Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene

MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời Cảm Ơn I MỤC LỤC II DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ IX DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ X Giới thiệu đề tài .1 Giới thiệu số phƣơng pháp nghiên cứu khả chống oxi hóa 2.1 Khái niệm gốc tự .3 2.2 Lợi ích gốc tự thể 2.3 Tác hại gốc tự thể 2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự NO .7 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) 10 2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10 2.4.5.1 Giới thiệu 10 2.4.5.2 Cấu tạo .10 2.4.5.3 Cơ chế hoạt động enzyme XO .10 2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11 Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào .12 II 3.1 Nuôi cấy tế bào 12 3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 13 3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu phát triển tế bào 13 3.2.2 Phƣơng pháp SRB 13 Tổng quan chất nghiên cứu thuộc họ lignan stilbene 14 4.1 Lignan 14 4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15 4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) .15 4.2 Stilbene 16 4.2.1 Resveratrol (RES) .17 4.2.2 Pterostilbene (PTS) 18 4.2.3 Piceatannol (PI) 19 Kết thảo luận 21 5.1 Kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21 5.1.1 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 21 5.1.2 Kết thử hoạt tính ức chế gốc tự NO 25 5.1.3 Kết thử hoạt tính ức chế enzyme XO 27 5.1.4 Tóm tắt kết thử hoạt tính chống oxi hóa 28 5.2 Kết nghiên cứu độc tính tế bào 31 5.2.1 Isotaxiresinol .31 5.2.2 Secoisolariciresinol 34 5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene Piceatannol 37 5.2.4 Tóm tắt kết nghiên cứu độc tính tế bào 42 Thực nghiệm 45 6.1 Hóa chất dụng cụ 45 6.1.1 Hóa chất 45 III 6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 46 6.1.3 Chuẩn bị mẫu 47 6.1.4 IC50 cách xác định 48 6.1.4.1 Định nghĩa 48 6.1.4.2 Cách xác định IC50 .48 6.2 Nghiên cứu khả chống oxy hóa 49 6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 49 6.2.1.1 Nguyên tắc 49 6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự DPPH 49 6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất .50 6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự NO .51 6.2.2.1 Nguyên tắc 51 6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất .52 6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự NO 52 6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO .54 6.2.3.1 Nguyên tắc 54 6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất .54 6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO .54 6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào .56 6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu phát triển tế bào 56 6.3.2 Phƣơng pháp SRB 57 Tài Liệu Tham Khảo .63 IV DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ITR Isotaxiresinol SSR Secoisolariciresinol RES Resveratrol PTS Pterostilbene PI Piceatannol Da Dalton ROS Reactive oxygen species DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl NO Nitric oxide SOD Superoxyde dimustase CAT Catalase FDA Flavin adenin dinucleotide Fe Iron Mo Molybdenum NED N-1-naptyletilendiamin dihydroclorur MDA Malonyl dialdehyde XO Xanthine oxidase SRB Sulforhodamine B V IC50 Half