Nghiên cứu công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học sulforaphane có tác dụng phòng chống vi khuẩn helicobacter pylori từ rau mầm cải ngọt súp lơ xanh bằng sóng siêu âm

Viện đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn nhiều thầy, giáo, gia đình bạn bè bảo động viên từ cán nghiên cứu phịng thí nghiệm Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, nhận giúp đỡ bạn bè người thân Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn: TS Nguyễn Tất Thắng (Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch) ln quan tâm bảo, tận tình giúp đỡ động viên suốt thời gian nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo viện tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài nghiên cứu Và xin chân thành cảm ơn tất bạn bè, người thân theo dõi, giúp đỡ động viên để tơi hồn thành tốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn bạn đồng môn lớp 1203.CNSH đồng hành, trải qua năm học viên mái trường viện đại học Mở hà Nội thân yêu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình tồn thể bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tơi, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận Hà nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Bùi Thị Thúy Quỳnh Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 10 A TÌNH HÌNH NGHIÊN CứU NGỒI NƯớC 10 I Tình hình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất sinh học Sulforaphane Thế giới 10 1.1 Sự hình thành, cấu trúc hóa học tính chất hóa lý 10 1.2 Phân bố tự nhiên 11 1.3 Tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe Sulforaphane 12 1.4 Cơ chế tác dụng Sulforaphane 15 1.5 Các sản phẩm Sulforaphane thương mại ứng dụng 16 1.6 Tính an tồn Sulforaphane 18 1.7 Phương pháp xác định Sulforaphane mẫu cải xanh rau cải khác 18 II Tình hình nghiên cứu cơng nghệ tách chiết tinh chế (thu nhận) hoạt chất sinh học Sulforaphane 19 3.1 Tách chiết dung môi 19 3.2 Cơng nghệ thiết bị trích ly dung mơi có hỗ trợ siêu âm 20 3.3 Công nghệ tách chiết tinh hoạt chất Sulforaphane 22 III Tình hình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất sinh học SFN điều trị viêm loét dày vi khuẩn Helicobacter pylori 25 3.1 Vi khuẩn H pylori bệnh dày 25 3.2 Tính nhậy cảm với kháng sinh H pylori 26 3.3 Tác dụng hoạt chất sinh học SFN H pylori 27 B TÌNH HÌNH NGHIÊN CứU TRONG NƯớC ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED Giới thiệu số rau họ cải Việt Nam 28 1.2.2 Giá trị kinh tế 30 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội Tình hình nghiên cứu nước công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học 31 VậT LIệU NGHIÊN CứU 34 1.1 Đối tượng nghiên cứu 33 1.2.1 Hóa chất 34 1.2.2 Thiết bị dụng cụ 34 Phương pháp nghiên cứu 36 2.1 Xử lý rau nguyên liệu cho tách chiết hoạt chất sinh học (xử lý rau nguyên liệu biện pháp lý kết hợp với sóng siêu âm) 36 2.2 Thu thập mẫu 37 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37 2.3.1 Xác định tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào phù hợp để thu nguyên liệu có hàm lượng hoạt chất sinh học SFN cao 37 2.3.2 Quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg nguyên liệu/ mẻ) 39 2.3.3 Đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn H pylori gây viêm loét dày chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN điều kiện in vitro 43 2.4 Phương pháp phân tích 45 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 45 2.4.2 Phương pháp đánh giá cảm quan 45 2.4.3 Phương pháp xác định độ ẩm 45 2.4.4 Phương pháp thu nhận glucosinolate 45 2.4.5 Phương pháp thu nhận dịch chiết chứa SFN (dung dịch thử) 46 2.4.6 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 47 2.4.7 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 47 2.4.8 Phương pháp đo mật độ quang 49 2.4.9 Xác định hiệu suất tách chiết 49 2.4.10 Phương pháp phân tích vi sinh 49 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Xác định tiêu chuẩn rau nguyên liệu đầu vào phù hợp để thu nguyên liệu có hàm lượng hoạt chất sinh học Sulforaphane 50 3.1.1 Lựa chọn rau nguyên liệu thích hợp cho tách chiết hoạt chất sinh học 50 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội 3.1.2 Ảnh hưởng độ tuổi rau nguyên liệu thu hoạch đến hàm lượng hoạt chất sinh học SFN 52 3.2 Nghiên cứu quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg nguyên liệu/ mẻ) 54 3.2.1 Lựa chọn phương pháp tách chiết hoạt chất SFN 54 3.2 Ảnh hưởng ascorbic acid đến chuyển hóa Glucosinolate thành SFN 55 3.2 Ảnh hưởng loại dung môi đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN 56 3.2.4 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất tách chiết hoạt chất FSN 58 3.2.5 Ảnh hưởng số lần tách chiết đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN 59 3.2.6 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN 60 3.2.