đồ án tốt nghiệp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa các dịch chiết từ lá chùm ngây nhằm ứng dụng trong mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CHÙM NGÂY NHẰM ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM Giảng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ

LÁ CHÙM NGÂY NHẰM ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Phương Anh

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Nữ

Mã số sinh viên: 57137363

Khánh hòa – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LỜI CẢM ƠN

Suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại Học Nha Trang, được sựgiảng dạy tận tình của các thầy cô trong bộ môn Hóa Học cũng như trong khoa CôngNghệ Thực Phẩm

Cho em được gởi lời cảm ơn chân thành đến cô TS Trần Thị Phương Anh đãtận tình giảng dạy chúng em trong suốt thời gian qua cũng như hướng dẫn tạo điềukiện và giúp đỡ cho em hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa Học đã cung cấpnhững kiến thức bổ ích, và truyền thụ những kiến thức quý báu cho chúng em

Nha Trang, Ngày 01 tháng 07 năm 2019 Sinh viên: Nguyễn Ngọc Nữ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản đồ án này là do tôi tự nghiên cứu, tính toán, thiết kế dưới

sự hướng dẫn của cô TS Trần Thị Phương Anh.

Để hoàn thành đồ án này, tôi chỉ sử dụng tài liệu tham khảo trong mục tài liệutham khảo, ngoài ra không dùng bất cứ tài liệu nào khác mà không được liệt kê

Nếu sai sót, tôi xin chịu mọi hình thức kỷ luật theo quy định

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÙM NGÂY 3

1.1.1 Tổng quan về nguồn gốc và phân bố của cây chùm ngây 3

1.1.2 Tổng quan về chùm ngây 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY CHÙM NGÂY 4

1.2.1 Thành phần hóa học có trong lá chùm ngây 4

1.2.2 Thành phần hóa học có trong hạt chùm ngây 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHỐNG OXI HÓA CÓ TRONG LÁ CHÙM NGÂY 6

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 10

1.4.1 Trong nước 10

1.4.2 Ngoài nước 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 13

2.2.2 Xác định độ ẩm của bột lá chùm ngây 14

2.2.3 Quy trình dự kiến thu nhận cao chiết và xác định hoạt tính chống oxi hóa từ bột lá chùm ngây 14

2.2.4 Quy trình bố trí thí nghiệm sau khi cải tiến 16

2.2.5 Các phương pháp phân tích hóa lý 18

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 22

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22

2.3.1 Hóa chất 22

2.3.2 Thiết bị sử dụng 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả đo độ ẩm 23

3.2 Thu nhận dịch chiết 23

3.3 Kết quả polyphenol tổng số của các dịch chiết 25

3.4 Kết quả tổng năng lực khử các cao chiết 26

3.5 Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol 28

3.6.Tương quan giữa TPC và khả năng loại gốc tự do DPPH của cao chiết EtOH 30

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 37

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒHình 1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của polyphenol

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của flavonoid

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của quercetin

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của keampferol

Hình 1.5 Công thức hóa học của ascorbic acid

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của beta carotene

Hình 2.1 Lá chùm ngây ở tỉnh Ninh Thuận

Hình 2.2 Bột lá chùm ngây sau khi xử lý

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận cao chiết và xác định hoạt tính chống oxi hóa từ bột lá chùm ngây.

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sau khi cải tiến

Hình 2.5 Phương trình phản ứng tạo phức của thuốc thử Folin-Ciocalteu với polyphenol

Hình 2.6 Phương trình phản ứng của DPPH

Hình 3.1 Kết quả so sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH của ascorbic acid, BHT

và cao chiết ethanol với mức ý nghĩa p < 0,05, n = 3

Hình 10.1 Đường chuẩn của gallic acid

Hình 10.2 Đường chuẩn của dung dịch FeSO4

Hình 10.3 Đường chuẩn của ascorbic acid

Hình 10.4 Đường chuẩn của BHT

Hình 10.5 Đường chuẩn của dịch chiết ethanol

Hình 10.6 Kết quả quét bước sóng polyphenol tổng số của đường chuẩn gallic acid.

Hình 10.7 Kết quả quét bước sóng polyphenol tổng số của dịch chiết methanol

Hình 10.8 Kết quả quét bước sóng polyphenol tổng số của dịch chiết ethanol Hình 10.9 Kết quả quét bước sóng polyphenol tổng số của dịch chiết EtOH/H2O Hình 10.10 Kết quả quét bước sóng tổng năng lực khử của đường chuẩn FeSO4 Hình 10.11 Kết quả quét bước sóng tổng năng lực khử của dịch chiết methanol Hình 10.12 Kết quả quét bước sóng tổng năng lực khử của dịch chiết ethanol Hình 10.13 Kết quả quét bước sóng tổng năng lực khử của dịch chiết EtOH/H2O Hình 10.14 Kết quả quét bước sóng khả năng bắt gốc tự do DPPH của ascorbic acid

Hình 10.15 Kết quả quét bước sóng khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết Ethanol

Hình 10.16 Kết quả quét bước sóng khả năng bắt gốc tự do DPPH của BHT

DANH MỤC BẢNGBảng 3.1 Độ ẩm của bột lá chùm ngây

Bảng 3.2 Kết quả hiệu suất chiết ban đầu khi chưa cải tiến, p < 0,05, n = 3

Bảng 3.3 Kết quả so sánh hiệu suất chiết sau khi được cải tiến quy trình, p < 0,05, n = 3

Bảng 3.4 Kết quả polyphenol tổng số của các dịch chiết với mức ý nghĩa p < 0,05,

Bảng 8.1 Kết quả xác định tổng năng lực khử của các dịch chiết từ bột chùm ngây và chứng dương là ascorbic acid.

