NGHIÊN cứu HOẠT TÍNH CHỐNG OXI hóa của CAO THÂN cây AN XOA (helicteres hirsuta lour

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN VĂN THỦY NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Tp HCM – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN VĂN THỦY NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Chuyên nghành: Sản xuất phát triển thuốc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: ThS Phan Thị Thanh Thủy Tp HCM – 2018 Lời cam đoan Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học ThS Phan Thị Thanh Thủy Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Văn Thủy Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Đề tài hồn thành mơn Hóa dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trong trình nghiên cứu, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô bạn bè Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Phan Thị Thanh Thủy, người tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn mơn Hóa dược, mơn Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành kế hoạch nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Dược Trường Đại học Nguyễn Tất Thành tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành báo cáo Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè người thân ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Văn Thủy Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Mục lục MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 CHI HELICTERES VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHÚNG 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Helicteres .2 1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Helicteres 1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA 13 1.2.1 Vị trí hệ thống phân loại thực vật 13 1.2.2 Đặc điểm thực vật 13 1.2.3 Công dụng chữa bệnh .14 1.2.4 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.2.5 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 1.3 CHẤT CHỐNG OXI HÓA 15 1.3.1 Vai trò chất chống oxi hóa .15 1.3.2 Các chất chống oxi hóa thường gặp 16 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA .18 1.4.1 Phương pháp DPPH .18 1.4.2 Phương pháp FRAP 18 1.4.3 Phương pháp MDA 19 1.4.4 Phương pháp ABTS .19 1.4.5 Phương pháp tổng lực khử 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Dụng cụ, hóa chất 20 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu 21 2.3.2 Phương pháp xác định sơ thành phần hóa thực vật 21 i Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Mục lục 2.3.3 Phương pháp chiết xuất dược liệu thu cao phân đoạn 23 2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng 25 2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng .27 2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa .27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30 3.1 CHỈ TIÊU BỘT DƯỢC LIỆU 30 3.1.1 Mất khối lượng sấy khô 30 3.1.2 Độ ẩm bột dược liệu .30 3.2 SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 30 3.3 CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ THU CAO PHÂN ĐOẠN 32 3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG PHENOLIC TỔNG .33 3.5 KẾT QUẢ SẮC KÝ LỚP MỎNG CÁC CAO PHÂN ĐOẠN 36 3.6 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA 37 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 KẾT LUẬN 45 4.1.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 45 4.1.2 Quy trình chiết xuất thu cao 45 4.1.3 Định lượng phenolic tổng phương pháp Folin – Ciocalteu 45 4.1.4 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa cao mơ hình DPPH .45 4.2 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Danh mục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ABTS DC DPPH EA Tiếng Anh Tiếng Việt 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulphonic acid) Dichloromethane 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Ethyl acetat FRAP Ferric reducing antioxidant power Khả chống oxi phương pháp khử sắt GAE Gallic acid equivalent Đương lượng acid gallic Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc lý lỏng hiệu cao IC Inhibitory concentration Nồng độ ức chế KH Lu1 LNCaP Ký Hiệu Human lung carcinoma Dòng tế bào ung thư phổi Hormone-dependent human prostate carcinoma Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol NMR Nuclear magnetic resonance PE Cộng hưởng từ hạt nhân Petroleum ether SKLM TPTZ Sắc ký lớp mỏng 2,4,6-tripyridyl-s-triazine i Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Danh mục DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các hợp chất sesquiterpenoid quinone phân lập từ chi Helicteres .3 Hình 1.2 Các hợp chất naphthoquinone phân lập từ chi Helicteres Hình 1.3 Các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Helicteres Hình 1.4 Các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Helicteres Hình 1.5 Các hợp chất lignan phân lập từ chi Helicteres Hình 1.6 Các hợp chất triterpenoid phân lập từ chi Helicteres .10 Hình 1.7 Các hợp chất cucurbitacin phân lập từ chi Helicteres .11 Hình 1.8 Các hợp chất khác phân lập từ chi Helicteres 12 Hình 1.9 Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) .13 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo Vitamin C 16 Hình 1.11 Công thức cấu tạo Vitamin E 17 Hình 2.1 Quy trình chiết xuất để thực sơ thành phần hóa học 22 Hình 2.2 Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ thân An xoa 24 Hình 2.3 Nguyên tắc phản ứng phương pháp DPPH .27 Hình 3.1 Kết chiết cao tổng thu cao phân đoạn từ thân An xoa 33 Hình 3.2 Đường chuẩn acid gallic 34 Hình 3.3 Biểu đồ hàm lượng phenolic tổng cao tổng cao phân đoạn 35 Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng cao tổng cao phân đoạn 36 Hình 3.5 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao tổng Ethanol 96% 39 Hình 3.6 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao phân đoạn Chloroform .39 Hình 3.7 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao phân đoạn Ethyl acetat .40 Hình 3.8 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao phân đoạn nước 41 Hình 3.9 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Vitamin C 42 Hình 3.10 Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao tổng cao phân đoạn so với Vitamin C 43 ii Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Danh mục DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các hợp chất sesquiterpenoid quinone phân lập từ chi Helicteres .2 Bảng 1.2 Các hợp chất naphthoquinone phân lập từ chi Helicteres Bảng 1.3 Các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Helicteres Bảng 1.4 Các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Helicteres Bảng 1.5: Các hợp chất lignan phân lập từ chi Helicteres Bảng 1.6: Các hợp chất triterpenoid phân lập từ chi Helicteres Bảng 1.7 Các hợp chất cucurbitacin phân lập từ chi Helicteres .10 Bảng 1.8 Các hợp chất khác phân lập từ chi Helicteres 11 Bảng 1.9 Khả gây độc tế bào lignan thân An xoa 14 Bảng 2.1 Các phản ứng đặc trưng để xác định nhóm hợp chất 22 Bảng 2.2 Nồng độ cao đem định lượng 25 Bảng 2.3 Quy trình xây dựng đường chuẩn acid gallic 26 Bảng 2.4 Dãy nồng độ pha dung dịch thử gốc 28 Bảng 2.5 Quy trình thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH 29 Bảng 3.1 Kết giảm khối lượng sấy khô 30 Bảng 3.2 Kết xác định độ ẩm bột dược liệu 30 Bảng 3.3 Kết sơ thành phần hóa thực vật 31 Bảng 3.4 Kết chiết cao toàn phần 32 Bảng 3.5 Kết chiết cao phân đoạn .32 Bảng 3.6 Tương quan hàm lượng acid gallic giá trị OD760 nm .33 Bảng 3.7 Hàm lượng phenolic tổng cao tổng cao phân đoạn 34 Bảng 3.8 Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao tổng 38 Bảng 3.9 Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao Chloroform 39 Bảng 3.10 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao Ethyl acetat 40 Bảng 3.11 Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao nước 41 Bảng 3.12 Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH Vitamin C 42 Bảng 3.13 Giá trị IC50 mẫu thử 43 iii Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Tóm tắt Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2013 – 2018 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Tác giả: Nguyễn Văn Thủy Hướng dẫn khoa học: ThS Phan Thị Thanh Thủy Mở đầu Những năm gần đây, An xoa (Helicteres hirsuta L.) lên thần dược trị ung thư, người dân Bình Phước sử dụng để điều trị ung thư gan Tuy nhiên Việt Nam giới chưa có nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Vì nghiên cứu thực nhằm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa cao chiết từ thân An xoa, từ đưa luận khoa học góp phần giải thích số tác dụng chữa bệnh làm tiền đề cho nghiên cứu sau Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thân An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu thập thị trấn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Tiến hành sơ thành phần hóa thực vật dựa phản ứng định tính đặc trưng thiết lập quy trình chiết cao theo phương pháp ngâm lạnh Cao chiết từ thân sử dụng để khảo sát hoạt tính chống oxi hóa dựa hai mơ hình: định lượng phenolic tổng phương pháp Folin-Ciocalteu thử hoạt tính chống oxi hóa mơ hình DPPH Kết Trong thân An xoa chứa đa dạng nhóm hợp chất tự nhiên, flavonoid polyphenol Hàm lượng phenolic tổng cao trong phân đoạn Ethyl acetat (143,83 μgGAE/mg) cao tổng Ethanol 96% (51,22 μgGAE/mg), cao phân đoạn Chloroform (47,58 μgGAE/mg) cao nước (37,67 μgGAE/mg) Hoạt tính chống oxi hóa cao phân đoạn Ethyl acetat (IC50 = 20,78 μg/ml) cao tổng Ethanol 96% (IC50 = 60,85 µg/ml), cao phân đoạn Chloroform (IC50 = 74,56 µg/ml) cao nước (IC50 = 101,16 µg/ml) Kết luận Phân đoạn Etyl acetat có hàm lượng phenolic tổng (143,83 μgGAE/mg) hoạt tính chống oxi hóa cao (IC50 = 20,78 μg/ml) Từ khóa: Helicteres hirsuta L., hoạt tính chống oxi hóa, hàm lượng phenolic tổng, DPPH, Folin-Ciocalteu Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết biện luận  Cao nước Bảng 3.11 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao nước Mẫu cao nước Ống Nồng độ (µg/ml) OD trung bình Chứng âm 0,815 40 0,663 18,65 80 0,466 42,82 120 0,310 61,96 160 0,179 78,04 200 0,075 90,80 IC (%) Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao nước 100 90 80 IC (%) 70 60 50 y = 0,4488x + 4,6012 R² = 0,9853 40 30 20 10 0 50 100 150 Nồng độ µg/ml 200 250 Hình 3.8 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao phân đoạn nước 41 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết biện luận  Vitamin C Bảng 3.12 Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH Vitamin C Mẫu Vitamin C Ống Nồng độ (µg/ml) OD trung bình Chứng âm 0,829 1 0,756 8,81 2 0,602 27,38 3 0,447 46,08 4 0,306 63,09 5 0,185 77,68 IC (%) Hoạt tính quét gốc tự DPPH Vitamin C 90 80 70 IC(%) 60 50 y = 17,346x - 7,4306 R² = 0,9976 40 30 20 10 0 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.9 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH Vitamin C 42 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết biện luận  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) cao chiết Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính ta xác định giá trị IC50 nồng độ dọn dẹp 50% gốc tự DPPH Các mẫu có giá trị IC50 thấp hoạt tính chống oxi hóa cao Bảng 3.13 Giá trị IC50 mẫu thử Mẫu Giá trị IC50 (µg/ml) Cao tổng Ethanol 96% 60,85 Cao phân đoạn Chloroform 74,56 Cao phân đoạn Ethyl acetat 20,78 Cao phân đoạn nước 101,16 Vitamin C 3,31 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH 120 101,16 Nồng độ (µg/ml) 100 74,56 80 60,85 60 40 20,78 20 3,31 Cao tổng Cao phân Cao phân Ethanol 96% đoạn đoạn Ethyl Cloroform acetat Cao phân đoạn nước Vitamin C Mẫu cao Hình 3.10 Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao tổng cao phân đoạn so với Vitamin C 43 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết biện luận Kết khảo sát cho thấy giá trị IC50 mẫu tăng dần theo thứ tự: Vitamin C (3,31 µg/ml), cao Ethyl acetat (20,78 µg/ml), cao tổng Ethanol 96% (60,85 µg/ml), cao Chloroform (74,56 µg/ml) cao nước (101,16 µg/ml) Giá trị IC50 cao tổng Ethanol 96% (60,85 µg/ml) so với Vitamin C (3,31 µg/ml) cho thấy cao chiết từ thân