maximal inhibitory concentration DMSO Dimethylsulfoxide NaCl Sodium chloride PBS Phosphate buffer saline FBS Fetal bovin serum TCA Trichloroacetic acid COX-1 Cyclooxygenase - COX-2 Cyclooxygenase - HPLC High performance liquid chromatography GC Gas chromatography NMR Nuclear magnetic resonance VI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH PI, RES PTS 21 Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 21 Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc tự NO 25 Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO 27 Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO Allopurinol nồng độ từ 0.2 đến uM 27 Bảng Tóm tắt kết thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH, gốc tự NO enzyme XO chất 30 Bảng Kết ảnh hƣởng ITR 300µM lên hình dạng tế bào 33 Bảng Kết ảnh hƣởng ITR lên dạng hình học tế bào 33 Bảng Kết ảnh hƣởng SSR lên dạng hình học tế bào 35 Bảng 10 Ảnh hƣởng RES lên dạng hình học dịng tế bào DLD-1 40 Bảng 11 Ảnh hƣởng PTS lên dạng hình học dịng tế bào DLD-1 41 Bảng 12 Ảnh hƣởng PI lên dạng hình học dịng tế bào DLD-1 42 Bảng 13 Tóm tắt kết nghiên cứu độc tính tế bào theo phƣơng pháp CC SRB 44 Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM 50 Bảng 15 Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ đến 10 μM 51 Bảng 16.Cách pha dung dịch thử hoạt tính NO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 53 Bảng 17 Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 56 VII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Phản ứng trung hòa gốc DPPH Hình Cơ chế phản ứng lên màu nitrit thuốc thử Greiss Hình Cơ chế phản ứng lên màu MDA Acid thiobarbituric Hình Cơ chế xúc tác XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric 11 Hình Phản ứng tạo acid uric 12 Hình Khung sƣờn cấu trúc Lignan 14 Hình Cơng thức cấu tạo Isotaxiresinol 15 Hình Công thức cấu tạo Secoisolariciresinol 16 Hình Khung sƣờn trans-stilbene 17 Hình 10 Khung sƣờn cis-stilbene .17 Hình 11 Cơng thức cấu tạo Resveratrol 17 Hình 12 Công thức cấu tạo Pterostilbene 18 Hình 13 Cơng thức cấu tạo Piceatannol 19 Hình 14 Cơng thức cấu tạo Quercetin .51 VIII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 50 Sơ đồ Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự NO .53 Sơ đồ Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55 IX DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị Biễu diễn % ức chế gốc tự DPPH• theo nồng độ chất 22 Đồ thị Biễu diễn % ức chế gốc tự NO theo nồng độ chất 26 Đồ thị Biễu diễn % ức chế enzyme XO theo nồng độ chất 28 Đồ thị Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm ITR số tế bào 31 Đồ thị Sự phụ thuộc nồng độ ITR phát triển tế bào theo SRB 32 Đồ thị Biễu diễn ảnh hƣởng ITR lên đƣờng kính tế bào DLD-1 34 Đồ thị Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm SSR số tế bào theo CC .34 Đồ thị Sự phụ thuộc nồng độ SSR số tế bào theo SRB 35 Đồ thị Ảnh hƣởng SSR lên đƣờng kính dịng tế bào DLD-1 36 Đồ thị 10 Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới phơi nhiễm chất RES, PTS, PI tƣơng ứng với hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp CC 38 Đồ thị 11 Sự phụ thuộc nồng độ chất phơi nhiễm RES, PTS PI vào số tế bào tƣơng ứng hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp SRB 39 Đồ thị 12 Ảnh hƣởng