Xác định hàm lượng hyaluronic acid ha trong một số nguồn phế phẩm thủy sản và nghiên cứu sử dụng protease để tách chiết

Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS.Võ Hồi Bắc, người truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiêm quý báu, quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, bảo suốt trình thực tập viết Báo cáo tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn tồn thể cán phịng Sinh hóa thực vật -Viện Công nghệ sinh học cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập phòng nghiên cứu Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô khoa Công nghệ Sinh học- Viện đại học Mở Hà Nội tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang quý báu để em bước vào đời cách vững tự tin Cuối em xin kính chúc q Thầy, Cơ dồi sức khỏe đạt nhiều thành công nghiệp cao quý Hà Nội ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Trần Thị Hồng Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ HYALURONIC ACID (HA) 1.1.1 Khái niệm HA 1.1.2 Vai trò Hyaluronic acid 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HYALURONIC ACID 1.2.1 Nghiên cứu Thế giới 1.2.2 Nghiên cứu Việt Nam 1.3 ỨNG DỤNG CỦA HA 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ THU NHẬN HA 1.4.1 Tách chiết thu nhận HA 1.4.2 Đánh giá sản phẩm 1.5 GIỚI THIỆU NGUỒN NGUYÊN LIỆU 10 1.5.1 Sụn động vật 10 1.5.2 Giới thiệu cá đuối, cá nhám da basa 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Chuẩn bị mẫu 14 2.1.3 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 14 2.2 XÁC ĐỊNH GỐC GLUCURONIC ACID CỦA HA THEO PHƯƠNG PHÁP SULFURIC ACID-CARBAZOLE CỦA BITTER (1962) 15 2.3 ĐỊNH LƯỢNG HA BẲNG PHƯƠNG PHÁP REISSIG (1955) 16 2.4 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) 17 2.5 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN SỤN, DA CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN (PIETROWA, 1966) 18 2.6 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO CHẾ PHẨM CỦA ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI 20 2.6.1 Xác định nhiệt độ thủy phân tối ưu 20 2.6.2 Xác định pH tối ưu 20 Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp 2.6.3 Xác định thời gian thủy phân tối ưu 21 2.6.4 Xác định nồng độ enzyme thủy phân tối ưu 21 2.7 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TÁCH CHIẾT HA, THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ SẢN PHẨM HA 21 2.7.1 Phương pháp tách chiết 21 2.7.2 Thu nhận GAG (glycosaminoglycan) 22 2.7.3 Thu nhận HA phức hợp tủa HA-CPC 22 2.7.4 Đánh giá sản phẩm HA 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HA TRONG XƯƠNG SỤN CÁ ĐUỐI (DASYATIS KUHLII), CÁ NHÁM (CARCHARHINUS )VÀ DA BASA (PANGASIUS BOCOURTI) Ở VIỆT NAM 23 3.2 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM PROTEASE THƯƠNG MẠI (ENV) ĐỂ THỦY PHÂN SỤN, DA CÁ VÀ CHIẾT RÚT HA 28 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 28 3.2.2 Ảnh hưởng pH 30 3.2.3 Xác định thời gian chế phẩm ENV thủy phân tối ưu xương sụn da cá 31 3.2.4 Xác định tỷ lệ chế phẩm ENV thủy phân tối ưu xương sụn da cá 32 3.3 THU NHẬN HA SƠ BỘ TINH SẠCH 35 3.4 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM HA 36 3.5 QUY TRÌNH TINH SẠCH HA TỪ XƯƠNG, SỤN CÁ ĐUỐI, CÁ NHÁM VÀ DA BASA 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 48 Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPC Cetylpyridium chloride CS Chondroitin sunfate CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide DMAB Dimetylamin benzaldehyde GAG Glycosaminoglycan HA Hyaluronic acid OD Optical Density PG Proteoglycan TCA Tricloacetic TLC Thin layer chromatography Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Hyaluronic acid từ số nguồn nguyên liệu Bảng 2: Thành phần mơ sụn 10 Bảng 2.1 Xây dựng đường cong chuẩn HA 17 Bảng 2.2 Xây dựng đường cong chuẩn tyrosine 19 Bảng 3.1 Hàm lượng HA mẫu xương sụn cá đuối, cá nhám da cá basa Việt Nam 25 Bảng 3.2 Hiệu suất thu GAG sử dụng nồng độ CPC CTAB 35 Bảng 3.3: Hàm lượng HA chế phẩm tinh sơ 37 Trần Thị Hồng 1101 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc đơn phân đường đôi hyaluronic acid Hình 2.1:Cơ chế phản ứng tạo màu glucorunic acid với carbazole 15 Hình 2.2: Phản ứng tạo màu N-acetyl-D-glucosamine DMAB 16 Hình 3.1: Định tính gốc glucuronic acid HA 24 Hình 3.2: Định lượng HA phản ứng màu xác định gốc N-acetyl-Dglucosamine 24 Hình 3.3: Phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn HA 25 Hình 3.4: Bản sắc kí mỏng TLC enzyme hyaluronidase, HA mẫu từ sụn cá nhám tươi 27 Hình 3.5: kết sắc kí mỏng TLC mẫu cá nhám, cá đuối da cá basa khô (A) mẫu tươi (B) 27 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ thủy phân ENV hàm lượng HA giải phóng mẫu sụn cá nhám, sụn cá đuối da cá basa 29 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ thủy phân ENV hàm lượng HA giải phóng 31 Hình 3.8 Hiệu thủy phân ENV theo thời gian 32 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ enzyme ENV lên thuỷ phân xương sụn cá nhám, cá đuối da cá basa 33 Hình 3.10: Khả thủy phân xương sụn cá nhám, cá đuối da cá basa enzyme ENV 34 Hình 3.11 Phản ứng màu đặc hiệu với chế phẩm HA tinh sơ từ cá nhám, cá đuối da basa 37 Hình 3.12: Phổ hồng ngoại IR HA chuẩn HA từ nguồn cá nhám, cá đuối, da basa 39 Hình 3.13: Quy trình tinh HA từ xương sụn cá nhám, cá đuối da basa 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Hyaluronic acid (HA) ví thần dược thập niên gần Có nhiều nghiên cứu phân tử vai trị lãnh vực điều trị ứng dụng ngành Y khoa HA sử dụng rộng rãi loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng khác ngày mở rộng ứng dụng hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh khác HA có khả cung cấp độ ẩm, tăng cường vững chắc, độ bền dai lớp đàn hồi da, ức chế giả phóng yếu tố tiềm viêm, gốc oxi hóa tự do, làm lành vết thương, giảm di ung thư, có tác dụng giảm đau có hiệu cao điều trị bệnh viêm khớp, tim mạch Hiện Việt Nam nhập thuốc chứa thành phần HA để điều trị bệnh viêm khớp, chống lão hóa, xóa nếp nhăn làm đẹp da (Duovital CHLB Đức, Havital-HA drink Thụy Sỹ với giá thành cao), chưa có đơn vị nước sản xuất HA để phục vụ Y dược Việc nghiên cứu điều tra tách chiết hyaluronic acid từ nguyên liệu thủy sản bước khởi đầu tạo công nghệ sản xuất thực phẩm chức chứa HA phục vụ Y học Ngành chế biến thủy sản nước giới hàng năm thải lượng lớn phụ phế phẩm cần xử lý chế biến tiếp Phụ phẩm thủy sản thường nội tạng, đầu, xương, da Để giải lượng lớn phụ phẩm nay, Việt Nam giới có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành sản phẩm có giá trị gia tăng Các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, chất có hoạt tính sinh học, màng sinh học chế biến từ số loại phụ phẩm thủy sản mang lại hiệu kinh tế lớn cho người Các nghiên cứu giới cho thấy nguyên liệu từ sụn da cá có chứa HA Tuy hàm lượng không cao so với nguồn nguyên liệu từ mào gà hay vi khuẩn, việc nghiên cứu tận thu HA từ phế thải da cá basa sụn cá đuối, nhám từ nhà máy chế biến thủy sản Việt Nam giải vấn đề nhiễm mơi trường mà cịn làm tăng giá trị thủy sản nguồn nguyên liệu từ biển Người dân nghèo có thêm cơng ăn việc làm đặc biệt nguồn nguyên liệu thuốc rẻ giúp giảm giá thành sản xuất thuốc Việc nghiên cứu điều tra, đánh giá đầy đủ tiềm nguồn dược liệu hyaluronic acid từ thủy sản Việt Nam cần thiết phù hợp với yêu cầu phủ để có chiến lược nghiên cứu khai thác hợp lý, hiệu nguồn tài nguyên quý từ thủy sản Do tiến hành thực đề tài: "Xác định hàm lượng Hyaluronic acid (HA) số nguồn phế phẩm thủy sản nghiên cứu sử dụng protease để tách chiết” Trong đề tài này, chúng tơi tập trung nghiên cứu nội dung sau đây: - Xác định hàm lượng HA từ sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii), cá nhám (Carcharhinus sorrah) da cá ba sa (Pangasius bocourti) - Tối ưu hóa điều kiện thủy phân, chiết rút HA (nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme thời gian thủy phân) chế phẩm thương mại protease ngoại bào từ vi sinh vât - Xác định phương pháp tách chiết thu nhận HA sơ tinh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ HYALURONIC ACID (HA) 1.1.1 Khái niệm HA HA polymer tự nhiên mạch thẳng thuộc nhóm glycosaminoglycan (GAG) , khơng chứa nhóm sulfat , cấu tạo hai đơn vị Nacetylglucosamine glucuronic ạcid xen kẽ liên kết với liên kết β(1-3) β(1-4) glycosidic (hình 1) Hình 1.1: Cấu trúc đơn phân đường đôi hyaluronic acid Số lượng disaccharides lặp lại phân tử HA khoảng 10.000, khối lượng phân tử HA khoảng 104 đến 107 Da (Cowman and Matsuoka, 2005) Những phân tử HA dài kích thước lớn tạo độ nhớt cao (bơi trơn) có hiệu lực chống lại nén cho phép khớp xương da chịu trọng lượng Hyaluronic acid tìm thấy tế bào thể xuất với nồng độ cao vị trí đặc biệt như: xương, sụn, dịch khớp, gân, dây chằng, mô liên kết, da,… 1.1.2 Vai trò Hyaluronic acid Hyaluronic acid tìm thấy tế bào thể xuất với nồng độ cao vị trí đặc biệt như: xương, sụn, dịch khớp, gân, dây chằng, mô liên kết, da,… Hyaluronic acid ý nhiều sau kênh truyền hình ABC new cơng bố báo cáo làng người Nhật Bản Yuzuri Hara, nơi dân cư có tỷ lệ người sống khỏe mạnh tuổi thọ cao giới Nghiên cứu tìm người dân có chế độ ăn bổ sung tỷ lệ cao hàm lượng HA cho thể (http://www.appliedhealth.com/ABC_News_HA.html) HA thành phần cấu tạo độ ẩm quan trọng lớp hạ bì Ở người sau tuổi 25, số lượng hyaluronic acid lại 65% so với thời tuổi vị thành niên dần lại 25% độ tuổi 60 Khi già, sống tế bào giảm dần da trở nên khơ nhăn độ ẩm HA có khả cung cấp độ ẩm tăng cường vững độ bền dai lớp đàn hồi da Ngoài HA cịn có nhiều chức sinh học khác thể sống: ức chế giải phóng yếu tố tiền viêm, gốc oxi hóa tự do, làm lành vết thương, giảm di ung thư, có tác dụng giảm đau có hiệu cao điều trị bệnh viêm khớp, tim mạch Hyaluronic acid ví thần dược thập niên gần Hyaluronic acid chondroitin thành phần proteoglycan (PG) chứa xương sụn (http://wikipedia.Cartilage) Trong thể sống, PG GAG giữ vai trò quan trọng nhiều trình khác như: điều hịa hoạt động enzyme bám dính, phát triển di thực tế bào (Lyon, 1998; Selleck, 2000; Turnbull, 2001) Phân tử (monomer) PG mô sụn với protein gắn kết acid hyaluronic tạo thành phức hệ thuỷ động học có khả nén thuận nghịch cần thiết cho sụn để chống lại ép nén với biến dạng nhỏ (Hascall, 1988) HA Collagen thành phần quan trọng để