An xoa có hoạt tính chống oxi hóa cao Trong cao phân đoạn, cao Ethyl acetat có hoạt tính chống oxi hóa mạnh Theo kết định lượng phenolic tổng, phân đoạn tập trung nhiều hợp chất phenolic Những hợp chất phenolic có nhiều nhóm OH tự do, OH tự thường dễ dàng nhường proton H+ cho chất oxi hóa làm trung hịa gốc tự do, cao chiết có chứa nhiều hợp chất phenolic hoạt tính chống oxi hóa theo chế quét gốc tự cần H+ cao Trong hai phân đoạn Ethyl acetat Chloroform phân đoạn Ethyl acetat có IC50 thấp nhiều lần so với phân đoạn Chloroform Cao nước thể hoạt tính yếu hàm lượng phenolic phân đoạn cao nước thấp, chứa chủ yếu đường khử, polyuronid Như Ethyl acetat phân đoạn chủ đạo định hoạt tính chống oxi hóa cao tổng Hoạt tính chống oxi hóa thân An xoa liên quan trực tiếp đến nhóm hợp chất phenolic Nhóm phenolic thành phần chủ đạo quy định hoạt tính chống oxi hóa cao phân đoạn Ethyl acetat thân An xoa 44 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết luận kiến nghị CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 4.1.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu Tỷ lệ khối lượng sấy khô 48% Độ ẩm bột dược liệu sau sấy khô 5,12% Kết sơ thành phần hóa thực vật cho thấy thân An xoa có chứa nhiều nhóm hợp chất tự nhiên như: tinh dầu, acid béo, alkaloid, tannin, coumarin, triterpenoid, polyphenol, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu polyuronic 4.1.2 Quy trình chiết xuất thu cao Đã thiết lập quy trình chiết cao tổng Ethanol 96% phương pháp ngâm lạnh Từ 100g nguyên liệu bột thân An xoa khô sau chiết cô đặc dịch chiết thu 3,02g cao tổng Từ cao tổng lắc phân đoạn thu 0,93g cao Chloroform, 0,12g cao Ethyl acetat 1,62g cao nước 4.1.3 Định lượng phenolic tổng phương pháp Folin – Ciocalteu Hàm lượng phenolic tổng cao Ethanol 96%, cao phân đoạn Chloroform, Ethyl acetat nước 51,22 μgGAE/mg; 47,58 μgGAE/mg; 143,83 μgGAE/mg; 37,67 μgGAE/mg Hàm lượng phenolic tổng tập trung nhiều phân đoạn Ethyl acetat 4.1.4 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa cao mơ hình dọn dẹp gốc tự DPPH Giá trị IC50 khả dọn dẹp gốc tự DPPH cao tổng ethanol 96%, cao Chloroform, cao Ethyl acetat cao nước 60,85 μg/ml, 74,56 μg/ml, 20,78 μg/ml 101,16 μg/ml Kết cho thấy cao Ethyl acetat phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao Có tương quan hàm lượng phenolic cao tổng cao phân đoạn với hoạt tính chống oxi hóa chúng Điều chứng tỏ hoạt tính chống oxi hóa thân An xoa liên quan trực tiếp đến nhóm hợp chất phenolic thành phần chủ đạo quy định hoạt tính chống oxi hóa 45 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Kết luận kiến nghị 4.2 KIẾN NGHỊ Trong thời gian gấp rút số điều kiện chưa cho phép nên số nội dung chưa thể thực Nếu có điều kiện tơi xin đề nghị thực để hoàn thành số mục tiêu sau: Tiếp tục nghiên cứu nhằm phân lập hợp chất cụ thể có tác dụng chống oxi hóa từ phân đoạn Etyl acetat sắc ký cột Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan cao tổng cao phân đoạn, từ tiến tới phân lập hợp chất cụ thể có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư nhằm giải thích tác dụng chữa bệnh lồi định hướng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất Dược phẩm thực phẩm chức 46 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1011-1017 [2] Nguyễn Hữu Duyên Lê Thanh Phước (2016), “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào Hep-G2 an xoa (Helicteres hirsuta L.)”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 47, tr 93-97 [3] Trần Hùng (2016), Phương pháp nghiên cứu Dược liệu, Đại học Y Dược, Tp.Hồ Chí Minh, tr 26-35 [4] Nguyễn Thị Thủy Hứa Thị Toàn (2017), “Một số phương pháp xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học dầu hạt thực vật”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ, 169(9), tr 33-37 Tài liệu tiếng nước [5] Al Muqarrabun, L.M.R and Ahmat, N (2015), “Medicinal uses, phytochemistry and pharmacology of family Sterculiaceae: a review”, Eur J Med Chem., 92, pp 514-530 [6] Benmehdi H, Behilil A, et al (2013), “Free radical