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN 62 3.2.8 Ảnh hưởng thời gian đến khả tách chiết hoạt chất SFN 63 3.3 Thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg ngun liệu/ mẻ) 64 3.3.2 Thu hồi SFN từ dịch tách chiết nhựa hấp phụ trao đổi anion 66 3.3.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg/mẻ) 67 3.3.5 Bước đầu đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn H pylori gây viêm loét dày chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN điều kiện in vitro 70 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 4.1 Kết luận ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 4.2 Đề nghị ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên Helicobacter pylori Sulforaphane Glucosinolate Glucoraphanin Rau mầm Trưởng thành Chất khô Sắc ký lỏng cao áp Bùi Thị Thúy Quỳnh Ký hiệu H pylori SFN GLS GRN RM TT CK HPLC Page Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1 Q trình chuyển hóa Glucoraphanin thành Sulforaphane thực vật [1] 10 Hình 1.2 Sơ đồ tác dụng ức chế phát triển khối u SFN 13 Hình 2.3: Đường chuẩn sinigrin 46 Hình 2.4: Phương trình đường chuẩn SFN 49 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất SFN 67 quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg/mẻ) 68 Bảng 2.1 Thiết bị dụng cụ 34 Hình 2.1 Nhựa trao đổi anion gốc bazơ mạnh Amberlite IRA400 42 Hình 2.2 Cột sắc ký với thể tích nhồi cột đường kính 40mm, cao 800mm 42 Bảng 3.1: Hàm lượng hoạt chất sinh học SFN mẫu rau nguyên liệu 50 Bảng 3.2 Ảnh hưởng độ tuổi rau nguyên liệu đến hàm lượng hoạt chất sinh học SFN 52 Bảng 3.3 Ảnh hưởng phương pháp tách chiết đến hàm lượng hoạt chất sinh học SFN 54 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ ascorbic acid đến tạo thành SFN 56 Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết SFN 57 Bảng 3.6: Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất tách chiết 58 Bảng 3.7: Ảnh hưởng số lần tách chiết đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN 60 Bảng 3.8: Ảnh hưởng pH môi trường đến khả tách chiết 61 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết 62 Bảng 3.10: Ảnh hưởng thời gian tách chiết 63 Bảng 3.12 Hiệu làm dịch tách chiết than hoạt tính thiết bị lọc nước kangaroo cải tiến 65 Bảng 3.13: Hiệu suất hấp phụ SFN loại nhựa trao đổi anion 66 Bảng 3.14 Tác dụng chế phẩm SFN lên số loét tá tràng 70 Bảng 3.15 Tác dụng diệt vi khuẩn H pylori chế phẩm SFN 71 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Sulforaphane sản phẩm thủy phân enzyme từ glucoraphanin nhiều nghiên cứu giới chứng minh có vai trị quan trọng kiểm soát ngăn ngừa hay phong tỏa hình thành phát triển ung thư Chất chứng minh có tác dụng làm giảm di chứng nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori có hiệu ngăn ngừa khối u dày vi khuẩn gây Hoạt chất sinh học Sulforaphane có mặt với hàm lượng cao hầu hết loại rau thuộc họ cải (Brassica oleracea) cải xanh, cải bắp, súp lơ, cải bruxen, cải xanh cải xoăn Trong số rau mầm bơng cải xanh súp lơ có hàm lượng hoạt chất sinh học cao Việc sản xuất Sulforaphane theo phương pháp tổng hợp hóa học khơng tốn tốn thời gian, mà địi hỏi phải có số hóa chất độc tính cao sản phẩm phản ứng cuối địi hỏi kỹ thuật tinh chế phức tạp Những khó khăn hạn chế việc sản xuất sử dụng Sulforaphane tổng hợp hóa học cơng nghiệp thực phẩm y dược Do đó, hoạt chất sinh học đến chủ yếu sản xuất từ nguồn nguyên liệu loại rau họ cải Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư, viêm nhiễm kể viêm loét ung thư dày vi khuẩn H pylori gây gia tăng nhanh chóng Các loại thuốc thực phẩm chức hỗ trợ điều trị ung thư phải