trì lớp da cấu trúc Collagen giúp cho da săn chắc, HA giúp nuôi dưỡng cung cấp nước cho sợi collagen HA giữ độ ẩm độ đàn hồi cho da 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HYALURONIC ACID 1.2.1 Nghiên cứu Thế giới Năm 1934, Karl Meyer John Palmer lần phát Hyaluronic acid (HA) dịch cầu mắt bò (Meyer, 1934) Cấu trúc HA xác định Karl Meyer cộng (hình 1.1) Hyaluronic acid tìm thấy tế bào thể xuất với nồng độ cao vị trí đặc biệt như: xương, sụn, dịch khớp, gân, dây chằng, mô liên kết, da,… Nguồn nguyên liệu HA từ sụn, da động vật nhà khoa học giới điều tra (bảng 1.1) HA phát sụn lợn (Timothy,1970), sụn cá mậ (Pat, 1974), sụn bò (Cullis-Hill, 1989) Gần UI/g ENV), tỷ lệ 175 µl ENV/3g sụn cá đuối tươi (hình 3.9, B) tỷ lệ 150 µl ENV/1,5g da cá basa tươi (hình 3.9, C) A B Hình 3.10: Khả thủy phân xương sụn cá nhám, cá đuối da cá basa enzyme ENV Chú thích: A Sụn cá đuối, cá nhám da basa tươi trước thủy phân; B Dịch sau thủy phân cá đuối, cá nhám da ba sa tươi Kết hình 3.10 cho thấy chế phẩm ENV cho hiệu thủy phân xương sụn cá nhám, cá đuối da cá basa mạnh Các mẫu xương sụn da cá bị thủy phân tơi bổ sung enzyme ENV Enzyme ENV nguồn enzyme an toàn sử dụng chế biến thực phẩm, hoạt tính thủy phân cao, ổn định giá thành rẻ, phù hợp cho việc sử dụng để sản xuất HA với quy mô lớn 34 3.3 THU NHẬN HA SƠ BỘ TINH SẠCH Sau thời gian thủy phân sụn cá nhám, cá đuối da basa ENV điều kiện tối ưu nghiên cứu trên, dịch sau thủy phân ly tâm 8.000v/phút 30 phút Ethanol dung môi hữu thường sử dụng để kết tủa protein polysacharid Ethanol nồng độ cao háo nước làm lớp vỏ hydrat protein làm protein kết tủa Chúng sử dụng etanol 75-80% thu chế phẩm thô chứa HA từ sụn cá nhám cá đuối da cá basa dựa theo kết nghiên cứu Võ Hoài Bắc cộng (Võ Hoài Bắc, 2010) Sau 24h 4ºC, polysacharid kết tủa thu hồi cách ly tâm tốc độ 10.000 v/phút ºC 20 phút Chế phẩm thô chứa HA sau tủa ethanol khoảng 75% loại bỏ phần lớn protein xương sụn da cá Bảng 3.2 Hiệu suất thu GAG sử dụng nồng độ CPC CTAB Nồng độ CPC Hiệu suất thu GAG Hiệu suất thu GAG Hiệu suất thu GAG CTAB (%) tương đối (%) tương đối (%) tương đối (%) (Sụn cá nhám) (Sụn cá đuối) (da basa) CPC CTAB CPC CTAB CPC CTAB 0.5 32 28 35 30 29 25 56 47 60 54 57 40 1.5 84 80 86 79 89 76 100 92 100 92 100 93 2.5 100 100 98 100 100 100 Để phân tách chế phẩm GAG chứa HA với collagen polysacharid khác nhiều nghiên cứu giới sử dụng muối cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) cetylpyridium chloride (CPC), tạo phức hợp tủa với chế phẩm GAG có chứa HA (Hascall, 1988) Trong phần thực thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu CS loại muối là: CPC CTAB 35 Kết bảng 3.2 cho thấy CPC với nồng độ % đạt hiệu tối đa tủa chế phẩm GAG chứa thành phần HA cho mẫu , lượng tủa GAG không thay đổi tăng nồng độ CPC Trong CTAB cần nồng độ 2.5% tủa tối đa GAG chứa thành phần HA Mặc dù CPC giá thành đắt CTAB, CTAB độc cho người sử dụng trình tinh chế HA Vì nhận thấy CPC nồng độ 2% hiệu an tồn cho q trình tách chiết HA Để phân tách HA phức hợp tủa GAG, số nghiên cứu sử dụng nồng độ muối NaCl khác để phân tách HA với glycosaminoglycan khác (Schiller, 1961) Nakano cộng nhận thấy rửa phức hợp GAG-CPC NaCl 0,4 M phần lớn hyaluronic acid phân tách (Nakano, 2001) Dựa vào nghiên cứu số tác giả Garnjanagoonchorn, Nakano cộng (Nakano, 2001 Garnjanagoonchorn, 2007), rửa tủa GAG - CPC với NaCl 0,4 M Ly tâm 10.000 v/1 phút 30 phút, loại tủa thu dịch Dịch tủa etanol với tỷ lệ 1:4 Tủa thu chế phẩm HA sơ tinh 3.4 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM HA Chúng sử dụng phương pháp màu đặc hiệu với HA (Reissig, 1955) phương pháp đo phổ IR (Infrared Spectroscopy) để đánh giá chất lượng chế phẩm HA sơ tinh Kết hình 3.12 cho thấy chế phẩm HA tinh sơ từ sụn cá nhám, cá đuối da cá basa cho màu đặc hiệu giống HA chuẩn Kết bảng 3.3 cho thấy chế phẩm có hàm lượng HA đạt khoảng 1.8% sụn cá nhám, 1.6% cá đuối tươi 1.3% da basa 36 Hình 3.11 Phản ứng màu đặc hiệu với chế phẩm HA tinh sơ từ cá nhám, cá đuối da basa Chú thích: 1, Cá nhám; 2, Cá Đuối,; 3, Da basa Bảng 3.3: Hàm lượng HA chế phẩm tinh sơ % khối lượng sản phẩm Mẫu % HA/g chế phẩm HA sơ tinh sạch/ khối lượng sụn (da) tươi Sụn cá nhám 1.8 63 ± 5.2 Sụn cá đuối 1.6 61 ± 5.0 Da ba sa 1.3 65 ± 5.0 Kết hình 3.13 ( B, C,D) cho thấy phổ hồng ngoại IR HA tách từ sụn cá đuối, cá nhám da basa hoàn toàn giống phổ hồng ngoại IR HA chuẩn (hình 3.13 A) 37 A B 38 C D Hình 3.12: Phổ hồng ngoại IR HA chuẩn HA từ nguồn cá nhám, cá đuối, da basa Chú thích: A, HA chuẩn; B da basa;C, Cá nhám; D, Cá đuối 39 3.5 QUY TRÌNH TINH SẠCH HA TỪ XƯƠNG, SỤN CÁ ĐUỐI, CÁ NHÁM VÀ DA BASA (Sụn, da) cá nghiền nhỏ + nước (V=10ml/1g sụn /1.5g da basa Enzyme protease Sụn cá nhám,nhiệt độ: 60 C; pH:6,T=18h, Enzyme: 125µl/3g sụn tươi Sụn cá đuối;nhiệt độ: 650C;pH:6;T=30h; Enzyme: 175µl/3g sụn Da basa, nhiệt độ: 650C;pH:6; T=30h; Enzyme: 150µl/1.5g da tươi Thủy phân sụn, da cá Để lạnh 40C ly tâm 8.000v/phút, 30 phút thu dịch Thêm C2H5OH theo V dịch/ C2H5OH= 1/3 40C, 24h Loại protein Ly tâm 10.000v/phút, 20 phút thu dịch, 40C [chế phẩm HA thô] Chế phẩm HA thô (Hòa tủa H2O khử ion) Thêm 2% cetylpyridinium chloride (CPC) Thu nhận GAG Ly tâm 10.000 v/phút, 15 phút, ºC (loại dịch,thu tủa) Tủa rửa NaCl 0,4M, Ly tâm 10000 v/phút, 30 phút, 4ºC(thu dịch, bỏ tủa) Thêm C2H5OH theo V dịch/ C2H5OH=1/3 4oC, 24h Ly tâm 12000 vòng/phút, 30 phút Thu tủa, bỏ dịch sấy khô, giữ 4oC Chế phẩm HA tinh sơ Hình 3.13: Quy trình tinh HA từ xương sụn cá nhám, cá đuối da basa 40 phân tách HA thu chế phẩm HA Từ kết nghiên cứu trên, đưa quy trình tinh HA *Chuẩn bị mẫu thủy phân protein liên kết với GAG, giải phóng GAG: Mẫu xương sụn cá đuối, cá nhám tươi nghiền nhỏ; da ba sa cắt nhỏ Với mẫu xương sụn khô ta thu cách sấy xương, sụn tươi 600C 5h, sau đem nghiền nhỏ Hao hụt trọng lượng sấy khô so với mẫu tươi giảm khoảng lần sụn lần da basa Thêm nước vào theo thể tích 10ml/1g sụn tươi, 10ml/1,5g da basa tươi Enzyme thương mại ENV thêm vào với nồng độ 125 µl/3g sụn cá nhám, 175 µl/3g sụn cá đuối, 150 µl/1,5g da basa Hỗn hợp ủ với nhiệt độ thích hợp: Cá nhám (600C), cá đuối da basa (650C); kết hợp khuấy đảo Sau thời gian tối ưu: cá nhám (18h), cá đuối da basa (30h), enzyme protease hoạt động thủy phân protein liên kết HA Hỗn hợp sau phản ứng ly tâm 40C, 8000 vòng/phút, 30 phút thu dịch loại bỏ cặn *Thu nhận GAG (bao gồm chủ yếu chất: HA, chondronitin sulfate, dermantant sulfate): Dịch thu đem tủa với C2H5OH theo tỷ lệ thể tích dịch/C2H5OH=1/4 Tủa thu được hòa với nước khử ion (khoảng 60ml với 10g xương, sụn ban đầu) Để phân tách glycosaminoglycan (GAG) gồm chất chủ yếu HA, chondroitin sulfate (CS), dermantant sulfate với chất khác chế phẩm HA thô thu nhận sau tủa ethanol sử dụng 2% muối cetylpyridium chloride (CPC) CPC tạo phức hợp tủa với GAG Hỗn hợp ly tâm 10000 