Nghiên cứu phương pháp chiết tách một số hoạt chất từ cây chút chít (rumex crispus l ) và thử nghiệm sản phẩm tách chiết theo hướng bảo vệ thực vật

Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan trực tiếp thực nghiên cứu luận văn Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa chép từ nghiên cứu khác Các số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa cơng bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!  Học viên Vũ Thị Lan Phương Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Nhờ có hướng dẫn thầy giáo, PGS TS Khuất Hữu Thanh, tạo điều kiện TS Lưu Hoàng Ngọc, PGS.TS.Nguyễn Văn Hùng, giúp đỡ mặt thiết bị, dụng cụ Trung tâm Nghiên cứu phát triển thuốc,Viện Hóa Sinh Biển ,Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, luận văn tốt nghiệp hoàn hành thời hạn Qua xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy, cô giáo: PGS TS Khuất Hữu Thanh, Tiến Sỹ Lưu Hoàng Ngọc, Tiến Sỹ Đoàn Thị Mai Hương, Tiến sỹ Nguyễn Thị Minh Hằng người tận tình bảo, hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thanh Loan, chun viên phịng Chính sách Phát triển cơng nghiệp hóa chất, Cục Hóa Chất, Bộ Cơng Thương, người giúp đỡ việc liên hệ chuẩn bị mẫu thực vật Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Nguyễn Văn Hùng, em Trần Hữu Giáp, tồn thể cơ, chú, anh chị em thuộc Trung tâm Nghiên cứu phát triển thuốc, Viện Hóa Sinh Biển ,Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn chị Phan Bích Thu, Viện Bảo Vệ Thực Vật, Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông Thôn giúp tiến hành thử hoạt tính đối tượng sâu bệnh Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên thực Vũ Thị Lan Phương Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.1 Vài nét họ rau Răm (Polygonaceae) 1.1.2 Vị trí phân loại chi Rumex hệ thống phân loại thực vật 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Rumex 1.1.4 Sự phân bố chi Rumex .4 1.1.5 Đặc điểm thực vật loài Rumex crispus 1.2 Những nghiên cứu hoạt tính sinh học Rumex crispus 1.3 Nghiên cứu hoá học chi Rumex 1.4 Nghiên cứu hóa học Rumex crispus 11 1.5 Đặc điểm sinh học sinh thái bệnh gây vi khuẩn, nấm mốc 14 1.5.1 Bệnh héo vàng cà chua nấm Fusarium oxyporium 14 1.5.2 Bệnh thối hạch bắp cải nấm Sclerotinia Sclerotinium (Lib.) De Bary 15 1.5.3 Bệnh thối nhũn hành ta vi khuẩn Ervinia carotovora .16 1.5.4 Bệnh đậu côve nấm Botrytis cineratis .17 1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ Rumex crispus làm thuốc bảo vệ thực vật 18 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 26 2.1.1 Mẫu thực vật 26 2.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu .26 2.1.3 Dung môi hóa chất 26 Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 2.2 Nội dung nghiên cứu 27 Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp chiết 27 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính 28 2.3.3 Phân lập xác định cấu trúc số chất từ cao tổng Rumex crispus 30 2.3.4 Phổ hồng ngoại (IR) 31 2.3.5 Phổ khối lượng (MS) 31 2.3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Thực nghiệm 33 3.1.1 Xử lý mẫu thực vật ngâm chiết 33 3.1.2 Phân lập số hợp chất dịch chiết 35 3.1.