scavenging activity, kinetic behavior and phytochemical constituents of Aristolochia clematitis L roots”, Arab J Chem, 10, pp 1402-1408 [7] Chang Y-S, Ku Y-R, Lin J-H, Lu K-L, Ho L-K (2001), “Analysis of three lupane type triterpenoids in Helicteres angustifolia by high-performance liquid chromatography”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26(56), pp 849-855 [8] Chen C-M, Chen Z-T, Hong Y-L (1990), “A mansonone from Helicteres angustifolia”, Phytochemistry, 29, pp 980-982 [9] Chen W, Tang W, Lou L, Zhao W (2006), “Pregnane, coumarin and lupane derivatives and cytotoxic constituents from Helicteres angustifolia”, Phytochemistry, 67, pp 1041–1047 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Tài liệu tham khảo [10] Chen Z-T, Lee S-W, Chen C-M (1994), “New flavoid glycosides of Helicteres angustifolia”, Heterocycles, 38, pp 1399-1406 [11] Chen Z-T, Lee S-W, Chen C-M (2006), “Cucurbitacin B 2-sulfate and cucurbitacin glucosides from the root bark of Helicteres angustifolia”, Chem Pharm Bull, 54, pp 1605-1607 [12] Chin Y-W, Jones WP, Rachman I, Riswan S, Kardono LBS, Chai H-B, et al (2006), “Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in Indonesia”, Phytother Res, 20, pp 62-65 [13] Chuakul W, Saralamp P, Boonpleng A (2002), “Medicinal plants used in the Kutchum District, Yasothon Province, Thailand”, Thai J Phytopharm, 9, pp 22–49 [14] Debnath T, Park P-J, Deb Nath NC, Samad NB, Park HW, Lim BO (2011), “Antioxidant activity of Gardenia jasminoides Ellis fruit extracts”, Food Chemistry, 128(3), pp 697-703 [15] Kamiya K, Saiki Y, Hama T, Fujimoto Y, Endang H, Umar M, et al (2001), “Flavonoid glucuronides from Helicteres isora”, Phytochemistry, 57, pp 297301 [16] Marja, P Kahkonen, Anu, I H., Heikki, J V., JussiPekka, R., Kalevi, P., Tytti, S K., Marina, H (1999), “Antioxidant activity of plant extractscontaining phenolic compounds”, J Agric FoodChem., 47, pp 3954-3961 [17] Pan M-H, Chen C-M, Lee S-W and Chen Z-T (2008), “Cytotoxic triterpenoid from the root bark of Helicteres angustifolia”, Chem Biodivers, 5, pp 565-574 [18] Pham, H N T, Nguyen, V T., Vuong, Q V., Bowyer, M C., Scarlett, C J (2017), “Bioactive compound yield and antioxidant capacity of Helicteres hirsuta Lour stem as affected by various solvents and drying methods”, Journal of Food Processing and Preservation, 41(1), pp e12879 [19] Pham, H N T, Nguyen, V T., Vuong, Q V., Bowyer, M C., Scarlett, C J (2017), “Phytochemical profiles and antioxidant capacity of the crude extracts, Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Tài liệu tham khảo aqueous- and saponin-enriched butanol fractions of Helicteres hirsuta Lour leaves and stems”, Slovak Academy of Sciences, 71(11), pp 1-10 [20] Pham, H N T, Nguyen, V T., Vuong, Q V., Bowyer, M C., Scarlett, C J (2017), “Optimization of ultrasound-assisted extraction of Helicteres hirsuta Lour for enhanced total phenolic compound and antioxidant yield”, AsiaPacific Journal of Chemical Engineering, 12(2), pp 332-347 [21 Rizvi, Kanti Bhooshan Pandey and Syed Ibrahim (2009), “Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2(5), pp 270-278 [22] Shekelle P, Morton S, Hardy M California (2003), “Effect of Supplemental Antioxidants Vitamin C, Vitamin E, and Coenzyme Q10 for the Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease”, ACP J Club, 140(3), pp 73-76 [23] Stroev E A., Makarova V G., (1998), Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory, Manual in Biochemistry, Moscow, pp 243-256 [24] Wang M, Liu W (1987), “A naphthoquinone from Helicteres angustifolia”, Phytochemistry, 26, pp 578-579 [25] Wang G-C, Li T, Wei Y-R, Zhang Y-B, Li Y-L, Sze SCW, et al (2012), “Two pregnane derivatives and a quinolone alkaloid from Helicteres angustifolia”, Fitoterapia, 83, pp 1643-1647 [26] Waterman, P.G., Mole, S., (1994), Analysis of Phenolic Plant Metabolites, Blackwell Scientific Publication, Oxford, pp 83–85 Tài liệu trang Web [27] Helicteres, [Date Accessed September 