nhập từ nước hãng dược nước ngồi sản xuất phân phối Do đó, việc nghiên cứu để sản xuất sản phẩm tương tự nước từ nguồn nguyên liệu nước, từ công nghệ tự tạo lập mang lại lợi ích nhiều mặt kinh tế xã hội Việt Nam có tiềm sản xuất tạo nguồn nguyên liệu rau cải loại dồi cho sản xuất hoạt chất Sulforaphane Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học Sulforaphane có tác dụng phịng chống vi khuẩn Helicobacter pylori từ rau mầm (cải ngọt, súp lơ xanh) sóng siêu âm” Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát: Tăng cường giá trị cho ngành sản xuất rau củ Việt Nam, giảm nhập sản phẩm chứa hoạt chất sinh học Sulforaphane Mục tiêu cụ thể: Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất sinh học Sulforaphane từ rau mầm (cải ngọt, súp lơ xanh) sóng siêu âm mơi trường chân khơng Đối tượng nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học từ rau họ cải, đối tượng nghiên cứu chủ yếu rau mầm súp lơ xanh, rau mầm cải (là nguồn nguyên liệu giàu hoạt chất sinh học) Tất loại rau sản xuất với số lượng lớn nước ta loại rau phù hợp với mục tiêu phát triển ngành rau nước để phục vụ nội tiêu xuất khẩu, đối tượng có hoạt tính sinh học ứng dụng nhiều cho sản xuất thực phẩm chức Phạm vi nghiên cứu - Các nội dung nghiên cứu đề tài thuộc lĩnh vực cơng nghệ sau thu hoạch có liên quan chặt chẽ với công nghệ chế biến - Phương pháp nghiên cứu có phạm vi tương đối rộng có liên quan đến chế biến thực phẩm, hóa phân tích hóa cơng - Phạm vi triển khai thực quy mơ nhỏ phịng thí nghiệm Tính cấp thiết đề tài Nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học Sulforaphane giới Việt Nam trở nên cần thiết ngày tăng loại chế phẩm Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội đánh giá loại thực phẩm chức có nhiều tính chất có lợi cho sức khỏe Các tính bật Sulforaphane bao gồm: Sulforaphane dạng tinh khiết hay dạng bột thô thể tác dụng dược lý rõ rệt Tác dụng chủ yếu Sulforaphane hỗ trợ phòng chí điều trị ung thư, có phịng chống bệnh viêm loét dày, tá tràng Ngoài cịn có số tác dụng có lợi cho sức khỏe giúp hỗ trợ tăng cường miễn dịch, phòng điều trị bệnh tim mạch, chống viêm đường hô hấp, chống viêm khớp, chống ơxy hóa giải độc tố gây ung thư Hiện giới, việc nghiên cứu để sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất sinh học Sulforaphane có nhiều kết công bố Thực tế, hoạt chất Sulforaphane thương mại hóa với sản lượng lớn ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp Trong đó, Việt Nam cịn kết nghiên cứu theo hướng chủ yếu dừng lại quy mô nhỏ chưa nghiên cứu toàn diện với định hướng xây dựng quy trình cơng nghệ phát triển sản xuất cơng nghiệp Việt Nam có tiềm trồng rau họ cải dồi dào, phong phú quanh năm chủ yếu tiêu thụ dạng nguyên liệu thơ, giá trị kinh tế cịn thấp, sở chế biến rau cịn chưa nhiều Vì vậy, việc nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học tạo sản phẩm chế phẩm hoạt chất sinh học để làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức cần thiết Nếu thành công sử dụng khối lượng lớn rau họ cải làm nguyên liệu để sản xuất Sulforaphane mang lại tác động kinh tế - xã hội đáng kể tạo sản phẩm có giá trị gia tăng cao, mà cịn góp phần giảm thiểu lượng nhập CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC Bùi Thị Thúy Quỳnh Page Viện đại học Mở Hà Nội CỦA ĐỀ TÀI I Tình hình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất sinh học Sulforaphane Thế giới A Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1 Sự hình thành, cấu trúc hóa học tính chất hóa lý a) Sự hình thành: Hình 1.1 Q trình chuyển hóa Glucoraphanin thành Sulforaphane thực vật [1] Glucoraphanin glucosinolate tìm thấy có hàm lượng cao giống rau cải xanh (Brassica oleracea italica) loại rau khác họ rau cải Tất glucosinolate bao gồm cấu trúc nhóm β-D-thioglucose, nhóm oxime sulfonat hóa chuỗi bên axit amin Glucosinolate cần phải thủy phân enzyme để trở thành isothiocyanate có hoạt tính Sulforaphane (C6H11NOS2) isothiocyanate có hoạt tính sinh học hình thành glucoraphanin chuyển hóa enzyme myrosinase Q trình chuyển hóa glucoraphanin nêu Hình 1.1 [63] b) Tên gọi: 1-Isothiocyanato-4-(methylsulfinyl)-Butane, 1-Isothiocyanato-4- (methylsulfinyl)butane, 4-Methylsulfinyl butyl