Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư gan của các cao chiết tách chiết từ cây an xoa (helicteres hirsuta lour )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ Nguyễn Thị Thùy Trang ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - Năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Thùy Trang ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Trữ Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu dựa tài liệu, số liệu tơi tự nghiên cứu tìm hiểu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm Học viên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Văn Trữ ln hết lịng dạy dỗ, bảo ban, dìu dắt, động viên, khích lệ cho tơi chun môn tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực luận văn Đó góp ý quý báu cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin cảm ơn đồng nghiệp Trung tâm Vật lý chất mềm-Vật lý Sinh học Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ đưa lời khun, góp ý bổ ích cho tơi suốt q trình tơi cơng tác trung tâm Tơi xin trân trọng cảm ơn tất thầy, cô Học viện Khoa học Công nghệ giảng dạy, tạo điều kiện sở vật chất, cung cấp cho kiến thức phong phú, làm tảng để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè người ln lắng nghe, sẵn sàng sẻ chia giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Luận văn tài trợ mặt kinh phí từ chương trình sau tiến sĩ tạo nguồn lực KHCN cho Viện Hàn lâm KHCNVN Tên đề tài hỗ trợ sau tiến sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ phân tử hợp chất thứ cấp tách chiết từ An xoa Helicteres hirsuta Lour lên tế bào ung thư gan Học viên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH M C C C K HI V CH CÁI VI T T T DANH M C C C BẢNG DANH M C C C HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .2 MỞ ĐẦ .3 CHƯƠNG TỔNG Q AN T I LI .7 1.1 Tổng quan ung thư gan 1.1.1 Nguyên nhân gây ung thư gan 1.1.2 Các yếu tố làm tăng nguy ung thư gan 1.1.3 Phương pháp điều trị ung thư gan 1.2 Tổng quan An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) 1.2.1 Đặc điểm hình thái An xoa 1.1.2 Thành phần hóa học 10 1.1.3 Phân bố 10 1.3 Tình hình nghiên cứu An xoa 11 1.3.3 Các nghiên cứu giới 11 1.3.4 Các nghiên cứu nước 14 1.4 Sử dụng An xoa điều trị ung thư gan 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 2.1.2 Hoá chất thiết bị nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 22 2.2.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu dược liệu 23 2.2.3 Phương pháp định danh loài phương pháp sinh học phân tử 23 2.2.4 Phương pháp sắc ký mỏng 25 2.2.5 Phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học hoạt tính gây độc tế bào 25 2.2.6 Phương pháp đánh giá khả ức chế phục hồi tổn thương 27 2.2.7 Phương pháp đánh giá khả ức chế di căn, xâm lấn 28 2.2.8 Phương pháp western blot 28 iv 2.2.9 Phương pháp real-time PCR 29 CHƯƠNG K T Q Ả V THẢO L ẬN 30 3.1 Kết định danh mẫu An xoa 30 3.2 Kết tách chiết phân đoạn dịch chiết từ An xoa 34 3.2.1 Tách chiết phân đoạn dịch chiết 34 3.2.2 Kiểm tra thành phần phân đoạn dịch chiết sắc ký mỏng 36 3.3 Kết đánh giá tính gây độc tế bào với cao chiết từ An xoa (mtt assay ) 