Đóng góp vào nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thuốc nhó đông morinda longissima y z ruan

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo LỜI MỞ ĐẦU Dân tộc ta có bề dày lịch sử dựng nước giữ nước, để tồn phát triển, từ ngàn đời này, người phải chống chọi với thiên nhiên bệnh tật y học chưa phát triển, người sống chủ yếu dựa vào thiên nhiên, lấy thảo mộc làm thuốc phòng chữa bệnh Do mà thuốc giữ vị trí quan trọng đời sống người, qua nhiều hệ đúc kết nhiều kinh nghiệm quý báu cho y học Mặt khác thuốc nguồn nguyên liệu quan trọng phuc vụ cho công nghệ bào chế, chiết xuất sản xuất thuốc Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ khoa học, kỹ thuật, y học giới nước phát triển mạnh, thuốc tổng hợp bán tổng hợp phong phú chủng loại, mẫu mã đa dạng, tiện lợi, thay hết loại thuốc có ngn gốc từ dược liệu Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu có tính ưu việt như: độc, tác dụng khơng mong muốn Vì khơng nguồn gốc dược liệu bán tổng hợp, tổng hợp chất theo cấu trúc hợp chất tự nhiên Đánh giá vai trò hợp chất tách chiết thực vật ứng dụng y tế theo số liệu khảo sát gần 50% dược phẩm sửdụng để chữa bệnh hay thử nghiệm lâm sàng Mặc dù có ghi chép tác dụng điều trịcủa sốcây thuốc nhìn tổng thểsốlượng nghiên cứu hóa thực vật cách chi tiết cịn khiêm tốn, số lượng hoạt chất liên quan trực tiếp đến tác dụng điều trị thuốc phát cịn Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa điều kiện thuận lợi tạo nên đa dạng cho giới thực vật.Theo số liệu thống kế thảm thực vật Việt Nam có 12.000 lồi 3.200 lồi ứng dụng làm thuốc Một vấn đề lớn đặt cho nhà nghiên cứu hóa sinh hữu hóa học hợp chất thiên nhiên cần phải phát triển nhiều phương pháp nghiên cứu mới, đại, để nhanh chóng đánh giá nguồn tài nguyên Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo thực vật Việt Nam, bước đầu có đóng góp quan trọng vào nghiên cứu hóa hữu cơ, hóa sinh, y dược giới Trong số 10 bệnh nguy hiểm bệnh gan gây tỉ lệ tử vong cho người đứng hàng thứ ba sau tim mạch ung thư Điều quan trọng gan là nơi dự trữ lượng, chuyển hóa chất, tổng hợp protein, cố định hormon, thuốc, đào thải chất độc chất vi khuẩn Bệnh lý gan bao gồm viên gan cấp, viêm gan mạn, gan nhiễm mỡ, xơ gan, ung thu gan phổ biến Trong viêm gan virut B bệnh hay gặp nhất, hậu lâu dài dẫn tới xơ gan ung thư gan Trong kho tàng y học cổ truyền dân tộc có thuốc chữa bệnh gan nói chung viêm gan B nói riêng Việc tìm kiếm phát tác nhân chống viêm gan B từ nguồn thuốc cổ truyền nhà khoa học giới quan tâm Cây Nhó đơng (Morinda longissimaY.Z.Ruan) thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), dược liệu quý trồng Sơn La, Lai Châu Bộ phận dùng làm thuốc loài rễ, thu hái quanh năm, với tác dụng nhiệt, giải độc, kiện tỳ, hoạt huyết, tiêu viêm, tán ứ, chữa viên gan, vàng da, xơ gan Tính đến nay, nghiên cứu lồi Việt Nam cịn sơ khai, chưa làm rõ giá trị khoa học lồi Với mục đích xác định giá trị quý báu loài thuốc này, chúng tới tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đóng góp vào nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học thuốc Nhó đơng (Morinda