vòng/phút, 40C, 15 phút để thu tủa loại dịch *Phân tách thu chế phẩm HA: Tủa rửa NaCl 0,4M, HA phân tách khỏi tủa HA-CPC Tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút loại tủa,thu dịch Để loại muối, dịch tiếp tục bổ sung C2H5OH với tỷ lệ dịch/C2H5OH=3/1, 40C, 24h Sau ta ly tâm 40C, 12000 vòng/phút, 30 phút loại dịch thu tủa sấy khô, giữ 40C ta chế phẩm HA sơ tinh 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1, Đây lần Việt Nam, hàm lượng HA xương sụn cá nhám (Carcharhinus Sorrah); cá đuối (Dasyatis Kuhlii) da cá basa (Pangasius bocourti) điều tra Hàm lượng HA từ sụn cá nhám, sụn cá đuối da cá basa xác định tương ứng 4,7 (±0,32) %; 4,3 (±0,35) % 0,7(±0,08) % trọng lượng khô 2, Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm enzyme ENV thủy phân sụn da cá để chiết rút HA: - Điều kiện thủy phân xương sụn cá nhám: nhiệt độ tối ưu: 60ºC; pH tối ưu 6; thời gian thủy phân 18 giờ, tỷ lệ thủy phân tối ưu: 125µl ENV /3g sụn tươi (hoạt độ: 0,96 UI/ml ENV) - Điều kiện thủy phân xương sụn cá đuối: nhiệt độ tối ưu: 65ºC; pH tối ưu 6; thời gian thủy phân 30 giờ, tỷ lệ thủy phân tối ưu: 150µl ENV /3g sụn tươi - Điều kiện thủy phân da cá basa: nhiệt độ tối ưu: 65ºC; pH tối ưu 6; thời gian thủy phân 30 giờ, tỷ lệ thủy phân tối ưu: 150µl ENV /1,5g da cá basa tươi 3, Kết sơ tinh - Xây dựng quy trình thu nhận HA sơ tinh chế phẩm enzyme ENV Kết thu nhận HA bán tinh đạt 1.8% trọng lượng mẫu xương sụn tươi cá nhám, 1.6% cá đuối 1.3% da cá basa Chế phẩm HA có độ đạt khoảng 63% từ cá nhám, 61 % cá đuối; đạt khoảng 65% từ da cá basa KIẾN NGHỊ Đây kết ban đầu xác định hàm lượng HA thu nhận HA sơ tinh từ nguồn sụn cá nhám, cá đuối da cá basa Cần có thời gian, cơng sức kinh phí để: Xác định phương pháp chiết rút thu nhận HA hiệu (kết hợp phương pháp sinh học với hóa học, sử dụng enzyme thủy phân lặp lại, loại mỡ da cá basa …) Tìm nguồn enzyme từ chủng vi sinh vật nước để thay enzyme nhập ngoại giúp giảm giá thành sản phẩm Hồn thiện quy trình tinh HA có chất lượng HA đạt 80-90% 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Balazs (27 February 1979), E.A Ultrapure Hyaluronic Acid and the Use Thereof U.S Patent 4,141,973, [2] Chain, E., and Duthie, E., Rrit J Exp Path., (1940) 21, 324 [3] Chien LJ, Lee CK (2007), Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis Appl Microbiol Biotechnol, 77:339-346 [4] Chong FB, Nielsen LK (2003), Amplifying the cellular reduction potential of Streptococcus zooepidemicus J Biotechnol, 100:33-41 [5] Chong FB, Blank LM, Mclaaughlin R, Nielsen LK (2005), Microbial hyaluronic acid production Appl Microbiol Biotechnol, 66:341-351 [6] Cowman M.K., Matsuoka S (2005), Experimental approaches to hyaluronan structure Carbohydrate Re-search, 340, 791–809 [7] Cullis-Hill, D, (1989), Preparation of hyaluronic acid from synovial fluid U.S Pat Nº 4,879,375 [8] Heldin P ( 2003) Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumour formation Braz J Med Biol Res 36(8): 967-73 [9] E Yu Ignatova, A N Gurov (March 1990), Principles of extraction and purification of hyaluronic acid (review) Pharmaceutical Chemistry Journal, Volume 24, Issue 3, pp 211-216 [10] Fong Chong B, Nielsen LK (2003), Aerobic cultivation of Streptococcus zooepidemicus and the role of NADH oxidase Biochem Eng J, 16:153-162 [11] Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A.