RES đƣờng kính dịng tế bào DLD-1 .40 Đồ thị 13 Ảnh hƣởng PTS lên đƣờng kính dịng tế bào DLD-1 41 Đồ thị 14 Ảnh hƣởng PI lên đƣờng kính dịng tế bào DLD-1 42 X Giới thiệu số phƣơng pháp nghiên cứu khả chống oxi hóa 2.1 Khái niệm gốc tự Oxy đƣợc xem nhƣ nguyên tố quan trọng giúp ngƣời trì sống, chúng tham gia vào q trình hơ hấp tế bào, sản sinh lƣợng cung cấp cho hoạt động sống ngƣời Khoảng vài thập niên gần đây, nghiên cứu khoa học chứng tỏ oxy vào thể tham gia nhiều q trình sinh hóa q trình oxy tạo tiểu phân trung gian gọi gốc tự Các gốc tự có nguồn gốc oxy có hoạt tính cao, bền vững đƣợc gọi chung gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) 1,2 Ban đầu oxygen nhận điện tử tạo gốc superoxyde (O2•–), gốc tự quan trọng tế bào Từ superoxyde (O2•–) nhiều gốc tự phân tử khác oxy có khả phản ứng cao đƣợc tạo nhƣ hydroxyl (HO●), hydroperoxyl (HOO●), peroxyl (ROO●), alkoxyl (RO●), lipoperoxyde (LOO•), H2O2 2,10,18 Các dạng oxy hoạt động có lƣợng cao, bền nên dễ dàng phản ứng với đại phân tử nhƣ protein, lipid, DNA, … gây rối loạn q trình sinh hóa thể Đồng thời, phân tử sống bị gốc tự cơng, điện tử trở thành gốc tự mới, tiếp tục phản ứng với phân tử khác tạo thành chuỗi phản ứng thƣờng gọi phản ứng dây chuyền, gây biến đổi có tác hại thể 2,10 Gốc tự đƣợc tạo nhiều cách Nó sản phẩm căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trƣờng, thuốc lá, dƣợc phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nƣớc có nhiều chlorine oxy 9,10 2.2 Lợi ích gốc tự thể Không phải gốc tự có hại thể Nếu đƣợc kiểm sốt, nguồn cung cấp lƣợng cho thể, tạo chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm Tƣơng ứng với nồng độ mẫu thử ta làm mẫu trắng (blank) nhƣng thay Vnitroprusside Vđệm Cũng nhƣ phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH, để có sở đánh giá hoạt tính mẫu chất khảo sát, sử dụng quercetin làm chất đối chứng dƣơng 6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO 6.2.3.1 Nguyên tắc Xanthine oxidase enzyme thân oxy hóa, xúc tác phản ứng oxy hóa xanthine tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự O2● Để thử hoạt tính ức chế XO ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp trắc quang để đo mật độ quang acid uric hình thành có khơng có mẫu thử Acid uric có bƣớc sóng cực đại hấp thu 290 nm Chất có khả kháng enzyme XO cao hạn chế hình thành acid uric, mật độ quang acid uric giảm 6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất  Đệm phosphate 70 mM, pH = 7.5: cân 3.702 g NaH2PO4.2H2O 16.57 g Na2HPO4.12H2O định mức thành 1000ml nƣớc cất lần Dùng NaOH H3PO4 điều chỉnh pH đến 7.5 máy pH  Xanthine oxidase 0.05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng (Một unit (U) XO đƣợc định nghĩa lƣợng enzyme cần thiết để tạo µmol acid uric phút 250C)  Xanthine 150 µM: cân xác 1.14 mg xanthine, pha bình định mức 50ml đệm phosphate 70 mM pH=7.5  HCl 1N: rút 16.7 ml HCl đậm đặc (37 %) thêm nƣớc cất lần thành 200ml  Dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500μM 6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO đƣợc tóm tắt sơ đồ dƣới đây: 54 V1 l mẫu (500M) V2 µl đệm pH 7.5 - 100l XO (0.05U/ml) Ủ 15 phút nhiệt độ phòng Dung dịch sau ủ - 900l Xanthine 150M Ủ lần (30 phút) Dung dịch sau ủ lần - 200l HCl 1N Đo = 293nm Sơ đồ Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55 Mẫu thử mẫu control đƣợc pha theo bảng 17 sau: C (μM) control 100 50 25 10 V1 mẫu(μl) 600 300 150 60 V2 đệm(μl) 1800 1200 1500 1650 1740 VXO (μl) 100 Vxanthine(μl) 900 VHCl 1N(μl) 200 Bảng 17 Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM Tƣơng ứng với nồng độ mẫu thử ta làm mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay 100μl XO 100μl đệm Để có sở đánh giá hoạt tính mẫu chất khảo sát enzyme XO, sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dƣơng, hợp chất ức chế enzyme XO mạnh, đƣợc sử dụng làm thuốc để chữa trị bệnh gút 6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu phát triển tế bào Dòng tế bào DLD-1 sử dụng cho thực nghiệm đƣợc cho vào giếng đĩa 24 giếng với mật độ khoảng 3.0 x 104 tế bào/giếng đƣợc ủ qua đêm môi trƣờng CO2 5% 37oC để đảm bảo tế bào kết dính vào đáy giếng sau tế bào sẵn sàng cho thí nghiệm Chuẩn bị dung dịch chất cần kiểm tra độc tính RES (0-60µM), PI (0-60µM), PTS (0-60µM), ITR (0-300µM), SSR (0-300µM) mơi trƣờng ni cấy tế bào (Fetal serum), trƣớc xử lý tế bào với dung dịch trên, môi trƣờng tế bào cũ cần đƣợc rửa cách sử dụng 1ml PBS, sau đem ủ cho khảo sát 24, 48 72 môi trƣờng CO2 5% 37oC 56 Sau đƣợc ủ tới thời gian cần khảo sát, tế bào đƣợc chụp ảnh sử dụng hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha Leica DMIRB (Leica Microsystem A/S) với độ phóng đại 200 lần Sau đó, tế bào đƣợc rửa PBS (1ml/giếng), thêm trysine (0.2ml/giếng) để thực trình trypsin hóa tách tế bào khỏi đáy giếng, tiếp tục thêm PBS (0.8ml/giếng), sau sử dụng pipet hút xả lực mạnh cho tế bào tách khỏi Dùng micropipet hút xác 800µl dung dịch tế bào chuẩn bị cho vào cốc đo có chứa 10ml NaCl 0.9%, sau thực bƣớc đếm tế bào sử dụng máy đếm Coulter Z2, Beckman Coulter cho tế bào có kích thƣớc lớn 11µm Q trình phát triển tế bào đƣợc thể số tế bào phần trăm tế bào đƣợc xử lý với chất cần khảo sát so với mẫu control (tế bào môi trƣờng nuôi cấy với DMSO) 6.3.2 Phƣơng pháp SRB Sulforhodamine B (SRB) 0.2% đƣợc chuẩn bị cách hòa tan 0.1g SRB vào 50ml axit acetic 1% lắc đều, thuốc thử đƣợc chứa lọ sẫm màu giữ lạnh sử dụng Trichloroacetic acid (TCA) 50% đƣợc chuẩn bị cách thêm 50g tinh thể TCA vào 100mml nƣớc cất khử ion, đƣợc lƣu lọ thủy tinh giữ lạnh sử dụng Chuẩn bị dung dịch đệm Tris[hydroxymethyl]aminomethane 10mM cách hòa tan 0.605g Tris-base vào 500 ml nƣớc đƣợc giữ lạnh đến sử dụng Quy trình phƣơng pháp SRB: Cho 100 μL tế bào vào đĩa 96 giếng cho lƣợng tế bào khoảng 10.000 tế bào/giếng sau ủ qua đêm môi trƣờng CO2 5% 37oC 57 Kiểm soát phát triển, phân bố tế bào giếng mật độ tế bào giếng khác sử dụng kính hiển vi tƣơng phản pha Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy chứa chất khảo sát vào giếng blank control Thêm 100 μL/giếng mơi trƣờng ni cấy có chứa chất khảo sát nồng độ khác vào đĩa 96 giếng theo thiết kế thí nghiệm Ủ tế bào môi trƣờng CO2 5% 37oC đến thời gian cần khảo sát phát triển tế bào phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm chất (24, 48, 72 giờ) Sau 24 giờ, dừng tiến hành q trình ni cấy cho đĩa khảo sát trình phát triển tế bào 24 để tiến hành đo mật độ quang tế bào theo bƣớc sau Cố định lƣợng protein tế bào sử dụng 100 μL TCA 10% (4°C)/giếng, sau giữ lạnh đĩa 4°C cách đặt đĩa tủ lạnh trƣớc