longissimaY.Z.Ruan)” Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Morinda 1.1.1 Sơ lược chi Morinda Chi Morindalà chi thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Tên chi bắt nguồn từ chữ Latin Morus “dâu”, có nguồn gốc từ Borneo, New Guinea, phía bắc Australia, New Caledonia [8] Trên giới có khoảng 65 loài thực vật thuộc chi Morinda, phân bố khắp vùng nhiệt đới Á nhiệt đới, từ Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Indonesia, Philippin, Ấn Độ, Úc đảo Thái Bình Dương [1] Tại Việt Nam, chi Morinda Phạm Hoàng Hộ (2000) ghi nhận gồm loài: M citrifolia, M cochinchinensis, M officinalis, M parvifolia, M persicaefolia, M tomentosa, M trichophylla, M villosa, M.umbellata [2] • Morinda citrifolia L var bracteata (Cây Nhàu, Indian Mulberry): Là loại gỗ đứng, cao 4-8 m Cành non màu xanh, tiết diện vng, có rãnh, nhẵn, cành già tiết diện tròn, màu nâu xám Lá đơn, mọc đối Phiến to, hình bầu dục hai đầu thuôn nhọn, dài 15-30 cm, rộng 10-15 cm Lá màu xanh bóng đậm mặt trên, mặt nhạt Bìa dợn sóng.Gân hình lơng chim, rõ mặt dưới, 6-7 cặp gân phụ Cuống 1-2 cm Lá kèm nằm mọc đối, hình xoan, cao 1-1.5 cm, màu xanh nhạt Cụm hoa đầu hình trịn hay bầu dục, ngồi nách Trục cụm hoa hình trụ, màu xanh, nhẵn, dài 12 cm Đáy cụm hoa có phiến hẹp, dài 5-8 mm Hoa đều, lưỡng tính Đài hoa gờ tròn Cánh hoa 5, ống tràng hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7-12 mm, bên có nhiều lơng trắng, thùy dài khoảng 5-8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ mấu nhỏ cong vào Khi hoa nở thùy cong xuống phía dưới, tiền khai van Nhị 5, nhau, rời, gắn phần loe ống tràng xen kẽ với cánh hoa, nhị ngắn Bao phấn hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng mm, ô, mở dọc, hướng trong, đính gốc Hạt phấn rời, hình hình cầu, màu vàng nhạt.Lá nỗn 2, vị trí trước sau, bầu dưới, ơ, nỗn, đính trung trụ.Vịi đầu nhụy Vòi nhụy dạng sợi màu xanh nhạt, dài Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo mm, đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài mm, màu xanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng Quả hạch kép bầu noãn phần đài hoa cụm hoa dính tạo thành Quả non màu xanh nhạt, dài 5-7 cm, rộng 3-4 cm Quả già màu ngà vàng, nhẵn bóng, mùi khai, cịn vết tích đĩa mật Hạt nhiều, hình bầu dục, đầu nhọn, màu nâu đen Sinh học sinh thái: Ra hoa quanh năm, nhiều tháng 11 đến tháng 2, cho từ tháng đến tháng Phân bố: Được tìm thấy chủ yếu vùng nhiệt đới thuộc Châu Á Châu Úc, đặc biệt Trung Quốc Ấn Độ Ở Việt Nam, mọc hoang khắp nơi, có trồng Cây thường dựa nước, có nhiều miền Nam, theo Petelot cịn có miền Bắc, gần cịn thấy Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế Bộ phận dùng: Rễ, quả, lá, vỏ • Morinda cochinchinensis DC (Nhàu Nam bộ, Ba kích lơng): Là lồi thực vật có hoa họ Tiến thảo.Lồi Augustin Pyramus de Candolle mô tảkhoa học năm 1830 Là lồi tiểu mộc, thân có lơng vàng dày, nằm Lá có phiến thon, chót có dài 5-10 mm, đen lúc khơ, hai mặt có lơng vàng, dày gân chính, gân phụ 10-12 cặp, cuống dài 4-10 mm, bẹ mỏng, nhọn, có lơng Tán 5-8, tán mang 30-40 hoa,cong 3-3 cm, hoa không gọng, lúc khô đen, đài cao 1.5 mm, vành có ống cao 