(2007), Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage Chemical Engineering and Processing 46; 465-471 [12] Hascall V.C (1988), Proteoglycans: The chondroitin sulfate/keratin sulfate proteoglycan of cartilage Institute for Scientific Information Atlas of Science, Biochemistry Institute for Scientific Information, Philadelphia, PA (1): 189-198 [13] Izawa N, Hanamizu T, Iizuka R, Sone T, Mizukoshi H, Kimura K, Chiba K (2009 Feb), Streptococcus thermophilus produces exopolysaccharides including hyaluronic acid J Biosci Bioeng.;107(2):119-23 [14] Juhlin L (1997), Hyaluronan in skin, J Intern Med 242 (1): 61-6 43 [15] José Antonio Vázquez , Isabel Rodríguez-Amado 1, María Ignacia Montemayor , Javier Fraguas , María del Pilar González and Miguel Anxo Murado(2013), Chondroitin Sulfate, Hyaluronic Acid and Chitin/Chitosan Production Using Marine Waste Sources: Characteristics, Applications and EcoFriendly Processes, A Review Mar Drugs, 11, 747-774 [16] Knudson W, Chow G, Knudson CB ( 2002 Jan), CD44-mediated uptake and degradation of hyaluronan Matrix Biol;21(1):15-23 [17] Krahulec J, Krahulcova J, (2006), Increase in hyaluronic acid production by Streptococcus equi subsp zooepidemicus strain deficient in betaglucuronidase in laboratory conditions Appl Microbiol Biotechnol, 71:415-422 [18] Lyon M, and Gallagher JT, (1998),Bio-specific sequences and domains in heparan sulphate and the regulation of cell growth and adhesion Matrix Biol 17: 485-493 [19] Mansour, M.B., H Majdoub, I Bataille, M.S Roudesli, M Hassine, N Ajzenberg, F Chaubet and R.M Maaroufi ( 2009), Polysaccharides from the skin of the ray Raja radula Partial characterization and anticoagulant activity Thrombosis Research, 123, 671-678 [20] Mao Z, Chen RR,( 2007), Recombinant synthesis of hyaluronan by Agrobacterium sp Biotechnol Prog, 23:1038-1042 [21] Meyer K, Palmer J, (1934), The polysaccharide of the vitreous humor J Biol Chem 107: 629-634 [22] Meyer, K., and Chaffee, E., J Biol Chem., (1941), 136, 491 [23] Murado, M.A.; Montemayor, M.I.; Cabo, M.L.; Vázquez, J.A.; González, M.P (2012), Optimization of extraction and purification process of hyaluronic acid from fish eyeball Food Bioprod Proc., 90, 491–498 [24] Nguyễn Kim Cẩn (2006).Nghiên cứu thuốc từ thảo dược NXB Khoa học Kỹ thuật Hà nội [25]- Nakano T, Ikawa N and Ozimek L (2001), Extraction Glycosaminoglycans from Chicken Eggshell Poultry Science; 80: 681-684 44 of [26] O’Regan, M.; Martini, I.; Crescenzi, F.; de Luca, C.; Lansing, M Molecula, (1994), mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis Int J Biol Macromol., 16, 283–286 [27] P Pat, (1975), 88291 , Jpn., Chem Abstr., 84, No 15711, (1975) [28] Pat, (1974), 2333184 , FRG; Chem Abstr., 81, No 4210, (1974) [29] Pat, (1976), 95116, Jpn.; Chem Abstr., 85, No 156941, (1976) [30] Pietrowa JS, Wincjunajte MM (1966) Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologicheskovo proiskhozhdenia, Priklad Biochem Mikro-bio, 232 [31] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2006).Hoá Sinh Học NXB Giáo dục [32] Phạm Võ Minh Thiện, Nguyễn Hoàng Khuê Tú, (2010), Phát hyaluronan từ số nguyên liệu tự nhiên Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3A): 685-691 [33] N periyasamy, S Murugan and P Bharadhirajan, (2013), Isolation and characterization of anticoagulant compound from marine mollusc Donax faba (Gmelin, 1791) from Thazhanguda, southeast Coast of india, African Journal of