isothiocyanate, DL-sulforaphane, SFN, Sulforafan, Sulforaphane, Sulforathane c) Cấu trúc: Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 10 Viện đại học Mở Hà Nội Bảng 3.7: Ảnh hưởng số lần tách chiết đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN Số lần tách Hàm lượng SFN Hiệu suất chiết (mg/ 100g CK) tách chiết (%) 1577,0 65,0 1676,4 69,1 1642,5 67,7 Kết nghiên cứu cho thấy: Hàm lượng hoạt chất SFN lần tách chiết khác khác Hàm lượng SFN đạt cao tách chiết 02 lần Hàm lượng SFN đạt 1676,4mg/100g CK (hiệu suất tách chiết đạt 69,1%) Hàm lượng SFN đạt thấp tách chiết 01 lần Hàm lượng SFN đạt 1577,0mg/100g CK (hiệu suất tách chiết đạt 65,0%) Nhưng hàm lượng SFN thu bắt đầu có xu hướng chững lại sau lần tách chiết thứ Điều số lần tách chiết tăng tạo điều kiện thuận lợi cho cấu tử khác hịa tan vào mơi trường, dịch tách chiết lẫn thêm nhiều tạp chất dẫn đến hiệu suất tách chiết giảm Như tách chiết hoạt chất SFN 02 lần cho hiệu suất tách chiết đạt cao nhất, đồng thời tiết kiệm lượng dung môi sử dụng nâng cao hiệu kinh tế Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Li Yang (2009), Lê Doãn Diên (2010) tách chiết hoạt chất SFN 02 lần cho hiệu suất tách chiết đạt cao Như số lần tách chiết hoạt chất SFN 02 lần thích hợp 3.2.6 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN Thí nghiệm tiến hành tách chiết hoạt chất giá trị pH môi trường khác là: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 Kết trình bày bảng 3.22 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 60 Viện đại học Mở Hà Nội Bảng 3.8: Ảnh hưởng pH môi trường đến khả tách chiết pH Hàm lượng SFN Hiệu suất môi trường (mg/100g CK) chuyển hóa (%) 5,5 - - 6,0 389,0 32,0d 6,5 1676,4 68,5b 7,0 1857,2 73,7a 7,5 1848,9 70,3a 8,0 854,3 50,1c Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác khác mức ý nghĩa α = 0,05 Kết bảng 3.8 cho thấy: Ở giá trị pH môi trường tách chiết khác cho hàm lượng hoạt chất SFN tách chiết khác Hàm lượng hoạt chất SFN tạo thành tăng dần giá trị pH khác tăng cao khoảng pH 6,5 - 7,0 Hàm lượng SFN đạt cao tách chiết pH 7,0 Hàm lượng SFN đạt 1857,2mg/100g CK (hiệu suất tách chiết đạt 73,7%) Như pH môi trường thích hợp cho q trình tách chiết SFN pH 7,0 Theo nghiên cứu Mc Gregor et al, (1983) Jan Jezek et al, (1999), môi trường có tính axit (pH = - 5) glucosinolate hoạt động tạo sản phẩm chủ yếu nitrile Mơi trường có tính kiềm (pH >8) hình thành thiocyanate Trong điều kiện mơi trường trung tính (pH = - 8), glucosinolate xúc tác enzyme nội sinh Myrosinase bị thủy phân tạo thành isothiocyanate, tiền chất glucoraphanin dễ dàng bị thủy phân tạo thành hoạt chất SFN tương ứng Mức độ ổn định hai hoạt chất phụ thuộc nhiều vào yếu tố pH môi trường Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Mc Gregor et al (1983) Jan Jezek et al, (1999) cho khoảng pH thích hợp cho trình tách chiết hoạt chất SFN 7,0 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 61 Viện đại học Mở Hà Nội Như giá trị pH môi trường thích hợp cho q trình tách chiết hoạt chất SFN 7,0 3.2.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN Thí nghiệm tiến hành tách chiết giá trị nhiệt độ khác là: 30; 35; 40; 45 50oC Đánh giá hàm lượng hoạt chất SFN hiệu suất chuyển hóa Kết trình bày bảng 3.10 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết Nhiệt độ Hàm lượng SFN Hiệu suất chuyển (oC) (mg/100g CK) hóa (%) 30 1108,4 58,3c 35 1857,2 73,7b 40 2212,8 80,0a 45 2286,5 80,3a 50 1755,6 71,7b Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác khác mức ý nghĩa α = 0,05 Kết cho thấy: Ở nhiệt độ tách chiết khác cho hàm lượng hiệu suất tách chiết hoạt chất SFN khác Hàm lượng hoạt chất SFN tạo thành tăng dần khoảng nhiệt độ tách chiết từ 35 - 45oC, sau giảm dần từ nhiệt độ 50oC trở Hàm lượng SFN đạt cao tách chiết 40oC Hàm lượng SFN đạt 2212,8mg/100g chất khô (hiệu suất tách chiết đạt 80,0%) Khi tách chiết nhiệt độ cao (50oC) hàm lượng hoạt chất SFN hiệu suất chuyển hóa bắt đầu giảm rõ rệt Trên sắc ký đồ xuất nhiều vết tạp chất Điều nhiệt độ tăng chuyển động phân tử tăng, dung môi thẩm thấu nhanh vào bên tế bào màng làm tăng áp suất nội bào, đến thời điểm định thành tế bào bị vỡ giải phóng chất môi trường Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 