vũ mạnh hưng nghiên cứu một số chỉ tiêu chất lượng định hướng tác dụng ức chế virus dengue của cỏ sữa lá nhỏ euphorbia thymifolia l

32 Bảng 11: Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng polyphenol tổng số tính theo đương lượng acid gallic trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ .... Tại một nghiên cứu tổng quan về các c

Tác nhân gây bệnh

Bệnh sốt xuất huyết dengue (SXHD) là bệnh do muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus truyền Tác nhân gây bệnh là virus Dengue thuộc chi Flavivirus, họ

Virus Dengue thuộc họ Flaviviridae, có 4 type huyết thanh khác nhau với nhiều kiểu gen khác nhau Các kiểu gen thuộc chu trình gây bệnh ở người thường gây ra những đợt dịch lớn, nghiêm trọng Trong khi đó, các kiểu gen thuộc chu trình ở rừng rú ít được biết đến hơn liên quan đến dịch tễ học và vai trò gây bệnh.

Hình 1: Cấu trúc virus Dengue [62]

Virus dengue có hình cầu, đối xứng khối, đường kính 45nm-50nm, chứa ARN một sợi đơn dương có chiều dài khoảng 11Kb, mã hóa cho 3 loại protein cấu trúc, 7 loại protein phí cấu trúc và 2 vùng không dịch mã UTR ở hai đầu Các protein cấu trúc của virus dengue bao gồm: Protein C (protein lõi - Capsid), protein M (protein màng- membrance) và protein E (protein envelop vỏ bao), các protein này đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và quyết định độc lực của virus Các protein phi cấu trúc bao gồm: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5; chúng tham gia vào quá trình sao chép ARN và nhân lên của virus Dengue [4], [32], [48]

Hình 2: Sơ đồ bộ gen của virus Dengue [15]

Virus Dengue có kháng nguyên kết hợp bổ thể, kháng nguyên trung hòa và kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định

3 kháng nguyên, người ta chia virus Dengue ra làm 4 type khác nhau được ký hiệu DENV-

1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 Dựa vào trình tự nucleotid vùng gen E, NS1, C-prM, ORFs , hoặc toàn bộ genome virus, để xác định các genotype trong từng type virus Dengue [22], [52]

Vòng đời của vi-rút DENV liên quan đến các sự kiện: hấp phụ, xâm nhập, hòa màng và giải phóng Virus liên kết với tế bào chủ thông qua tương tác giữa protein bề mặt của mình và thụ thể trên bề mặt tế bào Virus sau đó xâm nhập vào tế bào thông qua nội bào ARN và protein của virus được giải phóng vào tế bào chất ARN được dịch mã thành polyprotein và sau đó được phân cắt để tạo thành các protein ARN được sao chép thành ARN sợi âm, tạo khuôn mẫu cho quá trình sao chép dữ liệu di truyền tiếp theo Các protein virus và ARN mới được lắp ráp thành virion Virion được giải phóng khỏi tế bào và có thể tiếp tục lây nhiễm sang các tế bào khác.

Hình 3: Vòng đời của virus Dengue [39]

Vector truyền bệnh và con đường lây nhiễm

Muỗi Aedes aegypti và Aedes abopictus từ lâu đã được biết đến với vai trò vector truyền bệnh chủ yếu ở hầu hết các khu vực virus Dengue lưu hành Aedes albopictus ít

4 có vai trò truyền bệnh do ít đốt người và có thể sống ngoài thiên nhiên, rừng núi Tuy nhiên, trong những năm gần đây, vai trò gây bệnh của Aedes albopictus cũng đã được ghi nhận ở một số nước [38], [44]

Aedes aegypti có nguồn gốc từ châu Phi sau đó đã lan rộng ra hầu hết các khu vực khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [19] Loài muỗi này ưa thích đốt hút máu người, thường vào buổi sáng sớm và chiều tà, có thể đốt nhiều lần trong ngày Sau khi hút máu bệnh nhân nhiễm virus dengue, muỗi cái đã có khả năng truyền bệnh ngay khi nó hút máu người lành khác [7], [10], [44] Aedes aegypti thường đẻ trứng ở các vũng nước mưa, các đồ vật có chứa nước đọng nước [41]

Tại Việt Nam, muỗi Aedes aegypti là vector chính truyền bệnh sốt xuất huyết Chúng chủ yếu hoạt động vào hai giờ sau khi mặt trời mọc và vài giờ trước khi mặt trời lặn Mật độ muỗi Aedes aegypti thường tăng cao vào các tháng 7 và 8.

9 Trước đây, rất ít ổ dịch phát hiện có Aedes albopictus và nếu có mật độ loài muỗi này cũng rất thấp Nhưng trong những năm gần đây, tỷ lệ muỗi Aedes Albopictus xuất hiện tại vùng núi phía Bắc rất cao, nhưng cho đến nay chưa có công bố nào phát hiện được DENV từ Aedes albopictus ở Việt Nam [7], [11], [14]

Về con đường lây nhiễm, hiện nay tồn tại ba giả thuyết về đường lây truyền của DENV trong môi trường tự nhiên:

Thứ nhất, lây truyền ở động vật: Đây là đường lây truyền nguyên thủy gồm “khỉ - muỗi Aedes - khỉ” được ghi nhận ở Nam Á và châu Phi DENV chỉ gây nhiễm trong máu của loài khỉ mà không gây ra các biểu hiện bệnh Cả 4 type DENV đều phân lập được trong máu của loài khỉ

