Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thu của dịch chiết cây bảy lá một hoa (paris polyhylla var; chinensis) thu thập tại nghệ an

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH DƯƠNG THỊ HỒNG CƠNG THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris Polyphylla Var Chinensis) THU THẬP TẠI NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHỆ AN - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH DƯƠNG THỊ HỒNG CƠNG THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris Polyphylla Var Chinensis) THU THẬP TẠI NGHỆ AN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS BS NGUYỄN QUANG TRUNG TS NGUYỄN THỊ GIANG AN NGHỆ AN - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài luận văn này, bên cạnh trình học tập, nghiên cứu, tìm tịi thân, tơi nhận quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn tận tình đầy trách nhiệm Giảng viên-Tiến sĩ Nguyễn Thị Giang An với Tiến sĩ – Bác sĩ Nguyễn Quang Trung Qua xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô thầy Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Trung tâm Thực hành-Thí nghiệm, Thư viện trường Đại học Vinh; phịng Sinh học thực nghiệm- Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Khoa Giải phẫu bệnh – bệnh viện Ung bướu Nghệ An tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tôi vô biết ơn thầy, cô ngành Sinh học Viện Sư phạm Tự nhiên phòng Đào tạo trường Đại học Vinh dạy dỗ thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln bên động viên, ủng hộ tơi lúc khó khăn Tôi xin chân thành cảm ơn! Nghệ An, tháng năm 2019 Học viên Dương Thị Hồng Công MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY BẢY LÁ MỘT HOA 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Đặc điểm 1.1.4 Thành phần hóa học Bảy hoa 1.1.5 Tác dụng dược lý công dụng Bảy hoa 1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ 1.2.1 Ung thư 1.2.2 Các giai đoạn phát triển ung thư 11 1.2.3 Các đặc tính tế bào ung thư 12 1.2.4 Các đặc tính phát triển ni cấy tế bào tế bào ung thư 13 1.2.5 Kháng tế bào ung thư 14 1.3 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ ĐỘC CHẤT HỌC 15 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 16 1.4.1 Trong nước 16 1.4.2 Thế giới 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ĐỐI TƯỢNG 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Tế bào thử nghiệm 22 2.1.3 Động vật 23 2.1.4 Hóa chất 23 2.1.5 Thiết bị dụng cụ 23 2.1.6 Địa điểm nghiên cứu 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Thu hái mẫu 24 2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần chiết phân đoạn Bảy hoa 24 2.2.3 Khảo sát diện nhóm hợp chất saponin thân rễ Bảy hoa 27 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu độc cấp bán trường diễn Bảy hoa 28 2.2.5 Nuôi cấy tế bào 32 2.2.6 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 CHIẾT DỊCH CHIẾT CỦ BẢY LÁ MỘT HOA 35 3.1.1 Chiết dịch tổng số 35 3.1.2 Chiết phân đoạn Bảy hoa 36 3.2 ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG DỊCH CHIẾT BẢY LÁ MỘT HOA 36 3.3 NGHIÊN CỨU ĐỘC CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA DỊCH CHIẾT BẢY LÁ MỘT HOA 37 3.3.1 Nghiên cứu độc tính cấp dịch chiết Bảy hoa 37 3.3.2 Nghiên cứu độc cấp bán trường diễn dịch chiết Bảy hoa 40 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA DỊCH CHIẾT CỦ BẢY LÁ MỘT HOA 48 3.4.1 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư vú (MCF7) dịch chiết củ Bảy hoa 48 3.4.2 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư gan (HepG2) dịch chiết củ Bảy hoa 53 3.4.3 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) dịch chiết củ Bảy hoa 58 3.4.4 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư ruột kết (HT-29) dịch chiết củ Bảy hoa 63 3.5 BÀN LUẬN 68 3.5.1 Đối tượng nghiên cứu 68 3.5.2 Mơ hình nghiên cứu 69 3.5.3 Kết nghiên cứu 70 3.5.4 Hạn chế nghiên cứu 