phân tích phƣơng pháp SRB Sử dụng nƣớc cất khử ion (200 μL/giếng) để loại rửa TCA khoảng lần để khơ tự nhiên khơng khí Dùng pipet lấy 100 μL dung dịch SRB cho vào giếng nhuộm màu vòng 30 phút 10 Sử dụng miro-pipet điện tử kênh để loại SRB khỏi giếng dùng acit acetic 1% để rửa SRB, sau để khơ tự nhiên khơng khí 11 Để khơ đĩa tự nhiên khơng khí khơng cịn thấy ẩm bên giếng 12 Hòa tan protein nhuộm màu 100 μL Tris base 10 mM giếng Lắc đĩa nhẹ vòng 10 phút để hòa tan đồng hóa chất nhuộm giếng 13 Tiến hành đo mật độ quang sử dụng máy đọc ELISA bƣớc sóng 492 nm sử dụng bƣớc sóng 620 nm làm so sánh 58 14 Mật độ quang giếng tỷ lệ trực tiếp với số tế bào, vẽ đồ thị biễu diễn phụ thuộc giá trị mật độ quang theo nồng độ chất khảo sát tính tốn giá trị IC50 59 Trong đề tài chúng tơi nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa độc tính tế bào số chất họ lignan stilbene, kết cho thấy: Hai lignan, SSR ITR, có hoạt tính chống oxi hóa tƣơng đối mạnh thơng qua việc ức chế gốc tự DPPH NO, giá trị IC50 lần lƣợt 9.2 7.1 M gốc DPPH 61.9 36.2 M gốc NO, nhƣng lại khơng có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào DLD-1 Điều cho thấy hạn chế việc ứng dụng hai hợp chất vào loại dƣợc phẩm điều trị bệnh liên quan đến dịng tế bào DLD-1 Tuy nhiên, phát triển hƣớng nghiên cứu cho dòng tế bào khác để chứng minh khả chống oxy hóa mạnh hai hợp chất Ba hợp chất stilbene, RES, PTS PI có hoạt tính chống oxi hóa trung bình nhƣng lại có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào DLD-1 mạnh, giá trị IC50 lần lƣợt 30.8, 32.8 64.3M theo phƣơng pháp đếm tế bào 76.3, 44.6 117.9M theo phƣơng pháp SRB Kết nghiên cứu chứng minh rằng, hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch hợp chất thuộc họ stilbene hoạt tính chống oxy hóa chúng Bên cạnh đó, độc tính tế bào hợp chất cho thấy khả ứng dụng chúng Kết nghiên cứu ảnh hƣởng RES lên dạng hình học tế bào phù hợp với nghiên cứu trƣớc dòng tế bào HeLa Điều khẳng định ảnh hƣởng mạnh RES lên dòng tế bào DLD-1 Trong số hợp chất nghiên cứu cho thấy có PI thể tất hoạt tính nhƣ ức chế NO, ức chế DPPH ức chế enzyme XO, độc tính tế bào dịng tế bào DLD-1, cần có nghiên cứu sâu nhƣ khảo sát khả chống peroxy hóa lipid màng tế bào theo phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA, nghiên cứu chu kỳ tế bào theo phƣơng pháp flow cytometry, nghiên cứu chu trình chết (apotosis) dịng tế bào khác nhau, từ đánh giá thêm hoạt tính sinh học khác PI để sử dụng chất 60 Tài Liệu Tham Khảo HTTP://en.wikipedia.org/wiki/Free-radical_theory HTTP://en.wikipedia.org/wiki/Reactive_oxygen_species HỒ HUỲNH THÙY DƢƠNG, Nghiên cứu tác động kháng ung thƣ, chống oxi hóa thuốc Việt Nam phƣơng pháp sinh học phân tử, Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN, 2005 NGUYỄN THÚY VY, Effects of resveratrol on human cancer cell adhesion, DANIDA project work, 2007 VIỆN DƢỢC LIỆU, Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc từ dƣợc thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2006, 279-292 CROZIER.A, CLIFFORD.M.N, ASHIHARA.H, Plant Secondary Metabolites Occurrence, Structure and Role in the Human Diet, Blackwell Publishing, 2006, 12-19 RICE-EVANS C.A, DIPLOCK.A T, SYMONS M C R, Techniques In Free Radical Research, Elsevier Sci.BV, 1991, 22, 146-150 RAUSHANARA