38 3.3.1 Lựa chọn phân đoạn dịch chiết có khả gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 38 3.3.2 Đánh giá khả gây độc tế bào ung thư dịch chiết Dichloromethane dòng ung thư gan khác Hep-G2, Huh7 Chang cell 40 3.4 Thành phần hóa học cao chiết từ An xoa 43 3.5 Kết đánh giá khả ức chế phục hồi tổn thương với cao chiết từ An xoa (wound healing assay) 46 3.6 Kết đánh giá khả ức chế xâm lấn với cao chiết từ An xoa (invasion assay) 47 3.7 Kết đánh giá mức độ biểu gen liên quan đến trình di căn, xâm lấn tế bào ung thư tế bào ung thư xử lý với cao chiết từ An xoa 49 3.8 Thảo luận 51 T I LI THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC K HIỆU VÀ CH STT Từ tắt viết Tiếng Anh CÁI VIẾT T T Tiếng việt Đối chứng âm DMSO Dimethyl sufoxit DCLHH Dichloromethane hirsute Lour EtHH Etyl axetat Helicteres hirsute Dịch chiết etyl axetat Lour An xoa FBS Fetal Brovine serum Huyết bào thai bê HepG2 human hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người HPLC High Performance LiquidChromatography Sắc lý lỏng hiệu cao I% % Inhibition Phần trăm ức chế IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa 50% concentration MeHH Methanol Lour 10 MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 Diphenyltetrazolium Bromide Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 11 HEHH n-hexan Helicteres hirsute Lour Dịch chiết n-hexan An xoa 12 OD Optical Density Mật độ quang mẫu 13 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng Helicteres Helicteres Dịch chiết dichloromethane An xoa hirsute Cao chiết methanol An xoa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phân lập từ An xoa 13 Bảng 2.1 Thông tin mồi sử dụng 24 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi sử dụng đánh giá biểu gen liên quan đến trình di xâm lấm tế bào Hep-G2 29 Bảng 3.1 Kết tóm tắt Blast search trình tự gen AX NA.rbcL 31 Bảng 3.2 Kết tóm tắt Blast search trình tự gen AX NA.matK 33 Bảng 3.3 Khối lượng tỷ lệ cao chiết từ An xoa 34 Bảng 3.4 Kết xác định giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết đối chứng Ellipticine 38 Bảng 3.5 Kết xác định giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết dichloromethane 41 Bảng 3.6 Thành phần hóa học chất mẫu cao chiết An xoa.44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh An xoa ( Helicteres hirsuta Lour.) 10 Hình 1.2 Sáu hợp chất lignan tách chiết từ An xoa Indonesia 11 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất stigmasterol (A); Cấu trúc hợp chất lupeol (B); Cấu trúc hợp chất apigenin (C);Cấu trúc hợp chất tiliroside (D)19 Hình 2.1 Sơ đồ mơ tả phương pháp MTT 26 Hình 3.1 Kết so sánh trình tự sử dụng mồi rbcL 31 Hình 3.2 Kết so sánh trình tự sử dụng mồi matK 32 Hình 3.3 Mẫu An xoa tách chiết 34 Hình 3.4 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn mẫu An xoa 36 Hình 3.5 Sắc ký mảng cao chiết methanol từ An xoa Dung môi khai triển: Dichloromethane – n-Hexan (1:1) 37 Hình 3.6 Sắc ký mảng cao chiết methanol từ An xoa Dung môi khai triển: Dichloromethane – Methanol (95:5) 37 Hình 3.7 Sắc ký mảng cao chiết methanol từ An xoa Dung môi khai triển: Dichloromethane – Methanol (8:2) 37 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn tương quan % tỷ lệ tế bào sống nồng độ mẫu An xoa dịch chiết dichloromethane (DCLHH) 39 Hình 3.9 Hoạt tính gây độc tế bào Hep-G2 cao chiết từ An xoa chất 40 Hình 3.10 Hoạt tính gây độc tế bào Huh7 cao chiết dichlomethane từ An xoa 42 Hình 3.11 Hoạt tính gây độc tế bào Chang cell cao chiết dichlomethane từ An xoa 43 Hình 3.12 Helicteres hirsuta thành phần hóa học thực vật 45 Hình 3.13 Hoạt tính ức chế phục hồi tổn thương cao chiết dichlomethane từ An xoa lên tế bào Hep-G2 47 Hình 3.14 Chiết xuất dichlomethane Helicteres hirsuta ngăn chặn xâm lấn tế bào Hep -G2 48 Hình 3.15 Dịch chiết dichloromethane Helicteres hirsuta điều chỉnh giảm mức độ chuyển đổi tế bào biểu mô thành trung mô (EMT) 50 MỞ ĐẦU ng thư nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai giới, sau bệnh tim mạch Theo thống kê, riêng năm 2018, có tới 18.1 triệu ca mắc có tới 9.6 triệu ca tử vong ung thư [1] ng thư gan ung thư có tỷ lệ mắc cao Việt Nam năm 2018 theo Globocan, có 25.335 trường hợp (15,4%); Tỉ lệ ung thư gan nam 21,5% nữ 7,8% Ở Việt Nam, theo thống kê Tổ chức Y tế giới [2] số ca mắc ung thư tăng nhanh mức 68.000 ca năm 2000 lên 164.671 năm 2018, dự kiến tăng 190.000 ca năm 2020 Trong năm 2018 có tới 114.871 người tử vong ung thư, xấp xỉ 315 người chết ngày Đặc biệt tỉ lệ tử vong bệnh nhân ung thư Việt Nam cao lên tới 60% so với tỉ lệ tử vọng Mỹ 34.39% Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới (WHO) năm 2018, ung thư gan loại ung thư gây tử vong hàng đầu với gần 800.000 ca tử vong năm.Đáng lưu ý ung thư gan bệnh ung thư phổ biến Việt Nam với tỉ lệ mắc ung thư gan Việt Nam xếp vị trí thứ 4/185 quốc gia, vùng lãnh thổ có số liệu ung thư Trung bình 100.000 người Việt có 23,2 người bị ung thư gan [2] Phương pháp điều trị ung thư phổ biến áp dụng hóa trị liệu xạ trị kết hợp với phẫu thuật Nhược điểm tất phương pháp xảy tác dụng phụ nguy hiểm khơng mong muốn, chi phí cao, đơi không triệt để Theo báo cáo y tế Việt Nam, chi phí điều trị ung thư năm 2012 lên tới 25.78 nghìn tỷ đồng, xấp xỉ 1.2 tỷ đô la mỹ, chiếm tới 0.22 % tổng sản phẩm quốc nội (GDP) Do đó, xu điều trị ung thư tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên mang hoạt tính chống lại tế bào ung thư để sử dụng Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đảm bảo an tồn, khơng gây tác dụng phụ khơng mong muốn, với chi phí thấp Hơn nữa, chúng cịn sử dụng dạng thực phẩm chức năng, làm tăng cường sức đề kháng thể, từ phịng chống lại bệnh hiểm nghèo có ung thư Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) dạng bụi, thân gỗ, nhánh hình trụ, thường cao từ 1-3 mét Lá An xoa có hình trái xoan, mặt màu trắng, hai mặt phủ đầy lơng hình Các lông thường gây ngứa chạm vào Cây có hoa gồm cánh, có màu tím Quả An xoa 45 [65], [66] Agoramoorthy cộng (2007) cho thấy axit palmitic, hợp chất phân lập có vai trị chất kháng khuẩn kháng nấm [67] Hơn nữa, Jerah et al chứng minh axit octadecenoic phân lập ức chế virus sởi dòng tế bào Vero [68] DCLHH cho thấy tác dụng gây độc tế bào cao gây tổn hại DNA dòng tế bào ung thư Hợp