Bảng 9.1 Kết quả đo mẫu DPPH control.

Bảng 9.2 Kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid.

Bảng 9.3 Kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH của BHT.

Bảng 9.4 Kết quả khả năng khử gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol.

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

TPC (Total Polyphenol Content): polyphenol tổng số

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

VCK: vật chất khô

UV-VIS: quang phổ tử ngoại khả kiến

DPPH: 2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazyl

GAE (gallic acid equivalent): miligam đương lượng gallic acid

QE (quercetin equivalent): miligam đương lượng quercetin

BHT: Butylated Hydroxy Toluene

AA: ascorbic acid

IC50 (Median Inhibition Concentration): nồng độ ức chế trung bình

MeOH: methanol

EtOH: ethanol

% I (% Inhibition): phần trăm khả năng ức chế gốc tự do DPPH

NTU (Nephelometric Turbidity Units): đơn vị đo độ đục khuếch tán

CFU (Colony Forming Units): đơn vị hình thành khuẩn lạc

MPN (Most Probable Number): số lượng có thể xảy ra nhất

SPF (Sun Protection Factor): chỉ số chống nắng

HPLC-DAD: High Performance Liquid Chromatography-Diode Array

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): khả năng hấp thu gốc oxy hóa

UV (Ultraviolet): tia cực tím

UVB: Ultraviolet Burn

MỞ ĐẦU

Cây chùm ngây đã có mặt trên trái đất từ lâu đời và được sử dụng tại các nước

có nền văn minh cổ đại như Hy Lạp, Ý, Ấn Độ Cây chùm ngây có chứa nhiều chấtdinh dưỡng và các vi chất thiết yếu tốt cho sức khỏe con người Theo nhiều nghiêncứu, lá, hạt và thân cây chùm ngây có giá trị dinh dưỡng cao, do chứa nhiều hợp chất

sơ cấp với hàm lượng cao như protein, carbohydrate, khoáng (sắt, kali ) cũng nhưnhiều hợp chất thứ cấp có đặc tính sinh học quý như vitamin C, quercetin, keampferol,

β-sitosterol, β-carotene, đặc biệt cây còn có những hợp chất chống oxi hóa như

polyphenol, flavonoid Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ sức khỏe, ngăn ngừacác bệnh tim mạch, cao huyết áp, chống oxi hóa, ngăn ngừa tế bào ung thư Chính vìnhững công dụng trên, chùm ngây được ví như là cây thần kỳ và hiện được sử dụngrộng rãi trên thế giới cũng như Việt Nam

Polyphenol là một nhóm hợp chất tự nhiên rất phổ biến trong thực vật.Polyphenol có rất nhiều trong lá, hoa, quả của nhiều loài thực vật như chè, cacao,chùm ngây, cải xanh với hàm lượng cao từ 0,2 – 2 g/kg trọng lượng tươi Hiện naypolyphenol đang được quan tâm bởi các nhà thực phẩm, dược phẩm cũng như mỹphẩm bởi hoạt tính chống oxi hóa và khả năng kháng khuẩn mạnh, chống ung thư,chống các bệnh về tim mạch, kiểm soát béo phì và hàm lượng đường trong máu đãđược kiểm chứng qua rất nhiều báo cáo khoa học Polyphenol rất có lợi cho sức khỏecủa con người và đặc biệt chúng được tách chiết từ thiên nhiên (chùm ngây) nên khi sửdụng sẽ rất an toàn

Do đó, polyphenol được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và mỹphẩm Đã có rất nhiều công trình đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của chùm ngây dohàm lượng polyphenol và flavonoid cao Từ thực tế đó chúng tôi tìm hiểu đề tài

“Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa các dịch chiết từ lá chùm ngây Moringa Oleifera nhằm ứng dụng trong mỹ phẩm”

Mục đích của đề tài:

Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết trong dung môi

Nội dung nghiên cứu:

1) Thu nhận bột lá chùm ngây

2) Thu nhận cao chiết từ chùm ngây trong các dung môi chiết hydroalcolic(MeOH, EtOH, EtOH/H2O)

3) Xác định hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) các cao chiết

4) Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa các cao chiết: Khả năng khử sắt (FRAP) vàkhả năng bắt gốc tự do (DPPH) Biện luận mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa có trong bột lá chùm ngây, kết quả thu đượccủa đề tài là dữ liệu khoa học cho giảng viên và sinh viên khoa Công Nghệ ThựcPhẩm, các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm đến polyphenol trong lá chùm ngây

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, cao chiết với dung môi tương ứng với hàmlượng polyphenol tốt nhất và hoạt tính chống oxi hóa cao sẽ được lựa chọn để tiếp tụcnghiên cứu về cấu trúc hóa học, thu nhận và tinh chế các hợp chất cũng như thử

nghiệm hoạt tính sinh học in vitro khác Từ đó ứng dụng dịch/cao chiết chứa

polyphenol từ lá chùm ngây vào việc phát triển các sản phẩm mỹ phẩm, với mục tiêumong muốn là thay thế hoặc giảm dần sự có mặt các hoạt chất hóa học tổng hợp cótrong mỹ phẩm, cải thiện tính an toàn, hiệu quả đối với mỹ phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÙM NGÂY

