Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-o-rhamnoside.
Trong nghiên cứu sinh tổng hợp để quá trình chuyển hóa đạt hiệu quả cao thì việc đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy là rất cần thiết. Việc kết hợp các điều kiện tối ưu sẽ giúp sản xuất ra một lượng lớn sản phẩm, từ đó rút ngắn thời gian thực hiện, giảm chi phí cho sản phẩm. Trong quy trình sinh tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside, nhóm chúng tôi đã tiến hành đánh giá 3 điều kiện được xem như có ảnh hưởng lớn đối với hiệu suất chuyển hóa đó là: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ IPTG bổ sung. Bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3-O-rhamnoside rhamnoside
Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất tổng hợp rhamnetin-3- O-rhamnoside được tiến hành trên 3 loại môi trường: TB (Terrific Broth), LB (Lysogeny Broth) và M9 có bổ sung glucose hàm lượng 4 g/L (nguồn cung cấp carbon).
3.2.1.1. Thành phần các môi trường
Môi trường TB
Thành phần các chất được sử dụng trong môi trường TB được thể hiện trong bảng 3.1 dưới đây.
Bảng 3.1. Thành phần môi trường TB
Thành phần Hàm lượng các chất
Tryston 12 g/L
Dịch chiết nấm men 24 g/L
Glycerol 4 mL/L
Ngoài ra, chuẩn bị riêng 100 mL nước cất có chứa 2,31 g KH2PO4 và 12,54 g K2HPO4 và khử trùng song song với thành phần trên. Sau khi trử trùng, để nguội tới 60 ºC hoặc thấp hơn rồi bổ sung đệm phosphate này (pH 7,5) vào môi trường cho đủ 1L. Bảo quản ở 4 ºC.
Môi trường LB Bảng 3.2. Thành phần môi trường LB Thành phần Hàm lượng các chất Pepton 10 g/L Dịch chiết nấm men 0,5 g/L NaCl 10 g/L
Môi trường sau khi pha được hấp khử trùng tại 121oC trong 15 phút. Sau đó để nguội và bảo quản ở 4oC.
Môi trường M9
- Pha dung dịch gốc được thực hiện theo bảng sau:
Bảng 3.3. Thành phần các dung dịch gốc dùng để pha môi trường M9
Dung dịch gốc Hóa chất Hàm lượng các chất
Muối M9 (10X) Na2HPO4.H2O KH2 PO4 NaCl NH4Cl 75,2 g/L 30 g/L 5 g/L 5 g/L 20% glucose Glucose 20 mg/L MgSO4 1M MgSO4.7H2O 24,65 g/100 mL CaCl2 1M CaCl2.2H2O 14,70 g/100 mL Các vitamin Biotin 50 mg/50 mL
Thiamin Thiamin (thiamin.HCl) 50 mg/50 mL
Nguyên tố vi lượng (100X) EDTA FeCl3.6H2O ZnCl2 CuCl2.2H2O CoCl2.2H2O H3BO3 MnCl2.4H2O 5g/L 0,83g/L 84 mg/L 13 mg/L 10 mg/L 10 mg/L 1,6 mg/L
Các dung dịch mẫu được pha và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội, bảo quản ở 4oC.
- Pha môi trường M9 (thành phần cho 1L môi trường) Tiến hành pha môi trường M9 theo bảng sau
Bảng 3.4. Thành phần môi trường M9 Thành phần Hàm lượng các chất Thành phần Hàm lượng các chất Muối M9 100 mL 20% glucose 20 mL MgSO4 1M 1 mL Nguyên tố vi lượng (100X) 10 mL Biotin 1 mL Thiamin 1 mL CaCl2 0,3 mL
Lưu ý: Để tránh tạo kết tủa tạo CaSO4.2H2O, khi cho CaCl2 phải pha loãng với 10mL nước khử trùng, và cho vào sau cùng.
Sau khi đã cho đầy đủ các thành phần, nước cất khử trùng được thêm vào để thể tích đạt 1L và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 3 bình tam giác định mức 250mL đã được hấp khử trùng và sấy khô, ký hiệu tương ứng với 3 môi trường TB, LB, M9 như trên.
- Chủng vi khuẩn được nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có chứa 3 loại kháng sinh Kanamycin, Streptomycin và Chloramphenicol ở 37°C.
- Cấy chuyển ra ống nghiệm chứa 4 mL môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol nuôi qua đêm ở 37 °C tốc độ lắc 220 vòng/phút.
- Mỗi 500 µL dịch nuôi sau đó được chuyển sang các bình định mức 250mL chứa 50 mL lần lượt các môi trường TB, LB, M9 nuôi ở 37°C và 220 vòng/phút.
- Bổ sung IPTG nồng độ cuối cùng 0,5mM khi mật độ quang học ở 600nm (OD600) đạt 0,6.
- Hạ nhiệt độ xuống 32°C và nuôi tiếp trong 3-5h tạo điều kiện cho các protein tái tổ hợp biểu hiện.
- Bổ sung rhamnetin đã hòa tan trong methanol và DMSO với nồng độ cuối cùng là 30 µM, nuôi tiếp trong 24h sau đó tiến hành tách chiết.
- Thu sản phẩm sau khi tinh sạch và đông khô, tiến hành thí nghiệm xác định hiệu suất chuyển hóa.
Hình 3.6. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới hiệu suất