AKTER, S M RAQUIBUL HASAN, MD MOKARRAM HOSSAIN, MARIAM JAMILA, MD EHSANUL HOQUE MAZUMDER, SHAFIQUR RAHMAN, In Vitro Antioxidant and In Vivo Antidiarrhoeal Activity of Hydromethanolic Extract of Xanthium Indicum Koenig Leaves, Eur.J.Sci.Res, 2009, 33, 305-312 DONALD ARMSTRONG, Oxidants and Antioxidants, Ultrastructure and Molecular Biology Protocols, Humana Press, 2002, Volume 196, 3-12 10 HALLIWELL B, Reactive oxygen species in living systems, Am.J.Med, 1991, 91: 14S 63 11 ARJUN H BANSKOTA, NHAN TRUNG NGUYEN, YASUHIRO TEZUKA, QUAN LE TRAN, TAKAHIRO NOBUKAWA, YOUICHI KURASHIGE, MASAKIYO SASAHARA AND SHIGETOSHI KADOTA, Secoisolariciresinol And Isotaxiresinol Inhibit Tumor Necrosis Factor-Α-Dependent Hepatic Apoptosis In Mice, Life.Sci, 2004, 22, 27812792 12 A.H BANSKOTAA, N.T NGUYEN, Y TEZUKA, T NOBUKAWAB, S KADOTA, Hypoglycemic effects of the wood of Taxus yunnanensis on Streptozotocin-induced diabetic rats and its active components, Int.J.Phytother.Phytopharm, 2006, 13, 109 -114 13 BLASE BILLACK, VIJAYALAXMI RADKAR AND CHRISTELLE ADIABOUAH, In Vitro Evaluation Of The Cytotoxic And Antiproliferative Properties Of Resveratrol And Several Of Its Analogs, Cell.Mol.Biol.Letters, 2008, 13, 553-569 14 R D BLUMENTHAL, Methods in Molecular Medicine, Humana Press Inc , 2005, 39-48 15 JENNIFER BURNS, TAKAO YOKOTA, HIROSHI ASHIHARA, MICHAEL E J LEAN, AND ALAN CROZIER, Plant Foods and Herbal Sources of Resveratrol, J Agric Food Chem, 2002, 50, 3337-3340 16 AEDIN CASSIDY, BRYAN HANLEY AND ROSA M LAMUELARAVENTOS, Isoflavones, lignans and stilbenes – origins, metabolism and potential importance to human health, J Sci Food Agric, 2000, 80, 10441062 17 SUNIL K CHATTOPADHYAY, T R SANTHA KUMAR, PRAKAS R MAULIK, SACHIN SRIVASTAVA, ANKUR GARG, A ASHOKESHARON, ARVIND S NEGIA AND SUMAN PREET S KHANUJAA, Absolute Configuration and Anticancer Activity of Taxiresinol and Related Lignans of Taxus wallichiana, Bioor.Med.Chem, 2003, 11, 4945–4948 18 KNOX VAN DYKE, WOODFORK, CHRISTOPHER Luminescence VAN Biotechnology: DYKE, KAREN Instruments and Applications, CRC Press, 1994, section 5, 379-459 19 PATRIK C EKLUND, OTTO K LANGVIK, JOHAN P WăARNA TAPIO O SALMI STEFAN M WILLFăOR AND RAINER E SJăOHOLM, Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans, Org Biomol Chem, 2005, (3), 33363347 20 JIAN-GUO FANG, BO ZHOU, Structure-Activity Relationship and Mechanism of the Tocopherol-Regenerating Activity of Resveratrol and Its Analogues, J Agric Food Chem, 2008, 56, (23), 11458-11463 21 RUSS HILLE, HOWARD SPRECHER, On the Mechanism of Action of Xanthine Oxidase, J Biol Chem, 1987, 262, 23, 10914-10917 22 PETER HOUGHTON, RUI FANG, ISARIYA TECHATANAWAT, GLYN STEVENTON, PETER J HYLANDS, C.C LEE, The sulforhodamine (SRB) assay and other approaches to testing plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer activity, Methods, 2007, 42, 377–387 23 P IONITA, Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen Active Species, Chem.Pap, 2005, 59, 11-16 24 YIN J, TEZUKA Y, SUBEHAN, SHI L, NOBUKAWAB M, NOBUKAWAC T, KADOTAA S, In vivo anti-osteoporotic activity of isotaxiresinol, a lignan from wood Int.J.Phytother.Phytopharm, 2006, 13, 37–42 of Taxus yunnanensis, 25 SHIEGETOSHI KADOTA, TAKAHIRO NOBUKAWA, US Patent Application, US2008/ 