1.1.1 Tổng quan về nguồn gốc và phân bố của cây chùm ngây

[3, 4]Cây chùm ngây hay còn gọi là ba đậu dại, tên khoa học là Moringa Oleifera

Lam hay M Pterygosperma thuộc họ Moringaceae Trong tiếng Anh, cây chùm ngây

có rất nhiều tên gọi khác nhau như là cây cải ngựa (Horseradish tree; do rễ non củachúng có vị của cây cải ngựa), cây dùi trống (Drumstick tree; do quả của chúng giốngnhư dùi trống), Behen, Indian Horseradish, Noix de Bahen Đối với các nhà Phật họcthì cây chùm ngây được gọi là cây Độ Sinh (Tree of life), còn theo các nhà khoa họcdựa vào nguồn dinh dưỡng quý hiếm có trong cây chùm ngây đã đặt tên cho nó là câythần diệu (Miracle tree)

[12,16]Cây chùm ngây có nguồn gốc từ Hy Mã Lạp Sơn, phía Đông Bắc Ấn Độ,Bangladesh, Afghanistan, và Pakistan Chùm ngây được phát hiện và sử dụng trên

4000 năm, ngày nay nó được trồng rộng rãi ở Châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, ĐôngNam Á, Sri Lanka, Ấn Độ, Mexico, Malabar, Malaysia và Philippines Ở Việt Nam,cây chùm ngây được phát hiện mọc hoang dại và lâu đời như Thanh Hóa, Ninh Thuận,Bình Thuận, An Giang, Phú Quốc Trước đây cây chùm ngây rất ít được chú ý, đaphần người dân thường trồng để làm hàng rào, chỉ trong vài chục năm trở lại đây, khicác nhà nghiên cứu nhận thấy cây chùm ngây có nhiều dưỡng chất có tác dụng đặc biệtđối với sức khỏe cây chùm ngây mới được quan tâm rộng rãi

1.1.2 Tổng quan về chùm ngây

Chùm ngây thuộc dạng cây thân gỗ cao tới vài chục mét, Lá chùm ngây có dạng

lá kép có hình lông chim dài khoảng 30–60 cm, có nhiều phân nhánh nhỏ, lá có dạngchét hình trứng được mọc đối xứng

Hoa của chùm ngây màu trắng nhìn sơ qua hơi giống hoa đậu, mọc thành chùm

ở nách lá hay ngọn cành, có mùi thơm, cuống hoa dài từ 1-2 cm Cụm hoa năm cánhmọc đối diện có màu trắng hơi vàng, mọc không đều, có gân mỏng, có dạng thìa, mặttrong ở dưới cánh hoa có nhiều lông

Quả chùm ngây thuộc quả nang treo, dài từ 30-120 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh,quả có nhiều rãnh dọc, chỗ có chứa hạt hơi gồ lên, quả non có màu xanh đậm, khi già

có màu nâu xám, thường được thu hoạch vào khoảng tháng 3 hoặc tháng 4, mỗi quảchứa khoảng 26 hạt Hạt chùm ngây hình tròn có đường kính khoảng 1cm, hạt non cómàu xanh, hạt già có màu nâu đến đen nhưng thỉnh thoảng cũng có màu trắng nếu hạtnhân bên trong thấp, vỏ hạt có 3 cạnh với mỗi cạnh có một lớp màng mỏng trắng baoxung quanh

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY CHÙM NGÂY

[16]Cây chùm ngây nhanh chóng thu hút được sự chú ý của các nhà khoa học bởithành phần dinh dưỡng và là nguồn tạo ra lượng lớn calo với chi phí thấp Nó được sửdụng như một loại thực phẩm dùng để bổ sung dinh dưỡng đã được các nhà dượcphẩm chứng minh Toàn bộ cây đều có giá trị hữu ích từ rễ, thân, lá, hoa, cành đều cóchứa nhiều chất dinh dưỡng, chất chống oxi hóa và các thành phần dược liệu, theonghiên cứu chỉ ra rằng, chùm ngây có khả năng kháng khuẩn, chống viêm, chống ungthư, hạ đường huyết, hạ các thành phần lipid có trong máu và các hoạt động sinh họckhác

1.2.1 Thành phần hóa học có trong lá chùm ngây

Trong cây chùm ngây thì lá cây được biết đến là một bộ phận chứa nhiều dinhdưỡng nhất của cây và không có bất kỳ phản ứng phụ nào khi sử dụng, đặc biệt là láchùm ngây còn có thể sử dụng ở mọi lứa tuổi kể cả trẻ sơ sinh, tuy nhiên phụ nữ mangthai thì không nên sử dụng lá chùm ngây vì có nguy cơ xảy thai cao

Theo các nhà nghiên cứu cho thấy lá cây chùm ngây có nguồn dinh dưỡng caonhư protein, acid amine, khoáng chất, carbohydrate, vitamin và acid hữu cơ Ngoài ratrong lá chùm ngây còn chứa nhiều hoạt chất quý hiếm như quercetin, keampferol,niarizin, tannin, hexadecanoid acid, phytol, flavonoid, polyphenol, rutin Theo nghiêncứu của Đại học Johns Hopkins, Mỹ cho biết chùm ngây có chứa đến 18 trên tổng số