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 I KẾT LUẬN 75 II KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết Tên đầy đủ tắt ALT Men gan Alanin Amino Transferase AST Men gan Aspartate Amino Transferase BLMH Bảy hoa DMSO Dimethyl sulfoxit ED50 Liều có hiệu với 50% động vật thí nghiệm ETE Ether dầu hỏa FBS Huyết thai bò HCV Virus viêm gan C HCT Hematocrit IC50 Liều ức chế 50% động vật thí nghiệm LD Liều gây chết MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Lượng sắc tố trung bình hồng cầu MCHV Nồng độ huyết sắc tố trung bình thể tích máu MTT 3[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom NK Natural killer cell OD Mật độ quang PPC Paris polyphylla var chinensis PPY Paris polyphylla var yunnanensis, PVI Paris saponin VI PVII Paris saponin VII SRB Sulforhodamine TDH Liều gây độc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Liều uống cách pha mẫu thử Bảy hoa thử độc cấp 29 Bảng 2.2: Liều uống cách pha mẫu thử bảy hoa cho thử độc cấp bán trường diễn 31 Bảng 3.1: Khối lượng dịch tổng số thu sau chiết dung môi ethanol 35 Bảng 3.2: Kết chiết phân đoạn dịch chiết củ Bảy hoa 36 Bảng 3.3: Kết thử độc tính cấp dịch chiết bảy hoa mơ hình cht thí nghiệm 37 Bảng 3.4: Kết theo dõi khối lượng chuột lô 39 Bảng 3.5: Sự thay đổi trọng lượng chuột thí nghiệm cho uống BLMH (gram/con) 41 Bảng 3.6: Các tiêu huyết học cho chuột uống BLMH 42 Bảng 3.7: Một số tiêu hóa sinh cho chuột uống BLMH 44 Bảng 3.8: Kết quan sát hỉnh ảnh trọng lượng gan chuột sau nghiệm uống BLMH 46 Bảng 3.9: Kết mổ giải phẫu thận chuột sau nghiệm uống BLMH 47 Bảng 3.10: Kết mổ giải phẫu lách chuột sau nghiệm uống BLMH 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các phận sinh dưỡng sinh sản Bảy hoa – Paris polyphylla var chinenis Hình 1.2: Biểu đồ số ca mắc ung thư Việt Nam năm 2018 10 Hình 2.1: Bảy hoa đỉnh núi Fu Xai Lai Leng (xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An) 22 Hình 2.2: Máy cô quay chân không 26 Hình 2.3: Sơ đồ chiết cao tổng chiết phân đoạn Bảy hoa 27 Hình 2.4: A: Lồng nuôi cho lô chuột thử nghiệm B: Cho chuột uống thuốc kim đầu tròn 31 Hình 2.5: Phần mềm máy tính Table-Cuver 2D Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Củ Bảy hoa 35 Hình 3.2: Bột Bảy hoa 35 Hình 3.3: Thử phản ứng định tính saponin dịch chiết 36 Hình 3.4: Các lơ chuột (1-6) sau uống dịch chiết Bảy hoa lô 7- lô ĐC 38 Hình 3.5: Các lơ chuột thử nghiệm bình thường, hoạt động nhanh nhẹn 40 Hình 3.6: Sự thay đổi trọng lượng chuột thí nghiệm cho uống BLMH (gram/con) 41 Hình 3.7: Biểu đồ biểu diễn thay đổi số số sinh máu chuột uống BLMH liều lượng khác 43 Hình 3.8: Một số tiêu hóa sinh cho chuột uống BLMH 44 Hình 3.9: Hình ảnh giải phẫu đại thể gan chuột uống BLMH 45 Hình 3.10: Hình ảnh vi thể gan chuột uống BLMH 45 Hình 3.11: Hỉnh ảnh giải phẫu đại thể vi thể thận chuột sau thí nghiệm 46 Hình 3.12: Hỉnh ảnh giải phẫu đại thể vi thể lách chuột sau thí nghiệm 48 Hình 3.13: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) cao toàn phần 48 Hình 3.14: Hình ảnh tế bào ung thư vú (MCF7 ) bị ức chế cao toàn phần 49 Hình 3.15: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) cao phân đoạn butanol 49 Hình 3.16: Hình ảnh tế bào ung thư vú (MCF7 ) bị ức chế cao butanol 50 Hình 3.17: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) cao phân đoạn etyl axetat 50 Hình 3.18: Hình ảnh tế bào ung thư vú (MCF7 ) bị ức chế cao etyl axetat 51 Hình 3.19: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) cao phân đoạn ETE 52 Hình 3.20: Hình ảnh tế bào ung thư vú (MCF7 ) bị ức chế cao ETE 51 Hình 3.21: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) cao phân đoạn cặn nước 53 Hình 3.22: Hình ảnh tế bào ung thư vú (MCF7 ) bị ức chế cao cặn nước 53 Hình 3.23: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) cao tồn phần 53 Hình 3.24: Hình ảnh tế bào ung thư gan (HepG2) bị ức chế cao