Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn bã nấm men bia bằng protease tạo peptide có hoạt tính sinh học

 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trương Quốc Phong thạc sỹ Lâm Hải Yến cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, kỹ sư, sinh viên phịng thí nghiệm trọng điểm Proteomic Đại học Bách Khoa Hà Nội Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thu Hiền trung tâm Công nghệ sinh học thực phẩm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nội dung luận văn suốt trình thực tập phịng Tơi xin cảm ơn đến tất thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ truyền đạt cho nhiều kiến thức thời gian học tập trường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị em bạn bè bên cạnh ủng hộ động viên suốt q trình học tập nghiên cứu, để tơi có thêm động lực hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Đặng Anh Quân Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 i Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PEPTIDE 1.1.1 Khái niệm peptide 1.1.2 Sự tạo thành liên kết peptide 1.1.3 Tính chất hóa học peptide 1.2 PEPTIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC 1.2.1 Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học 1.2.2 Peptide chống oxi hóa 1.2.3 Peptide có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 1.2.4 Các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh 1.2.5 Các peptide kìm hãm ACE ( chống tăng huyết áp) 1.2.6 Các peptide chống ung thư 1.3 TỔNG QUAN VỀ BÃ MEN BIA 10 1.4.TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 12 1.4.1 Phân loại Protease 12 1.4.2 Giới thiệu số loại Protease 13 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PIPTIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15 1.5.1 Tình hình nghiên cứu peptide có hoạt tính sinh học giới 15 1.5.2 Tình hình nghiên cứu peptide có hoạt tính sinh học Việt Nam 16 PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 ii Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18 2.2.1 Phương pháp thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã men bia 18 2.2.2 Xác định hoạt độ protease phương pháp Anson cải tiến 19 2.2.3 Xác định hàm lượng Peptide tổng phương pháp OPA[16,17,25,26] 20 2.2.4 Phân tích Peptide điện di SDS-PAGE (Laemmli, 1950) 21 2.2.5 Tối ưu hóa thủy phân bã men bia Protease(Neutrase) theo quy hoạch bậc hai Box-Benken 22 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Ảnh hưởng nồng độ Enzym 24 3.2 Ảnh hưởng pH 25 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 27 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất 28 3.5 Ảnh hưởng thời gian 29 3.6 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân thu peptide 31 3.7 Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia protease thu peptide có hoạt tính sinh học 35 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 iii
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT NP Neuropeptide OP Opioid peptide/ Opioate peptide IP Imunopeptide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid DPPH 1,1-diphenl-2-picrylhydrazyl AMP Adenosine monophosphate 5'-GMP OPA SDS-PAGE 5'-guanosine monophosphate O-Phthaladehyde Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis SDS Sodium dodecyl sulfate TCA TriCloroacetic Acid ACE Angiotensin I Converting Enzyme Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 iv Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố hàm lượng peptide thu điều kiện thủy phân khác 32 Bảng 3.2: Kết phân tích mơ hình phương sai mơ hình ưu phần mềm DX7.1.5 33 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 v Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 Hoạt