường LB Thành phần Hàm lượng các chất Pepton 10 g/L Dịch chiết nấm men 0,5 g/L NaCl 10 g/L
Môi trường sau khi pha được hấp khử trùng tại 121oC trong 15 phút. Sau đó để nguội và bảo quản ở 4oC.
Môi trường M9
- Pha dung dịch gốc được thực hiện theo bảng sau:
Bảng 3.3. Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9
Dung dịch gốc Hóa chất Hàm lượng các chất
Muối M9 (10X) Na2HPO4.H2O KH2 PO4 NaCl NH4Cl 75,2 g/L 30 g/L 5 g/L 5 g/L 20% glucose Glucose 20 mg/L MgSO4 1M MgSO4.7H2O 24,65 g/100 mL CaCl2 1M CaCl2.2H2O 14,70 g/100 mL Các vitamin Biotin 50 mg/50 mL
Thiamin Thiamin (thiamin.HCl) 50 mg/50 mL
Nguyên tố vi lượng (100X) EDTA FeCl3.6H2O ZnCl2 CuCl2.2H2O CoCl2.2H2O H3BO3 MnCl2.4H2O 5g/L 0,83g/L 84 mg/L 13 mg/L 10 mg/L 10 mg/L 1,6 mg/L
Các dung dịch mẫu được pha và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội, bảo quản ở 4oC.
- Pha môi trường M9 (thành phần cho 1L môi trường) Tiến hành pha môi trường M9 theo bảng sau
Bảng 3.4. Thành phần môi trường M9 Thành phần Hàm lượng các chất Muối M9 100 mL 20% glucose 20 mL MgSO4 1M 1 mL Nguyên tố vi lượng (100X) 10 mL Biotin 1 mL Thiamin 1 mL CaCl2 0,3 mL
Lưu ý: Để tránh tạo kết tủa tạo CaSO4.2H2O, khi cho CaCl2 phải pha loãng với 10mL nước khử trùng, và cho vào sau cùng.
Sau khi đã cho đầy đủ các thành phần, nước cất khử trùng được thêm vào để thể tích đạt 1L và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 3 bình tam giác định mức 250mL đã được hấp khử trùng và sấy khô, ký hiệu tương ứng với 3 môi trường TB, LB, M9 như trên.
- Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa 3 loại kháng sinh Kanamycin, Streptomycin và Chloramphenicol ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37 °C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- Mỗi 500 µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang các bình định mức 250mL chứa 50 mL lần lượt các môi trường TB, LB, M9 nuôi ở 37°C và 220 vòng/phút.
- Bổ sung IPTG nồng độ cuối cùng 0,5mM khi mật độ quang học ở 600nm (OD600) đạt 0,6.
- Hạ nhiệt độ xuống 32°C và nuôi tiếp trong 3-5h tạo điều kiện cho các protein tái tổ hợp biểu hiện.
- Bổ sung rhamnetin đã hòa tan trong methanol và DMSO với nồng độ cuối cùng là 30 µM, nuôi tiếp trong 24h sau đó tiến hành tách chiết.
- Thu sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô, tiến hành thí nghiệm xác định hiệu suất chuyển hóa.
Hình 3.6. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Chúng tôi đã sử dụng các mức nồng độ IPTG cuối cùng khác nhau bao gồm: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mM.
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 6 bình tam giác định mức 100mL đã được hấp khử trùng và sấy khô, ký hiệu tương ứng với 6 mức IPTG thí nghiệm.
- Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa cả 3 loại kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4mL môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37°C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- Lần lượt mỗi 500 µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang các bình thể tích 250 mL có chứa 50 mL môi trường thích hợp.
- Tiến hành nuôi đồng thời các mẫu ở 37oC, tốc độ 220 vòng/phút trong 3-4h. - Khi OD600=0,6 thì tiến hành bổ sung IPTG lần lượt là 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mM tương ứng với ký hiệu ghi trên mỗi bình. Hạ nhiệt độ xuống 32oC, tốc độ 220 vòng/phút và nuôi trong 3-5h sau đó bổ sung cơ chất.
- Rhamnetin được bổ sung với nồng độ cuối cùng là 30µM, nhiệt độ và tốc độ lắc vẫn duy trì ở 32oC và 220 vòng/phút. Nuôi trong 24h sau đó tiến hành tách chiết, thu sản phẩm và thực hiện các thí nghiệm xác định hiệu suất chuyển hóa. 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O- rhamnoside
Các mức nhiệt độ được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm là 25, 27, 32 và 37oC kể từ sau khi bổ sung IPTG.
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị 4 bình tam giác định mức 250 mL đã được hấp khử trùng và sấy khô, ký hiệu tương ứng với 4 ngưỡng nhiệt độ thí nghiệm.
- Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa cả 3 loại kháng sinh Kanamycin, Streptomycin và Chloramphenicol ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nồng độ 100 µg/mL nuôi qua đêm ở 37°C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- 500 µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang bình định mức thể tích 250 mL đã chứa 50 mL môi trường thích hợp.
- Vi khuẩn được nuôi ở 37oC, tốc độ 220 vòng/phút trong 3-4h. Bổ sung IPTG nồng độ cuối cùng 0,5mM khi mật độ quang học ở 600nm (OD600) đạt 0,6.
- Sau đó tiến hành nuôi ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau bao gồm 25, 27, 32, và 37oC trong thời gian 4-5h.