Nghiên cứu một số tính chất sinh hóa và tác dụng sinh học của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum nees radlk

Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS.Võ Hồi Bắc, người tận tình hướng dẫn, bảo truyền đạt cho em kinh nghiệm vô quý báu suốt trình thực tập viết báo cáo tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn toàn thể cán phịng Sinh hóa thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập phòng nghiên cứu Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công nghệ Sinh học- Viện đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho em vốn kiến thức năm em học tập trường Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối em xin kính chúc q Thầy, Cơ dồi sức khỏe đạt nhiều thành công nghiệp cao quý Hà nội, ngày 22, tháng 5, năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thu Hà Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT CÂY XUÂN HOA 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CÂY XUÂN HOA 1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.2.3 Nghiên cứu dược tính 1.3 ĐỊNH NGHĨA VÀ PHÂN LOẠI PROTEASE 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phân loại 1.4 ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE 1.5 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PROTEASE TỪ THỰC VẬT VÀ TỪ CÂY XUÂN HOA 11 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 VẬT LIỆU 12 2.1.1 Mẫu thí nghiệm 12 2.1.2 Hóa chất sử dụng 12 2.1.3 Máy móc, thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.2.1 Phương pháp chiết rút protease từ Xuân Hoa 12 2.2.2 Xác định hoạt độ protease khuếch tán đĩa thạch có chứa chất Leluk cộng 13 2.2.3 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 13 2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 15 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp 2.2.5 Phương pháp tinh enzyme 16 2.2.6 Điện di protein 18 2.2.7 Phương pháp nghiên cứu tính chất protease 19 2.2.8 Xác định hoạt tính quét gốc tự sử dụng phương pháp DPPH 20 2.2.9 Xác định hoạt tính kháng viêm invitro sử dụng phương pháp ức chế enzyme hyaluronidase theo phương pháp Reissig 20 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 22 3.1 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ENZYME TRONG LÁ XUÂN HOA THEO MÙA 22 3.2 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA 22 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT HOẠT HĨA VÀ KÌM HÃM LÊN CHẾ PHẨM ENZYME PROTASE 29 3.3.1 Ảnh hưởng Mercapetanol lên hoạt tính protease 29 3.3.2 Ảnh hưởng Sodium thiosulfate (Na2S2O3) lên hoạt tính protease 29 3.3.3 Ảnh hưởng EDTA lên hoạt tính protease 30 3.3.4 Ảnh hưởng H2O2 lên hoạt tính protease 31 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA PH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH PROTEASE 31 3.5 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PROTEASE TINH SẠCH TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA 32 3.5.1 Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase, kháng viêm protease từ Xuân Hoa 32 3.5.2 Đánh giá hoạt tính quét gốc tự protease Xuân Hoa 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 40 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT APS: Amonium Persulfat BSA: Bovine Seurum Albumin DMAB: p-dimethylamino benzaldehyde DMSO: Dimethyl Sulfoxide DPPH: 1,1-diphenyl-2 icrylhydrazyl EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GFP: Green Fluorescent Protein HA: Hyaluronic Acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography OD: Optical Density SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfat PolyAcrylamide TCA: Tricloacetic UV: Ultra Violet Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn tyrosine 14 Bảng 2.2 Xác định đường cong chuẩn protein 15 Bảng 2.3: Công thức pha gel tách (12%) 18 Bảng 2.4: Công thức pha gel cô (5%) 18 Bảng 2.5: Nồng độ chất ảnh hưởng đến hoạt tính protease 20 Bảng 2.6: Xác định