động Renin-angiotensin-aldosterone Hình 2.1 Đường chuẩn Tyrosine 19 Hình 2.2 Đường chuẩn Peptone 21 Hình 3.1a: Ảnh hưởng nồng độ enzyme 24 Hình 3.1b: Điện di nồng độ enzyme khác 25 Hình 3.2a: Ảnh hưởng pH 26 Hình 3.2b: Điện di đồ pH khác 26 Hình 3.3.a: Ảnh hưởng nhiệt độ 27 Hình 3.3.b: Điện di đồ nhiệt độ khác 27 Hình 3.4.a: Ảnh hưởng nồng độ chất 28 Hình 3.4.b: Điện di đồ nồng độ chất khác 29 Hình 3.5.a: Ảnh hưởng thời gian 30 Hình 3.5.b: Điện di đồ sản phẩm peptide thời điểm thủy phân khác 30 Hình 3.6 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia 35 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 vi Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) peptide ngồi giá trị dinh dưỡng cịn có khả tác động tới chức sinh lý thể, giúp tăng cường nâng cao sức khỏe người khả chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, tác dụng kìm hãm enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) chống tăng huyết áp [20], ngồi cịn có khả điều hịa miễn dịch, chống đơng máu [29] … Peptide có hoạt tính sinh học tách chiết từ nguồn tự nhiên (động vật, thực vật), lên men vi sinh vật, thủy phân giới hạn protein từ nguồn khác protease Các nghiên cứu peptide có hoạt tính sinh học nước ta dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm khai thác chủ yếu đối tượng nguyên liệu từ sữa, đậu tương Trong nguồn bã men bia nước ta dào, chứa hàm lượng protein cao, giàu vitamin, đặc biệt vitamin nhóm B khoáng chất, trở thành nguồn nguyên liệu tốt cho trình sản xuất peptide Thủy phân giới hạn bã nấm men bia tạo peptide có hoạt tính sinh học bổ sung vào thực phẩm chức tận dụng nguồn nguyên liệu bã thải, tạo sản phẩm có chất lượng cao mà cịn giải vấn đề ô nhiễm môi trường gây lượng lớn bã men bia thải hàng năm Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn bã nấm men bia Protease tạo peptide có hoạt tính sinh học” Nội dung bao gồm: - Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym, nồng độ chất) để thu peptide thấp phân tử - Tối ưu hóa điều kiện thủy phân - Xây dựng quy trình thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PEPTIDE 1.1.1 Khái niệm peptide Peptide protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino acid liên kết với nhau, có khối lượng phân tử thường 6.000 Dalton Chúng tổng hợp tự nhiên hình thành thủy phân protein Măc dù có cấu trúc nhỏ nhiều peptide có vai trị quan trọng hoạt động trao đổi chất thể 1.1.2 Sự tạo thành liên kết peptide Liên kết peptide (-CO-NH-) tạo thành phản ứng kết hợp nhóm αcacboxil amino acid với nhóm α- amino amino acid khác, loại phân tử nước (phản ứng ngưng tụ) [4] Hình 1.1 Sự tạo thành liên kết peptide Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học Sản phẩm phản ứng hình 1.1 dipeptide Nếu 3, 4, 5… nhiều amino acid kết hợp với tạo peptide có tên tương ứng tripeptide, tetrapeptide, pentapeptide, polypeptide Trong phân tử protein ngồi liên kết pepide, amino acid cịn kiên kết với liên kết disulfide Liên kết disunfide có vai trị quan trọng việc tạo cấu hình khơng gian cho số loại protein, đặt biệt protein có chức sinh học quan trọng hoocmon, kháng thể số protein khác 1.1.3 Tính chất hóa học peptide Peptide có tính chất hóa lý khơng khác nhiều so với amino acid chứa nhóm –NH2 nhóm –COOH tự Sự sai khác chủ yếu bên R gốc amino acid tham gia chuỗi peptide Chính khác mạch bên R, khác số lượng loại amino acid peptide làm cho điểm đẳng điên, khối lượng khác Peptide tham gia phản ứng đặc trưng nhóm –NH2 nhóm –COOH Tính lưỡng tính H2N-R-COOH + H+ H2N-R-COOH + OH- H3N+-R-COOH H2N-R-COO- + H2O Tạo phức chất với este H2N-R-COOH + R’OH Khí HCl bão hịa H2N-R-COO R’+ H2O Sản phẩm tạo dạng muối, lấy sản phẩm cho