Nghiên cứu sử dụng protease để tách chiết và tinh sạch chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (dasiatis kuhlii)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA LÂM HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PROTEASE ĐỂ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH CHONDROITIN SULFATE TỪ XƢƠNG SỤN CÁ ĐUỐI (Dasiatis kuhlii) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 307 Giáo viên hướng dẫn : TS Võ Hoài Bắc ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm Sinh viên thực Khoá học : Lê Thị Tình : 2005 - 2009 Hà Nội – 2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có nguồn dƣợc liệu tự nhiên phong phú, dồi song việc sản xuất thuốc chữa bệnh nƣớc ta phần lớn lại nhập dƣợc liệu từ nƣớc ngoài, giá thành cao Ngoài việc cung cấp thực phẩm cho ngƣời, thuỷ sản nguồn dƣợc liệu tự nhiên quý, ví dụ nhƣ: iốt chống biếu cổ từ rong mơ, arginin chữa bệnh vô sinh nam từ tinh cá, vitamin A từ dầu cá, guanine từ vây cá Đặc biệt, nhiều dƣợc liệu quý đƣợc chiết xuất từ phế thải nhà máy chế biến thuỷ sản nhƣ glucosamin đƣợc chiết xuất từ vỏ tôm [18,22], chondroitin từ sụn cá mập [30] Vì vậy, việc điều tra nghiên cứu nguồn dƣợc liệu từ thủy sản cần thiết, nhằm tận dụng nguồn dƣợc liệu quý từ thủy sản, chủ động cung cấp nguồn nguyên liệu dƣợc, giảm giá thành nhập thuốc Điều đáng ý thủy sản thƣờng có hàm lƣợng glucozamin, chondroitin sulfate cao đối tƣợng nghiên cứu khác, chúng nguồn nguyên liệu đầy tiềm để sản xuất chế phẩm thuốc Chondroitin sulfate (CS) glycosaminoglycan sulfate, thành phần cấu tạo nên sụn khớp CS làm tăng khả sản xuất chất nhầy khả bôi trơn dịch khớp, đảm bảo chức dinh dƣỡng vận động linh hoạt khớp bao hoạt dịch Vì vậy, CS giúp giảm ngăn chặn trình thối hố khớp [7] CS cịn có vai trị bảo vệ sụn khớp ức chế enzyme phá huỷ sụn khớp nhƣ collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase [4] Hiện thuốc kết hợp CS glucosamin đƣợc sử dụng hiệu để điều trị bệnh viêm khớp Ngoài chất CS góp phần ni dƣỡng tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc Một tác dụng quan trọng khác CS khả ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển Nhiều nghiên cứu giới tách chiết CS từ số nguồn nguyên liệu nhƣ từ da cá Labeo rohita, sụn cá mực [39], sụn cá mập [25], sụn gà [17], sụn bò [24] Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ nguồn nguyên liệu khác đƣợc nhà nghiên cứu giới đặc biệt quan tâm nhằm hạ giá thành sản phẩm Do vậy, tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu sử dụng protease để tách chiết tinh chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasiatis kuhlii)” Đề tài chúng tơi nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dƣợc phẩm nƣớc nhà giai đoạn tới Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chondroitin sulfate (CS) 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc CS CS đƣợc tách lần Davidson Meyer CS glycosaminoglycan (GAG) đƣợc tìm thấy tự nhiên nhƣ polyme mạch thẳng (không phân nhánh) gồm đơn vị cấu tạo đƣờng (disaccharide) N-acetyl-D- galactosamin D-glucuronic acid xen kẽ (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid) [12] Ở