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập 37 3.2 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 41 3.2.1 Chrysophanol (RP1.1) 41 3.2.2 Emodin (RP4.5) 45 3.2.3 Physcion (RP1.4) 47 3.2.4 Quercetin (RP10.5.2) 49 3.2.5 Kaempferol (RC8.4.2) 51 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học .53 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ ĐỀ XUẤT 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng1.1: Chỉ số DPPH dịch chiết từ Rumex crispusa [18] Bảng 1.2: Các số FRAP, DPPH, LP chất BHT, Quercetin, Rutin, acid Ascobic dịch chiết Metanol từ Rumex crispus [32] .7 Bảng1.3: Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ loài Rumex crispus [18] Bảng 1.4 Tổng hàm lượng anthracene phần chi Rumex L [30] .11 Bảng 1.5 Hoạt tính dịch chiết metanol chiết từ Rumex crispus sáu loại bệnh hại [21] .19 Bảng 1.6 Tính kháng nấm Erysiphe graminis hordei lúa mạcha dịch chiết metanol từ rễ Rumex crispusb [20] 19 Bảng 1.7 Hoạt tính kháng nấm Sphaerotheca fuliginea dưa chuộta dịch chiết metanol từ rễ Rumex crispusb [21] 20 Bảng 1.8 Khả kháng nấm dịch chiết rễ Rumex crispus chiết dung môi khác nhaua [20] 20 Bảng 1.9 Hoạt tính chrysophanol, nepodin, parietin loại nấm bệnha 21 Bảng 1.10 Hoạt tính kháng nấm Blumeria graminis f sp Hordeia 22 Bảng 1.11 Khả kiểm soát nấm mốc gây bệnh dưa chuột chrysophanol, nepodin parietin chiết từ rễ Rumex crispusa .22 Bảng 1.12 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến khả kháng nấm Fusarium .24 Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính dịch chiết Rumex crispus loại bệnh hại trồng 53 Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ HÌNH Hình 1.1 Cây Rumex crispus L Hình 1.2 Lá hoa Rumex crispus L Hình 1.3: Chế phẩm dạng viên chiết từ Rumex crispus dùng chữa bệnh đường hô hấp người Hình 3.1 Bản mỏng TLC hợp chất RP1.1 (hệ dung môi n-hexan/EtOAc 8:2, màu TT CeSO4) 41 Hình 3.2 Bản mỏng TLC hợp chất RP1.1 (hệ dung môi n-hexan/ axeton 9:1, màu TT CeSO4) 41 Hình 3.3 Phổ 1H-1H COSY giãn rộng hợp chất 42 Hình 3.4: Phổ HMBC chất RP1.1 44 Hình 3.5 : Một số tương tác phổ HMBC chất RP1.1 44 Hình 3.6 Bản mỏng TLC hợp chất (hệ dung môi n-hexan/ EtOAc 8:2, màu TT CeSO4) 45 Hình 3.7 Phổ 13C-NMR chất RP4.5 46 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR giãn rộng chất 47 Hình 3.9 Bản mỏng TLC hợp chất (hệ dung môi n-hexan: EtOAc= 8:2, màu TT CeSO4) 48 Hình 3.10 Bản mỏng TLC hợp chất (hệ dung môi n-hexan: axeton = 9:1, màu TT CeSO4) 48 Hình 3.11 Phổ 1H-NMR chất RP1.4 .49 Hình 3.12 Bản mỏng TLC hợp chất RP10.5.2 (Dung môi CH2Cl2/MeOH 95:5 màu TT CeSO4) 50 Hình 3.13 Bản mỏng TLC hợp chất RC8.4.2 51 (n-Hexan/Axeton 7:3, màu TT CeSO4) 51 SƠ ĐỒ Sơ đồ Quy trình ngâm chiết mẫu thực vật 34 Sơ đồ Quá trình phân lập chất từ cặn n-hexan .35 Sơ đồ 3: Quá trình phân lập chất từ cặn chiết EtOAC 36 Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT  Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) CC Column Chromatography (Sắc ký cột)  Các phương pháp phổ EI-MS Electronic Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng) IR Infared Spectrometry(Phổ hồng ngoại) H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonace Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonace Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) DEPT Distortioless Enhancement by Polarisation Transfer (phổ DEPT) COSY Correlation Spectroscopy (Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation (phổ tương tác hai chiều dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân)  Các chữ viết tắt khác EtOAc