Thứ hai, lây truyền dịch tễ ở động vật: Đây là đường lây truyền giữa các loài khỉ Touqe trong giai đoạn 1986-1987, tại Sri Lanka, dựa trên nghiên cứu huyết thanh học Khoảng 94% số khỉ bị ảnh hưởng với phạm vi 3 km trong khu vực nghiên cứu Các DENV đã lây chéo sang con người từ loài linh trưởng khi có các điều kiện thuận lợi

Thứ ba, lây truyền dịch tễ: Chu trình này được duy trì bởi “Người - Aedes aegypti - người” Muỗi Aedes aegypti đã tạo ra chu kỳ dịch bệnh ở người và người trở thành nguồn lưu trữ DENV Sau khi hút máu người bị nhiễm DENV, virus sẽ nhân lên trong cơ thể muỗi bao gồm cả tuyến nước bọt, đường sinh dục, trứng đã phát triển đầy đủ vào thời điểm đẻ trứng Thời gian ủ bệnh bên ngoài, thường kéo dài khoảng 8 -12 ngày ở nhiệt độ 25-28°C Sau khi lây nhiễm, muỗi có thể lây truyền virus trong suốt quãng đời còn lại [61] Lây truyền SXHD qua truyền máu, cấy ghép và truyền qua nhau thai là khá hiếm [45] Để lây truyền xảy ra, muỗi cái phải đốt người bị nhiễm bệnh trong giai đoạn virus nhân lên, thường là 2 ngày trước khi biểu hiện triệu chứng sốt và 4-5 ngày sau khi bắt đầu sốt Nguy cơ lây nhiễm do muỗi có liên quan chặt chẽ với nồng độ virus trong máu và tình trạng sốt cao ở bệnh nhân

5 Đường lây truyền dịch tễ chính là đường lây truyền DENV ở loài người và con người đã trở thành vật chủ chính của DENV [61].

Các đích tác dụng dược lý tiềm năng ức chế virus Dengue

Các mục tiêu chính của thuốc kháng virus Dengue là các protein phi cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) và các enzyme virus (NS2B/NS3 protease, NS3 helicase, NS5-ARN phụ thuộc vào polymerase, NS5-methyltransferase) Bên cạnh đó, các protein cấu trúc tham gia xâm nhập tế bào chủ và lắp ráp hạt virus cũng là mục tiêu tiềm năng 4 đích tác dụng dược lý tiềm năng được chú ý là NS2B/NS3 protease, NS3 helicase, protein vỏ E và NS5-ARN phụ thuộc polymerase & NS5-methyltransferase.

NS3 là protein đa chức năng với hoạt tính của enzym serin giống chymotrypsin, với 2 enzym chính là ARN helicase và ARN triphosphatase NS3 tham gia vào quá trình phân cắt polyprotein của virus Dengue và sao chép ARN NS2B liên kết với NS3 để tạo thành phức hợp protease DENV và đóng vai trò là đồng yếu tố trong cấu trúc hoạt động của protease serin DENV của NS3 [42] NS2B/NS3 là một serine protease hai tiểu đơn vị, đóng vai trò chính trong các liên kết/phân cắt polyprotein của virus ở bảy vị trí khác nhau, việc ức chế chúng dẫn đến suy giảm sự phát triển của virus Có nghiên cứu đã chỉ ra, các protein NS3 tích cực phân tách với các tế bào chủ dẫn đến sự xáo trộn tín hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, giúp virus trốn tránh hệ thống miễn dịch [30]

NS3 là một protein đa chức năng được tìm thấy trong tất cả Flaviviridae, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus NS3 bao gồm serine protease ở đầu N chịu trách nhiệm phân cắt polyprotein của virus trong quá trình dịch mã và miền helicase /nucleotide triphosphatase (NTPase)/ARN triphosphatase ở đầu C có chức năng chính liên quan đến việc tháo xoắn chuỗi ARN kép thành chuỗi ARN đơn để tổng hợp bộ gen của virus Đột biến trong các vị trí hoạt động của NS3 helicase và NTPase làm bất hoạt chức năng của NS3 cũng như làm giảm khả năng sống sót của virus [74]

Protein E gồm ba miền (miền I–III), trong đó miền I là miền trung tâm có chức năng bản lề, miền II neo đậu ban đầu với màng tế bào, miền III liên kết và hòa màng virus với màng tế bào vật chủ Nhiều nghiên cứu ức chế DENV tập trung vào miền III của protein E vì đây là miền rất quan trọng giúp virus liên kết và xâm nhập vào tế bào vật chủ Các chất ức chế tập trung vào miền này không cần nhắm vào protein như một tổng thể, do đó có thể giảm nguy cơ phát triển khả năng kháng thuốc.

6 xâm nhập vào tế bào chất của tế bào để ức chế sự nhân lên hoặc giải phóng virion nên ít gây độc hơn [31]

1.1.3.4 NS5-ARN phụ thuộc polymerase và NS5-methyltransferase

Protein NS5 là protein lớn nhất (104 kDa) và được bảo tồn nhất trong số các protein của virus DENV Protein NS5 bao gồm 2 miền chức năng quan trọng: NS5-methyltransferase (MTase) và NS5-RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) Những miền này đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sao chép, phiên mã và gắn mũ bộ gen của DENV, trở thành mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc ức chế DENV.