thể ngƣời, CS thành phần tạo nên sụn khớp, có xƣơng, da, thể thuỷ tinh mắt, van tim thành động mạch Trọng lƣợng phân tử CS thƣờng khoảng 50.000 dalton [14] Kato (1994) Bernfield (1999) nhận thấy CS thƣờng gắn với protein liên kết o-glycosid tạo thành proteoglycan (PG), hợp chất hữu thuộc nhóm mucopolysaccharide [6] Chondroitin mô động vật polysaccharide mang điện tích âm (anionic polysaccharide) liên kết đồng hố trị với protein cấu tạo PG Chuỗi CS đƣợc gắn với nhóm OH gốc serine số protein Các protein gắn chọn lọc xác nhƣ với GAG chƣa đƣợc làm sáng tỏ Sự gắn kết chuỗi GAG bắt đầu với đƣờng đơn theo phƣơng thức cố định: Xyl-Gal-Gal-GlcA, xylose đƣợc gắn với protein mạng lƣới nội bào, phân tử đƣờng khác đƣợc gắn hệ Golgi [36] CS ƣa nƣớc hàm lƣợng nƣớc mơ sụn cao Các điều kiện thủy phân làm giảm trọng lƣợng phân tử trung bình sản phẩm thu đƣợc Mỗi phân tử đƣờng khơng bị sulfate hoá, bị sulfate hoá lần hay lần Đa phần nhóm OH vị trí carbon GalNAc đƣợc sulfate hoá, số chuỗi GAG vị trí GlcA Q trình sulfate hố nhờ enzyme sulfotransferase đặc hiệu Việc sulfate hố vị trí khác tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù chondroitin GAG Trong thể sống, PG GAG giữ vai trị quan trọng nhiều q trình khác nhƣ: điều hòa hoạt động enzyme bám dính, phát triển di thực tế bào [19,33,37] GAG cịn có chức cấu trúc điều khiển thể sống Về cấu trúc, thành phần mơ sụn (nhƣ aggrecan) Về điều khiển, CS dễ gắn kết với protein mơ tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ quan trọng cho việc điều hoà hoạt động tế bào Phân tử PG mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) với protein gắn kết hyaluronic acid tạo thành phức hệ thuỷ động học có khả nén thuận nghịch cần thiết cho sụn để chống lại ép nén với biến dạng nhỏ [12] Cơng thức hố học chondroitin sulfate : Hình 1.1 : Cấu trúc hố học đơn vị chuỗi CS Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2, R3 = H Hình 1.2: Cấu trúc mạch CS Chondroitin có loại A, B C chúng đặc trƣng số lƣợng vị trí nhóm sulfate nhóm disaccharide lặp lại chuỗi polysaccharide Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn C4, có nhiều mơ sụn, CS kết hợp với protein tạo nên chondromucoit; chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn C6; chondroitin sulfate B: có acid iduronic thay cho acid glucuronic Loại A B thƣờng đƣợc tìm thấy sụn động vật cạn (bị lợn), ngƣợc lại loại C đƣợc tìm thấy nhiều loài cá cá mập, loại chứa chủ yếu 6S disaccharide Tuy nhiên CS từ nguồn nguyên liệu khác chứa mức độ hay nhiều số lƣợng isome khác Trong CS A CS C thành phần chủ yếu hình thành PG [40] Hình 1.3: Chondroitin Sulfate A GlcA-GalNAc-4S Chondroitin sulfate B IdoA-GalNAc-4S Là tên cũ dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thƣờng có nhiều da, cịn thấy có van tim, gân, thành mạch Vị trí bị sulfate hố C4 GlcNAc C5 glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid Hình 1.4: Chondroitin sulfate B IdoA-GalNAc-4S Chondroitin Sulfate C GlcA-GalNAc-6S Chondroitin sulfate đƣợc tách trƣớc cấu trúc đƣợc xác định Vì tên gọi CS có thay đổi [16] Ngồi cịn có chondroitin sulfate D E đƣợc tóm tắt bảng 1.1 Hình 1.5: Chondroitin