22 acid amine cần thiết cho cơ thể, lá chùm ngây chứa nhiều vitamin và muối khoáng

có ích với hàm lượng rất cao

Lá chùm ngây còn có rất nhiều tác dụng về mặt dược lý như kháng khuẩn,chống viêm, chống oxi hóa, bổ sung dinh dưỡng cho người suy dinh dưỡng, hạ huyết

[12]Bảng so sánh thành phần dinh dưỡng có trong 100 g lá chùm ngây tươi so với các thực phẩm khác:

Bảng 1.1 Bảng so sánh thành phần dinh dưỡng có trong lá chùm ngây

Thành phần dinh

Vitamin A Cao gấp 4 lần so với cà rốt và 13 lần so với rau bina

Vitamin C Cao gấp 7 lần so với cam

Vitamin B Cao gấp 4 lần so với thịt nhím

Vitamin B3 Cao gấp 50 lần so với đậu phộng

Vitamin E Cao gấp 6 lần so với dầu hạt cải

Canxi Cao gấp 4 lần so với sữa

Magie Cao gấp 36 lần so với trứng

Kali Cao gấp 63 lần so với sữa và 3 lần so với chuối

Sắt Cao gấp 25 lần so với rau bina

Protein Cao gấp 2 lần so với sữa

polyphenol Cao gấp 8 lần so với rượu vang

Amino acid Cao gấp 2 lần so với giấm đen

R-amino acid Cao gấp 30 lần so với gạo lứt và 4 lần so với trà

GABAchlorophyll Cao gấp 4 lần so với lúa mỳ

1.2.2 Thành phần hóa học có trong hạt chùm ngây

Hạt chùm ngây được sử dụng rộng rãi ở các nước như Lào, Campuchia, TháiLan, Ấn Độ nhờ vào các thành phần dược tính và thành phần dinh dưỡng có tronghạt chùm ngây cao Thành phần dược tính có trong hạt chùm ngây rất đa dạng, có khảnăng chống oxi hóa, giảm cân, bảo vệ hệ tim mạch, tăng lưu thông máu, chống ungthư, giảm tiểu đường, ngăn ngừa khối u, viêm loét, thiếu vitamin, tăng cường hệ miễndịch Do đó hạt chùm ngây cũng được ưa chuộng và được các nhà khoa học đặc biệtquan tâm nghiên cứu

Theo các nhà nghiên cứu cho thấy trong hạt chùm ngây có chứa nhiều thànhphần hóa học như sau:

- 18 loại acid amine

- 8 loại khoáng chất như: sắt, kẽm, canxi, mangan, magie, photpho, kali, natri

- 7 loại vitamin như: vitamin A, vitamin C, vitamin B1, B3, B5, B6, B9

- Nhiều hợp chất chống oxi hóa như: zeatin, alpha-sitosterol, quercetin,

caffeoylquinic acid, kaempferol

- Hạt chùm ngây chứa 42% (w/w) là dầu rất giàu chất chống oxy hóa như oleic

- Polyphenol:

Polyphenol còn được gọi là polyhydroxyphenols, polyphenol hiện tồn tại rấtnhiều phân tử khác nhau, số lượng và đặc điểm của các cấu trúc phenol cũng phụthuộc vào đặc tính vật lý, sinh hóa của các lớp phenol Polyphenol xuất hiện nhiều ởtrong rau, củ, quả Các hợp chất polyphenols có khả năng làm chậm quá trình oxi hóa,khi polyphenol vào cơ thể người sẽ ức chế ngay quá trình oxi hóa bằng cách làm cảntrở các phản ứng oxi hóa trong cơ thể, từ đó ức chế sự oxi hóa của lipid

Polyphenol có cấu trúc như một cái phễu lọc tia UV (Hình 1.1), giúp cho tế bàochống lại được sự phá hoại của tia cực tím, hơn thế nữa chức năng chính của

polyphenol đã được chứng minh là để bảo vệ lá cây khỏi bị hư hại bởi các gốc tự dothông qua hoạt động chống oxi hóa của chúng (Baldisserotto et al [11], 2018)

Cơ chế kháng oxi hóa của các chất phenol: Vô hoạt các gốc tự do, tạo phứcdạng chelat với các ion Fe2+ và Cu2+ , kìm hãm enzyme có khả năng xúc tác các phảnứng tạo gốc tự do như xanthine oxydase, hoạt động hiệp đồng với các chất chống oxihóa khác

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của polyphenol

- Flavonoid:

Flavonoid trước đây còn được gọi là vitamin P (do tác dụng thẩm thấu vàothành mạch máu) Đây là một nhóm hợp chất tồn tại trong các loại thực vật

Về mặt hóa học, flavonoid có cấu trúc chung bao gồm hai vòng phenyl và vòng

dị vòng Cấu trúc carbon này có thể viết tắt là C6-C3-C6 Theo danh pháp IUPAC,chúng có thể được phân thành flavonoid hoặc bioflavonoid

Phần lớn flavonoid có màu vàng, flavonoid khi tiếp xúc với rượu sẽ chuyểnsang màu đỏ sẫm Chúng hoạt động như chất chống oxi hóa, kháng sinh, ức chế chu kỳ

tế bào Các chất chống oxi hóa này đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng cườngsức khỏe về mặt tâm thần khi có tuổi tác Hoa quả trái cây có múi như cam, quýt làmột nguồn phong phú về hợp chất Flavonoid