62 Viện đại học Mở Hà Nội dẫn đến hiệu suất thu hồi chất chiết tăng, dịch chiết lẫn nhiều tạp chất; đồng thời làm cho hoạt chất SFN bị phân hủy phần hoạt chất dễ bị phân hủy nhiệt độ cao Do vậy, nhiệt độ tách chiết tăng tạo điều kiện thuận lợi cho cấu tử khác hòa tan lẫn vào dịch chiết mà cịn gia tăng chi phí sản suất Như nhiệt độ thích hợp cho tách chiết hoạt chất SFN 40oC 3.2.8 Ảnh hưởng thời gian đến khả tách chiết hoạt chất SFN Thí nghiệm tiến hành tách chiết hoạt chất SFN thời gian khác là: 15, 30, 45, 60, 75 phút Đánh giá hàm lượng hoạt chất SFN hiệu suất chuyển hóa Kết trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng thời gian tách chiết Thời gian tách chiết (phút) Hoạt chất SFN Hàm lượng SFN Hiệu suất chuyển (mg/100g CK) hóa (%) 15 160,6 21,2d 30 2212,8 78,7b 45 2538,9 84,3a 60 2550,9 84,5a 75 1594,2 66,8c Ghi chú: Các giá trị cột có số mũ khác khác mức ý nghĩa α = 0,05 Kết nghiên cứu bảng 3.10 cho thấy: Theo thời gian tách chiết, hoạt chất nhóm glucosinolate bị chuyển hóa, cấu tử SFN hình thành tăng dần hàm lượng Như vậy, thời gian tách chiết khác cho hàm lượng hoạt chất hiệu suất tách chiết khác Hàm lượng hoạt chất SFN tăng dần khoảng thời gian tách chiết từ 45 - 60 phút, sau giảm dần từ phút tách Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 63 Viện đại học Mở Hà Nội chiết thứ 75 trở Hàm lượng SFN đạt cao tách chiết phút 45 Hàm lượng SFN đạt 2538,9mg/100g chất khô (hiệu suất tách chiết đạt 84,3%) Tuy thời gian tách chiết 60 phút hàm lượng hiệu suất SFN có cao so với tách chiết 45 phút, hiệu suất cao không đáng kể từ 0,2% Nhưng thời gian tách chiết kéo dài thêm 15 phút ảnh hưởng đáng kể đến hiệu kinh tế Mặt khác, kéo dài thời gian tách chiết tạo điều kiện thuận lợi cho cấu tử khác hòa tan vào dịch chiết làm tăng tỷ lệ tạp chất Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Malcolm Elliott CS (1970) cho thời gian tối ưu cho q trình chuyển hóa GLS thành SFN 40 - 50 phút Điều trình tách chiết, sóng siêu âm làm tăng tốc độ phá vỡ tế bào mô thực vật tốc độ truyền khối, thời gian tách chiết hoạt chất SFN rút ngắn Như thời gian tách chiết hoạt chất sinh học SFN thích hợp 45 phút Kết luận: Qua kết nghiên cứu cho thấy: Để tách chiết hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5kg ngun liệu/ mẻ) yếu tố công nghệ bao gồm: Sử dụng máy siêu âm (cơng suất 500W, tần số sóng siêu âm 20kHz) để tách chiết hoạt chất SFN Dùng ascorbic acid nồng độ 0,02% để chuyển hóa GLS thành SFN Quá trình tách chiết hoạt chất SFN thực sau: dung môi tách chiết ethyl acetate; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 4/1; số lần tách chiết 02 lần; pH môi trường 7,0; nhiệt độ 40oC thời gian tách chiết 45 phút 3.3 Thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg nguyên liệu/ mẻ) 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến q trình làm dịch chiết chứa hoạt chất SFN Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 64 Viện đại học Mở Hà Nội Sau tách chiết thu hồi dịch có chưa hoạt chất SFN, tiến hành làm dịch than hoạt tính tỷ lệ khác là: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0% Kết trình bày bảng 3.25 Bảng 3.11 Ảnh hưởng than hoạt tính đến q trình làm dịch tách chiết chứa hoạt chất SFN Tỷ lệ than hoạt tính SFN Hàm lượng SFN Mật độ quang đo (mg/100g chất khơ) bước sóng 210nm 2538,9 0,85 1,0 2630,1 0,68 1,5 2637,5 0,57 2,0 2678,9 0,45 2,5 2679,0 0,43 3,0 2678,1 0,41 (% dịch tách chiết) Qua bảng 3.11 cho thấy: Tỷ lệ than hoạt tính 2,0% thích hợp để làm sơ dịch tách chiết Khi xử lý tỷ lệ này, dịch SFN có mật độ quang học OD nhỏ Đồng thời thu dịch tách chiết có hàm lượng % SFN cao Do xử lý với than hoạt tính, hàm lượng SFN tăng mạnh, chứng tỏ lượng đáng kể tạp chất bị loại bỏ khỏi dịch Sau có số liệu thí nghiệm tỷ lệ than hoạt tính 2,0% phù hợp nhất, đề tài sử dụng tỷ lệ để xử lý 4.000 ml dịch tách chiết lại nhằm tạo lượng dịch tách chiết đủ cho nghiên cứu Phân tích hàm lượng SFN dịch tách chiết cho kết hàm lượng SFN đạt 3,35g/100g chất khô (bảng 3.12) Bảng 3.12 Hiệu làm dịch tách chiết than hoạt tính thiết bị lọc nước kangaroo cải tiến Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 65 Viện đại học Mở Hà Nội Thể tích dịch Hàm