Sulfate C GlcA-GalNAc-6S Bảng 1.1: Phân loại chondroitin sulfate Tên Chondroitin sulfate A Vị trí bị sulfate hố Carbon đƣờng - N- Chondroitin-4-sulfate (C4S), acety-D-lgalactosamine ngƣời: sụn, giác mạc, da, thành mạch (GalNAc) Chondroitin sulfate B (tên cũ Dermatant sulfate) Tên phân loại Carbon GalNAc – L-iduronic acid Chondroitin-4-sulfate (C4S) Chondroitin-6-sulfate (C6S), thƣờng có sụn da cá Chondroitin sulfate C Carbon GalNAc Chondroitin sulfate D Carbon glucuronic Chondroitin-2,6-sulfate acid and GalNAc (C2,6S) Chondroitin sulfate E Carbons GalNAc Chondroitin-4,6-sulfate (C4,6S) 1.1.2 Các nghiên cứu chiết xuất định lƣợng CS Nhiều nghiên cứu giới tách chiết CS từ số nguồn nguyên liệu nhƣ từ da cá Labeo rohita, sụn cá mực [39], cá mập [25], sụn gà [17], sụn bò [24] Vì phân tử CS đa dạng phức tạp, tổng hợp đƣợc mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống đoạn mạch CS: tổng hợp đƣợc số CS tetrasaccharide [13], có khả kích thích phát triển phân hố neron disaccharide khơng có tác dụng Vì vậy, CS chủ yếu đƣợc tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên Bảng 1.2: Hàm lƣợng chondroitin sulfate đƣợc tách từ nguồn sụn khác Nguyên liệu CS (%) CS 6( %) Loại CS 9,60 ± 1,05 8,76 ± 0,96 C4S, C6S Sụn lƣỡi 14,84 ± 0.38 13,54 ± 0,35 C4S, C6S Xƣơng sƣờn 5,56 ± 0,96 5,08 ± 0,87 C4S, C6S Xƣơng ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 C4S, C6S Cổ họng 9,51 ± 1,99 8,68 ± 1,81 C4S, C6S Cá đuối 5,27 ± 0,91 4,81 ± 0,84 C4S, C6S Xƣơng lƣỡi hái gà 14,08 ± 2,51 13,38 ± 4,74 C4S, C6S STT Vây cá mập Cá sấu: 1.1.2.1 Các phƣơng pháp tách chiết CS CS đƣợc chiết nƣớc nóng, dung dịch muối hyaluronic acid Có số phƣơng pháp sử dụng kiềm (NaOH 0,5M), axit HCl 1,5N, nhiên xuất việc phá vỡ liên kết glycoside Vì vậy, phƣơng pháp thủy phân protein enzyme phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến hiệu Nhiều nghiên cứu sử dụng papain, tripsin chymotrysin Hiện papain protease vi khuẩn, nấm đƣợc sử dụng rộng rãi Papain đƣợc sử dụng thủy phân 60ºC, 24h [29] Khi sử dụng protease từ vi khuẩn nấm phải tối ƣu hóa hoạt động enzyme 1.1.2.2 Các phƣơng pháp tinh CS - Các chuỗi dài hydrophilic polymers, đặc biệt CS khơng tan ethanol, acetone methanol, sử dụng dung mơi để thu CS Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa đƣợc hàm lƣợng CS cao phân tách đƣợc với polysaccharide khác [35] Có thể sử dụng ethanol với muối calcium 0,5M dung dịch acetic acid [20] - Để tủa CS sử dụng muối ammonium nhƣ cetylpyridium chloride (CPC) cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB), tạo tủa phân tách CS với glycosaminoglycan khác, collagen hyaluronic acid phần lớn bị loại bỏ [13] Các phức hợp CS tủa hịa tan muối Scott mơ tả cụ thể phƣơng pháp [31,32] Phức hợp CPC CS đƣợc hịa tan 0,9N KCL, 1N MgCl2 > 0,7N MgSO4 Đây phƣơng pháp hiệu để tách tinh polysaccharide nucleic acids Các polysaccharide tổng số đƣợc hịa tan dung dịch muối 2M NaCl, 2M KCl 1,5M MgSO4 - CS polyanion với tác dụng điện tích âm cao, CS bị giữ với nhựa trao đổi anion Vì vậy, tinh CS cột sắc ký trao đổi ion, sau tinh sắc ký lọc gel (nhƣ cột sắc ký Sepharos CL- 6B columm) 1.1.2.3 Các phƣơng pháp định