khả kháng viêm enzyme protease Xuân Hoa 21 Bảng 3.1: Hàm lượng enzyme Xuân Hoa theo mùa 22 Bảng 3.2: Tóm tắt q trình tinh protease từ Xuân Hoa 26 Bảng 3.3: Kết xác định hoạt tính quét gốc tự protease 34 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 1.1: Cây Xuân Hoa Hình 3.1: Sơ đồ làm protease từ Xuân Hoa 23 Hình 3.2: Tinh protease từ Xuân Hoa cột DEAE-Sephadex A-50 25 Hình 3.3: Điện di protein phân đoạn sau qua cột sắc kí trao đổi ion DEAESephadex A-50 gel polyacrylamit 12.5% 25 Hình 3.4: Tinh protease từ phân đoạn ống 12-16 DEAE-Sephadex A-50 cột Sephacryl S-200 26 Hình 3.5 Kiểm tra hoạt tính protease Xuân Hoa qua bước tinh 27 Hình 3.6: Phổ điện di protein bước tinh enzyme 28 Hình 3.7: Phổ điện di protein bước tinh enzyme 28 Hình 3.8: Ảnh hưởng Mercapetanol lên hoạt tính protease 29 Hình 3.9: Ảnh hưởng Na2S2O3 lên hoạt tính protease 29 Hình 3.10: Ảnh hưởng EDTA lên hoạt tính protease 30 Hình 3.11: Ảnh hưởng H2O2 lên hoạt tính protease 31 Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính protease từ Xn Hoa 31 Hình 3.13: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa 32 Hình 3.14: Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase protease 33 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk thuộc họ Ơrơ Acanthaceae dùng dân gian để chữa nhiều bệnh như: nhiễm khuẩn tiêu hóa, trĩ, chấn thương chảy máu, tiêu mủ vết thương…Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết, ức chế enzyme acetylcholinesterase Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính tác dụng dược lý tập trung vào nhóm chất thứ cấp cịn nhiều công dụng khác lưu truyền dân gian Xuân Hoa chưa chứng minh Trong năm gần đây, việc ứng dụng protease Y học nhà khoa học giới quan tâm Các nghiên cứu cho thấy protease có hiệu điều hòa miễn dịch, kháng viêm, tiêu cục máu đông, làm mau lành vết thương, chống tắc nghẽn mạch máu, chống ung thư… Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa chứa hàm lượng lớn enzyme protease Cho đến chưa có nghiên cứu cách có hệ thống protease từ Xn Hoa, chưa có nghiên cứu sâu tìm hiểu đặc tính sinh hóa chế tác dụng khả ứng dụng Y học protease Do tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu số tính chất sinh hóa tác dụng sinh học protease từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk ” Đề tài chúng tơi nghiên cứu cần thiết, góp phần bổ sung thông tin khoa học thuốc quý Việt Nam Trong đề tài này, chúng tơi tập trung nghiên cứu nội dung sau đây: - Tinh protease từ thuốc Xuân Hoa P palatiferum (Ness) Radlk - Xác định số tính chất sinh hóa protease tinh - Đánh giá số tác dụng sinh học protease từ thuốc: hoạt tính quét gốc tự kháng viêm Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT CÂY XUÂN HOA Cây Xuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, cịn có tên Tu Linh, Nhật Nguyệt hay Con Khỉ, Hoàn Ngọc, Thần dưỡng sinh, Trắc Mã, Điền Tích, Lan Điều Tên khoa học Pseuderanthemum Palatiferum Radik (Nees) Họ Ô rô (Acanthaceae) họ thực vật hai mầm thực vật có hoa, chứa khoảng 250 chi khoảng 2.700 loài [Henrik Fischer W Jensen,1988] Theo Phạm Hoàng Hộ [Phạm Hồng Hộ,2000], chi Pseuderanthemum có khoảng 196 lồi Ở Việt Nam, chi Pseuderanthemum có lồi thứ Đề tài khảo sát thành phần hóa học Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Mơ tả: Cây mọc cao từ 1-2m sống lâu năm, thân xanh màu tím lục, già chuyển thành màu nâu, phân nhiều nhánh, mọc đối diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp nguyên, cuống dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm Hoa mọc kẽ đầu cành Hoa lưỡng tính, khơng Bộ phận dùng: Lá Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang nhiều nơi, coi thuốc q có uy tín dân gian tỉnh thành miền Bắc, thủ đô Hà Nội Từ năm 1998, rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa bệnh thuộc nhóm bệnh đường tiêu hóa Hình 1.1: Cây Xn Hoa Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CÂY XUÂN