Phương pháp điều trị sốt xuất huyết Dengue

1.1.4.1 Phương pháp điều trị hiện tại

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh SXHD Thực hiện các biện pháp phòng muỗi đốt là cách tốt nhất để tránh bị sốt xuất huyết Phần lớn các trường hợp đều được điều trị ngoại trú và theo dõi tại y tế cơ sở, chủ yếu là điều trị triệu chứng, bù dịch sớm bằng đường uống và theo dõi chặt chẽ phát hiện sớm sốc xảy ra để xử trí kịp thời [2]

1.1.4.2 Triển vọng điều trị trong tương lai

Phần lớn bệnh nhân mắc bệnh SXHD không có triệu chứng hoặc có triệu chứng nhẹ, được điều trị triệu chứng và bù dịch Tuy nhiên với các trường hợp trở nặng, do các dấu hiệu cảnh báo xuất hiện muộn nên có thể khó kiểm soát sốt xuất huyết nặng bằng các biện pháp thông thường và các biện pháp can thiệp thường muộn nên kém hiệu quả

Các hướng điều trị đặc hiệu cho SXHD gồm tác dụng vào virus dengue, tác dụng lên tế bào vật chủ và liệu pháp trị liệu kháng thể đơn dòng Bên cạnh đó, WHO ưu tiên phát triển vaccine phòng ngừa SXHD Tuy nhiên, phát triển vaccine SXHD gặp khó khăn do phải bảo vệ cả 4 type huyết thanh và hạn chế nguy cơ mắc SXHD nặng hơn ở lần nhiễm sau (ADE) Hai loại vaccine Dengvaxia và QDENGA® đã cấp phép ở một số quốc gia nhưng còn gây lo ngại, trong khi vaccine TV003/TV005 vẫn trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III.

Một số loài thực vật từ lâu đã có mặt trong phương pháp điều trị SXHD ở nhiều quốc gia trên thế giới [63] Do đó, nghiên cứu thuốc từ thực vật trong điều trị SXHD là một hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm Dịch chiết từ nhiều loài thực vật và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu được công nhận là có tác dụng chống

7 sốt xuất huyết trên các thử nghiệm in vitro, in silico và in vivo mở ra tiềm năng to lớn cho việc phát triển thuốc điều trị SXHD [59]

1.1.5 Một số hợp chất trong dược liệu có giá trị trong điều trị sốt xuất huyết Dengue

Năm 2020, Faraat Ali cùng các cộng sự đã công bố một nghiên cứu tổng quan có hệ thống về các hợp chất trong thực vật có giá trị điều trị bệnh sốt xuất huyết Dengue bao gồm 6 nhóm chất gồm: polysaccharid, flavonoid, alcaloid, terpenoid, glycosid và acid béo [23]

Polyphenol là một nhóm các chất chuyển hóa thực vật thứ cấp bao gồm hơn 8000 hợp chất được xác định cho đến nay Dựa trên số lượng vòng phenolic, chúng được phân loại thành các lớp khác nhau [34]

Bảng 1: Sơ đồ phân loại nhóm polyphenol [34]

Các hợp chất polyphenol có vai trò kháng virus thông qua nhiều cơ chế như ức chế trực tiếp virus hoặc protein virus, protein tế bào chủ hoặc các con đường sao chép virus Sự hiện diện của nhóm polyphenol góp phần quan trọng vào hoạt động kháng virus Nghiên cứu các dẫn xuất tổng hợp từ polyphenol mở ra triển vọng trong phát triển phương pháp điều trị sốt xuất huyết.

Tại một nghiên cứu tổng quan về các cây thuốc tiềm năng để điều trị sốt xuất huyết Dengue của Mohammed SM Saleh và Yusof Kamisah công bố năm 2020 đã chỉ ra có 51 hợp chất hoạt tính sinh học thu được từ nhiều nguồn thực vật khác nhau đã được báo cáo thể hiện các mức độ chống sốt xuất huyết Dengue khác nhau trong đó có 4 acid phenolic, 14 flavonoid, 17 polyphenol khác, glycosid flavonoid và các dẫn xuất [75]

8 Đặc biệt, acid gallic là một chất có cấu trúc hóa học tương đối đơn giản đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế DENV [57], [66] Có thể kể tới, một thử nghiệm tác dụng ức chế của acid gallic trên DENV-2, acid gallic cho hoạt tính ức chế cao nhất với IC50 là 0,191μg/mL, CC50 là 89,765 μg/mL và chỉ số chọn lọc là 469,408 ở

Axit gallic thể hiện hiệu quả ức chế DENV ở nồng độ 45 PFU, với giá trị IC50 là 0,522 μg/mL, CC50 là 89,765μg/mL và chỉ số chọn lọc là 171,963 ở 90 PFU Nghiên cứu cũng chứng minh axit gallic có khả năng làm giảm đáng kể kháng nguyên E phụ thuộc vào liều lượng, với hiệu quả cao nhất ở giai đoạn sau nhiễm trùng, cho thấy khả năng ức chế quá trình lây nhiễm sau khi virus xâm nhập tế bào Mô hình tương tác in silico cho thấy axit gallic có thể liên kết với protein NS5 MTase và NS5-RdRp, với năng lượng liên kết tương ứng là −7,49 và −7,35, hé lộ tiềm năng ứng dụng của axit gallic làm hoạt chất điều trị SXHD.