tồn phần 54 Hình 3.25: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) cao phân đoạn butanol 54 Hình 3.26: Hình ảnh tế bào ung thư gan (HepG2) bị ức chế cao butanol 55 Hình 3.27: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) cao phân đoạn etyl axetat 55 Hình 3.28: Hình ảnh tế bào ung thư gan (HepG2) bị ức chế cao etyl axetat 56 Hình 3.29: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) cao phân đoạn ETE 56 Hình 3.30: Hình ảnh tế bào ung thư gan (HepG2) bị ức chế cao ETE 57 Hình 3.31: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2)của cao phân đoạn cặn nước 57 Hình 3.32: Hình ảnh tế bào ung thư gan (HepG2) bị ức chế cặn nước 58 Hình 3.33: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) cao toàn phần 58 Hình 3.34: Hình ảnh tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) bị ức chế cao toàn phần 59 Hình 3.35: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) cao phân đoạn butanol 59 Hình 3.36: Hình ảnh tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) bị ức chế cao butanol 60 Hình 3.37: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) cao phân đoạn etyl axetat 60 Hình 3.38: Hình ảnh tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) bị ức chế cao etyl axetat 61 Hình 3.39: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (SK-LU-1)của cao phân đoạn ETE61 66 A Nồng độ cao 100 µg/ml B Nồng độ cao 20 µg/ml C Nồng độ cao 0,8 µg/ml Hình 3.47: Hình ảnh tế bào ung thư ruột kết (HT-29) bị ức chế cao etyl axetat Kết hình 3.46 3.47 cho thấy, hoạt tính ức chế tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao etyl axetat tốt với giá trị IC50 = 7,62 μg/ml Phần trăm tế bào ung thư bị ức chế phụ thuộc vào nồng độ cao chiết thể sau: - Ở nồng độ 0,8 (µg/ml), cao chiết ức chế 4,17 % tế bào ung thư - Ở nồng độ (µg/ml) cao chiết ức chế 8,29 % tế bào ung thư - Ở nồng độ 20 (µg/ml) 100 (µg/ml) ức chế 100 % tế bào ung thư Khơng có tế bào ung thư sống sót 3.4.4.4 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao phân đoạn ETE Hình 3.48: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao phân đoạn ETE 67 A Nồng độ cao 100µg/ml B Nồng độ cao 20 µg/ml C Nồng độ cao 4µg/ml Hình 3.49: Hình ảnh tế bào ung thư ruột kết (HT-29 ) bị ức chế cao ETE Kết hình 3.48 3.49 cho thấy, khả ức chế tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao ETE là: - Ở nồng độ (µg/ml), 20 (µg/ml) cao chiết ETE ức chế 5,86 %; 19,72 % tế bào ung thư Ở nồng độ 100 (µg/ml) cao chiết ức chế 26,47 % tế bào ung thư, thấp nhiều so với đối chứng (99,12 %) Tiến hành đếm mật độ tế bào ung thư nồng độ thí nghiệm thấy bị giảm không đáng kể - Chỉ số IC50 cao chiết ETE >100 (µg/ml) IC50 Elipticine 0,39 (µg/ml) Cao chiết ETE khơng xem có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư ruột kết (HT-29) 3.4.4.5 Đánh giá khả kháng tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao phân đoạn cặn nước Hình 3.50: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư ruột kết (HT-29) cao phân đoạn cặn nước 68 A Nồng độ cao 100 µg/ml B Nồng độ cao 20 µg/ml C Nồng độ cao 0,8 µg/ml Hình 3.51 Hình ảnh tế bào ung thư ruột kết (HT-29 ) bị ức chế cao cặn nước Kết hình 3.50 3.51 cho thấy cao chiết cặn nước không xem có hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư ruột kết (HT-29) thể sau: - Ở nồng độ (µg/ml), 20 (µg/ml), 100 (µg/ml) cao chiết cặn nước ức chế 3,73 %; 8,79 %, 38,45 % tế bào ung thư, thấp nhiều so với đối chứng - Kết đếm mật độ tế bào ung thư nồng độ thí nghiệm thấy bị giảm khơng đáng kể 3.5 BÀN LUẬN 3.5.1 Đối tượng nghiên cứu Paris polyphylla var chinenses (Bảy hoa) loài thân thảo, sống lâu năm, ưu bóng, phân bố Nghệ An, Lào Cai, Yên Bái nước ta số vùng núi Trung Quốc, Ne Pan, Mianma, Ấn Độ Trong dân gian, Bảy hoa loài thuốc dùng để chữa rắn cắn, trị ung nhọt, sưng đau, viêm mủ da hen suyễn Theo Đỗ Tất Lợi thuốc vị thuốc Việt Nam, Bảy