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của flavonoid

- Quercetin: Là một flavonol thuộc loại flavonoid, thường được tìm thấy trong

rau, củ và trái cây Quercetin là một chất chống oxi hóa mạnh, hỗ trợ chống lại các tếbào gốc tự do Quercetin làm tăng tuổi thọ, hỗ trợ tim mạch, làm giảm cholesterol xấu

và tăng cường cholesterol tốt, giảm tiểu đường, hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, ngănngừa ung thư và cải thiện giấc ngủ Theo nghiên cứu của Coppin và cộng sự[20], láchùm ngây được thu thập từ châu Phi và được phân tích bởi HPLC – UV – MS Kếtquả hàm lượng Quercetin có trong lá chùm ngây chiếm từ 0,6 – 1% (g/100 g trọnglượng khô) Kết quả này cho thấy hàm lượng Quercetin có trong lá chùm ngây khácao

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của quercetin

- Keampferol: keampferol là một flavonol tự nhiên thuộc nhóm flavonoid.

Keampferol là một chất chống oxi hóa mạnh giúp ngăn ngừa thiệt hại tế bào do cácgốc tự do gây ra Keampferol giúp ngăn ngừa xơ cứng động mạch bằng cách ức chếquá trình oxi hóa lipoprotein mật độ thấp và sự hình thành các tiểu cầu trong máu.Ngoài ra nó còn giảm sự gia tăng tế bào của các tế bào ung thư, kích thích tăng sinh tếbào thận và tăng yếu tố tăng trưởng xương, giảm nguy cơ loãng xương Keampferolcòn có tác dụng chống khối u, chống viêm và chống lão hóa Keampferol được tìmthấy trong trà, bông cải xanh, bưởi, cải bắp và các nguồn thực vật khác Theo nghiêncứu của Coppin và cộng sự[20], với điều kiện thí nghiệm như Quercetin Kết quả hàmlượng Keampferol có trong lá chùm ngây chiếm từ 0,6 – 0,7% (g/100 g trọng lượngkhô) Kết quả này cho thấy hàm lượng Keampferol có trong lá chùm ngây chiếm mộtlượng tương đối cao

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của keampferol

- Ascorbic acid (AA): Hay còn gọi là vitamin C, đây là chất chống oxi hóa có

trong huyết tương, chúng có khả năng khử gốc tự do và không cho gốc tự do xâm nhậpvào các phân tử cholesterol, ngăn ngừa không cho các gốc tự do xâm nhập qua màng

tế bào giúp mau lành vết thương, kích thích sản xuất kháng thể Ascorbic acid chiếmmột phần lớn đáng kể trong lá chùm ngây Ascorbic acid dễ bị phân hủy khi gia nhiệt

do đó các loại thực phẩm nên ăn sống thì có tác dụng tốt hơn

Hình 1.5 Công thức hóa học của ascorbic acid

- β – Carotene: trong nhóm Carotenoid là tiền chất của vitamin A, khi vào cơ thể

chúng sẽ được hấp thụ và chuyển hóa thành vitamin A β – Carotene có nhiều trong

các loại rau quả như: cà rốt, cà chua, dưa hấu, bí ngô, rau ngót, rau đay, rau dền, quýt,chùm ngây

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của beta carotene

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Võ Hồng Thi và cộng sự (2012)[5] đã sử dụng hạt chùm ngây để làm trong nướctại Việt Nam, được khảo sát bằng một loạt thực nghiệm bằng thiết bị Jar Test trên cácmẫu nước đục nhân tạo và tự nhiên Khảo sát độ đục từ khoảng 44 NTU đến 300 NTU(đơn vị đo độ đục khuếch tán), kết quả cho thấy hạt chùm ngây trồng và thu hái ở ViệtNam có khả năng làm giảm trên 80% độ đục của nước ứng với nồng độ chùm ngây

100 mg/l Trong giới hạn khảo sát, nước càng đục thì hiệu quả giảm độ đục của hạtchùm ngây càng cao ở cùng ngưỡng nồng độ hạt chùm ngây

Trần Công Luận và cộng sự (2013)[6] phân lập và xác định các hợp chất có hoạttính chống oxi hóa trong lá chùm ngây, đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước đượccông bố đã phân lập được hai hợp chất flavonoid là vitexin (25 mg/g bột mẫu) vàisoquercitrin (200 mg/g bột mẫu) được phân lập từ phân đoạn ethyl acetate của láchùm ngây đều có hoạt tính chống oxi hóa theo những cơ chế khác nhau Đánh giáhoạt tính chống oxi hóa của hai chất được phân lập cho thấy:

- Isoquercitrin (6,64 µg/ml) có hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao hơn vitexin(85,18 µg/ml) và cao hơn chứng dương vitamin C

- Tại nồng độ 1000 µg/ml, vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử của vitamin

C và isoquercitrin đạt được 70% năng lực khử của Vitamin C

- Vitexin có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do IC50 cao nhất (248,152 µg/ml),cao hơn vitamin C (2183 µg/ml)

1.4.2 Ngoài nước

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây chùm ngây Hầu hếttất cả các bộ phận của cây chùm ngây đều được nghiên cứu và cho ra những ứng dụngliên quan, phục vụ cho sức khỏe và đời sống của con người