2.2 mm,trắng Hợp to vào cm, vàng chín • Morinda officinalis How (Nhàu thuốc, Ba kích thiên): Là lồi thảo, sống lâu năm, leo thân quấn Thân non mầu tím, có lơng, phía sau nhẵn Cành non, có cạnh Lá mọc đối, hình mác bầu dục, thn nhọn, cứng, dài 6-14 cm, rộng 2.5-6 cm, lúc non mầu xanh lục, già mầu trắng mốc Lá kèm mỏng ôm sát thân Hoa nhỏ, lúc non mầu trắng, sau vàng, tập trung thành tán đầu cành, dài 0.3-1.5 cm, đài hoa hình chén hình ống gồm đài nhỏ phát triển khơng Tràng hoa dính liền phía thành ống ngắn.Quả hình cầu, chín mầu đỏ, mang đài cịn lại đỉnh Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo Sinh học sinh thái: Mùa hoa vào tháng đến tháng 6, mùa vào tháng đến tháng 10 Thu hái: Ba Kích trồng năm thu hoạch Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11 Dùng cuốc đào rộng xung quanh gốc, lấy toàn rễ rửa sạch.Loại rễ to, mập, cùi dầy, mầu tía loại tốt.Rễ nhỏ, gầy, cùi mỏng, mầu loại vừa Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô Phân bố: Cây mọc hoang trồng số vùng đồi núi nước ta • Morinda parvifolia Bartl (Nhàu nhỏ): Là loại leo, cành non có lơng mịn màu vàng Lá mọc đối, phiến xoan ngược, dài 2-6 cm, rộng 1-1.5 cm, gân phụ 4-5 cặp, cuống dài 4-8 mm, kèm mỏng Cụm hoa gồm 2-6 đầu nhỏ 5-8 mm cuống dài 1-2.5 cm, đầu có 4-8 hoa màu trắng, nụ cao mm Quả hợp xám vàng cam hay hồng, đường kính 8-10 mm Bộ phận sử dụng: Rễ Phân bố: Loài phân bố Nam Trung Quốc Việt Nam Ở nước ta gặp Quảng Bình • Morinda persicaefolia Buch-Ham Var oblonggifolia Pit (Nhàu nước): Cây mọc thành bụi cao 0.5-1 m, khơng có lơng, màu nâu Lá mọc đối, có chụm 3, nhọn chóp, có có khía sâu, dài tới 11.5 cm, rộng tới cm Lá kèm dính Hoa trắng xếp thành đầu đối diện với Quả kép hình trứng xù xì, dài gần cm, rộng 2.5 cm, gồm nhiều hạch Bộ phận dùng: Rễ Phân bố: Phân bố chủ yếu vùng Ấn Độ-Mã Lai, mọc hoang nhiều ven đường dựa bờ nước, bờ ruộng, nơi ẩm thấp, úng ngập không chết không ưa đất phèn Sinh học sinh thái: Cây phát triển nhanh, mạnh rộng khắp theo dịng nước trơi khắp nơi; tái sinh dễ dàng rễ Thu hoạch rễ Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo vào mùa khơ, tốt nên dùng loại rễ lớn có đường kính 1cm Ra hoa từ tháng đến tháng 5, từ tháng đến tháng • Morinda tomentosa Heyn(Nhàu nhuộm, Nhàu lơng): Là lồi nhỡ hay gỗ nhỏ Lá thuôn cong hay hẹp bầu dục, nhọn hai đầu, nhẵn hay có lơng mềm ráp, dài 8-20 cm, rộng 3-8 cm, hoa trắng, thành đầu thường đơn độc (đối diện với lá) nách lá, thành chuỳ Quả gồm hạch dính nhau, hình cầu hay hình trứng, rộng 1.52.5 cm, có bề mặt xù xì, với hạch có màng hố gỗ, chứa hạt ô Bộ phận dùng: Rễ, vỏ Phân bố: Tìm thấy chủ yếu nước Đông Dương Thái Lan, Ấn Độ, Mianma Ở nước ta, thường mọc rừng thưa, rừng thưa Tây Nguyên (Kontum), tỉnh Nam Trung đến Tây Ninh Sinh học sinh thái: Ra hoa từ tháng 11 đến tháng 4, từ tháng đến tháng • Morinda trichophylla Merr (Nhàu có lơng): Là nhánh non có lơng mịn, có phiến bầu dục, dài cỡ 10 cm, có lơng gân, nâu đen lúc khơ, gân phụ 11 cặp, cuống dài cm, mảnh, bẹ cao cm, mỏng Tán 9-10, nhỏ, cọng dài 3-4 cm, nỗn sào có lơng, buồng nỗn, vành có ống có lơng trong, dài mm Phân bố: Ninh Bình (chợ Gành) • Morinda villosa Hook(Nhàu lơng, Gạch): Là loại nhỏ, có lơng.Cành non gần cạnh, màu nâu, có lơng cứng, sau nhẵn xám đen.Lá hình bầu dục, thn hay trái xoan rộng, có mũi nhọn đỉnh, trịn khơng đối xứng gốc, màu nâu lục mặt trên, nhạt có nhiều lơng mặt dưới, gân, kèm hình ống mềm, có lơng.Hoa tập hợp 5-12 đầu cành.Hoa màu trắng.