hoa liệt kê với nhiều tác dụng kháng khuẩn trực khuẩn lỵ, trực khuẩn coli, liên cầu khuẩn, kháng virut cúm Ngồi cịn có khả chống co thắt, trừ đờm giảm ho, trấn tĩnh giảm đau, chống viêm cầm máu, làm giảm mỡ máu… Bảy hoa chứng minh có thành phần hóa học flavonol số glycosid, saponin chiếm thành phần với nhiều loại: saponin 69 spirostan, saponin furostan, saponin pseudo-spirostanol, pregnan, saponin triterpenoid…giữ hoạt tính sinh học cao [21] [43] [44] [46] Ở nước ngồi có cơng trình nghiên cứu Lin-Lin Gao, HaoJang, Li Fu Rong, Jiao Peng [43][46][48] nhiều nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh công dụng Bảy hoa đặc biệt hoạt tính kháng tế bào ung thư Tuy nhiên, cơng trình nước nghiên cứu hoạt tính sinh học thuốc cịn hạn hẹp, có nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng giải độc gan Phạm Nguyễn Duy Bình [2], thử hoạt tính kháng tế bào ung Nguyễn Thị Duyên Bảy hoa thu hái Lào Cai [5] Nghiên cứu với mục tiêu khảo sát khả ức chế tế bào ung thư Bảy hoa thu hái Nghệ An - nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt, dược liệu tự nhiên thu hái đánh giá mang nhiều hoạt tính sinh học mạnh 3.5.2 Mơ hình nghiên cứu Để chứng minh hoạt tính sinh học Bảy hoa thu hái Nghệ An hướng tới bệnh nhân ung thư Bước loại cao chiết BLMH thử độc tính cấp độc bán trường diễn động vật thí nghiệm để chứng minh tính an tồn Sau đó, xác định khả kháng tế bào ung thư dịch chiết Bảy hoa dòng tế bào tế bào ung thư vú (MCF7), ung thư phổi SK-LU-1, ung thư ruột kết HT-29, ung thư gan HepG2 Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) cung cấp Phép thử thực theo phương pháp Monks (1991) cách tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein Do số lượng tế bào nhiều (lượng protein cao) giá trị mật độ OD lớn Phép thử thực lần để lấy giá trị OD, sau lấy giá trị trung bình Để có kết luận kết nghiên cứu Ellipticine sử dụng để làm đối chứng dương với nồng độ 10, 2, 0,4 , 0,08 μg/ml Ellipticine chất tinh khiết có khả ức chế tế bào ung thư tốt chứng minh qua nghiên cứu thăm dị Bên cạnh tế bào nuôi môi trường DMSO 10% xem đối chứng âm 70 3.5.3 Kết nghiên cứu 3.5.3.1 Kết thử nghiệm độc cấp Kết bảng 3.3 cho thấy chuột tất lô thử nghiệm uống cao chiết liều 3000 mg/kg trọng lượng thể đến 5500 mg/kg trọng lượng thể có biểu chức bình thường Như vậy, cao chiết Bảy hoa khơng thể độ độc cấp tính liều nghiên cứu chưa xác định LD50 Theo phân loại chất độc theo đường uống tổ chức WHO (WorldHealth Organization, 1993), Tổ chức Hợp tác Phát triển kinh tế giới (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) mẫu thử nghiệm không gây độc liều tối đa, không xác định giá trị LD50 có giá trị LD50> 5000 mg/kg thể trọng theo đường uống coi khơng độc khơng phân loại Vì vậy, dựa kết thu thử nghiệm kết luận cao chiết Bảy hoa thuộc nhóm không gây độc đường uống 3.5.3.2 Kết thử nghiệm độc bán trường diễn Kết theo dõi biểu bên ngồi hình 3.5 tăng trọng lượng chuột bảng 3.5 cho thấy biểu chức năng, trọng lượng chuột lơ thí nghiệm so với lơ đối chứng khơng có bất thường, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p> 0,05 Điều cho thấy cao chiết Bảy hoa không gây độc cấp bán trường diễn cho chuột Phân tích kết huyết học chuột uống cao chiết Bảy hoa bảng 3.6 cho thấy, số huyết học chuột sau uống BLMH không thay đổi đáng kể với lô đối chứng Riêng số bạch cầu động vật thí nghiệm khơng thay đổi đáng kể sau uống BLMH liều 500 mg/kg/ngày (p>0,05) Tuy nhiên nồng độ 1000 mg/kg/ngày 2000 mg/kg/ngày cho chuột uống thời gian 60 ngày làm tăng số bạch cầu thể chuột (p0,05) Ở liều 2000 mg/kg/ngày thời gian 60 ngày làm giảm số AST ALT gan so với lô đối chứng (p 100 µg/ml Trên giếng ni cấy bốn dịng tế bào ung thư thử nghiệm với hai loại dịch chiết này, thấy mật độ tế bào ung thư bị giảm không đáng kể tất nồng độ Chứng tỏ hai phân đoạn khơng có hoạt tính ức chế tế bào ung thư Hai phân đoạn