Bảng 2: Một số hợp chất polyphenol có tác dụng kháng DENV

Hợp chất Nhóm chất Nguồn gốc thực vật

Tác dụng kháng Dengue TLTK

Rumex dentatus, Commelina benghalensis, Ajuga bracteosa, Ức chế DENV-2 với hoạt tính ức chế cao nhất với IC50 là 0,191μg/mL, CC50 là 89,765 μg/mL và chỉ số chọn lọc là 469,408 ở 45 PFU

Propyl gallat acid phenolic Ức chế sự sao chép, bám dính DENV-2 in vitro CC50 223,99 μg/mL và IC50 = 15,57 μg/mL

Quercus lusitanica Ức chế DENV-2 protease (98%) ở nồng độ 0.3 mg/mL

Acid ellagic polyphenol Spondias mombin và Ức chế DENV-2 (25%) ở nồng độ 500 àg/mL

Gắn kết tốt với tất cả 4 glycoprotein của virus sốt xuất huyết 1-4 ức chế đáng kể sự nhân lên của vật chủ virus

Hiệp đồng tác dụng kháng virus với hyperoside

Quercetin Flavonoid Houttuynia cordata Ức chế DENV-2 ở 500 àg/mL (IC50 = 176.76 àg/mL)

Houttuynia cordata Ức chế DENV-2 ở 500 àg/mL (IC50 = 467,27 àg/mL)

[29], [60] Apigenin Flavonoid Ức chế sao chép DENV2 và thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa và kích hoạt STAT2 Tyr

Spondias tuberosa Ức chế DENV-2 ở 500 àg/mL 68,42%

Geraniin tannin Nephelium lappaceum, Geranuim thunbergii Ức chế sự sao chép của DENV-

2 trong cả thử nghiệm in vitro và in vivo

Tác dụng hiệp đồng chống DENV cùng acid gallic, geraniin và syringing

Nghiên cứu năm 2016 đã mô phỏng tương tác phân tử và phát hiện ba hợp chất triterpenoid trong cây Azadirachta indica có ái lực liên kết mạnh với protease DENV NS2B-NS3.

Năm 2017, andrographolide có nguồn gốc từ Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall ex Nees cho thấy hoạt tính tốt trên cả DENV-2 và DENV-4 [64]

Trong nghiên cứu tổng quan về cây thuốc tiềm năng để điều trị sốt xuất huyết của Mohammed SM Saleh và Yusof Kamisah công bố năm 2020 cũng đã chỉ ra 6 terpenoid,

2 ankaloid, 1 saponin, 7 polysaccharid có tác dụng ức chế virus Dengue tốt như: Andrographolid, Betulinic acid 3ò-caffeat, Castanospermin, Galactomannan, Kappa carrageenan, Palmatin, Trigocherrin (A, B, C), Acid ursolic,…[75] Trong nghiên cứu

“Khám phá hợp chất tự nhiên ức chế NS5 methyltransferase của virus dengue dựa trên tiếp cận in silico” các tác giả đã chỉ ra bên cạnh khung cấu trúc flavonoid, khung cấu trúc steroid có khả năng gắn kết tốt NS5 methyltransferase và ức chế protein này Trong đó, Ecliptalbin trong loài Eclipta prostrata cho thấy tiềm năng ức chế NS5 methyltransferase của DENV cao nhất với ái lực gắn kết 10,3 kcal.mol -1 [17]

Tổng quan về Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) 10 1 Vị trí phân loại

Thành phần hóa học

Theo các tài liệu đã công bố, thành phần hóa học của Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) gồm các hợp chất polyphenol, flavonoid, tanin, triterpen, terpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác [54], [58], [85] Trong đó, nhiều hợp chất có tiềm năng ức chế DENV tốt bao gồm:

Năm 1990, Lee và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của chất tannin có khả năng thủy phân mới là acid isomallotinic từ E thymifolia Ngoài ra, họ còn tìm thấy 15 loại tannin khác và một lượng lớn polyphenol trong E thymifolia.

12 Bảng 3: Một số hợp chất phenolic có trong Cỏ sữa lá nhỏ

STT Tên hợp chất Cấu trúc hóa học TLTK

Ngoài các hợp chất polyphenol có tiềm năng tốt trong điều trị SXHD, một số hợp chất steroid có tác dụng ức chế Dengue cũng xuất hiện trong Cỏ sữa lá nhỏ như: β –sitosterol đã được phân lập từ Cỏ sữa lá nhỏ [15] Qua nghiên cứu in silico và in vitro đã cho thấy khả năng ức chế sự nhân lên của DENV bởi β –sitosterol [37], [47], [60] Taraxerol và Campesterol [8], [58] được nghiên cứu có ái lực liên kết cao với NS2BNS3 và NS5 trong một nghiên cứu in silico thể hiện tiềm năng ức chế với NS2BNS3 và NS5 của DENV [60].