Đài 4-5 khơng nhau.Tràng 4-5 cong ngồi, ống tràng có lơng họng Nhị 4-5 Bầu ơ, chứa nỗn.Quả kép, gần hình cầu, gồm nhiều hạt dính Bộ phận dùng: Tồn Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo Phân bố: Phân bố chủ yếu miền Đông Dương Ấn Độ, Việt Nam mọc hoang dọc bờ sông Vĩnh Phú, Hồ Bình Sinh học sinh thái: Cây hoa tháng 5-6, chín tháng Thu hái tồn quanh năm, phơi khơ • Morinda umbellata L (Nhàu tán, Mặt quỷ): Cây mọc toả hay leo, tới 10 m Lá hình trái xoan ngược rộng, thn, bầu dục, hay hình dải-ngọn giáo, thót lại gốc, tù nhọn hay có nhọn mũi đầu, dài 2-12.5 cm rộng tới 4cm, nhẵn hay có lơng mặt dưới, gân phụ 4-6 cặp, cuống dài cm, kèm hình tam giác, cao 2-5 mm Hoa xếp thành đầu đường kính khoảng mm nhánh hay xếp hình tán Hoa trắng, tràng có ống có lơng vùng cổ, thuỳ thon Quả gồm hạch dính nhau, rộng 8-10 mm, gần hình cầu, dẹp, có bề mặt sù xì, với nhân cao mm, dày mm Hạt nhân Bộ phận dùng: Toàn Phân bố: Loài phân bố Ấn Ðộ, Trung Quốc Việt Nam Thường gặp mọc bờ đất chân đồi ven suối, ven rừng đồng bằng, tán gỗ Cũng gặp mọc bị bụi nơi đất khơ trãi nắng miền trung du từ Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hồ Bình, Ninh Bình qua Thanh Hố, Nghệ An đến Gia Lai Sinh học sinh thái: Thu hái rễ vào mùa xuân, mùa thu, rửa sạch, loại bỏ rễ con, ngâm nước ấm, cắt ngắn phơi Ra hoa quanh năm 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Morinda: Morinda chi thực vật có hoa thuộc họ cà phê, Rubiaceae Đặc điểm chung đơn, mép nguyên, mọc đối có kèm, tràng hợp, nhị nhiều hơn, nhị trước cánh hoa, bao phấn ô, rời, mở dọc Bầu hạ, nhiều nỗn có giảm cịn nỗn, đính nỗn trung trụ, đính nỗn bên, hạt có nội nhũ [3] Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo 1.1.3 Phân bố chi Morinda: Được tìm thấy chủ yếu vùng nhiệt đới châu Á châu Úc, nước Đông Dương Ở nước ta mọc hoang ven đường vùng đồi núi, có người dân trồng 1.1.4 Tác dụng dược lý chi Morinda: Hầu hết dược tính chi Morinda biết đến thông qua nghiên cứu loài vốn biết đến thuốc sử dụng nhân dân nhiều nước thuộc khu vực Đông dương Châu Á Nhân dân ta nhiều nơi có truyền thống dùng rễ Nhàu thái mỏng phơi khô sắc uống để trị đau lưng, phong thấp Nhiều người dùng trái Nhàu chín chấm muối ăn với công dụng Phụ nữ số vùng cịn ăn trái Nhàu chín để làm nhuận trường, họat huyết điều hòa kinh nguyệt Giáo sư Caujolle – Giám đốc Trung tâm khảo cứu Quốc gia Pháp độc tính chất cộng thí nghiệm vật ni nhận thấy tinh chất rễ Nhàu có tác dụng nhuận trường nhẹ lợi tiểu nhẹ, làm êm dịu thần kinh, hạ huyết áp kéo dài Sách “Gia y trị nghiệm” lương y Việt Cúc có ghi “rễ Nhàu vị đắng, ấm, thông huyết mạch, trừ phong tê nhức mỏi, hạ huyết áp” Trên thực tế, dùng độc vị phối hợp với số vị thuốc khác, rễ Nhàu có hai tác dụng đáng lưu ý dưỡng tâm an thần thông kinh hoạt huyết.Những người thường hay