ETE (chiết với dung môi không phân cực) cặn nước (chiết với dung mơi phân cực mạnh) khơng hịa tan hợp chất phân cực nhẹ saponin Bên cạnh cặn nước cịn chứa phần lớn cặn xenlulozo Cụ thể saponin khơng có hai phân đoạn Kết từ hình 3.15; 3.25; 3.35; 3.45 cho thấy khả kháng tế bào ung thư phân đoạn butanol mức tương số IC50 = 15,14 - 20,23 µg/ml Trên hình ảnh tiêu quan sát được, tế bào ung thư bị giảm mật độ rõ rệt nồng độ 100 µg/ml Các nồng độ thấp mật độ tế bào ung thư bị giảm ít, khơng đáng kể Điều lí giải sau: n-butanol chất phân cực nên số saponin phân cực hòa tan nó, hàm lượng saponin phân đoạn chiết mức vừa phải 73 Từ bảng 3.17, 3.27, 3.37, 3.47 cho kết dịch chiết phân đoạn etyl axetat có khả ức chế tế bào ung thư cao cao nhiều so với cao toàn phần phân đoạn dịch chiết khác với số IC50 = 7.62 -7.86 µg/ml dòng tế bào ung thư thử nghiệm Mật độ tế bào ung thư nuôi cấy với dịch chiết giếng giảm rõ rệt nồng độ 100 µg/ml 20 µg/ml Có thể giải thích kết sau: etyl axetat chất phân cực nhẹ - dung mơi tốt để hịa tan chất phân cực nhẹ saponin Nên hàm lượng saponin phân đoạn lớn nhiều so với phân đoạn khác Nghiên cứu Nguyễn Thị Duyên thành phần hóa học Bảy hoa kết phân lập cho thấy có mặt hơp chất saponin phần lớn phân đoạn cao chiết etyl axetat cao chiết butanol [5] Điều phù hợp với kết phân đoạn etyl axetat phân đoạn butanol thể tác dụng chống tế bào ung thư rõ Trong đề tài thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư dịch chiết phân đoạn Bảy hoa thu hái Sa Pa ( Lào Cai) Nguyễn Thị Duyên cho thấy: dịch chiết phân đoạn etyl axetat butanol có hoạt tính cao với số IC50 = 6,42 – 11,92 µg/ml [5] Tuy nhiên tác giả thử nghiệm dịng tế bào ung thư khác nên so sánh sát hoạt tính kháng tế bào ung thư Bảy hoa thu hái Lào Cai Nghệ An Qua kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết bốn dòng tế bào ung thư kết luận dịch chiết etyl axetat có hoạt tính mạnh đặc biệt ức chế ung thư ruột kết (HT-29) với IC50 = 7,62 μg/ml Khẳng định rằng, phân đoạn dịch chiết etyl axetat đối tượng chữa ung thư tiềm Có thể tiến hành thử nghiệm phân đoạn tế bào ung thư ruột kết (HT-29) môi trường in vivo để xác định rõ định hướng ứng dụng Mặt khác, theo Yoshihiro Mimaki cao chiết metanol phần thân rễ Paris polyphylla var chinensis ức chế 99% tăng sinh tế bào ung thư HL-60 mức liều 10 µg/ml, IC50 = 3,3 µg/ml [42], hoạt tính cao nhiều so với phân đoạn etyl axetat mà chiết Vì vậy, nên tiến hành chiết thêm phân đoạn methanol cao BLMH thu hái Nghệ An khảo sát độc tế bào phân đoạn Lin-Lin Gao cộng phân lập dioscin- loại saponin từ Paris chinensis Kết nghiên cứu hợp chất ức chế tăng trưởng dòng tế bào ung 74 thư buồng trứng SKOV3 ung thư dày SGC-7901 tốt [30] Năm 2015, Hao Jiang cộng nghiên cứu tác dụng chống ung thư phổi Paris saponin I từ Paris polyphylla Smith var chinensis (Franch) Hara Paris polyphylla Smith var yunnanensis (Franch) Hand-Mazz Kết cho thấy paris saponin I ức chế dòng tế bào ung thư phổi kháng gefitinib PC-9-ZD in vitro [33] Từ khẳng định BLMH có khả gây độc tới nhiều dòng tế bào ung thư khác Nên tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư BLMH thu hái Nghệ An nhiều dòng tế bào ung thư để làm sáng tỏ hoạt tính sinh học thuốc 3.5.4 Hạn chế nghiên cứu Nghiên cứu khảo sát cao toàn phần phân đoạn ETE, butanol, etyl axetat, cặn nước Còn phân đoạn khác methanol hợp chất tinh khiết chưa phân tách để thử nghiệm rõ Nghiên cứu tiến hành dòng tế bào ung thư: ung thư vú (MCF7), ung thư phổi SK-LU-1, ung thư ruột kết HT-29, ung thư gan HepG2 Cần phải thử nghiệm nhiều dòng tế bào ung thư khác để làm sáng tỏ khả ức chế tế bào ung thư Bảy hoa Rõ ràng nghiên cứu ban đầu, cho thấy tiềm tác dụng chống tế bào ung thư Bảy hoa Việc tiếp tục đánh giá tác dụng chống tế bào ung thư Bảy hoa phải tiến hành invivo cần thiết để có lựa chọn đắn định hướng ứng dụng chống tế bào ung thư loài 