Tác dụng sinh học

Hiện tại, chưa có nhiều nghiên cứu công bố về tác dụng ức chế virus Dengue của

Cỏ sữa lá nhỏ hay tác dụng điều trị sốt xuất huyết của cây thuốc này trong y học cổ truyền Tuy nhiên một loài khác thuộc chi Euphorbia là Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) đã có nhiều nghiên cứu chứng minh là có tác dụng tăng số lượng tiểu cầu và ức chế virus Dengue [24], [26], [76], [77], [83]

Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) có nhiều đặc điểm tương đồng về thành phần hóa học với Cỏ sữa lá lớn như acid gallic, quercetin, myricetin, rutin, kaempferol và acid protocatechuic [81], [15], [54] trong đó acid gallic và một số hợp chất polyphenol đã được nghiên cứu có tác dụng ức chế DENV, điều này gợi ý về tiềm năng của Cỏ sữa lá nhỏ trong điều trị SXHD Gần đây, qua sàng lọc trong nghiên cứu in vitro tác dụng kháng virus dengue của một số dược liệu, cao Cỏ sữa lá nhỏ cho thấy tác dụng ức chế trên cả 4 chủng của virus Dengue với giá trị hiệu giá kháng thể trung hòa PNRT50 < 312,5 μg/ml trên cả 4 typ DENV Đây là nghiên cứu in vitro đầu tiên gợi ý về tác dụng ức chế virus Dengue của Cỏ sữa lá nhỏ [9]

Hoạt tính hạ đường huyết của cây Cỏ sữa lá nhỏ được đánh giá bằng xét nghiệm dung nạp glucose đường uống ở chuột Sau khi sử dụng các liều chiết xuất khác nhau, chuột được cho dùng glucose (2g/kg trọng lượng cơ thể) Một giờ sau đó, mức độ glucose trong huyết thanh được đo sau 2 giờ Kết quả cho thấy chiết xuất này làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết thanh ở chuột phụ thuộc vào liều lượng khi dùng với liều 50, 100, 200 và 400 mg/kg trọng lượng cơ thể Liều 400 mg/kg mang lại mức giảm glucose huyết thanh cao nhất (60,5%) So với thuốc hạ đường huyết tiêu chuẩn là glibenclamid (10 mg/kg trọng lượng cơ thể), chiết xuất này làm giảm nồng độ glucose huyết thanh 48,6%.[71]

1.2.5.3 Chống oxy hóa hoặc loại bỏ gốc tự do

Với hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, chiết xuất ethanol của E thymifolia hiệu quả trong việc ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở mô hình chuột thí nghiệm, thể hiện qua giảm nồng độ malondialdehyd trong não Ngoài ra, chiết xuất này còn ức chế gốc tự do nitric oxid, một sản phẩm của phản ứng peroxy hóa lipid Những tác dụng này ngang bằng với tác dụng của vitamin E, một chất chống oxy hóa tiêu chuẩn.

Hoạt tính chống viêm được đánh giá bằng chiết xuất ethanol của toàn bộ cây bằng phương pháp phù chân chuột do carrageenan gây ra Chiết xuất ở liều 100 mg/kg trọng lượng cơ thể làm giảm phù nề tương đương với thuốc tiêu chuẩn, Indomethacin (10 mg/kg) Chiết xuất được phát hiện có tác dụng chống viêm đáng kể [35]

Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol E thymifolia chống lại chủng nấm Candida albicans đã được báo cáo Cao lỏng E thymifolia có tác dụng kháng tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, trực khuẩn lỵ Shigella Flexneri, S Sonnei, S Shigae [8] Chiết xuất ethyl acetate (0,45 mg/ml) và chloroform (0,7 mg/ml) của E thymifolia chống lại Escherichia coli và Shigella flexneri [8] Cả hai chất chiết xuất đều ức chế sự phát triển của E coli và S flexneri bằng các nghiên cứu trong thử nghiệm in-vitro, chiết xuất ethyl axetat chống lại S flexneri bằng in-vivo E thymifolia thể hiện hoạt động kháng khuẩn nhờ các alkaloid

Mủ tươi cho hoạt tính tốt hơn khi so sánh với mủ pha loãng, mủ khô và chiết xuất ethyl acetat, butanol, chloroform của cây tươi [50], [51], [58].

Ứng dụng

Ở nhiều quốc gia, Cỏ sữa lá nhỏ (E thymifolia L.) được ứng dụng rộng rãi trong y học với các công dụng như: an thần, cầm máu; kích thích, làm se niêm mạc đường tiêu hóa giúp cải thiện bệnh tiêu chảy và kiết lỵ; có tác dụng tẩy giun sán.

15 làm dịu, nhuận tràng; và cả các trường hợp đầy hơi, táo bón; trong ho mãn tính; thuốc kháng virus trong bệnh hen phế quản và viêm quanh móng [49], [69], [79], [88]

Dịch ép cây cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng ở miền nam Ấn Độ để chữa bệnh giun đũa Cây tươi được sử dụng trong bệnh nhãn khoa, nhiệt miệng, lở loét, teo, kiết lỵ và đau vú

Cây cũng được sử dụng làm thuốc hạ sốt, trị cảm lạnh mãn tính, rối loạn kinh nguyệt, nhiễm trùng đường tiết niệu, các bệnh về da như bệnh phong, sởi và các bệnh khác Cây nghiền nát được xoa lên đầu như một chất gây kích ứng để thúc đẩy sự phát triển của tóc trong trường hợp rụng tóc Người ta cho rằng mủ Cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng trị mụn trứng cá và làm thuốc bổ trị rong kinh [49], [50] Ở Việt Nam, theo Đỗ Huy Bích, Cỏ sữa lá nhỏ có vị đắng the, tính bình, mát Tác dụng thông huyết, cầm máu, giảm đau, tiêu độc, kháng khuẩn, thông sữa và lợi niệu Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được dùng làm thuốc chữa lỵ trực khuẩn rất phổ biến nhất là đối với trẻ em Ngoài ra còn dùng chữa cho trẻ em ỉa chảy phân xanh, mụn nhọt, phụ nữ băng huyết hoặc mới đẻ ít sữa, tắc tia sữa, làm nở phế quản, trị bệnh ngoài da [8], [12]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu – thiết bị 16 2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, hóa chất, dung môi