Biotechnology, 5968-5974 [34] Prescott AL,(2003), Method for purifying high molecular weight hyaluronic acid USP 6660853 [35] Reissig J.L, Jack L Strominger and Luis (1955) A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars J Biol Chem., 217:959-966 [36] Reig F B (1992) Separation and indentification of sugars and maltodextrines by thin layer chromatography: Application to biological fluids and humen milk Talanfa, Vol 39, No 11, pp 1493-1498 [37] Schiller S, Solver G.A, Dorfman A (1961), A method for the separation of acid mucopolysaccharides: its application to the isolation of heparin from the skin of rats J Biol Chem; 983-987 [38] Selleck SB (2000) Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics Trends Genet 206-212 [39] Shankar K, Muthuvel A, Sadhasivam G, Thangavel.B (2013) Isolation, characterizationand antioxidantactivity 45 of hyaluronicacid frommarinebivalvemollusc Amussium pleuronectus Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre: 1-7 [40] Shiedlin A, Bigelow R, Christopher W, Arbabi S, Yang L, Maier RV, Wainwright N, Childs A, Miller RJ (2004) Evaluation of hyaluronan from different sources: Streptococcus zooepidemicus, rooster comb, bovine vitreous, and human umbilical cord 5(6):2122-7 [41] Stern R, ( 2005), Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology Pathol Biol 53(7): 372-382 [42] Swann, D.A.( 1968) Studies on hyaluronic acid: The preparation and properties of rooster comb hyaluronic acid Biochim Biophys Acta, 156, 17–30 [43] Timothy E Hardingham and Helen Muir, ( 1974 June), Hyaluronic acid in cartilage and proteoglycan aggregation Biochem J.; 139(3): 565–581 [44] Tohoku, ( 1980), Extraction of Hyaluronic Acid from Rabbit Skin with Lanthanum Chloride J exp Med 132, 337-340 [45] Turnbull J, Powell A, and Guimond S (2001) Heparan sulfate: decoding a 0dynamic multifunctional cell regulator Trends Cell Biol (11): 75-82 [46] Vijayabaskar P, Somasundaram ST (2012), Studies on molluscan glycosaminoglycans (GAG) from backwater clam Donax cuneatus (Linnaeus) Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine S519-S52)5 [47] Võ Hồi Bắc, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh ,( 2010 ), Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease (ETM) cho trình tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) cá Nhám (Carcharhinus Shrah) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3A): 593-602 [48] Vynios DH, Aletras A, Tsiganos CP, Tsegenidis T, Antonopoulos CA, Hjerpe A, Engfeld B (1985).Proteoglycans from squid cranial cartilage extraction and characterization, Comp Biochem Physiol 80B 4: 761-766 [49] Widner B, Behr R, Von Dollen S, (2005), Hyaluronic acid production in Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol, 71:3747-3752 [50] Yu HM, Stephanopoulos G, (2008), Metabolic engineering of Escherichia coli for biosynthesis of hyaluronic acid Metabolic Eng, 10:24-32 46 [51] Zhao Yuhong, ( 2008), Preparation and identifi cation of Hyaluronic Acid From Fresh Pigskin Journal of Northeast Agricultural University, Vol 15 No.3 44-49 Web: [52] http://BME/ME 456 Biomechanics [53] http://wikipedia.Cartilage [54] http://wikipedia.Chondroitin Sulfate [55] http://ccbolgroup.com/hierbas2E.html [56] http://vienthuysan2.com [57] http://www.appliedhealth.com/ABC_News_HA.html 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: đường chuẩn tyrossine 48