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thực đề tài “Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư dịch chiết bảy hoa – paris polyphylla var Chinensis thu thập Nghệ An” thu kết sau: Từ củ Bảy hoa, phương pháp chiết ethanol thu 105g cao tổng với hiệu suất chiết 13,125% Trong dung môi khác thu g cao ETE, 24 g cao etyl axetat, 19 g cao butanol 60 g cặn Đã tiến hành thử nghiệm độc cấp thử nghiệm độc bán trường diễn dịch chiết Bảy hoa chuột nhắt trắng BALB/c, kết cho thấy cao cồn Bảy hoa không gây độc chuột thí nghiệm Thử nghiệm dịch chiết tồn phần dịch chiết phân đoạn dịng tế bào ung thư ung thư gan (HepG-2), ung thư phổi (SK-LU-1), ung thư vú (MCF7), ung thư ruột kết (HT- 29, cho thấy: Phân đoạn cao etyl axetat thể hoạt tính gây độc mạnh bốn dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 = 7,62 – 7,87 µg/ml với tỷ lệ ức chế tế bào ung thư từ 90, 51-100% nồng độ 20% µg/ml Phân đoạn dịch chiết butanol thể hoạt tính ức chế với số IC50 = 15,29 – 20,23 μg/ml, với tỷ lệ ức chế tế bào ung thư từ 51,77- 65,18% nồng độ 20% µg/ml Phân đoạn ETE cặn nước khơng thể hoạt tính mẫu nghiên cứu Phân đoạn dịch chiết cao toàn phần có hoạt tính kháng tế bào ung thư thấp với số IC50 là: 57,74 - 66,42 μg/ml B KIẾN NGHỊ Với thời gian hạn chế, đề tài đạt số kết Nếu đề tài tiếp tục, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Phân lập hợp chất saponin tinh khiết thân rễ Bảy hoa để thử nghiệm khả kháng tế bào ung thư hợp chất saponin tinh khiết - Thử nghiệm đặc tính kháng ung thư động vật thí nghiệm để khẳng định chắn hoạt tính thể động vật toàn vẹn 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 10 11 12 13 Đỗ Huy Bích, Đỗ Quang Cường, Bùi Xuân Cương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ trung Đàm (2006), Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật Phạm Nguyễn Duy Bình (2016), “Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Tác Dụng Dược Lý Cây Bảy Lá Một Hoa Thu Thập Tại Nghệ An”, Trường Đại học Vinh Võ Văn Chi (2012), Từ Điển Cây Thuốc Việt Nam - Tập 1, NXB Y học Nguyễn Thượng Dong (2006), Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Dược Lý Của Thuốc Từ Dược Thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Thu, Phạm Quốc Long (2016), “Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Phần Trên Mặt Đất Bảy Lá Một Hoa”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, 472-478 Đỗ Trung Đàm (1996), Phương Pháp Nghiên Cứu Độc Cấp Tính Cây Thuốc, NXB- Y học Đỗ Trung Đàm (2001), “Phương Pháp Ngoại Suy Liều Có Hiệu Quả Tương Đương Giữa Người Và Động Vật Thí Nghiệm”, Tạp chí dược học Nguyễn Thị Đỏ (2007), Thực Vật Chí Việt Nam 8, NXB Khoa học kĩ thuật Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Phùng Trung Hùng, Phạm Thiên Tánh, Nguyễn Phước Long (2012), “Apoptosis - chết tế bào” Trần Hùng, Ngô Vân Thu (2011), Dược Liệu Học - Tập 1, NXB Y học Hà Nội Nguyễn Chân Hùng (2004), Ung bướu học nội khoa, NXB Y học Từ Minh Koóng, (2007), Kỹ Thuật Chiết Xuất Dược Liệu – Tập 1, NXBY học 14 Nguyễn Minh Khởi, Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Quỳnh Nga, Nguyễn Xuân Trường, Phạm Ngọc Khánh, Trương Quang Lực (2017), Kết nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thuốc Việt Nam giai đoạn 2011 – 2016, Viện Dược liệu - Bộ Y tế 15 Đỗ Tất Lợi (2015), Những Cây Thuốc Và Vị Thuốc Việt Nam, NXBHồng Đức 77 16 17 18 19 20 Nguyễn Quỳnh Nga, Nguyễn Văn Khiêm (2015), “Nghiên Cứu Phân Loại Một Số Loài Thuộc Chi Paris Ở Việt Nam Sử Dụng Đặc Điểm Hình Thái, Chỉ Thi Pcr-Pelp”, Đề tài cấp sở viện Dược liệu Nguyễn Thị Thu (2017), “Khai Thác Và Phát Triển Nguồn Gen Bảy Lá Một Hoa (Paris Chinensis Franch.) Và Huyết Rồng Lào (Spatholobus Suberectus Dunn.) Làm Nguyên Liệu Sản Xuất Thuốc”, Bộ Khoa học Công nghệ Cao Ngọc Minh Trang (2015), Giáo Trình Độc Chất Học, ĐH Văn Lang Châu Thị Nhã Trúc, Lâm Bích Thảo, Trần Lê