- Chiết xuất dược liệu: Ethanol (EtOH), Methanol (MeOH), nước cất, dung dịch acid chlorhydric đậm đặc

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Toluen, ethylacetat, dichloro methan, acid formic, aceton Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck

- Hóa chất định lượng: Thuốc thử Folin-Ciocalteu, dung dịch Na2CO3 7,5%, Methanol HPLC, acid phosphoric

- Chất đối chiếu: Acid gallic có độ tinh khiết ≥98%: hãng Chemfaces (Phụ lục 2)

- Đánh giá in vitro tác dụng ức chế virus Dengue: Eagle’s MEM (EMEM); Fetal Bovine Serum (FBS); 0.5% 10x trypsin-EDTA solution; Dulbeco Phosphate Buffered Saline (PBS), Gibco, 500ml; Methylcellulose-4000, Wako Pure Chemical Industry, 500g; 7.5% Sodium Carbonate Solution (NaHCO3), Gibco, 100ml (25080); L-Glutamine-200mM, Gibco, 20ml (25030-149); Dung dịch Formandehyde 37%; Crystal violet

2.1.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

- Dụng cụ: Dụng cụ thí nghiệm thường quy bằng thủy tinh: cốc có mỏ, bình nón, bình định mức, phễu, pipet, đũa thủy tinh, lọ vial, giấy lọc, màng lọc 0,45 àm

+ Máy cô quay, bếp hồng ngoại

+ Tủ sấy Memmert (Đức), tủ hốt

+ Máy đo quang phổ UV- VIS: Hitachi U-1800

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu, Nhật Bản)

+ Tủ nuôi ấm 37 độ C, 5% CO2

+ Tủ an toàn sinh học cấp hai

+ Pippetman và đầu cụn: 10; 20; 100; 200 và 1000 àl

+ Tube ly tâm 1,5 ml vô trùng

+ Trang phục bảo hộ (găng tay, khẩu trang )

2.1.2.3 Dòng tế bào và virus

- Tế bào BHK21 (được cung cấp bởi Trường Đại học Nagasaki, Nhật Bản) được nuôi cấy trong môi trường EMEM.17

- Chủng virus Dengue type 1 (Chủng VN/2017/D7709)

- Chủng virus Dengue type 2 (Chủng 00St22A)

- Chủng virus Dengue type 3 (Chủng SLMC50)

- Chủng virus Dengue type 4 (Chủng SLMC318)

Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Định lượng polyphenol tổng số

Nội dung 1: Định lượng polyphenol tổng số trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ tính theo đương lượng acid gallic bằng phương pháp Folin-Ciocalteu

Nội dung 2: Định tính acid gallic bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nội dung 3: Điều chế và khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ Nội dung 4: Đánh giá invitro tác dụng ức chế virus Dengue của Cao đặc cỏ sữa lá nhỏ điều chế được bằng phương pháp trung hòa giảm đám hoại tử (PNRT)

2.3.1 Định lượng polyphenol tổng số

- Phương pháp: Folin-Ciocalteu (Waterman & Mole, 1994)

- Nguyên tắc: Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức phosphor wolframphosphomolypdat Phức này sẽ bị khử bởi các hợp chất polyphenol tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh thẫm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ polyphenol Căn cứ vào cường độ màu được đo trên máy đo độ hấp thu quang ở bước sóng 765 nm và phương trình đường chuẩn của acid gallic với thuốc thử có thể xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong mẫu nghiên cứu

- Chuẩn bị dung dịch thử:

Dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ được xay nhỏ đến cỡ bột thô (1400/355) Cân chính xác khoảng 1,5 g bột thô dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml, thêm dung môi chiết vào thấm ẩm dược liệu sau đó thêm vừa đủ 25 ml EthOH 70% chiết siêu âm trong 15 phút, thu lấy dịch chiết lần 1 Thêm tiếp 25 ml dung môi vào ống chiết trong điều kiện và thời gian như lần 1 Thu dịch chiết lần 2 Gộp dịch chiết lần 1 và lần 2 vào bình định mức 50ml Dùng 1 lượng EthOH 70% vừa đủ để rửa bã dược liệu sau đó thêm vào bình định mức trên vừa đủ 50ml Lắng, lọc, ly tâm sau đó hút 3ml cho vào bình định mức 100ml Bổ sung EthOH 70% vừa đủ 100ml Lắc đều thu được dung dịch thử A

Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% được pha loãng bằng nước cất

Dung dịch Na2CO3 7,5%: Cân 7,50g Na2CO3 khan hòa tan trong 100ml nước cất

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn:

Cân chính xác khoảng 10 mg acid gallic chuẩn vào trong bình định mức 10 ml, hòa tan và bổ sung bằng nước cất vừa đủ đến vạch Pha loãng tiếp bằng nước cất để được dãy dung dịch chuẩn nồng độ 10 àg/ml, 20 àg/ml, 50 àg/ml, 75 àg/ml, 100 àg/ml