HOA 1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục [Xuân Lục,2005] đưa số thuốc từ kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa: • Chữa bệnh đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày khỏi, nấu canh nhạt để ăn • Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dày, đường ruột, đái máu, phân máu kể đái buốt, đái rắt,…): ăn đói sắc nước đặc để uống, nấu canh độ bát nhỏ Ăn 1-5 lần, máu cầm, nên ăn ngày lần • Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn xong, đau giảm dần, người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác khỏi bệnh Thử nghiệm qua số bệnh ung thư dày, gan, phổi,… thấy có diễn biến tốt Lượng dùng thường xuyên theo mức độ đau, thông thường ngày lần, lần 3-7 lá, tùy theo hiệu giảm đau • Các bệnh u phổi, tiền liệt tuyến: liều dùng trên, sau tuần triệu chứng giảm hẳn, bệnh nhân ăn ngủ tốt Riêng u xơ tiền liệt tuyến, ăn vào cuối tháng, khoảng tháng liên tục • Các bệnh gan (xơ gan cổ trướng, viêm gan,…): ăn tươi ngày lần đói Bột khô với bột Tam thất theo tỉ lệ 1:1 thuốc trị xơ gan đặc hiệu • Bệnh thận (viêm thận cấp mãn, suy thận, tượng nước đái đục, đái máu): điều trị sau tuần Ăn lần/ngày, nước giải nửa ngày tăng lên lần/ngày Trong thời gian nửa tháng, triệu chứng bệnh giảm rõ rệt • Chữa viêm loét (loét dày, hành tá tràng, đại tràng, trĩ nội ngoại, trực tràng,…): ăn tươi đói (tốt vào buổi sáng) Với vết thương thuộc phạm vi dày, cần ăn tuần, tránh uống rượu mạnh Khi chữa vết loét thuộc phần ruột, liều lượng cần nhiểu tùy theo nặng, nhẹ • Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: biến đổi huyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợp mắt nghỉ thời gian ngắn, huyết áp trở lại bình thường, lên rối loạn thần kinh thực vật, tùy theo mức độ để định Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp liều lượng, ăn vào buổi sáng giúp thể ổn định ngày đề phòng thời tiết thay đổi đột ngột • Chữa chấn thương (các loại chấn thương, đặc biệt chấn thương sọ não, va đập, gãy dập xương hay bắp thịt): thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục mô bị dập, kháng viêm nhiễm, làm thuốc đắp thuốc uống Với vết thương kín, nhai để đắp, vết thương hở nên giã để đắp • Chữa cảm cúm: kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi, nhiệt độ cao, nên ăn cách giờ, sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn tiêu hóa khỏi Sau sốt, nên ăn cháo có thuốc trộn vào giúp cho người bệnh mau chóng trở lại bình thường • Khơi phục sức khỏe: mệt mỏi toàn thân cần nâng cao sức chịu đựng cường độ cao, nên ăn liều đinh 5-7 trước nửa Trẻ lỏng nên lấy từ 1-2 giã lấy nước cho uống 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu cộng [Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, 2000] cô lập hợp chất phytol, β-sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol poriferasterol, β-sitosterol 3- β-O-D-glucopyranoside từ Xuân Hoa Năm 2003, Phan Minh Giang cộng [Phan Minh Giang, 2003] cô lập từ khô Xuân Hoa hợp chất 1-pentacosanol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside stigmasterol 3-O-βD-glucopyranoside apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside Năm 2004, Nguyễn Văn Hùng cộng [Nguyễn Văn Hùng, 2004] cô lập tứ Xuân Hoa hợp chất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid palmitic acid Năm 2005, Mai Đình Trị cộng [Mai Đình Trị, 2005] lập hợp chất từ Xuân Hoa bao gồm: β-amyrin, oleanolic, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn hợp hợp β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside stigmasterol 3O-β-D-glucopyranoside Năm 2007, Trần Kim Thu Liễu [Trần Kim Thu Liễu, 2007] cô lập từ Xuân Hoa hợp chất squalene, dotriacontane, phytol, palmitic acid, β4 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Từ kết trình bày bảng 3.2 chúng tơi nhận thấy quy trình để tinh protease từ Xuân Hoa (theo hình 3.1) cho chế phẩm enzyme có độ tăng gấp 11,48 lần, hoạt độ riêng ( 2,44 đv/ mg Pr) Protease sau tinh chế qua giai đoạn khác kiểm tra hoạt tính đĩa thạch có chứa casein theo phương pháp mơ tả mục 2.2.2 Kết hình 3.5 cho thấy protease qua bước tinh có hoạt tính mạnh Chúng tơi tiến hành kiểm tra protein hoạt tính protease qua bước tinh phương pháp điện di gel polyacrylamide (hình 3.6) Kết cho thấy sau tinh qua cột Sephacryl S200 cho băng protein có kích thước khoảng 80 KDa Hình 3.5 Kiểm tra hoạt tính protease Xuân Hoa qua bước tinh Nước cất, Enzyme qua tủa cồn, Enzyme qua Ca3(PO4)2, Enzyme qua DEAE-Sephadex A-50, Enzyme qua Sephacryl S-200 27 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp 94 67 43 30 20.1 14.4 Hình 3.6: Phổ điện di protein bước tinh enzyme 1-Dịch chiết 2- Tủa cồn 3- Qua Ca3(PO4)2 4- Qua cột DEAE-Sephadex A-50 5- Qua Sephacryl S-200; 6- Maker protein Hình 3.7: Phổ điện di protein bước tinh enzyme 1-Dịch chiết , 2- Tủa cồn, 3-Qua Ca3(PO4)2, 4- Qua cột DEAESephadex A-50, 5- Qua Sephacryl S-200 28 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Kết điện di protease (hình 3.7) qua bước tinh khác cho băng hoạt tính 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT HOẠT HĨA VÀ KÌM HÃM LÊN CHẾ PHẨM ENZYME PROTASE 3.3.1 Ảnh hưởng Mercapetanol lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối(%) 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 296 303 298 266 202 100 0.02 0.04 0.06 0.08 Nồng độ mercapetanol (%) 0.1 Hình 3.8: Ảnh hưởng Mercapetanol lên hoạt tính protease Kết hình 3.8 cho thấy Mercapetanol nồng độ 0.02 (%) có tác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối đa nồng độ 0.08 (%) 3.3.2 Ảnh hưởng Sodium thiosulfate (Na2S2O3) lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối (%) 250 200 150 100 200 154 50 100 107 123 0.001 0.005 152 0.01 0.015 0.02 Nồng độ Na2S2O3 (M) Hình 3.9: Ảnh hưởng Na2S2O3 lên hoạt tính protease 29 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Kết hình 3.8 cho thấy Na2S2O3 nồng độ 0.001 (M) có tác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối đa nồng độ 0.015 (M) Qua kết trình bày hình 3.8; 3.9 chúng tơi nhận thấy hợp chất có tác động hoạt hoá protease từ Xuân Hoa hợp chất có tác dụng liên kết với nhóm SH protease [Rawling, 1994] Vì có khả protease từ Xuân Hoa thuộc nhóm cysteine protease (trung tâm hoạt động có chứa nhóm -SH), thuộc nhóm protease papain, ficin bromelain [Konno, 2004] Vì thời gian điều kiện kinh phí đề tài hạn chế chúng tơi chưa đánh giá ảnh hưởng chất ức chế đặc hiệu cystein protease đến hoạt động protease 3.3.3 Ảnh hưởng EDTA lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối (%) 160 140 120 100 80 60 100 105 112 126 120 140 100 40 20 Nồng độ EDTA (M) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hình 3.10: Ảnh hưởng EDTA lên hoạt tính protease Kết hình 3.10 cho thấy EDTA nồng độ 0.02 (M) có tác dụng hoạt hóa protease hoạt hóa tối đa nồng độ 0.1 (M) EDTA ức chế Metalloprotease, protease từ Xuân Hoa khơng thuộc nhóm Metalloprotease 30 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp 3.3.4 Ảnh hưởng H2O2 lên hoạt tính protease Hoạt tính enzyme tương đối (%) 120 100 80 60 100 98 94 40 87 76 50 20 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ H2O2 (M) Hình 3.11: Ảnh hưởng H2O2 lên hoạt tính protease H2O2 với nồng độ 0,2 M có tác dụng ức chế hoạt tính protease từ Xuân Hoa ức chế 50 % hoạt tính nồng độ 0,5 M Kết phù hợp với kết tác giả khác nghiên cứu chất có tác dụng ức chế enzyme thuộc nhóm cystein protease [Rawling, 1994] 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA PH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH PROTEASE Hình 3.13 cho thấy hoạt tính protease Xuân Hoa tinh mạnh vùng pH 7-8 Điều chứng tỏ protease Xuân Hoa thuộc loại kiềm yếu Tính chất tương tự protease tìm thấy papain từ nhựa đu đủ (Carica papaya L Latex), bromelain từ dứa (Ananas Comususae) protease nghiên cứu gần từ Nicotiana tobaccum, Muraya