0146659 A1, 2008 26 ROBERT E KING, JOSHUA A BOMSER, AND DAVID B MIN, Bioactivity of Resveratrol, Comp.Reviews in Food Sci Food Saf, 2006, 27 KUO-LUNG KU, PING-SHUN CHANG, YA-CHIN CHENG, AND CHING-YI LIEN, Production of Stilbenoids from the Callus of Arachis hypogaea: a Novel Source of the Anticancer Compound Piceatannol, J Agric Food Chem, 2005, 53, 3877-3881 28 YU-LING LEE, SHAO-YU JIAN, PEI-YING LIAN AND JENG-LEUN MAU, Antioxidant properties of extracts from a white mutant of the mushroom Hypsizigus marmoreus, J.Food Com.Anal, 2008, 21, 2, 116124 29 XIAO TIAN LIANG, WEI SHUO FANG, Medicinal Chemistry of Bioactive Natural Products, John Willey & Son, 2006 30 DEˆNIS PIRES DE LIMA, RODRIGO ROTTA, ADILSON BEATRIZ, MARIA RITA MARQUES, RAQUEL C MONTENEGRO, MARNE C VASCONCELLOS, CLA´UDIA PESSOA, MANOEL O DE MORAES, LETI´CIA V COSTA-LOTUFO, ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA, MARCOS NOGUEIRA EBERLIN Synthesis and biological evaluation of cytotoxic properties of stilbene-based resveratrol analogs, Eur.J.Med.Chem, 2008, 1-7 31 ZHI XIU LIN, J.R.S HOULT, AMALA RAMAN, Sulforhodamine B assay for measuring proliferation of a pigmented melanocyte cell line and its application to the evaluation of crude drugs used in the treatment of vitiligo, J Ethnophar, 1999, 66, 141–150 32 YINRONG LU, YEAP FOO.L, Antioxidant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis), Food chem, 2001, 75, (2), 197-202 33 MARIA DE LUCIA, LUCIA PANZELLA, ORLANDO CRESCENZI, ALESSANDRA NAPOLITANO, VINCENZO BARONE AND MARCO D’ISCHIA, The catecholic antioxidant piceatannol is an effective nitrosation inhibitor via an unusual double bond nitration, Bioor.Med.Chem.Letters 16, 2006, 2238–2242 34 MARK S MESKIN, WAYNE R BIDLACK, R KEITH RANDOLPH, Phytochemicals: Nutrient–Gene Interactions, CRC Press, 2006, 41-81 35 MARCO MILANESIO, DAVIDE VITERBO, SUNIL K.CHATTOPADHYAY, MANISH KULSHRESTHA AND GIOVANNI APPENDINO, Crystal and Molecular Structure of Secoisolariciresinol, Croat Chem Acta, 1999, 72, (2–3), 351-363 36 MAREK MURIASA, WALTER JAăGERA, NORBERT HANDLERA, THOMAS ERKERA, ZSUZSANNA HORVATHB, THOMAS SZEKERESB, HANS NOHLC, LARS GILLEC, Antioxidant, prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated resveratrol analogues: structure activity relationship, Biochem Pharm 2005, 69, 903–912 37 ZDENKA OVESNÁ, KATARÍNA KOZICS, YVONNE BADER, PHILIPP SAIKO, NORBERT HANDLER, THOMAS ERKER AND THOMAS SZEKERES, Antioxidant activity of resveratrol, piceatannol and 3,3',4,4',5,5'- hexahydroxy-trans-stilbene in three leukemia cell lines, Oncol.Reports, 2006, 16, 617-624 38 LESTER PACKER, Methods in enzymology, Academic Press, 1999, volume 310, 489-503 39 LUCIA PANZELLA, MARIA DE LUCIA, CARMINE AMALFITANO, ALESSANDRO PEZZELLA,ANTONIO EVIDENTE, ALESSANDRA NAPOLITANO, AND MARCO D’ISCHIA, Acid-Promoted Reaction of the Stilbene Antioxidant Resveratrol with Nitrite Ions: Mild Phenolic Oxidation at the 4/-Hydroxystiryl Sector Triggering Nitration, Dimerization, and Aldehyde-Forming Routes, J Org.Chem, 2006, 71, 4246-4254 40 K.T PAPAZISIS, G.D GEROMICHALOS, K.A DIMITRIADIS, A.H KORTSARIS, Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay, J Immunol Methods, 1997, 208, 151–158 41 ZHIBY PAUL, NANJOO SUH, XINGPEI HAO, BARBARA SIMI, HANG