Lần lượt cho 1 ml dung dịch thử A hoặc nước cất hoặc dung dịch gallic acid chuẩn vào bình định mức 10 mL Thêm 5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, lắc đều, để yên 5 phút Sau đó, thêm tiếp 4 mL Na2CO3 7,5% Lắc đều, thêm nước cất để đạt thể tích 10 mL Hỗn hợp được để yên trong tối 1 giờ, sau đó, đo độ hấp thu ở bước sóng 765 nM

Hình 5: Quy trình tiến hành định lượng polyphenol tổng số

- Thẩm định phương pháp định lượng:

Hàm lượng polyphenol toàn phần trong dịch chiết được tiến hành theo hướng dẫn của AOAC [90] về độ phù hợp hệ thống, độ lặp lại, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giá trị RSD được sử dụng để đánh giá các chỉ tiêu trên được quy định theo hàm lượng chất cần định lượng trong mẫu đem định lượng theo AOAC [90] được thể hiện ở Bảng 4

Bảng 4: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau

Độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống, được phân tích dựa trên các yếu tố như máy móc và thiết bị.

Tiến hành đo hấp thụ của dung dịch thử 6 lần Ghi lại các giá trị độ hấp thụ A Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,7% [90]

 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ chất phân tích

Tiến hành đo quang các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ A và nồng độ dung dịch chuẩn Đường chuẩn được đánh giá dựa vào hệ số hồi quy tuyến tính R (hay giá trị R 2 )

 Độ lặp lại Độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại trên cùng một đối tượng trong cùng một điều kiện phân tích Độ lặp lại được đánh giá bằng sự phân bố của các giá trị đo trong các phép thử quanh giá trị trung bình, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên cùng một mẫu dược liệu và tính toán SD và Yêu cầu: RSD ≤ 2,7% [90]

 Độ đúng: Độ đúng của phương pháp định lượng: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của phép phân tích và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lí thuyết

Để xác định độ chính xác bằng phương pháp thêm chuẩn, cần tạo các mẫu thử thêm chuẩn với nồng độ tương ứng là 80%, 100% và 120% lượng acid gallic chuẩn có trong mẫu thử.

Cụ thể, cách chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn được chuẩn bị với lượng như bảng 5, sau khi phối hợp dung dịch thu được được lắc đều trong 5 phút sau đó tiến hành tạo phức với thuốc thử folin-ciocalteu và đo quang theo các bước đã trình bày ở trên Ghi nhận số liệu và tính toán độ thu hồi

20 Mẫu Nồng độ mẫu chuẩn sử dụng (àg/ml)

V dung dịch chuẩn V dung dịch thử (ml)

Bảng 5: Cách chuẩn bị mẫu thẩm định độ đúng phương pháp định lượng polyphenol tổng số Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi (R%) của một lượng chất chuẩn đã biết được thêm vào mẫu phân tích Độ thu hồi được tính theo công thức sau:

Cm+C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chất chuẩn thêm (lý thuyết)

Yêu cầu: Độ thu hồi 97,0% – 103,0% [90]

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Bàn luận 42 1 Về định lượng polyphenol tổng số

3.2.1 Về định lượng polyphenol tổng số

Theo các tài liệu đã công bố, thành phần hóa học của Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) gồm các hợp chất polyphenol flavonoid, tanin, triterpen, terpen, sterol, acid hữu cơ, tinh dầu và các thành phần khác [54], [58], [85] Trong số đó, các hợp chất phenolic thể hiện vai trò to lớn trong tác dụng kháng virus Dengue thông qua nhiều cơ chế hoạt động như các cơ chế tác động trực tiếp chống lại các hạt virus hoặc protein virus, protein tế bào chủ hoặc các con đường liên quan đến chu kỳ sao chép và nhân lên của virus [64] Các hợp chất có tác dụng trên DENV tiêu biểu có thể kể tới thuộc nhóm polyphenol là acid gallic, quercetin, quercitrin, geraniin, Vì vậy, việc đánh giá hàm lượng polyphenol tổng số có liên quan mật thiết và có ý nghĩa lớn trong việc nghiên cứu giá trị của Cỏ sữa lá nhỏ trong điều trị SXHD

Trong nghiên cứu này, hàm lượng tổng các hợp chất polyphenol trong dịch chiết Ethanol 70% được định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ UV-VIS bởi các hợp chất phenolic phản ứng lên màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi Ethanol là dung môi xanh, rẻ, được sử dụng phổ biến Qua khảo sát các nồng độ Ethanol khác nhau (25%, 50%, 70%, 96%) nhận thấy, dung môi

43 Ethanol 70% cho kết quả hàm lượng polyphenol tổng số tính theo đương lượng acid gallic cao nhất, quá trình lọc, lắng, ly tâm diễn ra thuận lợi Ở nồng độ ethanol thấp hơn (25%, 50%) dược liệu trương nở mạnh, quá trình lắng, lọc, ly tâm diễn ra khó khăn gây hao hụt, sai số trong quá trình định lượng Phương pháp định lượng nêu trên được sử dụng khá phổ biến, dễ thực hiện, có tính ứng dụng thực tế cao và được thẩm định về độ thích hợp hệ thống, độ đúng, độ lặp lại, độ tuyến tính, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện chứng tỏ kết quả định lượng là đáng tin cậy Từ kết quả định lượng, hàm lượng polyphenol tổng số tính theo đương lượng acid gallic trong mẫu dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ nghiên cứu là 49,84 (mg GAE/g dược liệu)

Kết quả nghiên cứu này đóng góp vào việc thiết lập tiêu chuẩn dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ, định hướng cho các nghiên cứu hóa thực vật tiếp theo về các hợp chất phenolic, tổng quan về hàm lượng các hợp chất này trong Cỏ sữa lá nhỏ.