tính định lƣợng CS - Phƣơng pháp 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB): Xác định CS phƣơng pháp GAGs sulfate dựa theo thay đổi quang phổ hấp thụ DMMB gắn với GAGs: Hồ tan CS khơ vào nƣớc loại ion để nhận dung dịch 8-12% (W/v) Xác định CS dung dịch theo Farndale cộng dùng C4S C6S làm chất chuẩn, DMMB làm chất màu tác dụng với GAGs đo độ hấp thụ bƣớc sóng 525nm máy quang phổ [8] - Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS 10 27 Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V (1998) Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases Microbiol Mol Biol Rev 62: 597–635 28 Robert M.L., Thomas N.H and Ian A.N (2000) A fingerprinting method for chondroitin/dermatan sulfate and hyaluronan oligosaccharides Glycobiology 10 (4): 393-401 29 Roden L., Baker J., Cifonelli J A., Mathews M (1973) Methods in Enzymolog., 28 (7),73 30 Rodén L., Baker J.R, Cifonelli A and Mathews M.B (1972) Isolation and characterization of connective tissue polysaccharides Methods in Enzymology 53A 69-82 31 Scott J E (1965) Methods in Carbohydrate Chemistry Whistler R L., Ed.; Academic: Newyork, 5: 38 – 44 32 Seiichi T., Toshiyuki W., Itsuo H., Masanori I and Masachika I (2005) Bacteriolytic Activity of Alkaline Protease BYA from Bacillus sp Y Journal of Oleo Science, Vol 54, No 11, p: 595-600 33 Selleck S.B (2000) Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics Trends Genet., 16 206212 34 Sharmin S., Towhid H.Md and Anwar M.N (2005) Isolation and Characterization of a Protease Producing Bacteria Bacillus amovivorus and Optimization of Some Factors of Culture Conditions for Protease Production Journal of Biological Sciences (3): 358362 35 Shil S.C; You S.J., Anb K.; Kang C W (2006) Study on extraction of mucopolysaccharide-protein containing chondroitin sulfate from chicken keel cartilage Asian-australasian journal of animal sciences 19 (4): 601-604 36.Silbert J.E., Sugumaran G (2002) Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate IUBMB Life 54 (4): 177–86 37.Turnbull J., Powell A., and Guimond S (2001) Heparan sulfate: decoding a 0dynamic multifunctional cell regulator Trends Cell Biol 11, 75-82 38.Uebelhart D., Malaises M., Marcolongo R., DeVathairell F., Piperno M., Mailleux E., Fioravanti A., Matoso L., Vignon E (2004), Intermittent treatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate: a one year, randomized,double blind, multicenter study versus placebo, Osteoarthr Cartilage 12 269–276 39.Vynios D.H., Aletras A., Tsiganos C.P, Tsegenidis T., Antonopoulos C.A., Hjerpe A., Engfeld B (1985) Proteoglycans from squid cranial cartilage extraction and characterization, Comp Biochem Physiol 80B 4: 761–766 Trang Web: 40 http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn 41 http://vi.wiktionary.org/wiki/hplc) MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chondroitin sulfate (CS) 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc CS 1.1.2 Các nghiên cứu chiết xuất định lƣợng CS 1.1.3 Ứng dụng CS Y học 11 1.2 Protease 12 1.3 Giới thiệu cá đuối 13 Chƣơng 2: MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP 15 2.1 Mục