tác dụng với ammoniac để tái tạo nhóm chức amin (-NH2) Ngồi phản ứng nhóm –NH2 -COOH đầu tận cùng, gốc R peptide cho phản ứng màu đặc trưng amino acid tự Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học tương ứng Một phản ứng màu đặc trưng cho liên kết peptide phản ứng Biure, phản ứng không xảy với amino acid tự Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím đỏ có khả hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm Đây phản ứng sử dụng rộng rãi để định lượng protein 1.2 PEPTIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC 1.2.1 Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học Peptide có hoạt tính sinh học peptide mà ngồi giá trị dinh dưỡng cịn có số ảnh hưởng đặc biệt đến chức sinh lý thể.Tính chất quy định thành phần thứ tự amino acid peptide Mellander (1950) người đưa thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học ơng nhận thấy peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein hoạt động chất mang chất khoáng Những nghiên cứu peptide có bước tiến đáng kể vài thập niên gần Những hiểu biết tác dụng chế tác dụng peptide làm cho chúng ngày nhận nhiều quan tâm đặc biệt lĩnh vực y dược Ngồi ra, peptide có hoạt tính sinh học cịn sử dụng loại thực phẩm chức năng, thực phẩm chức có nguồn gốc từ sữa [3,24,26] Những hoạt tính sinh học peptide nhà khoa học quan tâm nghiên cứu chủ yếu có hoạt tính ức chế ACE, khả kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống oxi hóa chống ung thư [27] Peptide có hoạt tính sinh học thu từ nhiều nguồn: động vật (sữa, trứng, nọc rắn, nội tạng bò, heo…), từ nguồn thực vật (đậu tương, nấm…) vi sinh vật Tuy nhiên sản xuất từ nguồn động, thực vật thường gặp hạn chế phải cần số lượng lớn đưa vào sản xuất quy mơ lớn.Vì thế, nhà khoa học quan tâm khai thác vi sinh vật, đặc biệt nấm men lồi có chứa khoảng 50% Đặng Anh Qn K18.CNSH.1102
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Sau chọn nồng độ enzyme 4%, pH 6.5, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành peptide có kích thước nhỏ 10kDa với dải nhiệt độ 40oC; 45oC; 50oC; 55oC; 60oC Các điều kiện khác thực cố định: nồng độ chất 20%, thời gian 14h Dịch thủy phân sau qua màng siêu lọc 10kDa tiến hành xác định hàm lượng peptide kết biểu diễn hình 3.3.a hình 3.3.b Hình 3.3.a: Ảnh hưởng nhiệt độ Hình 3.3.b: Điện di đồ nhiệt độ khác Đặng Anh Qn K18.CNSH.1102 27 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học Kết từ hình 3a.cho thấy từ 40oC đến 50oC, nhiệt độ thủy phân tăng hàm lượng peptide thu tăng lên đạt giá trị lớn 38,56 mg/ml 50oC Kết phù hợp với công bố Hasan Tanguler Huseyin Erten (2008) Nhưng từ 50oC đến 60oC hàm lượng peptide giảm dần tăng nhiệt độ Điều giải thích nhiệt độ cao làm biến tính protein nên làm giảm hoạt độ protease chế phẩm giảm, dẫn đến hình thành sản phẩm thủy phân giảm theo 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất Sau chọn nồng độ enzym, pH, nhiệt độ thủy phân tối ưu, tiến hành thủy phân bã nấm men bia với nồng độ enzyme 4%, pH 6.5, nhiệt độ 500C, thời gian 14h với nồng độ chất 15%; 20%; 25% (7,5; 10; 12,5g bã men bia/50ml dịch thủy phân) theo thể tích dịch thủy phân Sản phẩm sau thủy phân lọc qua màng lọc Dịch sau thủy phân qua màng siêu lọc tiến hành phân tích phương pháp điện di SDS-PAGE xác định hàm lượng peptide phương pháp OPA Kết trình bày hình 3.4.a 3.4.b Hình 3.4.a: Ảnh hưởng nồng độ chất Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 28 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.4.b: Điện di đồ nồng độ chất khác Kết hình 4a 4b cho ta thấy nồng độ chất tăng khoảng 1525% hàm lượng peptide sản phẩm thủy phân tăng lên Tuy nhiên nồng độ chất 20% 25%, hàm lượng