2018], Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Phụ lục PHỤ LỤC Bảng 1: Tương quan hàm lượng acid gallic giá trị OD760 nm Hàm lượng acid gallic (µg) 10 20 30 40 50 OD (760 nm) Lần Lần Lần 0,125 0,130 0,130 0,247 0,273 0,273 0,416 0,418 0,412 0,579 0,576 0,582 0,680 0,681 0,684 OD trung bình 0,128 ± 0,003 0,264 ± 0,015 0,415 ± 0,003 0,579 ± 0,003 0,682 ± 0,002 Bảng 2: Hàm lượng phenolic tổng cao tổng cao phân đoạn Mẫu Ethanol 96% Chloroform Ethyl acetat Nước OD (760 nm) Lần Lần Lần 0,288 0,284 0,287 0,270 0,260 0,265 0,812 0,826 0,818 0,207 0,209 0,208 OD trung bình 0,286 ± 0,002 0,265 ± 0,005 0,819 ± 0,007 0,208 ± 0,001 Bảng 3: Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao Ethanol 96% OD (517 nm) Ống Nồng độ (µg/ml) Lần Lần Lần Chứng âm 0,877 0,880 0,879 0,879 ± 0,002 20 0,781 0,782 0,778 0,780 ± 0,002 40 0,580 0,582 0,581 0,581 ± 0,001 60 0,427 0,429 0,429 0,428 ± 0,001 80 0,277 0,276 0,280 0,278 ± 0,002 100 0,162 0,161 0,165 0,163 ± 0,002 OD trung bình Bảng 4: Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao Chloroform Ống Chứng âm Nồng độ (µg/ml) 20 40 60 Lần 0,811 0,751 0,631 0,491 OD (517 nm) Lần 0,819 0,752 0,629 0,499 PL-1 Lần 0,815 0,754 0,634 0,497 OD trung bình 0,815 ± 0,004 0,752 ± 0,002 0,631 ± 0,003 0,496 ± 0,004 Nguyễn Văn Thủy Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học 80 100 Phụ lục 0,361 0,253 0,362 0,251 0,369 0,259 0,364 ± 0,004 0,254 ± 0,004 Bảng 5: Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao Ethyl acetat Ống Chứng âm Nồng độ (µg/ml) 10 20 30 40 50 Lần 0,811 0,564 0,407 0,270 0,151 0,053 OD (517 nm) Lần 0,819 0,561 0,411 0,273 0,152 0,051 Lần 0,815 0,566 0,409 0,271 0,148 0,052 OD trung bình 0,815 ± 0,004 0,564 ± 0,003 0,409 ± 0,002 0,271 ± 0,002 0,150 ± 0,002 0,052 ± 0,001 Bảng 6: Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH cao nước Ống Chứng âm Nồng độ (µg/ml) 40 80 120 160 200 Lần 0,811 0,663 0,461 0,312 0,178 0,074 OD (517 nm) Lần 0,819 0,665 0,469 0,309 0,181 0,071 Lần 0,815 0,661 0,467 0,308 0,179 0,081 OD trung bình 0,815 ± 0,004 0,663 ± 0,002 0,466 ± 0,004 0,310 ± 0,002 0,179 ± 0,002 0,075 ± 0,005 Bảng 7: Thơng số thử hoạt tính dọn gốc tự DPPH Vitamin C Ống Chứng âm Nồng độ (µg/ml) Lần 0,822 0,750 0,606 0,441 0,302 0,188 OD (517 nm) Lần 0,835 0,755 0,603 0,443 0,309 0,183 PL-2 Lần 0,831 0,764 0,597 0,456 0,307 0,184 OD trung bình 0,829 ± 0,007 0,756 ± 0,007 0,602 ± 0,005 0,447 ± 0,008 0,306 ± 0,004 0,185 ± 0,003 Nguyễn Văn Thủy NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) ĐƯỢC CHIẾT TỪ HAI DUNG MÔI N-HEXAN VÀ DICLOETAN Nguyễn Văn Thủy1 Hướng dẫn khoa học: ThS Phan Thị Thanh Thủy2 Sinh viên nghành Dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trưởng mơn Hóa Dược - Khoa Dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Email: vanthuypharm@gmail.com TÓM TẮT Những năm gần đây, An xoa (Helicteres hirsuta L.) xem thần dược trị ung thư, người dân số huyện Bình Phước sử dụng để điều trị ung thư gan Kết khảo sát cho thấy thân An xoa có chứa hợp chất như: tinh dầu, alkaloid, tannin, coumarin, triterpenoid, polyphenol, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu polyuronic Từ 100g nguyên liệu bột thân An xoa khô sau chiết cô đặc dịch chiết thu 0,277 g cao dicloetan 0,161 g cao n-hexan Hàm lượng phenolic tổng cao dicloetan 30,340 μg GAE/mg cao nhexan 24,737 μg GAE/mg Giá trị IC50 khả dọn dẹp gốc tự DPPH cao dicloetan, cao n-hexan 468,92 µg/ml 432,11 µg/ml Từ khóa: An xoa, Helicteres hirsuta L., chống oxi hóa, phenolic RESEARCH ABOUT THE GLUE’S ANTIOXIDANT ABILITY EXTRACTED FROM THE TWO SOLVENTS OF N-HEXAN AND DICLOETAN OF HELICTERES HIRSUTA L ABSTRACT In recent years, the Helicteres hirsuta L has been considered as a cancer drug and used by people in some districts of Binh Phuoc to treat liver cancer In the stem of Helicteres hirsuta contents many compositions such as: attar, alkaloid, tannin, coumarin, triterpenoid, polyphenol, flavonoid, saponin, deodorant, organic acid and the polyuronics From 100 gram of