lượng SFN tách chiết (lít) (g/100g chất khơ) Trước làm 4,0 2,54 Than hoạt tính 4,0 2,78 Lọc thiết bị 4,0 3,02 0,4 3,35 Bước làm kagaroo Cô chân không 3.3.2 Thu hồi SFN từ dịch tách chiết nhựa hấp phụ trao đổi anion Do SFN chất lưỡng tính nên loại nhựa sử dụng để hấp phụ SFN bao gồm: Amberlite IRA 400, Amberlite IRA 410, Amberlite IR - 4B, Amberlite XE - 98 Khảo sát nồng độ hấp phụ loại nhựa Dung dịch phản hấp phụ chọn HCl 2,5 % Xác định hàm lượng SFN phương pháp so màu Tính hiệu suất hấp phụ (%) để xác định loại nhựa hấp phụ cao Kết thể bảng 3.13 Bảng 3.13: Hiệu suất hấp phụ SFN loại nhựa trao đổi anion Loại nhựa Nồng độ nhựa, lượng SFN hấp phụ (%) 0,01 0,05 0,1 0,5 Amberlite IRA 410 33,3 50,0 65,5 81,0 Amberlite IRA 400 51,2 65,5 71,4 92,4 Amberlite IR - 4B 23,8 45,0 58,9 78,6 Amberlite XE - 98 16,7 27,9 40,0 80,5 Qua kết bảng 3.13 cho thấy: Khi sử dụng loại nhựa hấp phụ trao đổi anion khác để làm dịch chứa hoạt chất SFN cho hiệu suất hấp phụ khác Trong loại nhựa sử dụng thí nghiệm loại nhựa hấp phụ SFN nhiều Amberlite IRA 400 với hiệu suất lên đến 92,4% nồng độ nhựa 0,5% Nhựa Amberlite IR - 4B cho hiệu suất hấp phụ SFN thấp Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 66 Viện đại học Mở Hà Nội đạt 78,6%.Như loại nhựa Amberlite IRA 400 thích hợp để sử dụng trình thu hồi chế phẩm chứa hoạt chất SFN từ dịch tách chiết 3.3.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg/mẻ) a, Quy trình công nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất sinh học SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg/mẻ) Ngun liệu Lựa chọn, làm sạch, cắt nhỏ Làm khô Kiểm tra chất lượng Bổ sung ascorbic acid BS sodium sulfide Đóng gói chân khơng Thủy phân Ngun liệu đạt tiêu chuẩn sản xuất SFN BS Ethyl acetat đệm phosphate Tách chiết sóng siêu âm Dịch chứa SFN Bã Lọc qua NaCl Na2SO3 Làm dịch SFN Li tâm Sấy chân không Cô quay chân không Bã thải SFN Thu hồi dung mơi Bảo quản Hình 3.7 Sơ đồ quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận hoạt chất SFN Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 67 Viện đại học Mở Hà Nội quy mơ phịng thí nghiệm (5 kg/mẻ) b) Thuyết minh quy trình - Lựa chọn nguyên liệu: Rau mầm súp lơ xanh (thu hoạch sau gieo ngày thu mua vùng trồng rau sạch, có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng; phân tích kiểm tra hàm lượng kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, vi sinh vật Chọn rau cịn tươi, khơng bị dập nát, thối hỏng Rau sau thu hoạch vận chuyển nơi sơ chế làm Rau đựng túi nilon đục lỗ đặt thùng nhựa có lỗ - Xử lý sơ nguyên liệu: Rau nguyên liệu cắt bỏ phần rễ, làm tạp chất (rửa nước bể siêu âm, tần số sóng siêu âm 40kHz, công suất siêu âm 1800W, nhiệt độ nước rửa 30oC) Để nước tự nhiên - Làm nhỏ nguyên liệu: Rau nghiền nhỏ (kích thước rau nguyên liệu từ 35mm) nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào mơ, giải phóng tạo điều kiện cho enzyme Myrosinase hoạt động chuyển hóa chất - Làm khơ ngun liệu: Sau rau làm khơ đến độ ẩm - 10% sấy bơm nhiệt nhiệt độ 55oC 48h thu mẫu rau nguyên liệu xử lý Rau bảo quản túi nilon (PVC) thời gian không tháng - Thủy phân acid: Rau nguyên liệu nghiền nhỏ bổ sung dung dịch ascorbic acid nồng độ 0,02 % điều chỉnh pH 6,5 chlohydric acid, bổ sung 0,1g sodium sulfide Quá trình thủy phân glucosinolate 40 phút nhiệt độ thường, tốc độ khuấy 100 vòng/phút - Tách chiết hoạt chất SFN dung mơi kết hợp với sóng siêu âm: Q trình thực hệ thống thiết bị tách chiết siêu âm có điều chỉnh nhiệt độ Tách chiết hoạt chất SFN tiến hành hai lần: lần thực nhiệt độ 40oC, cơng suất sóng siêu âm 320W, tần số sóng siêu âm 20 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 68 Viện đại học Mở Hà Nội KHz 45 phút; nguyên liệu sau tách chiết lần xong tiến hành tách chiết lần Sử dụng dung môi tách chiết ethyl acetate, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu = 4/1 Tách chiết thời gian 45 phút, nhiệt độ 40oC, pH môi trường 7,0 Sau đó, lọc qua NaCl Na2SO3 thu dịch chiết chứa SFN Phần bã sử dụng để tách chiết lần thứ với điều kiện tách chiết lần thứ - Thu hồi dịch chứa hoạt chất sinh học: Dịch chiết chứa SFN ly tâm loại bỏ số tạp chất 10.000 vòng/phút, phần dịch lọc đem cô đặc điều kiện chân không