koenigii, Moringa oleifera Coriandrum sativum [Sharmila, 2012] Hoạt tính tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 30 40 50 60 65 70 75 Nhiệt Nhiệt độ 0độ 80 ( C) (0C) Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa 31 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Hoạt tính tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 pH 4.43 5.46 6.47 7.4 8.12 Hình 3.13: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính protease từ Xuân Hoa Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Kết hình 3.12 cho thấy nhiệt độ tối ưu protease từ Xuân Hoa cao 70°C, chứng tỏ protease bền nhiệt Tính chất bền nhiệt thuận lợi cho ứng dụng protease Y học Công nghệ Sinh học 3.5 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA PROTEASE TINH SẠCH TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA 3.5.1 Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase, kháng viêm protease Xuân Hoa % HA tương đối (%) 120 100 80 A 60 100 83 40 60 57 50 0.004 0.008 0.016 20 0 0.002 32 Hoạt độ protease (U) Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp B Hình 3.14: Tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase protease A Nồng độ ức chế enzyme hyaluronidase protease tinh từ Xuân Hoa B Hình ảnh phản ứng màu sử dụng thuốc thử đặc hiệu DMAB xác định HA 1: đối chứng; 2: Phản ứng thủy phân HA; 3: Enzyme Xuân Hoa ức chế hyaluronidase nồng độ 0.002 (U); 4: Enzyme Xuân Hoa ức chế hyaluronidase nồng độ 0.004 (U); 5: Enzyme Xuân Hoa ức chế hyaluronidase nồng độ 0.008 (U); 6: Phản ứng enzyme Xuân Hoa ức chế hyaluronidase nồng độ 0.016 (U) Hình 3.14 (A) cho thấy, protease Xuân Hoa nồng độ 0.002(U) có tác dụng ức chế enzyme hyaluronidase ức chế đến 50% hoạt động hyaluronidase nồng độ 0.016 (U) Kết cho thấy protease Xuân Hoa có khả kháng viêm việc ức chế hoạt động hyaluronidase Hyaluronidase thủy phân mucopolysaccharid loại acid hyaluronic mô liên kết Các nhà khoa học giới nghiên cứu chứng minh vai trò enzyme thúc đẩy hoạt động nhân tố gây viêm mô Hoạt động hyaluronidase tăng lên bệnh viêm nhiễm, dị ứng, ung thư Phương pháp ức chế hoạt động hyaluronidase nhiều nhà khoa học giới sử dụng để xác định hoạt tính kháng viêm chất có hoạt tính sinh học [Ghiware, 2012; Trilochan, 2013] Papain từ nhựa đu đủ bromelain từ dứa protease từ thực vật 33 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu ứng dụng Y học để điều trị bệnh viêm [Maria,2013] 3.5.2 Đánh giá hoạt tính quét gốc tự protease Xuân Hoa Bảng 3.3: Kết xác định hoạt tính quét gốc tự protease STT Tên mẫu EC50 µg/ml Protease qua canxiphosphat >128 Tham khảo Resveratrol 8.3 Dựa vào bảng 3.3 cho thấy protease Xn Hoa khơng có tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 1,1-diphenyl-2 icrylhydrazyl (DPPH) chất tạo gốc tự dùng để sàng lọc tác dụng chống oxi hóa chất nghiên cứu Tuy nhiên, cần có thời gian để nghiên cứu khả chống oxy hóa protease phương pháp khác 34 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1, KẾT LUẬN Chế phẩm protease tinh từ Xuân Hoa có độ tăng gấp 11,48 lần so với hoạt tính protease dịch chiết thơ, hoạt tính đặc hiệu 2.44 (U/mg protein) có trọng lượng phân tử khoảng 80 KDa Đã nghiên cứu số tính chất sinh hóa protease: protease Xuân Hoa thuộc loại kiềm yếu Hoạt tính protease tinh mạnh vùng pH 7-8, nhiệt độ tối ưu protease từ Xuân Hoa 700C Các hợp chất EDTA, Na2S2O3 Mercapetanol có liên quan đến nhóm -SH tác động hoạt hoá protease tinh từ Xn Hoa Vì có khả protease thuộc nhóm proteinaza cysteine protease (trung tâm hoạt động có chứa nhóm -SH) Đã nghiên cứu số tác dụng sinh học protease tinh sạch: protease Xuân Hoa ức chế 50% hoạt động hyaluronidase nồng độ 0.016 (U), khơng có hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 2, KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng chất ức chế đặc hiệu để xác định xác protease từ Xuân Hoa thuộc nhóm cystein protease Cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng sinh học khác protease mơ hình invitro invivo 35 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Brand-Williams W., Cuveliver M E., Berset C (1995), “Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 28, 25-30 [2] Đặng Thị Thu (2012), “ Công nghệ enzyme” NXB Khoa học, tr 233-299 [3] Dieu HK., Loc CB, Yamasaki S (2006), “The effects of Pseuderanthemum palatiferum, a new medicinal plant, on growth performances and diarrhea of piglets”, Japa Agri Res Qua., 40 (1), pp 85-91 [4] Garbin F., Harrach T., Eckert K., Maurer H R (1994) “Bromelain proteinase F9 augments human lymphocyte-mediated growth inhibition of various tumor cells in vitro” Int J Oncol 5: 197–203 [5] Ghiware N.B., Aseemuddin N, Kawade R.M, Vadvalkar S.M (2012) “Pharmacological Exploration Of Saccharum officinarum Leave Extracts For Its Anti-Oxidant And Anti-Inflammatory Activity” International Journal of PharmTech Research Vol.4, No.4: 1785-1791 [6] Grabowska E., Eckert K., Fichtner I., Schulze-Forster K., Maurer H R (1997) “Bromelain proteases suppress growth, invasion and lung metastasis of B16F10 mouse melanoma cells” Int J Oncol 11: 243–248 [7] Greenberg D.M; Winnick T, Ann.Rev.Biochem., 1945, 14, 31 [8] Henrik Fischer W Jensen, Soren Rosendal Jensen, Bent Juhl Neilsen (1988), “Chemotaxonomy of the Acanthaceae Iridoids and quaternary amines”, Phytochemistry, 27 (8), pp 2581-2589 [9] Huang JR, Wu CC, Hou RC, Jeng KC “Bromelain inhibits lipopolysaccharideinduced cytokine production in human THP-1 monocytes via the removal of CD14” Immunological Investigations 2008; 37(4):263-77 [10] Indranil C, Usha S, Sanat K B, Mangala L and Sadhan K D.A “Protease Isolated from the Latex of Plumeria rubra Linn (Apocynaceae) 2: Antiinflammatory and Wound-Healing Activities”.Tropical Journal of Pharmaceutical Research December 2011; 10 (6): 755-760 36 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp [11] Konno K, Hirayama C, Nakamura M, Tateishi K, Tamura Y, Hattori M, Kohno K Papain protects papaya trees from herbivorous insects: role of cysteine proteases in latex Plant J 2004 Feb;37(3):370-8 [12] Lamport DT; JW Catt, “Plant carbohydrates II Encyclopedia of plant physiology”, 1982, 14B, 133-157 [13] Lê Thị Lan Oanh, Võ Hoài Bắc, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thị Dung, Hoa Thị Hằng, Trần Thị Thơm (1999), “Khảo sát số tiêu sinh hóa tác dụng thủy phân protein Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees)”, Tạp chí Dược liệu, (1), tr 13-17 [14] Lê Ngọc Tú ( 2010), “Hố sinh cơng nghiệp”, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 31 [15] Leluk J, Pham Tran Chau, Kieleczawa.(1985) XXI Meet Pol Biochem Soc., Krakov, Abstract, 139 [16] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent J Biol Chem 193 (1): 265–75 [17] Loew , Rep.U.S.Dep.Agric., 1900, 65 [18] Laemmli U.K., 1970 Nature, 227, pp 680-685 [19] Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Nguyễn Công Hào, Phan Phước Hiền (2005), “Triterpenoid steroid phân lập từ Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum, Acanthaceae”, Tuyển tập cơng trình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa học Hữu Tồn quốc lần thứ ba, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 422-425 [20] María E Errasti, Néstor O Caffini, Lilian E Pelzer, Alejandra E Rotell Antiinflammatory Activity of Bromelia hieronymi: Comparison with Bromelain Planta Med 2013; 79(03/04): 207-213 [21] Nath LK, Dutta SK Wound healing Response of the Proteolytic Enzyme Curcain Indian J.Pharmacol 1992; 24: 114-115 [22] Netti C., Bandi G L., Pecile A (1972) Antiinflammatory action of proteolytic enzymes administered orally compared with antiphlogistic compounds Il Pharmaco Ed Pr 8, 27: 453–466 37 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp [23] Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng (2000), “ Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Xn