chất DCLHH xác định axit asexadecanoic báo cáo hoạt động cảm ứng trình chết theo chương trình phản ứng phá hủy DNA [69], [70] Tuy nhiên, ảnh hưởng hợp chất riêng lẻ chiết xuất Helicteres hirsuta tế bào ung thư biểu mô tế bào gan cần nghiên cứu thêm Hình 3.12 thành phần hóa học thực vật (A) , (B) TLC diện chiết xuất a: tia cực tím 254nm đèn chiếu sáng, b: hiển thị Vanillin/H2SO4 1: Chiết xuất n-Hexan, 2: Chiết xuất Dichloromethane, 3: Chiết xuất etyl axetat, 4: Chiết xuất methanol (C) Sắc ký đồ GC-MS mẫu cao chiết từ An xoa việc phân tích thành phần hóa học thực vật cao chiết methanol 46 TLC kỹ thuật sàng lọc sơ ban đầu định tính có mặt chất mẫu nghiên cứu Hình 3.12B cho thấy số lượng hợp chất kỵ nước tập trung chủ yếu HEHH DCLHH (tương ứng điểm 1, 2), hầu hết chất có giá trị Rf > 0,3 Trong đó, hai mẫu EtHH MeHH (điểm 3, 4) chủ yếu chứa hợp chất ưa nước (Rf < 0,3) phát thuốc thử Vanillin (Hình 3.12Bb) Ngồi ra, kết GC-MS cho thấy, 20 thành phần thực vật khác quan sát thấy cao chiết methanol Helicteres hirsuta Thời gian lưu (RT), diện tích peak số lưu chúng trình bày Hình 3.12C Bảng 3.6 Trong 20 hợp chất phát đó, có hợp chất hữu dễ bay axit Hexadecanoic axit Palmitic, metyl este với thời gian lưu 40,70 phút 39,34 phút Ba hợp chất axit 6,9-Octadecadienoic, metyl este; axit 6-octadecenoic; methyl isoheptadecanoate (thời gian lưu 43.31, 44.61, 45.13) hợp chất có hàm lượng trung bình phát 3.5 K T QUẢ Đ NH GI KHẢ NĂNG ỨC CH SỰ PH C HỒI TỔN THƯƠNG VỚI CAO CHI T TỪ CÂY AN XOA (WOUND HEALING ASSAY) Để tiếp tục điều tra khả chống ung thư Helicteres hirsuta , thử nghiệm đánh giá khả ức chế phục hồi tổn thương phân đoạn dịch chiết dichloromethane, Ethyl acetate, n- Hexan với tế bào ung thư gan Hep-G2 (wound healing assay) tiến hành Trong trình thử nghiệm, tế bào di chuyển vào khoảng trống chúng tăng sinh Tế bào xử lý với nồng độ (50μg/mL) 24h, 48h, 72h Helicteres hirsuta thể Hình 3.13 ức chế trình phục hồi tổn thương cao nhiều so với điều trị DMSO Xử lý phân đoạn dịch chiết dichlomethane (DCLHH ) H hirsute cho thấy mức độ ức chế cao (sau 24h-48h ức chế khoảng 63% sau 72h ức chế 59%), sau phân đoạn dịch chiết Ethyl acetate cho thấy mức độ ức chế trung bình (sau 24h ức chế khoảng 86%, sau 48h ức chế 79%, sau 72h ức chế 76% ), Cuối nHexan cho thấy mức độ ức chế thấp (sau 24h ức chế khoảng 98%, sau 48h - 72h ức chế 85% ) so sánh với biện pháp kiểm soát xử lý DMSO Kết chứng minh việc xử lí với nồng độ 50μg/mL phân đoạn dịch chiết dichloromethane (DCLHH ) Helicteres hirsuta có hoạt tính ức chế phục hồi tổn thương tế bào Hep-G2 Mức độ tế bào di 47 Hình 3.13 Hoạt tính ức chế phục hồi tổn thương phân đoạn dịch chiết dichloromethane từ An xoa (A) Hình ảnh ức chế phục hồi tổn thương tế bào HepG2 điều trị dịch chiết , n-Hexan, Dichloromethane, Ethyl axetat (B) Phân tích định lượng xét nghiệm chữa lành vết thương tế bào HepG2 3.6 K T QUẢ Đ NH GI KHẢ NĂNG ỨC CH SỰ XÂM LẤN VỚI CAO CHI T TỪ CÂY AN XOA (INVASION ASSAY) Tiếp tục đánh giá khả ức chế xâm lấn dịch chiết Helicteres hirsuta dòng tế bào Hep-G2 với nồng độ khác 12,5μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL dịch chiết Helicteres hirsuta Kết cho thấy phân đoạn dịch chiết dichloromethane Helicteres hirsuta ức chế đáng kể xâm lấn tế bào Hep-G2 theo cách phụ thuộc vào nồng độ, so sánh với biện pháp kiểm soát xử lý DMSO (Hình 3.14B) Số lượng tế bào bị xâm lấn giảm 50% xử lý với 50 μg/mL phân đoạn dịch chiết 48 Tỷ lệ số lượng tế bào xâm lấn dichloromethane (DCLHH) Phân tích định lượng số lượng tế bào bị xâm lấn liệu khác biệt đáng kể (Hình 3.14A) Ở nồng độ 50 μg/mL cho thấy mức độ tế bào xâm lấn thấp đạt 59% phân đoạn dịch chiết dichloromethane so với đối chứng DMSO, nồng độ 25 μg/mL cho thấy mức độ tế bào xâm lấn đạt mức trung bình 62%, cuối mức độ tế bào xâm lấn đạt mức cao tìm thấy nồng độ 12,5% Kết chứng minh việc xử lý với phân đoạn dịch chiết dichloromethane Helicteres hirsuta làm ức chế khả xâm lấn tế bào HepG2 Hình 3.14 Phân đoạn dichlomethane Helicteres hirsuta ngăn chặn xâm lấn tế bào Hep -G2 (A) phân tích định lượng tương đối số lượng tế bào bị xâm lấn lần điều trị (B) xét nghiệm xâm lấn tế bào HepG2 49 3.7 K T QUẢ Đ NH GI MỨC Đ BIỂU HI N CỦA CÁC GEN LIÊN Q AN Đ N Q TRÌNH DI CĂN, XÂM LẤN CỦA T B O NG THƯ KHI T B O NG THƯ ĐƯỢC XỬ LÝ VỚI CAO CHI T TỪ CÂY AN XOA EMT đóng vai trị quan trọng phát triển di ung thư [71] Do vậy, Sau ghi nhận hoạt tính phân đoạn dịch chiết dichloromethane An xoa, tiến hành đánh giá ảnh hưởng dich chiết lên mức độ biểu số gen liên quan đến trình chuyển đối tế bào biểu mô thành trung mô EMT Sự khác mức độ biểu số EMT phân tích, kết thể Hình 3.15 Qua phân tích Western blot để kiểm tra mức độ biểu protein liên quan đến di N-cadherin, E-cadherin xử lý phân đoạn dịch chiết dichloromethane (DCLHH ) Helicteres hirsuta nồng độ khác 12,5μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL Kết cho thấy liều lượng DCLHH làm giảm biểu E-cadherin phụ thuộc vào nồng độ (ở nồng độ 12,5μg/mL có mức độ biểu protein 81%, xử lí nồng độ 25μg/mL mức độ biểu protein 62%, xử lí nồng độ 50μg/mL mức độ biểu protein 58% ), không làm thay đổi đáng kể biểu N-cadherin mức độ protein (ở nồng độ 12,5μg/mL có mức độ biểu protein 101%, xử lí nồng độ 25μg/mL mức độ biểu protein 109%, xử lí nồng độ 50μg/mL mức độ biểu protein 108%) ( Hình 3.15 A, B) Sự biểu mức E-cadherin xác định yếu tố điều chỉnh di Do đó, việc ngăn chặn phát triển E-cadherin hỗ trợ hoạt động chống di phân đoạn dịch chiết dichloromethane Hơn nữa, biểu mRNA cho thấy kết tương tự, nồng độ DCLHH làm giảm biểu E-cadherin không làm thay đổi đáng kể biểu N-cadherin, Snail Twist giảm phụ thuộc vào nồng độ xử lý DCLHH (Hình 3.15C) Tóm lại, kết cho thấy DCLHH có hoạt tính gây độc tế bào HepG2 nhờ khả ức chế EMT Mức độ biểu mRNA Mức độ biểu protein 50 Hình 3.15 Phân đoạn dịch chiết dichloromethane Helicteres hirsuta điều chỉnh giảm mức độ chuyển đổi tế bào biểu mơ thành trung mơ (EMT) (A,B) Phân tích Western blot cho thấy mức độ biểu protein tương đối cadherin.(C) phân tích định lượng tương đối mức độ mRNA N-cadherin, E-cadherin, Snail Twist tế bào HepG2 xử lý phân đoạn 51 dịch chiết dichloromethane Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình, n = 3; * p < 0,05; ** p < 0,01; ***p