material is the dry powder of the stem of the Helicteres hirsuta, collecting 0.277 gram of the dicloetan glue and 0.161 gram of the n-hexan glue after extracting and concentrating the extraction The content of total phenolic in the dicloetan glue is 30,340 μg GAE/mg and in the n-hexan glue is 24,737 μg GAE/mg IC50 values for DPPH radical scavenging ability of dicloetan glue, n-hexan glue are 468.92 μg / ml and 432.11 μg / ml, respectively Keywords: Helicteres hirsuta L antioxidant activity, phenolic Hiện việc sử dụng An xoa để điều trị ĐẶT VẤN ĐỀ Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour) sử bệnh nước ta chủ yếu dựa kinh nghiệm dân dụng từ lâu Y học cổ truyền Việt Nam để điều trị gian Tuy giới có số nghiên cứu số bệnh như: Thân dùng làm thuốc chữa ung nhọt, hoạt tính sinh học lồi dược liệu Việt giải độc gan; rễ dùng làm dịu đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, Nam cơng trình nghiên cứu cịn Do đó, cảm cúm làm thuốc tiêu độc [1] mục đích nghiên cứu thành phần hóa học Theo nghiên cứu Indonesia An xoa hoạt tính sinh học An xoa nhằm góp phần giải có khả chống lại tế bào ung thư, ung thích cơng dụng chữa bệnh lồi thảo dược thư gan [3] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu để nghiên cứu thân An xoa, phương pháp dọn gốc tự DPPH [6] Pha loãng dịch thân thu thập vào tháng năm 2017 thị chiết mẫu nồng độ phù hợp sau hút thêm trấn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Mẫu thực vật gồm lá, 0,5ml dung dịch DPPH vào ống nghiệm để hoa, thân An xoa đối chiếu với tài liệu bóng tối 30 phút, đo độ hấp thụ quang học TS Võ Văn Chi [1] Kết giám định 517nm Hoạt tính chống oxi hóa xác định theo An xoa (Helicteres hirsuta Lour) thuộc họ Trôm công thức: 2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxi hóa Khả chống oxi hóa xác định (Sterculiaceae) Mẫu thân tươi đem sấy nhiệt độ 𝐼𝐶(%) = 70 C tới độ ẩm 10% Mẫu khô sau o xay nhỏ cho phù hợp với yêu cầu thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất Chiết xuất phương pháp chiết ngâm lạnh với dung môi chiết n-hexan dicloetan 100g bột An xoa khơ ngâm với lít dung mơi, giữ n nhiệt độ phịng ngày, khuấy trộn Dịc h c hi ết cô áp suất giảm máy cô 𝑂𝐷𝑐 − 𝑂𝐷𝑡 × 100 𝑂𝐷𝑐 IC(%): Hoạt tính dọn gốc tự DPPH ODc: Mật độ quang mẫu chứng âm ODt: Mật độ quang mẫu thử Từ IC (%) nồng độ mẫu ta dựng đường hồi quy tuyến tính, từ tính IC50 (khả dọn dẹp 50% DPPH mẫu) Giá trị IC50 thấp tương ứng với hoạt tính chống oxi hóa mẫu thử cao quay chân không để thu hồi dung mơi có cao ngược lại Mẫu chứng dương sử dụng để so thành phẩm sánh Vitamin C 2.2.2 Sơ hóa thực vật Dựa vào độ hòa tan hợp chất dược liệu để tách chúng dung mơi có độ phân cực tăng dần: phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh cách chiết với dung mơi: dietyl eter, cồn nước Sau xác định nhóm hợp chất dịch chiết phản ứng hóa học đặc trưng dựa theo quy trình cải tiến Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh [2] 2.2.3 Xác định hàm lượng phenolic tổng Hàm lượng phenolic tổng xác định phương pháp Folin-Ciocalteu theo Waterman Mole [4] Tiến hành pha loãng dung dịch thử với nồng độ phù hợp (dịch thu phần chiết mẫu) Sau đó, hút 0,5ml dung dịch mẫu pha lỗng vào ống nghiệm Thêm vào 0,5ml dung dịch Folin-Ciocalteu, tiếp tục thêm 1,5ml dung dịch Na2CO3 20% lắc đều, thêm nước cất vừa đủ 10ml Để dung dịch nhiệt độ phịng bóng tối 2h Sau đo độ hấp thu quang học bước sóng 758nm Gallic acid dùng làm chất chuẩn Hàm lượng phenolic tổng biểu diễn theo microgam acid gallic có 1mg cao An xoa khơ (µgGAE/1mg) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2.1 Kết sơ hóa thực vật Giảm khối lượng sấy khô thân An xoa 74,63% Độ ẩm bột dược liệu sau sấy khô 4,32% Độ ẩm cao dicloetan cao n-hexan 6,8% 7,7% Kết phân tích sơ hóa thực vật cho thấy thân An xoa có chứa nhiều nhóm hợp chất như: tinh dầu, alkaloid, tannin, coumarin, triterpenoid, polyphenol, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu polyuronic 3.2.2 Hàm lượng phenolic tổng Phenolic thành phần quan trọng chiếm