nhiệt độ ≤ 55oC đến nồng độ SFN dịch chiết ≥ 40% thu dịch cô đặc chứa SFN - Làm dịch cô đặc chứa SFN: Dịch cô đặc chứa SFN làm than hoạt tính nồng độ 2%, loại bỏ màu thời gian 30 phút nhiệt độ 50oC Sau trình làm đặc, dịch chứa hoạt chất SFN có màu vàng sẫm Dịch sau làm than hoạt tính tiếp tục sử dụng nhựa hấp phụ trao đổi anion Amberlite IRA 400 để làm sạch, thu chế phẩm chứa hoạt chất SFN - Thu nhận chế phẩm chứa hoạt chất SFN: Tiến hành sấy chân không để thu nhận chế phẩm chứa hoạt chất SFN Sấy nhiệt độ 50oC Sau sấy, độ ẩm chế phẩm đạt 4,5 - 5% - Phân tích, đánh giá chất lượng chế phẩm chứa hoạt chất SFN + Chỉ tiêu cảm quan: màu vàng nhạt, trạng thái mịn, tơi xốp, mùi vị hăng đặc trưng + Chỉ tiêu hóa lí: Độ ẩm: 4,8% Hàm lượng SFN: 77,6% Hàm lượng nitrat (NO3): 60mg/kg Hàm lượng kim loại nặng: Arsen (As) mg/kg, Chì (Pb) 0,1 mg/kg, Thủy ngân (Hg) mg/kg, Cadimi (Cd) 0,05 mg/kg Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 69 Viện đại học Mở Hà Nội + Chỉ tiêu vi sinh: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (Cfu/g) 2,34.102; Coliforms (Cfu/g) Khơng phát hiện; E coli (Cfu/g) Không phát hiện; Salmonella (Cfu/25g) Không phát hiện; Tổng số bào tử nấm men - nấm mốc (Bào tử/g) 23,0 - Bảo quản: Sản phẩm bảo quản nhiệt độ mát 10 - 20oC loại bao bì có khả chống hút ẩm, chống ánh sáng lọ thủy tinh màu, bao bì tráng nhơm lớp dán kín, 3.3.5 Bước đầu đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn H pylori gây viêm loét dày chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN điều kiện in vitro Chế phẩm chứa hoạt chất sinh học Sulforaphane (hàm lượng 77,6%) ký hiệu Sulfo sử dụng trình đánh giá hiệu phòng chống vi khuẩn H pylori gây viêm loét dày chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN điều kiện in vitro a, Tác dụng chống loét tá tràng chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN Kết nghiên cứu tác dụng chống loét tá tràng chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN chuột cống trắng trình bày bảng 3.14 Bảng 3.14 Tác dụng chế phẩm SFN lên số loét tá tràng Lô Số Số ổ loét Mức độ loét Diện tích ổ chuột TB (N) trung bình lt cịn (S) trung bình sống (mm2) Lô 1: Chứng 10 0 (n = 10) Lơ 2: Mơ hình 13 2,1 ± 0,6 1,7 ± 0,6 16,4 ± 12,7 (n = 18) Lô 3: 14 1,1 ± 0,9* 1,3 ± 1,0 10,3 ± 10,2 Ranitidin (n = 18) Lô 4: HPmax 11 1,9 ± 0,5 1,5 ± 0,6 12,8 ± 5,9 (n = 18) Chỉ số loét (I) 5,4 ± 1,9 3,4 ± 2,5* 4,6 ± 1,4 * Ghi chú: - Khác biệt so với lô chứng sinh học (lô 1) *: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01; ***: p ≤ 0,001 - Khác biệt so với lơ mơ hình (lơ 2) ∆: p ≤ 0,05; ∆∆: p ≤ 0,01; ∆∆∆: p ≤ 0,001 Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 70 Viện đại học Mở Hà Nội Qua kết bảng 3.14 cho thấy: Số ổ loét, mức độ loét, diện tích ổ lt trung bình số lt có xu hướng giảm so với lơ mơ hình, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Nghiên cứu khả chống loét tá tràng thực mơ hình gây lt tá tràng cysteamin Nghiên cứu mơ hình thực nghiệm chế phẩm Sulfo với liều 470,0mg/kg/ngày (liều tương đương với liều dự kiến dùng người), kết cho thấy số ổ loét, diện tích ổ lt trung bình số lt có xu hướng giảm so với mơ lơ hình b, Tác dụng diệt vi khuẩn H pylori chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN Kết nghiên cứu tác dụng diệt vi khuẩn H pylori chế phẩm chứa hoạt chất sinh học SFN trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Tác dụng diệt vi khuẩn H pylori chế phẩm SFN Nồng độ dung dịch Sulfo Số lượng Đường kính vịng vơ khuẩn (g/mL) chuột (mm) 1,7 10 5,5 ± 0,97 3,3 10 6,7 ± 2,16 5,0 10 11 ± 3,02 6,7 10 12,8 ± 4,63 Qua kết nghiên cứu bảng 3.15 cho thấy: Khả diệt vi khuẩn H pylori chế phẩm chứa hoạt chất SFN có liên quan thuận với nồng độ của chế phẩm in vitro Dung dịch SFN có tác dụng diệt vi khuẩn H pylori phụ thuộc vào nồng độ chế phẩm, nồng độ dung dịch SFN 1,7 (g/mL) đường kính vịng vơ khuẩn đạt 5,5 ± 0,97 (mm); nồng độ dung dịch SFN 6,7 (g/mL) đường kính vịng vơ khuẩn đạt 12,8 ± 4,63 (mm) Như nồng độ chế phẩm cao tác dụng ức chế vi khuẩn H pylori mạnh Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 71 Viện đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: 4.1 Kiến nghị Lựa chọn rau nguyên liệu tuổi rau thích