Nikolaus Foild (2000) và cộng sự đã sử dụng hạt của cây chùm ngây chiết suấtnhiên liệu sinh học(Bio-diesel) cũng cho kết quả hết sức khả quan: 11 kg hạt câyChùm ngây có thể chiết suất được 2,6 lít dầu Bio-diesel, hiệu quả chiết suất lên tới65%, quy trình chiết suất dầu hết sức đơn giản Sử dụng nghiên cứu này, công tyFAKT (Đức) đã cho ra đời dây chuyền chiết suất nhiên liệu sinh học từ cây Chùmngây với khả năng chiết suất được 80 – 90 kg dầu/h, giá thành khoảng 1400 USD

Choquenet và CS (2007) [10] đã khảo sát tiềm năng sử dụng rutin và Hai hợp chất thứ cấp được tìm thấy trong lá chùm ngây, nhằm tìm kiếm hoạt chất mới,phối trộn kết hợp với tác nhân chống nắng vật lý TiO2 và ZnO trong kem chống nắng.Kết quả khảo sát cho thấy, khi kết hợp với TiO2, chỉ số SPF thu được là khoảng 30

quercetin-Baldisserotto (2018)[11] báo cáo về tiềm năng sử dụng dịch chiết lá chùm ngâynhư là thành phần đa chức năng trong kem chống nắng Thành phần polyphenol cótrong dịch chiết lá chùm ngây được nghiên cứu bằng các phương pháp HPLC-DAD,polyphenol tổng số của dịch chiết (Folin-ciocalteu), khả năng khử sắt (FRAP), khảnăng chống oxi hóa (ORAC), khử gốc tự do (DPPH), khả năng lọc tia UV và khả năngtăng sinh tế bào Kết quả cho thấy khả năng chống nắng có trong dịch chiết lá chùmngây có chỉ số chống nắng SPF 2, tương ứng với mức bảo vệ 50% chống lại tia UV-B

ở nồng độ thấp từ 2% đến 4%

Hạt Chùm Ngây có chứa một số hợp chất “đa điện giải” (polyelectrolytes) tựnhiên có thể dùng làm chất kết tủa để làm trong nước Kết quả thử nghiệm lọc nước:Nước đục (độ đục 15-25 NTU, chứa các vi khuẩn tạp 280-500 CFU/ml, khuẩn Coli từphân 280-500 MPN/100 ml Dùng hạt Chùm Ngây làm chất tạo trầm lắng và kết tụ,đưa đến kết quả rất tốt (độ đục còn 0.3-1.5 NTU; vi khuẩn tạp còn 5-20 CFU; vàkhuẩn coli còn 5-10 MPN) Phương pháp lọc này rất hữu dụng tại các vùng nông thôncủa các nước nghèo và được áp dụng khá rộng rãi tại Ấn Độ (Babu, R., andChaudhuri, M (2005), Journal of Water and Health, 3(1), 27-30)

Qua các nghiên cứu trên, chúng tôi nhận định chùm ngây có tiềm năng ứngdụng rộng rãi, bởi chứa nhiều hoạt chất quý giá, nhiều hoạt tính sinh học Do đó,trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp, chúng tôi khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của caochiết trong các dung môi phân cực (MeOH, EtOH, H2O ) Lá chùm ngây thu nhận ởvùng Ninh Thuận, Việt Nam nhằm đánh giá khả năng ứng dụng cao chiết lá chùmngây trong mỹ phẩm như là hoạt chất đa chức năng: hấp thụ UV, chống oxi hóa, khángkhuẩn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là lá chùm ngây, tên khoa học là Moringa

Oleifera được thu hái ở phường Mỹ Hải tỉnh Ninh Thuận.

Hình 2.1 Lá chùm ngây ở tỉnh Ninh Thuận2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu

Hình 2.2 Bột lá chùm ngây sau khi xử lý

 Nhận xét quy trình:

Lá chùm ngây tươi được thu hái tại phường Mỹ Hải, tỉnh Ninh Thuận Sau khithu hái, lá được xử lý bằng cách loại bỏ những lá úa, hỏng, có sâu bệnh sau đó rửasạch và phơi khô Cần lưu ý trong quá trình phơi, lá được phơi trong bóng râm, tránhtiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời do hàm lượng polyphenol trong lá sẽ dễ bị

phân hủy và biến tính khi tiếp xúc với nhiệt độ cao Trong quá trình phơi, thườngxuyên kiểm tra và trở lá vì phơi trong bóng râm lá dễ bị mốc Sau khi lá khô đạt đến độgiòn, lá được đem đi xay nhỏ thành bột và bảo quản ở nhiệt độ 4oC Bột lá có màuxanh đậm, do trong quá trình thu hái, lựa chọn những lá già và tốt, không bị sâu bệnh,

vì hàm lượng polyphenol có trong lá già cao hơn so với lá non, bột lá có vị đắng và cómùi thơm của lá

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận cao chiết và xác định hoạt tính chống

oxi hóa từ bột lá chùm ngây.