3.2.2 Về định tính và định lượng acid gallic toàn phần Đã có một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của acid gallic cũng như một số tannin gallic như geraniin, colargin… là những thành phần mang lại tác dụng ức chế DENV tốt [75] Tiêu chí được dùng để đánh giá hàm lượng của các thành phần này trong

Cỏ sữa lá nhỏ là hàm lượng acid gallic toàn phần thông qua quá trình thủy phân bởi acid chlorhidric 4M và nhiệt độ Đề tài đã tiến hành định tính acid gallic, định lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ bằng cách thủy phân để chuyển acid gallic dạng kết hợp trong taniin gallic, muối gallat về dạng acid tự do

- Định tính acid gallic: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để tiến hành định tính acid gallic trong dịch chiết Cỏ sữa lá nhỏ cũng như trong cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ điều chế được Phương pháp sử dụng thiết bị đơn giản, chi phí thấp và thực hiện nhanh; thực hiện tách dễ dàng với các mẫu có nhiều thành phần như dịch chiết dược liệu Tuy nhiên, phương pháp sắc ký lớp mỏng có độ lặp lại của trị số Rf thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá trình khai triển sắc ký Sau khi khảo sát trên các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, nhằm so sánh khả năng chiết tách của các hệ dung môi đã tìm ra 2 hệ có khả năng tách tốt, bao gồm hệ I: CH 2 Cl 2 : Acid formic : Aceton = 8:1:2 và hệ II: EtOAc : Toluen: Acid formic = 6:6:1 Trong đó hệ II: EtOAc : Toluen: Acid formic = 6:6:1 cho kết quả tách tốt nhất Từ kết quả sắc kí đồ của dịch chiết Cỏ sữa lá nhỏ và cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ điều chế được cho thấy vết có Rf và màu sắc tương đồng với chất đối chiếu acid gallic chuẩn Do vậy, có thể kết luận được sự có mặt của acid gallic trong mẫu dược liệu nghiên cứu và mẫu cao đặc điều chế được

- Định lượng acid gallic toàn phần: Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp HPLC để tiến hành định lượng acid gallic toàn phần do đây là phương pháp phổ biến được sử dụng để định lượng acid gallic, đồng thời phương pháp này có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác

44 Tham khảo chuyên luận dược liệu Ngũ Bội tử trong Dược điển Việt Nam V, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hệ dung Methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% để tiến hành khảo sát và kết quả điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

 Cột: C18 Inersustain GL Science (250  4,6 mm; 5 m)

 Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% = 15 : 85

 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

 Dectector DAD với bước sóng 214 nm

Quá trình thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ về tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chụm (độ lặp lại), độ đúng đều đạt giới hạn yêu cầu Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký được lựa chọn là hoàn toàn phù hợp Kết quả định lượng có độ tin cậy cao

Tiến hành định lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ nhận thấy hàm lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu là 0,257%

Kết quả của nghiên cứu với việc xác định được hàm lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ, là cơ sở cho các nghiên cứu phân lập, tối ưu hóa chiết xuất acid gallic từ Cỏ sữa lá nhỏ sau này

3.2.3 Về điều chế và khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ

Cao Cỏ sữa lá nhỏ có thành phần tương tự dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ, không có tá dược bổ sung Do đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp định lượng acid gallic đã xây dựng và thẩm định đối với dược liệu để định lượng acid gallic toàn phần trong cao đặc điều chế được và đã xác định được hàm lượng acid gallic troàn phần trong cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ là 0,91%

Hiệu suất chiết acid gallic toàn phần là 64,49% Điều này có thể lý giải do acid gallic và các tanin gallic có cấu trúc phân tử khác nhau, dẫn đến độ phân cực khác nhau (acid gallic và muối gallat có độ phân cực lớn và các tanin gallic có độ phân cực kém hơn) Dung môi ethanol 25% là dung môi có độ phân cực vừa phải, cho thấy đây là dung môi phù hợp để chiết được nhiều acid gallic và tanin gallic nhưng không chiết được hết hoàn toàn do không có độ phân cực phù hợp với tất cả hợp chất cần chiết Ngoài ra hiệu suất chiết xuất acid gallic còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian thủy phân, các thành phần khác trong dược liệu,…

Kết quả của nghiên cứu với việc khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng gồm: cảm quan, mất khối lượng do làm khô (7,62%), định tính được sự có mặt của acid gallic và định lượng acid gallic toàn phần trong mẫu cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ điều chế được là 0,91% góp phần xây dựng tiêu chuẩn cao dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ, cũng như bước đầu

45 có thể xác định được các chỉ tiêu cần khảo sát trong các nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất acid gallic từ dược liệu Cỏ sữa lá nhỏ

3.2.4 Về tác dụng ức chế virus Dengue của cao đặc Cỏ sữa lá nhỏ