Ethyl acetat MeOH Methanol s: singlet d:doublet t:triplet m: multiplet dd:double doublet br:broad Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học LỜI MỞ ĐẦU Sâu bệnh, côn trùng hại trồng nguyên nhân làm giảm suất, từ làm ảnh hưởng tới an ninh lương thực giới Việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trở thành nhu cầu thiếu sản xuất nông nghiệp giới Tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi hóa chất bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học làm gia tăng ô nhiễm môi trường, làm ảnh hưởng tới sức khỏe người Do người hướng tới tìm kiếm sử dụng sản phẩm thân thiện với mơi trường, độc với người sử dụng, phân hủy nhanh để thay sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp hóa học Các sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc thay quan tâm Thực vật với số lượng lớn lồi, nhiều lồi có hoạt tính, nguồn nguyên liệu đồi cho việc nghiên cứu, chiết tách để tạo chế phẩm có hoạt tính phịng trừ sâu bệnh, trùng hại trồng Các nghiên cứu gần giới cho thấy dịch chiết lồi Chút chít nhăn (Rumex crispus L.) có hiệu diệt nấm tốt, đặc hiệu với loại nấm mốc gây bệnh mốc sương lúa, đậu Hà Lan dưa chuột Ngoài ra, chế phẩm có tác dụng với loại nấm mốc Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Puccinia recondite, Blumeria graminis f.sp.hordei gây bệnh lúa khoai tây Ở Việt Nam, năm 2008, nhóm nghiên cứu TS Lưu Hồng Ngọc, Viện Hóa học cơng nghiệp Việt Nam chủ trì, bước đầu nghiên cứu cao dịch chiết từ rễ Chút chít nhăn (R crispus) với định hướng làm thuốc trừ nấm thảo mộc thân thiện môi trường Trên sở kết nghiên cứu Chút chít nhăn (R Crispus) kể trên, em định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phương pháp chiết tách số hoạt chất từ Chút chít (Rumex crispus L.) thử nghiệm sản phẩm tách chiết theo hướng bảo vệ thực vật” làm đối tượng nghiên cứu đồ án Mục tiêu đồ án tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện tài liệu để sớm đưa chế Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội Luận văn thạc sỹ khoa học Công nghệ Sinh học phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ Chút chít nhăn (R crispus) phục vụ bà nông dân Nội dung cụ thể đồ án sau: - Chiết tách dịch chiết tổng Chút chít nhăn (Rumex crispus) - Thử hoạt tính sinh học dịch chiết etyl axetat, n-hexan metanol trên:  nấm Fusarium oxyporium gây bệnh héo vàng cà chua  nấm Sclerotinia sclerotinium gây bệnh cải bắp  nấm Botrytis cineratis gây bệnh đậu côve  vi khuẩn Ervinia carotovora gây bệnh thối nhũn hành ta - Chiết tách xác định cấu trúc chất từ dịch chiết etyl axetat Chút chít nhăn (R crispus) - Chiết tách xác định cấu trúc chất từ dịch chiết n- hexan Chút chít nhăn (R crispus) Vũ Thị Lan Phương Đại học Bách khoa Hà Nội ... phương pháp chiết tách số hoạt chất từ Chút chít (Rumex crispus L. ) thử nghiệm sản phẩm tách chiết theo hướng bảo vệ thực vật? ?? l? ?m đối tượng nghiên cứu đồ án Mục tiêu đồ án tiếp tục nghiên cứu hoàn... tâm Thực vật với số l? ?ợng l? ??n l? ??i, nhiều l? ??i có hoạt tính, nguồn nguyên liệu đồi cho việc nghiên cứu, chiết tách để tạo chế phẩm có hoạt tính phịng trừ sâu bệnh, trùng hại trồng Các nghiên cứu. .. rễ Chút chít nhăn (R crispus) với định hướng l? ?m thuốc trừ nấm thảo mộc thân thiện môi trường Trên sở kết nghiên cứu Chút chít nhăn (R Crispus) kể trên, em định l? ??a chọn đề tài ? ?Nghiên cứu phương