 Giải thích quy trình:

Quy trình này được thực hiện theo nghiên cứu của (Badisserotto et al.,2018) và

có một số điều chỉnh để cải thiện hiệu suất chiết và phù hợp với điều kiện phòng thínghiệm Mục đích của việc bố trí thí nghiệm này là tìm ra quy trình chiết polyphenol

từ bột lá chùm ngây với hiệu suất chấp nhận được

Tính hiệu suất chiết

Xác định hoạt tính chống oxi hóa

Dịch chiết EtOH/H2O: Cân 2 g bột lá được thu nhận từ quá trình trên cho vào

40 ml dung dịch hydroalcoholic (Ethanol: nước, 70:30 v/v) theo tỷ lệ nguyên liệu/dungmôi là 1/20 w/v, sau đó hỗn hợp được chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm trong vòng

1 giờ Lọc, thu dịch chiết và bỏ bã, sau đó xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịchchiết

Dịch chiết methanol và ethanol: Cân 10 g bột lá cho vào 200 ml dung môi

methanol và ethanol, sau đó hỗn hợp được chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm trongvòng 1 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 w/v Lọc và thu dịch chiết, sau đó côquay dưới áp suất thấp để thu cao chiết, tính hiệu suất chiết và xác định hoạt tínhchống oxi hóa có trong cao chiết

2.2.4 Quy trình bố trí thí nghiệm sau khi cải tiến

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sau khi cải tiến

 Thuyết minh quy trình:

Sau khi khảo sát và tiến hành thực nghiệm từ quy trình dự kiến có thể thấy rằng,

số lần chiết quá nhiều gây ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và tiêu tốn nhiều dung môi

Bột lá

-Chiết bằng dung môi: ROH

-Tỷ lệ dung môi/nguyênliệu: 1/20 (w/v)

- Chiết hỗ trợ sóng siêu âm

-Thời gian chiết: cách 20phút nghỉ 10 phút, siêu âm trongvòng 1 giờ

- Phơi trong bóng râm

- Cô quay dưới áp suất thấpsạch

- Phơi trong bóng râm đến khi khô

Cao chiết

Tính hiệu suất chiết

Xác định hoạt tính chống oxi hóa

ưu cho hàm lượng polyphenol cao nhất là cần thiết Tiến hành thiết lập sơ đồ bố trí thínghiệm cải tiến như sau:

Cân chính xác 10 g bột lá chùm ngây cho vào cốc thủy tinh 250 ml Thêm dungmôi chiết vào với tỷ lệ cố định là 1:20 w/v Chiết bằng bể siêu âm với các loại dungmôi MeOH, EtOH Trong quá trình chiết, cách 20 phút tắt bể siêu âm và để nghỉ 10phút , quá trình này được lặp đi lặp lại cho đến 1 giờ, đậy kín cốc trong thời gian chiết,tiến hành chiết lại 3 lần Sau khi chiết, lọc dịch và thu dịch chiết, sau mỗi lần chiếtđịnh tính polyphenol bằng FeCl3 5% dung dịch chuyển sang màu xanh nâu (Phụ lục 2),định tính cho đến khi dung dịch không còn đổi màu chứng tỏ polyphenol trong bột lá

đã được chiết cạn Sau khi chiết cạn hết polyphenol có trong bột mẫu, tiến hành thudịch và loại bỏ bã, sau đó dịch chiết đem đi cô quay để thu cao chiết Từ đó xác địnhđược hiệu suất chiết và hoạt tính chống oxi hóa của bột lá chùm ngây

Đối với dịch chiết bằng EtOH/H2O 7:3 v/v, tiến hành cân 2 g bột mẫu cho vàocốc thủy tinh sau đó thêm 40 ml dung môi Chiết bằng bể siêu âm với thời gian nhưtrên, sau đó lọc thu dịch chiết và loại bã Từ đó xác định hoạt tính chống oxi hóa củacác cao chiết từ bột lá chùm ngây

2.2.5 Các phương pháp phân tích hóa lý

2.2.5.1 Xác định hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết được tiến hành bằng phương pháp cân khối lượng Sau khi thuđược dịch chiết, tiến hành cô quay chân không dưới áp suất thấp để loại bỏ hoàn toàndung môi chiết Sau khi dung môi chiết được loại bỏ hoàn toàn sẽ thu được cao chiết.Lượng chất khô thu được đem cân để xác định khối lượng và tính toán hiệu suất chiếttheo công thức sau:

HS (%) =

Trong đó:

- HS: Là hiệu suất chiết, đơn vị %

- m1: Khối lượng mẫu đem chiết, đơn vị g

- m2: Khối lượng chất khô thu được sau khi bay hơi hết dung môi chiết, đơn vị g

2.2.5.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Nguyên tắc: Dùng để ước tính tổng hàm lượng phenolic có trong các mẫu,

thuốc thử Folin sẽ phản ứng với phenolic trong môi trường kiềm và tạo thành dungdịch có màu xanh lam (Hình 2.5) Thuốc thử này chứa chất oxi hóa (phospho-vonframic acid), trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl của phenol (-OH) dễ bị oxihóa thành cetone và sinh ra H3(PMo13O40) có màu xanh với có độ hấp thụ cực đại ở

bước sóng 765 nm ( trong quá trình phản ứng cần phải thực hiện trong bóng tối, nếu

có ánh sáng thì sẽ làm giảm độ hấp thụ, gây ảnh hưởng đến kết quả đo) Hàm lượng

polyphenol bằng cách đo độ hấp thụ quang của H3(PMo13O40) ở λ = 765 nm và địnhlượng dựa vào phương trình đường chuẩn gallic acid

H3PO4(MoO3)13 + + H3O+ + H3(PMo13O40)

Pereaksi Folin-Ciocalteu Senyawa Fenol Kuinon Kompleks molypdenum-blue

Hình 2.5 Phương trình phản ứng tạo phức của thuốc thử Folin-Ciocalteu với

polyphenol [25]