tiêu 15 2.2 Nội dung 15 2.3 Vật liệu 15 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Nuôi cấy chủng vi khuẩn sinh protease ngoại bào… … 15 2.4.2 Xác định hoạt độ protease phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch (Leluk cộng sự) 17 2.4.3 Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến 18 2.4.4 Xác định điều kiện tối thích cho hoạt động protease 20 2.4.5 Xác định thời gian nuôi cấy tối ƣu để chủng B26 sinh protease ngoại bào mạnh 22 2.4.6 Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry 22 2.4.7 Phƣơng pháp sinh học tách chiết chondroitin sulfate 23 2.4.8 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC định tính xác định độ chế phẩm CS 23 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Sàng lọc nghiên cứu protease ngoại bào có hoạt tính cao từ vi sinh vật để sử dụng cho quy trình tinh CS 24 3.1.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh protease ngoại bào hoạt tính cao 24 3.1.2 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân xƣơng sụn cá đuối protease ngoại bào từ chủng B26 28 3.2 Xây dựng quy trình tinh chondroitin sulfate từ xƣơng sụn 35 cá đuối 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A660 Đo OD bƣớc sóng 660 nm A750 Đo OD bƣớc sóng 750 nm B26 Bacillus subtilis VTCC-B-26 B505 Bacillus subtilis VTCC-B-505 BSA Albumin huyết bò CĐ Cá đuối CPC Cetylpyridium chloride CS Chondroitin sunfate CS4 Chondroitin-4-sulfate CS6 Chondroitin-6-sulfate CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide DMMB 1,9-dimethylmethylene blue GAG Glycosaminoglycan GalNAc N-acety-D-lgalactosamine HPLC High Press Liquid Chromatography OD Optical Density PG Proteoglycan TCA Tricloacetic UV Ultraviolet DANH MỤC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Phân loại chondroitin sulfate 1.2 Hàm lƣợng chondroitin sulfate đƣợc tách từ nguồn sụn khác 2.1 Các chủng vi khuẩn sinh protease ngoại bào nuôi cấy 15 2.2 Xác định đƣờng cong chuẩn tyrosine 18 3.1 Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi khuẩn nghiên 26 cứu 3.2 Hoạt tính protease chủng Bio1, Bio 2, Bio 7, B26 MF 34 26 3.3 Hàm lƣợng số chất chế phẩm CS tinh protease 38 ngoại bào từ chủng B26 DANH MỤC HÌNH Nội dung Hình Trang 1.1 Cấu trúc hố học đơn vị chuỗi CS 1.2 Cấu trúc mạch CS 1.3 Chondroitin Sulfate A 1.4 Chondroitin sulfate B 1.5 Chondroitin Sulfate C 3.1 Đồ thị đƣờng chuẩn tyrosine 25 3.2 Hoạt độ protease dịch ni vi khuẩn (unit/ml) 25 3.3 Hoạt tính protease chủng vi sinh vật Bio1, Bio 2, Bio 7, 27 B26 MF 34 3.4 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ protease ngoại bào chủng 29 B26 chất xƣơng sụn cá đuối 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ protease ngoại bào 30 chủng B26 chất xƣơng sụn cá đuối 3.6 Ảnh hƣởng thời gian thuỷ phân tối thích protease 30 ngoại bào từ chủng B26 chất xƣơng sụn cá đuối 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ thuỷ phân tối thích protease 31 ngoại bào từ chủng B26 chất xƣơng sụn cá đuối 3.8 Khả thủy phân sụn cá đuối enzyme ngoại bào 32 chủng B26 3.9 Hoạt tính protease chủng B26 theo thời gian nuôi cấy 33 3.10 Hoạt tính protease chủng B26 ni cấy theo thời gian 