hợp chứa hàm lượng hoạt chất cao là: rau mầm súp lơ xanh, thu hoạch sau gieo ngày Hàm lượng hoạt chất SFN đạt 1480mg/100g CK Khảo sát số thông số trình tách chiết hoạt chất sinh học Sulforaphane: - Sử dụng máy siêu âm (công suất 500W, tần số sóng siêu âm 20kHz) để tách chiết hoạt chất SFN - Dùng ascorbic acid nồng độ 0,02% để chuyển hóa GLS thành SFN - Q trình tách chiết hoạt chất SFN thực sau: dung môi tách chiết ethyl acetate; tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 4/1; số lần tách chiết 02 lần; pH môi trường tách chiết hoạt chất SFN 7,0; nhiệt độ tách chiết 40oC; thời gian tách chiết 45 phút Thu hoạt chất SFN đạt 2538,9mg/100g chất khô, hiệu suất tách chiết đạt 84,3% Bước đầu đánh giá hiệu phịng chống vi khuẩn Helicobacter pylori chế phẩm có chứa hoạt chất sinh học Sulforaphane điều kiện in vitro với liều 6,7mg/ml tạo vịng vơ khuẩn có đường kính là: 12,8 ± 0,63 mm Đề tài xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết hoạt chất SFN quy mơ phịng thí nghiệm (5kg ngun liệu/mẻ) 4.2: Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp tách chiết, thu nhận, làm dịch tách chiết, điều kiện bảo quản thích hợp - Nghiên cứu mở rộng quy trình tách chiết chế phẩm chứa hoạt chất SFN để ứng dụng vào sản xuất quy mô pilot Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 72 Viện đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, Nhà xuất Khoa học - Kỹ thuật Hà Nội (2004) Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học - Kỹ thuật (1995) Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Quốc Khánh, Lê Thị Lan Oanh, Viện Công nghệ sinh học, Khảo sát Polysacarit số thuốc, Kỷ yếu - Annual Report, 520-529, (2001) Vũ Thị Thu Hiền (2012) Nghiên cứu số chất kháng oxy hóa rau mầm họ cải Luận văn thạc sỹ Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Nguyễn Đình Lục, “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị siêu âm công suất 1,5KW ứng dụng làm sạch, chiết suất hợp chất tự nhiên từ củ họ gừng” Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ (2006) Nguyễn Đức Tiến, Nguyễn Tất Thắng, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất số sản phẩm thực phẩm chức năng” Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Báo cáo kết đề tài cấp Bộ (2006) Nguyễn Đức Tiến, “Hồn thiện cơng nghệ sản xuất cao nấm Linh chi trà nấm Linh chi hòa tan”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp tỉnh (2012) Lê Ngọc Tú (Chủ biên), Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cần (2001) Hóa học thực phẩm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phạm Xuân Vượng, Trần Như Khuyên, Giáo trình kỹ thuật sấy nơng sản Nhà xuất nông nghiệp (2006) Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 73 Viện đại học Mở Hà Nội 10 Sulforaphane - Wikipedia, the free encyclopedia en.wikipedia.org/wiki/Sulforaphane 11 Fahey J.W., Talalay P., 1999 Antioxidant functions of sulforaphane: a potent inducer of phase II detoxifi-cation enzymes Food Chem Toxicol, 37, 973-979 12 Myzak M.C., Tong P., Dashwood W.M., et al., 2007 Sulforaphane retards growth of human PC-3 xenografts and inhibits HDAC activity in human subjects Exp Biol Med, 232, 227-234 13 Shankar S., Ganapathy S., Srivastava R., 2008 Sulforaphane enhances the therapeutic potential of TRAIL in prostate cancer orthotopic model through regulation of apoptosis, metastasis, and angiogenesis Clin Cancer Res, 14, 6855-6865 14 Liang H, Li C., Yuan Q., Vriesekoop F., 2007 Separation and Purification of Sulforaphane from Broccoli Seeds by Solid Phase Extraction and Preparative High-Performance Liquid Chromatography J Agric Food Chem., 55 (20), 8047-8053 15 West et al., 2002 J Chromatography A, 966, 227-232 16.http://www://thucphamchucnang.org.vn/nghien%20thuoc.html Trần Hữu Thị, Lê Doãn Diên, Phạm Thị Mai, Vũ Thị Nhị, 2007 Thực phẩm chức năng: Hợp chất lưu huỳnh chiết xuất từ loại rau cải họ chữ thập có ích cho người nghiện thuốc 17.http://www.tin247.com/tim_thay_hoat_chat_phong_cong_ung_thu_trong _cai_hoa_xanh-4-62124.html Mỹ Hằng, 2008 Tìm thấy hoạt chất phịng chống ung thư cải hoa xanh 18 http://www.saigondautu.com.vn/Pages/20150521/Nghich-ly-rau-sachNguoi-dung-can-nguoi-ban-kho.aspx Bùi Thị Thúy Quỳnh Page 74