Cách tiến hành: Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) được xác định theo

phương pháp Vongsak và cộng sự (2013) với một vài thay đổi nhỏ Hút 0,5 ml các mẫudịch chiết được pha loãng với nồng độ thích hợp trộn với 2,5 ml dung dịch Folin-Ciocalteu (pha loãng với tỷ lệ 1:10 v/v bằng nước cất) Sau đó thêm 0,8 ml Na2CO37,5% (w/v) nhằm điều chỉnh hỗn hợp ở pH = 10 để Folin phản ứng tốt nhất Hỗn hợpđược ủ trong tối trong vòng 30 phút Đo độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng trên ở λ =

725 nm bằng máy đo quang phổ UV-Vis Libra S50 Hàm lượng TPC được tính toán từđường chuẩn gallic acid (từ 12 đến 44 µg/ml), được biểu diễn theo số miligam gallicacid tương đương (GAE) trên một gam chất khô (mg GAE/g VCK)

2.2.5.3 Xác định khả năng khử sắt của các dịch chiết

Nguyên tắc: Khi có sự xuất hiện của chất kháng oxi hóa thì K3Fe(CN)6 (Fe3+)phản ứng với chất kháng oxi hóa tạo phức K4Fe(CN)6 (Fe2+), sau đó K4Fe(CN)6 tác

O

O H

O

dụng với FeCl3 tạo phức K4[Fe(CN)6]3 phức này được phát hiện ở bước sóng 700 nm.Nếu nồng độ chất kháng oxi hóa càng cao thì bước sóng càng tăng.

Cách tiến hành: Năng lực khử của các dung dịch được xác định theo phương

pháp của Oyaizu và cộng sự (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ Hút 0,5 ml các caochiết MeOH, EtOH, EtOH/H2O đã được pha loãng với nồng độ thích hợp, thêm 1,0 mlđệm phosphate pH 7,2 Tiếp đến 0,5 ml K3Fe(CN)6 1% (w/v) được cho vào, định mứcbằng nước cất đến 25,00 ml Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong vòng 30 phút, làm nguộibằng nước lạnh trong vòng 5 phút Thêm 1,00 ml CCl3COOH 10% (w/v) và 0,1 mlFeCl3 0,1% (w/v) Độ hấp thụ quang của hỗn hợp được đo ở λ = 672 nm Tổng nănglực khử được tính toán từ đường chuẩn FeSO4 (từ 0,04 đến 0,2 mg/ml), biểu diễn theo

số miligam FeSO4 tương đương (FeSO4) trên 1 gam chất khô (mg FeSO4/g VCK).(Phụ lục 5)

2.2.5.4 Xác định hoạt tính khử gốc tự do DPPH

Nguyên tắc: xác định khả năng bắt gốc tự do của các chất chống oxi hóa, các

electron đơn lẻ của nguyên tử nitơ có trong DPPH được giảm bằng cách nhận mộtnguyên tử hydro từ chất chống oxi hóa với hydrazine tương ứng Khi các chất chốngoxi hóa cho hydrogen thì độ hấp thụ sẽ giảm tại bước sóng cực đại, màu dung dịchphản ứng sẽ nhạt dần từ tím sang vàng nhạt

Hình 2.6 Phương trình phản ứng của DPPH

- Phương pháp này được so sánh bởi giá trị IC50. IC50 (nồng độ ức chế trung bình):

là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát IC50được định nghĩa là nồng độ (mg/ml hoặc µg/ml) của mẫu tại đó nó có thể ức chế 50%gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp

- Cách xác định IC50: sau khi ta lập được phương trình tuyến tính y = ax + b, tathay y = 50% tìm ra được giá trị của x, đó chính là IC50.

Khả năng bắt gốc tự do của DPPH được tính theo công thức sau:

% Inhibition =

Trong đó:

- % Inhibition: khả năng bắt gốc tự do của DPPH, đơn vị %

- Ablank: Độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết

- Asample: Độ hấp thụ quang học của mẫu có chứa dịch chiết

Cách tiến hành: khả năng bắt gốc tự do DPPH được tiến hành theo phương

pháp của Pothitirat và cộng sự (2009) với một vài hiệu chỉnh nhỏ Tiến hành so sánhkhả năng khử gốc tự do của cao chiết ethanol với ascorbic acid và BHT tại các nồng

độ khác nhau (từ 0,5 đến 5,0 µg/ml) Dịch chiết tại các nồng độ thêm vào 3 ml DPPH0,2 mM sau đó hỗn hợp được ủ trong tối khoảng 30 phút Đo độ hấp thụ ở λ = 515 nm.Tính toán và vẽ đồ thị so sánh khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết với ascorbic acid

và BHT (Phụ lục 6)

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các phương pháp phân tích được tiến hành lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậycao Số liệu, tính toán và các hình vẽ đồ thị được thực hiện bằng phần mềm Excel( Office 2010, Microsoft, USA)

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.3.1 Hóa chất

Ethanol, methanol, nước cất, dung dịch Folin-Ciocalteu (Trung Quốc), Na2CO3,gallic acid (Trung Quốc), FeSO4, K2HPO4, KH2PO4, K3Fe(CN)6, trichloroacetic acid(TCA), FeCl3, Butylated Hydroxytoluene (BHT), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) (Đức), ascorbic acid

2.3.2 Thiết bị sử dụng

Tủ lạnh, bể siêu âm Branson CPX 1800–E-USA, máy cô quay IKA – Đức RV

10 basic V, máy đo UV-Vis Libra 50