peptide khác biệt khơng nhiều (38,37 mg/ml 40,46 mg/ml) Vì vậy, nên chọn nồng độ chất 20% cho nghiên cứu 3.5 Ảnh hưởng thời gian Trong thực tế sản xuất, thời gian yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chi phí lượng trình suất hoạt động thiết bị thủy phân Sau chọn yếu tố thủy phân (nồng độ E/S, pH, nhiệt độ, nồng độ chất) tối ưu, tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân Dịch thủy phân điều kiện nồng độ chất 20%, nhiệt độ 50oC, nồng độ enzyme 4% thu mốc thời gian 12h; 14h; 16h; 18h; 20h Kết điện di hàm lượng peptide theo phương pháp OPA thu hình 3.5.a 3.5.b Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 29
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Hình 3.5.a: Ảnh hưởng thời gian Hình 3.5.b: Điện di đồ sản phẩm peptide thời điểm thủy phân khác Từ kết hình 5, ta nhận thấy khoảng thời gian đầu từ 12h đến 16h trình thủy phân, hàm lượng peptide thu tăng nhanh (tăng 4,66%), sau từ 16h đến 20h, tốc độ tăng chậm dần ( từ 16-18h tăng 0,65% từ 18-20 h, tăng 0,49%) sau 20 h thủy phân, đạt giá trị cực đại 39,03 mg/ml Tương ứng ảnh điện di Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 30 Khóa luận tốt nghiệp
 Khoa Công nghệ sinh học đồ thời điểm 20h xuất băng đậm Như vậy,trong khoảng thời gian thủy phân tăng từ 16-20 h hàm lượng peptide tăng khơng nhiều nên chúng tơi chọn thời gian thủy phân 16h Khi hàm lượng peptide thu 38,59 mg/ml nhằm tiết kiệm thời gian chi phí lượng nhiệt cho trình thủy phân tiến hành 50oC 3.6 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân thu peptide Dựa sở khảo sát điều kiện thích hợp tạo peptide có hoạt tính sinh học yếu tố ảnh hưởng đơn: nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ, nồng độ chất, thời gian Nhận thấy để đạt hiệu thủy phân thu peptide sinh học cao, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời yếu tố theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken đến trình thủy phân giới hạn bã men bia protease nhắm tìm điều kiện tối ưu để thu peptide sinh học Quy hoạch sử dụng yếu tố cần tối ưu, ma trận thực nghiệm thiết lập gồm 17 thí nghiệm kết hợp mức (cao, thấp, trung bình) yếu tố cần khảo sát Riêng thí nghiệm kết hợp yếu tố mức trung bình ( thí nghiệm tâm ) lặp lại lần Kết thí nghiệm thể bảng 3.1 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 31
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố hàm lượng peptide thu điều kiện thủy phân khác TN Nồng độ Enzyme (%) X1 Nồng độ chất (%) X2 pH 15 6.5 25.11 15 6.5 25.67 3 25 6.5 40.04 25 6.5 44.26 20 6.0 33.59 20 6.0 36.42 20 7.0 33.02 20 7.0 34.33 15 6.0 24.69 10 25 6.0 40.59 11 15 7.0 22.56 12 25 7.0 41.47 13 20 6.5 38.42 14 20 6.5 37.65 15 20 6.5 36.89 16 20 6.5 37.30 17 20 6.5 38.43 Đặng Anh Quân K18.CNSH.1102 Hàm lượng Peptide (mg/ml) X3 32
 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Kết từ bảng 3.1 cho thấy hàm lượng peptide thu sau thủy phân bã nấm men bia protease neutrase nằm khoảng 22,56 đến 44,26 mg/ml, tương ứng với thí nghiệm số 11 số Ở mức cực tiểu (thí nghiệm số 1, 2, 9, 11) cực đại (thí nghiệm số 3, 4, 10, 12) nồng độ chất hàm lượng peptide thu chênh nhiều mức cực đại cực tiểu nồng độ enzyme pH hàm lượng peptide thu chênh không nhiều xét diều kiện chất Điều cho thấy yếu tố nồng độ chất ảnh hưởng lớn đến trình thủy phân bã men bia Mặt khác yếu tố pH ảnh hưởng khơng nhiều việc chọn giá trị pH nằm vùng axit yếu trung tính chất chế phảm Neutrase protease trung tính theo khuyến cáo nhà sản xuất Bảng 3.2 Kết phân tích mơ hình phương sai mơ hình ưu phần mềm DX7.1.5 Thơng số Mơ hình Nồng độ Enzyme (X1) Nồng độ chất (X2) pH (X3) SS df 674.30 9.95 583.62 MS Chuẩn F Mức có nghĩa p 74.92 221.25