XIAO, AGNESM RIMANDO, AND BANDARU S Pterostilbene, an Active Constituent of Blueberries, Suppresses Aberrant Crypt Foci Formation in the Azoxymethane-Induced Colon Carcinogenesis Model in Rats, Cancer Res., 2007, 13, (1), 350-355 42 JAN POKORNY, Application of phenolic antioxidants in food products, EJEAFChe, 2008, 7, 3320-3324 43 V PONT AND R PEZET, Relation Between the Chemical Structure and the Biological Activity of Hydroxystilbenes Against Botrytis cinerea, J phytopath, 1990, 130, 1-8 44 RALF PÖRTNER, Ani.Cell Biotech: Methods and Protocols, Second Edition, 2007, 222-239 45 SOARES.R, COSTA.C, Oxidative Stress, Inflammation and Angiogenesis in the Metabolic Syndrome, Springer Sci, 2009, 21-55 46 VIJAYALAXMI RADKAR, DIANE HARDEJ, CESAR LAU-CAM, AND BLASE BILLACK, Evaluation of resveratrol and piceatannol Cytotoxicity in macrophages, T cells, and Skin cells, Arh Hig Rada Toksikol, 2007, 58, 293-304 47 AGNES M RIMANDO, WILHELMINA KALT, JAMES B MAGEE, JIM DEWEY, JAMES R BALLINGTON, Resveratrol, Pterostilbene, and Piceatannol in Vaccinium Berries, J Agric Food Chem, 2004, 52, 4713 – 4719 48 BHARAT B AGGARWAL SHISHIR SHISHODIA, Resveratrol in Health and Disease, CRC Press Taylor & Francis, 2006, 1-27 49 PAOLA SIGNORELLI, RICCARDO GHIDONI, Resveratrol as an anticancer nutrient: molecular basis, open questions and promises, J.Nut.Biochem, 2005, 16, 449–466 50 DANIELE SIMONI, MARINELLA ROBERTI, FRANCESCO PAOLO INVIDIATA, ENRICO AIELLO, STEFANIA AIELLO, PAOLO MARCHETTI, RICCARDO BARUCHELLO, MARCO ELEOPRA, ANTONIETTA DI CRISTINA, STEFANIA GRIMAUDO, NICOLA GEBBIA, LUCIA CROSTA, FRANCESCO DIELIG AND MANLIO TOLOMEO Stilbene-based anticancer agents: Resveratrol analogues active toward HL60 leukemic cells with a non-specific phase mechanism Bioor.Med.Chem.Letters, 2006, 16, 3245–3248 51 JAMES SWARBRICK, Encyclo.Pharm.Tech, Informa Healthcare USA, Inc, third edition, 2007, 1, 152-154 52 RAHMAN.A.U, Studies in Natural products chemistry, Elsevier Sci.BV, first edition, 1994, 17, 331-357 53 RANMAN.A.U, Studies in natural product chemistry-structure, Elsevier Sci.BV, 1998, 20, 149-183 54 PRAJAKTA DESAI.V, RAJU WADEKAR R, GIRISH KENDAR H, KALPANA PATIL S, Free radical scavenging activity of aqueous extract of roots of Baliospermum montanum Muell-Arg, Int J Green Pharm, 2008, 2, 31-33 55 WILFRED VERMERRIS, RALPH NICHOLSON, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, 2006, Chapter 7, 235 – 252 56 M V VESELOVA, S A FEDOREEV, N A VASILEVSKAYA, V A DENISENKO, AND A V GERASIMENKO, Antioxidant activity of polyphenols from the far-east plant taxus cuspidate, Pharm.Chem.J, 2007, 41, 29-43 57 WIELAND VOIGT, Methods in Molecular Medicine, Humana Press Inc, 110, 39-48 58 ELISABETH WENZEL AND VERONIKA SOMOZA, Metabolism and bioavailability of trans-resveratrol, Mol Nutr Food Res, 2005, 49, 472 – 481 ... tế bào dung dịch trypsin 2% 12 3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu phát triển tế bào Nghiên cứu phát triển tế bào dựa phƣơng pháp đếm tế bào sinh tế bào. .. vitamin C hợp chất có thực phẩm, rau nhƣ hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Ni cấy tế bào Dịng tế bào ung... vitamin C hợp chất có thực phẩm, rau nhƣ hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Ni cấy tế bào Dịng tế bào ung