Quan, Trần Cơng Luận (2015), “Phân Lập Một Số Steroid Từ Lồi Bảy Lá Một Hoa Thu Hái Tại Kontum”, Tạp chí Dược liệu, tập 20, 82-86 Viện Dược liệu (2015), “Nghiên Cứu Phân Loại Một Số Loài Thuộc Chi Paris (Họ Trilliaceae) Ở Việt Nam Sử Dụng Đặc Điểm Hình Thái Và Chỉ Th”, Báo cáo tổng kết đề tài sở, 41-43 Tài liệu tiếng Anh 21 22 23 24 25 26 Chen C.X, Zhang Y.T, and Zhou J (1983), “Studies on the Saponin Components of Plants in Yunnan Vi Steroid Glycosides of Paris Polyphylla Sm Var Yunnanensis”, Acta Bot Yunnan, 5, 91 - 97 Chen G.L, Hou G L (2013), “Effect of Paris Saponin on Antitumor and Immune Function in U14 Tumor-Bearing Mice”, African Journal and Traditional, Complementary and Aternative Medicines, 10, 503-507 Chia-Woei Wang, Cheng-Jeng Tai, Chen-Yen Choong, Yu-Chun Lin, Bao-Hong Lee, Yeu-Ching Shi, and Chen-Jei Tai (2016), “Aqueous Extract of Paris Polyphylla (Aepp) Inhibits Ovarian Cancer Via Suppression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma Coactivator (Pgc)-1alpha”, Molecules Darnell J., Losdish H., and Baltimore D (1990), Molecular Cell Biology, Scientific American Books, 954-1002 Deng Dawei, Lauren Denis R, and Cooney Janine M (2008), “Antifungal Saponins from Paris Polyphylla Smith”, Planta medica, 74 Devkota Krishna P, Khan M Tareq H, and Ranjit Rosa (2007), “Tyrosinase Inhibitory and Antileishmanial Constituents from the Rhizomes of Paris Polyphylla”, Natural product research, 21(4), 321-327 78 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Dutt A T, Chatterjee N R, Ghpsh S, and Chopra R N (1938), “Chemische Untersuchung Der Wurzwln Von Paris Polyphylla”, Teil Arch Pharm, 343-345 Feiyan Wen, Tiezhu Chen, Hoongxiang Yin, Juan Lin, and Hao Zhang (2019), “In Vitro Effects on Thrombin of Paris Saponins and in Vitro Hemostatic Activity Evaluation of Paris Fargesii Var Brevipetala” Flora of China (2000), “Paris Linnaeus Sp”, 24, 89-90 Gajdus, Kaczynski Z, and Kawiak A (2014), “Isolation and Identification of Cytotoxic Compounds from the Rhizomes of Paris Quadrifolia L.”, Pharmacogn Mag, 10(2), 324-33 Gao Lin Lin, Li Fu Rong, and Fio Peng (2011), “Apoptosis of Human Ovarian Cancer Cells Induced by Paris Chinensis Dioscin Via a Ca2+ Mediated Mitochondrion Pathway”, Asian Pac J Cancer Prev, 12(5), 1361 Guo L, Su J, and Deng B W (2008), “Active Pharmaceutical Ingredients and Mechanisms Underlying Phasic Myometrial Contractions Stimulated with the Saponin Extract from Paris Polyphylla Sm Vả Yunnanensis Used for Abnormal Uterine Bleeding”, Human Reproduction,23(4), 964971 Huang Y, Wang Q, and Ye W C (2005), “A New Homo-Cholestane Glycoside from Paris Polyphylla Var Chinensis”, Chin J Nat Med, (2), 138-140 Ivan Damjanov (1996), “Pathology for the Health Related Professions”, by WB Saunder companny Jiang H, Zhao P, Feng J, Su D, and Ma S (2014), “Effect of Paris Saponin I on Radio Sensitivity in a Gefitinib-Resistant Lung Adenocarcinoma Cell Line”, Oncol Lett Kim Ki Hyun, Lee Kyu Ha, and Kim Ho Kyung (2011), “Antineuroinflammatatory Constituents from the Root Extract of Paris Verticillata”, Canadian Journal of Chemistry, 89(4), 441-45 Li FR, Jiao P, Yao ST, Sang H, Qin SC, Zhang W, Zhang YB, and Gao LL (2012), “Paris Polyphylla Smith Extract Induces Apoptosis and Activates Cancer Suppressor Gene Connexin26 Expression”, Asian Pacific Journal of Caner Prevention, 13, 205-209 79 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 Li Fu Rong, Jiao Peng, and Yao Shu- Tong (2012), “Paris Polyphylla Smith Extract Induces Apoptosis and Activates Cancer Suppressor Gene Connexin 26 Expression”, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 13(1), 205-209 Liu Zhen, LiNan, and Gao Wenyuan (2012), “Comparative Study on Hemostatic, Cytotoxic and Hemolytic Activities of Diferent Species of Paris L”, Journal of ethnopharmacology, 142(3), 789-794 Li Xi, Wang