Hoa”, Tạp chí Dược Liệu, (6), tr 16 [24] Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quyết Chiến (2004), “Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 2, tr 75-79 [25] Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Trần Vân Hiền, Tạ Thị Phòng, Trần Lê Dung (1999), “Thử độc cấp diễn tác dụng bảo vệ tế bào gan Xuân Hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk.”, Tạp chí dược học, 9, tr 15-17 [26] Phạm Hoàng Hộ (2000), “Cây cỏ Việt Nam”, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, tr.67 [27] Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn (2003), “Phytochemical study on Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk., Acanthaceae”, Tạp chí Hóa học, 41 (2), tr 115-118 [28] Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn(2005), “Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa khảo sát sơ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phần chiết giàu flavonoid từ Xuân Hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk.”, Tạp chí dược học, 9, tr 9-12 [29] Peerawit Padee, Somsak Nualkeaw, Chusri Talubmook, Supasorn Sakuljaitrong (2009), “Acute toxicity and sub-acute toxicity of Pseuderanthemum palatiferum”, Isan Journal of Pharmaceutical Sciences, (1), pp 74-81 [30] Pietrowa JS, Wincjunajte MM (1966) Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologicheskovo proiskhozhdenia, Priklad Biochem Mikro-bio, 232 [31] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2006).“Hoá Sinh Học” NXB Giáo dục [32] Rabelo A.P.B., E.B Tambourgi, A Pessoa Jr (2004) Bromelain partitioning in two- phase aqueous systems containing PEO–PPO–PEO block copolymers, J Chromatogr., B 807, p 61–68 [33] Reissig J.L, Jack L Strominger and Luis (1955) A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars J Biol Chem., 217:959-966 [34] Rawlíng, N D., and Barrett, A J (1994) Families of cysteine peptidases, Methods Enzymol 244, 461-485 38 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp [35] Sharmila S, Rebecca L J, Merina P D, Saduzzaman Md Isolation and partial purification of Protease from plant leaves Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2012, 4(8):3808-3812 [36] Trần Kim Thu Liễu, Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), “Contribution to the study on chemical constituents of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk (Acanthaceae)”, Tuyển tập cơng trình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa học Hữu Tồn quốc lần thứ tư, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 426-429 [37] Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài, Lê Mai Hương (1998), “Góp phần nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.Acanthaceae”, Tạp chí Dược liệu, (2), tr 37-42 [38] Trilochan S, Prasanna KP (2013) Evaluation of Invitro Antioxidant, Anti Inflammatoryand Anti diabetic Potential of Curcumin Indo American Tournal of Pharmaceutical Research, Vol 3, Isue 3: 2808-2818 [39] Veremeenko KN, Dosenko VE, Kizim AI, Terzov AI The mechanism of the curative action of systemic enzyme therapy Lik Sprava 2000; 2(3):3-11 (A Russian scientifically refereed medical paper) [40] Xuân Lục (2005), “Cây thuốc diệu kỳ, Tu lình, thuốc nhiều tên nhiều tác dụng”, Tạp chí dược liệu sức khỏe cộng đồng, 2, tr.22-23 [41] Wararut Buncharoen, Supap Saenphet, Kanokporn Saenphet (2010), “Acetylcholinesterase inhibitory effect of Pseuderanthemum palatiferum in albino rats”, Trends Research in Science and Technology, (1), pp 13-18 39 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC OD 750 (nm) Lượng tyrosine (µmol) Phụ lục 1: Đường chuẩn tyrosine OD 660 (nm) Lượng protein (mg/ml) Phụ lục 2: Đường chuẩn protein 40 Bùi Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp OD (585nm) HA (mg) Phụ lục 3: Phương trình hồi quy tuyến tính HA Phụ lục 4: Đồ thị tương quan giưa mật độ quang học nồng độ DPPH 41