tỉ lệ lớn thực vật nói chung Đây chất chống oxi hóa mạnh Vì vậy, tiêu quan trọng nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa thực vật Hàm lượng phenolic tổng cao dicloetan 30,340 μg GAE/mg cao n-hexan 24,737 μg GAE/mg (Hình 1) Theo Marja đồng sự, loại thực vật có hàm lượng phenolic tổng lớn 20 µgGAE/mg xem có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [5] KẾT LUẬN Kết cho thấy hàm lượng chất chống oxi 35 μg GAE/mg 30 30,340 24,737 25 hóa thân An xoa dồi Trong hàm lượng 20 phenolic tổng cao dicloetan (30,340 μg GAE/mg) 15 cao so với cao n-hexan (24,737 μg GAE/mg) 10 Giá trị IC50 khả dọn dẹp gốc tự DPPH cao dicloetan, cao n-hexan 468,92 µg/ml 432,11 µg/ml, cho thấy cao n-hexan có hoạt tính Cao dicloetan Cao n-hexan Hình 1: Hàm lượng phenolic tổng cao An xoa Như kết cho thấy chiết chống oxi hóa mạnh cao dicloetan dung mơi có độ phân cực trung bình (Dicloetan) An xoa nguồn chiết suất chất chống oxi hóa tự (N-hexan) hàm lượng phenolic tổng nhiên giúp nâng cao khả ứng dụng lĩnh vực cao chiết cao Dựa theo kết sơ thành Dược phẩm thực phẩm chức phần hóa thực vật dự đoán hợp chất TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Những kết tiềm sử dụng phenolic có độ phân cực thấp coumarin, phenolic alkaloid hay flavonoid dạng tự 3.2.3 Hoạt tính chống oxi hóa Kết khảo sát cho thấy giá trị IC50 mẫu tăng dần theo thứ tự: Vitamin C (3,38 µg/ml), cao n- [1] Võ Văn Chi (2012) Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 1011-1017 [2] Trần Hùng (2006) Phương pháp nghiên cứu Dược liệu Đại học Y Dược, Tp.Hồ Chí Minh, pp 12-27 hexan (432,11 µg/ml) cao dicloetan (468,92 µg/ml) (Hình 2) Theo đó, khả chống oxi hóa cao Vitamin C, tiếp cao n-hexan cuối cao dicloetan [3] Chin Y-W, Jones WP, Rachman I, Riswan S, Kardono LBS, Chai H-B, et al (2006) Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta 500 432,11 Nồng độ (µg/ml) Tài liệu tiếng nước ngồi 468,92 400 collected in Indonesia, Phytother Res, 20:62–5 [4] Chumark P, Khunawat P, Sanvarinda Y, Phornchirasilp S, Morales NP, Phivthong-Ngam L, 300 Ratanachamnong P, Srisawat S, Pongrapeeporn KU 200 (2007) The in vitro and ex-vivo antioxidant properties, hypolipidaemic and antiatherosclerotic activities of 100 3,38 Vitamin C Cao n-hexan Cao dicloetan Hình 2: Hoạt tính chống oxi hóa (IC50) cao chiết Dựa theo kết định lượng phenolic tổng, ta water extract of Moringa oleifera Lam leaves J Ethnopharmacol, 116:439–446 [5] Marja, P Kahkonen, Anu, I H., Heikki, J V., JussiPekka, R., Kalevi, P., Tytti, S K., Marina, thấy cao dicloetan có hàm lượng phenolic cao H.(1999) Antioxidant activity of plant extractscontain- cao n-hexan khả chống oxi hóa lại ing phenolic compounds J Agric FoodChem., 47: thấp Điều chứng tỏ hợp chất phenolic 3954 – 3961 chiết dung mơi n-hexan có khả chống [6] Molyneux P (2004) The use of the stable free oxi hóa cao so với dicloetan radical diphenylpicryl hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant ac-tivity J Sci Technol, 26:211-21 PHIẾU XÁC NHẬN SỬA CHỮA Nội dung khóa luận chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng Các nội dung chỉnh sửa sau : - Sửa lại cách viết tên khoa học - Bổ sung thời gian ngâm chiết nguyên liệu - Sửa lại sơ đồ chiết cao phân đoạn - Bổ sung phần khảo sát dung môi pha động GVHD Sinh viên (ký ghi rõ họ tên) (ký ghi rõ họ tên) Chủ tịch Hội đồng GV phản biện (ký ghi rõ họ tên) (ký ghi rõ họ tên) ... Với lý trên, An xoa (Helicteres hirsuta Lour. ) chọn làm đối tượng cho đề tài nghiên cứu với tên đề tài là: ? ?Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa cao thân An xoa (Helicteres hirsuta Lour. )”, với... NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour. ) Chuyên nghành: Sản xuất phát triển thuốc KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: ThS Phan... phần quan trọng chiếm tỉ lệ lớn thực vật nói chung Đây chất chống oxi hóa mạnh Vì vậy, tiêu quan trọng nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa thực vật Trong nghiên cứu này, cao tổng Ethanol 96% cao