33 3.11 Sơ đồ thủy phân protein xƣơng sụn cá đuối 34 protease ngoại bào chủng B26 3.12 Qui trình tách chiết chondroitin sulfate từ xƣơng sụn cá đuối 35 3.13 Phổ CS chuẩn từ sụn vi cá mập 37 3.14 Phổ CS từ xƣơng sụn cá đuối (chế phẩm CS tinh sạch) 38 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu sử dụng protease để tách chiết tinh chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasiatis kuhlii)” đƣợc thực dƣới đồng ý Khoa Lâm học, Trung tâm giống Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp hƣớng dẫn TS Võ Hoài Bắc - Phịng hóa sinh thực vật - Viện cơng nghệ sinh học - Viện khoa học công nghệ Ths Nguyễn Thị Hồng Gấm - Trung tâm giống Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Võ Hoài Bắc ThS Nguyễn Thị Hồng Gấm tận tình giúp đỡ, bảo, tạo điều kiện thuận lợi q trình tơi làm luận văn Cảm ơn ThS Đỗ Ngọc Tú, cán bộ, nhân viên Phịng hóa sinh thực vật - Viện công nghệ sinh học - Viện khoa học công nghệ Việt nam, thầy cô giáo Trung tâm giống CNSH, khoa Lâm học, bạn bè đồng nghiệp, gia đình tạo điều kiện vật chất động viên tinh thần suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Mặc dù cố gắng song kinh nghiệm trình độ cịn hạn chế, khóa luận chắn khơng thể tránh khỏi thiếu sót định Rất mong nhận đƣợc thơng cảm ý kiến đóng góp thầy cô giáo, cán khoa học bạn để khóa luận đƣợc hồn thiện Rất chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2009 Sinh viên thực Lê Thị Tình BẢN SỐ LIỆU GỐC Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh protease ngoại bào hoạt tính cao Nồng độ protein dịch ni vsv sinh protease(µg/ml) A 750 xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosine Nơng độ protease (µmol/ml) A750 0.1 0.17 0.2 0.337 0.3 0.461 0.4 0.588 0.5 0.708 Hoạt độ protease (unit/ml) STT Chủng vi khuẩn 10 bio1 bio2 bio6 bio7 TH3 TH5 TH6 TH9 B26 B505 Hoạt độ protease (unit/ml) 0.10 0.27 0.05 0.14 0.06 0.02 0.07 0.07 0.29 0.01 11 MF34 0.15 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân tối thích xƣơng sụn cá đuối protease ngoại bào từ chủng B26 (A750) 2.1 A750 pH pH Thí nghiệm Đối chứng 4,5 0,715 5,5 0,773 6,5 0,818 7,5 0,803 8,5 0.864 9,5 0.846 0,719 0.432 0,771 0.432 0.826 0.475 0.798 0.475 0.863 0.450 0.848 0.450 0.436 0.436 0.477 0.477 0.444 0.444 Kết pH Thí nghiệm Đối chứng Hiệu OD Hoạt tính tƣơnng đối (%) 4,5 0.717 0.434 0.283 5,5 0.772 0.434 0.338 6,5 0.822 0.476 0.346 7,5 0.800 0.476 0.324 8,5 0.864 0.477 0.387 9,5 0.847 0.477 0.370 73.1 87.3 89.4 83.7 100 95.6 2.2 A750 Nhiệt độ Nhiệt độ 30 40 50 60 70 80 90 Thí nghiệm 0.77 0.87 0.98 1.14 1.21 0.94 0.87 0.80 0.89 1.04 1.11 1.25 0.91 0.84 0.38 0.41 0.48 0.61 0.48 0.21 0.40 0.40 0.41 0.51 0.59 0.48 0.24 0.38 Đối chứng Kết Nhiệt độ Thí nghiệm Đối chứng Hiệu OD Hoạt tính tƣơnng đối (%) 30 0.79 0.39 0.39 40 0.88 0.41 0.47 50 1.01 0.50 0.51 60 1.12 0.60 0.53 70 1.23 0.48 0.75 80 0.93 0.22 0.71 90 0.85 0.39 0.46 52.6 62.2 68.2 70.2 100 93.8 61.3 2.3 A750 Thời gian Thời gian 1h 4h 8h 12h 18h 24h đối chứng 0.252 0.288 0.312 0.348 0.406 0.314 0.256 0.294 0.323 0.358 0.408 0.418 0.594 0.715 0.773 0.828 0.877 0.852 0.581 0.692 0.78 0.83 0.889 0.809 Thí nghiệm Kết Thời gian 1h 