Ji- Hong, and Xiao Ya – Xiong (2010), “Effect of Paridis Extract on Proliferation of Human Colon Cancer Sw 480 Cells and Mechanism of the Effect”, Chinese Journal of Biologicals, 6, 022 Man Shuli, Gao Wenyuan, and Zhang Yanjun (2009), “Antitumor and Antimetastatic Activies of Rhizoma Paridis Saponins”, Steroids, 74(13), 1051-1056 Markham K R, Ternai B, Stanley R, Geiger H, and Mabry T J (1978), “Carbon - 13 Nmr Stidies of Flavonoids - Iii: Naturally Occurring Flavonoid Glycosides and Their Acylated Derivatives”, Tetrahedron, 34, 1389-1392 Matsuda H, Pongpiriyadacha Y, and Morikawa T (2003), “Protective Effects of Steroid Saponins from Pari Polyphylla Var Yunnanensis on Etanol”, Bioorg Med Chem Lett, 13, 1101-1106 Nakano K, and Nohara R (1983), “18- Norspirostanol Derivatives from Trilliun Tschonoskii”, Phytochemistry, 22, 1047-48 Negi JS, Bisht VK, Bhandari AK, Bhatt VP, Singh P, and Singh N (2014), “Paris Polyphylla: Chemical and Biological Prospectives”, AntiCancer Agents in Medicinal Chemistry, 833-839 Qin Xu-Jie, Yu Mu-Yuan, Ni Wei, Yan Huan, Chen Chang- Xiang, Cheng Yung-Chi, Li He, and Liu Hai-Yang (2016), “Steroidal Saponins from Stems and Leaves of Paris Polyphylla Vả Yunnanensis”, Phytochemistry, 121, 20-29 Rebecca K.Y Lee, Tim T Kwok, Siu K Kong, Ming Li, Ho P Ho, Bao Yu, Kwok P Fung, Yick K Suen, Judy Y.W Chan, Macey M.S Lee, Yan C Li, Rose C.Y Ong, and Jenny Y.N Cheung (2009), “Polyphyllin D - a Potential Anti-Cancer Agent to Kill Hepatocarcinoma Cells with Multi-Drug Resistance”, Current Chemical Biology, 409-419 80 48 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Shen Shian, Chen Daju, and Li Xu (2014), “Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Leaves of Paris Polyphylla”, Carbohydrate polymers, 104, 80-86 Wang Ying, Hao Juan, and Gao Wenyuan (2013), “Stady on Hemostatic Activities of the Rhizome of Paris Bashanensis”, Pharmaceutical biology, 51(10), 1321-1325 Wenjie Zhang, Dian Zhang, Xi Ma, Zhaoyang Liu, Fang Li, and Dongna Wu (2014), “Paris Saponin Vii Suppressed the Growth of Human Cervical Cancer Hela Cells”, J Med Res Wen Yan-Shi, Ni Wei, Qin Xu-Jie, Yan Huan, ChenChang-Xiang, Hua Yan, Cheng Yung-Chi, He Li, and Liu Hai-Yang (2015), “Steroidal Saponins with Cytotoxic Activity from the Rhizomes of Paris Polyphylla Var Yunnanensis”, Phytochemistry, 12, 31-34 Yan L.L, Zhang Y.J, and Gao W Y (2009), “In Vitro and in Vivo Anticancer Activity of Steroid Saponins of polyphylla chinensis”, Exp Oncol, 31, 27-32 Yanting Qi, Xiaona Chen, Chu-yan Chan, Dan Li, Chonggang Yuan, Fei Yu, Marie C Lin, David T Yew, Hsiang-Fu Kung, and Lihui Lai (2008), “Two-Dimensional Differential Gel Electrophoresis/Analysis of Diethylnitrosamine Induced Rat Hepatocellular Carcinoma”, Int J Cancer Zhang LT, Zuo YT, and Gao WY (2007), “Anti-Tumor Effects of Extracts and Chemical Constituents from Paris Polyphylla Var Yunnanensis”, Chin Trad Herb Drugs Zhang Wenjie, Zhang Dian, and Ma Xi (2014), “Paris Saponin Vii Suppressed the Growth of Human Cervical Cancer Hela Cells”, European Journal of Medical Research, 19(1), 1-7 World Health Organization (2019), “Number of cancer cases in the wordin 2018” Zschech D, Waun Ki Hong,William N Hait (2013), “Cancer medicine”, Wiley Blackwell ... - Chiết dịch chiết phân tích số thành phần hóa học có Bảy hoa tỉnh Nghệ An - Thử nghiệm độc cấp tính dịch chiết Bảy hoa chuột - Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết Bảy hoa thu. .. DƯƠNG THỊ HỒNG CƠNG THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris Polyphylla Var Chinensis) THU THẬP TẠI NGHỆ AN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14... bào ung thư dịch chiết Bảy hoa – Paris polyphylla var Chinensis thu thập Nghệ An? ?? Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Thử nghiệm khả kháng số tế bào ung thư dịch chiết Bảy hoa thu hái Nghệ An