4h 8h 12h 18h 24h Đối chứng 0.254 0.291 0.318 0.353 0.407 0.416 Thí nghiệm 0.588 0.704 0.777 0.829 0.883 0.892 hiệu OD 0.33 0.41 0.46 0.48 0.47 0.43 % 70.1 86.7 96.4 100 100 100 2.4 A750 Nồng độ Nồng độ 100 µl 200 µl 400 µl 500 µl Thí nghiệm 0.620 0.794 0.867 0.960 0.654 0.788 0.879 0.971 0.214 0.310 0.510 0.601 0.215 0.301 0.503 0.605 Đối chứng Kết Nồng độ Thí nghiệm Đối chứng Hiệu OD Nồng độ Hoạt tính tƣơnng đối (%) 100 µl 0.654 0.215 0.440 0,2 ml 90.5 200 µl 0.791 0.306 0.486 0,4 ml 100 400 µl 0.873 0.507 0.367 0,8 ml 75.4 500 µl 0.966 0.603 0.363 1ml 74.7 2.5 A750 thời gian ni cấy tối thích chủng B26 Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h Đƣờng kính vịng thuỷ phân (mm) 20 27.6 22.5 22 Định lƣợng potein chế phẩm CS mg (x) Phƣơng trình liên hệ A660 hàm lƣợng prtein chế phẩm y = 1,2571 x y : A660 B26 (10 mg) = 0,41 x : lƣợng protein chế phẩm (10mg) = 0,41/1,2571 = 0,33  Hàm lƣợng prtein chế phẩm 3,3% X ác định hàm lƣợng CS chế phẩm 10g sụn cá đuối đem tách chiết thi đƣợc 110mg CS  Hàm lƣợng CS xƣơng sụn cá đuối = 110/10000 * 100% = 1,1% PHỤ LỤC Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh protease ngoại bào hoạt tính cao Nồng độ protein dịch ni vsv sinh protease(µg/ml) A 750 xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosine Nơng độ protease (µmol/ml) A750 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.17 0.337 0.461 0.588 0.708 Hoạt độ protease (unit/ml) STT Chủng vi khuẩn 10 bio1 bio2 bio6 bio7 TH3 TH5 TH6 TH9 B26 B505 Hoạt độ protease (unit/ml) 0.10 0.27 0.05 0.14 0.06 0.02 0.07 0.07 0.29 0.01 11 MF34 0.15 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân tối thích xƣơng sụn cá đuối protease ngoại bào từ chủng B26 (A750) 2.1 A750 pH pH Thí nghiệm Đối chứng Hiệu OD Hoạt tính tƣơnng đối (%) 4,5 0.717 0.434 0.283 5,5 0.772 0.434 0.338 6,5 0.822 0.476 0.346 7,5 0.800 0.476 0.324 8,5 0.864 0.477 0.387 9,5 0.847 0.477 0.370 73.1 87.3 89.4 83.7 100 95.6 2.2 A750 Nhiệt độ Nhiệt độ Thí nghiệm Đối chứng Hiệu OD Hoạt tính tƣơnng đối (%) 30 0.79 0.39 0.39 40 0.88 0.41 0.47 50 1.01 0.50 0.51 60 1.12 0.60 0.53 70 1.23 0.48 0.75 80 0.93 0.22 0.71 90 0.85 0.39 0.46 52.6 62.2 68.2 70.2 100 93.8 61.3 2.3 A750 Thời gian Thời gian 1h 4h 8h 12h 18h 24h Đối chứng 0.254 0.291 0.318 0.353 0.407 0.416 Thí nghiệm 0.588 0.704 0.777 0.829 0.883 0.892 hiệu OD 0.33 0.41 0.46 0.48 0.47 0.43 % 70.1 86.7 96.4 100 100 100 2.4 A750 Nồng độ Nồng độ 100 µl 200 µl 400 µl 500 µl Thí nghiệm 0.654 0.791 0.873 0.966 Đối chứng 0.215 0.306 0.507 0.603 Hiệu OD 0.440 0.486 0.367 0.363 Nồng độ Hoạt tính tƣơnng đối (%) 0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1ml 90.5 100 75.4 74.7 2.5 A750 thời gian ni cấy tối thích chủng B26 Thời gian 24h 48h 72h 96h 120h Đƣờng kính vịng thuỷ phân (mm) 20 27.6 22.5 22 Định lƣợng potein chế phẩm CS mg (x) Phƣơng trình liên hệ A660 hàm lƣợng prtein chế phẩm y = 1,2571 x y : A660 B26 (10 mg) = 0,41 x : lƣợng protein chế phẩm (10mg) = 0,41/1,2571 = 0,33  Hàm lƣợng prtein chế phẩm 3,3% Xác định hàm lƣợng CS chế phẩm 10g sụn cá đuối đem tách chiết thi đƣợc 110mg CS  Hàm lƣợng CS xƣơng sụn cá đuối = 110/10000 * 100% = 1,1%