căng thẳng tâm lý, dễ bực bội, cáu gắt, khó ngủ, dùng rễ Nhàu cảm thấy tinh thần êm dịu, thư giãn dễ ngủ Ngược lại, số bệnh nhân bình thường hay lo sợ vu vơ, buồn bực, than vãn sắc rễ Nhàu uống, làm cho họ cảm thấy tươi tỉnh lạc quan Quả nhàu có tác dụng nhuận trường, lợi tiểu, kích thích tiêu hóa, trừ thấp nhiệt, điều kinh Thường dùng để trợ tiêu hóa, chống táo bón, điều hịa kinh nguyệt, chữa bạch đới, băng huyết, phụ trợ chữa đái tháo đường, cao huyết áp Ngồi cịn chữa đau gân, ho cảm, lỵ Người ta dùng nhàu chín chấm muối để ăn nướng chín để ăn Quả nhàu non thái lát mỏng ngâm rượu, uống chữa Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo phong thấp, đau lưng.Quả nhàu khơ cịn ngâm rượu.Mỗi ngày uống lần, lần muỗng (thìa) canh, trước sau bữa ăn Hoặc đâm nhỏ nhàu khô dùng pha trà uống ngày thay trà Lá nhàu có tác dụng làm tăng lực, hạ sốt, làm êm dịu điều kinh Thường dùng chữa lỵ, tiêu chảy, cảm sốt, nấu canh để ăn bổ dưỡng Dùng ngoài, rửa thật sạch, giã nát đắp giúp vết thương mau lành, vết loét, làm mau lên da non Hoặc lấy dịch thấm vào vải gạc đắp chữa viêm khớp đau nhức.Ngày dùng 12-20g sắc uống.Dùng ngồi khơng kể liều lượng [4] Theo sách Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam nghiên cứu Ba kích (Morinda officinalis How) với bệnh nhân nam có hoạt động sinh dục khơng bình thường, Ba kích có tác dụng làm tăng khả giao hợp Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, khơng làm tăng địi hỏi tình dục, khơng thấy có tác dụng kiểu Androgen Tuy không làm thay đổi tinh dịch đồ thực tế có tác dụng hỗ trợ cải thiện hoạt động sinh dục điều trị vơ sinh cho nam giới có trạng thái vơ sinh tương đối suy nhược thể lực.Còn trường hợp tinh dịch ít, tinh trùng chết nhiều, khơng có tinh trùng, khơng xuất tinh giao hợp xử dụng Ba kích chưa thấy kết Đối với thể người tuổi già, bệnh nhân không biểu mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu mà khơng thấy có yếu tố bệnh lý gây nên số trường hợp có đau mỏi khớp, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt, thể qua cảmgiác chủ quan đỡ mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon dấu hiệu khách quan tăng cân nặng, tăng lực.Còn bệnh nhân đau mỏi khớp sau dùng Ba kích dài ngày, triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt 1.1.5 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Morinda Các nghiên cứu nước: Với mục đích xác định giá trị quý báu thuốc q Nhó đơng nói riêng chi Morinda nói chung nghiên cứu hóa thực vật nhằm tìm Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo hoạt chất có tác dụng sinh học tiến hành từ lâu, nhiên số lượng quy mơ nghiên cứu cịn sơ khai Năm 2004, luận án tiến sĩ tác giả Phạm Minh Hưng phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ rễ loài Morinda longissima scopoletin (1), emodin (2), 1,3-dihydroxy-4-ethoxy methyl anthraquinone (3) βsitosterol (4) [5]: Phân tích thành phần hóa học mẫu cành, loài Đơn mặt quỷ (Morinda umbellate L.) mọc vườn quốc gia bạch mã, nhóm nghiên cứu Vũ Hương Giang cộng phân lập hợp chất Umbellatolides A (5), Umbellatolides B (6), Deacetylasperulosidic acid (7), 4-Epi-borreriagenin (8) 1-C-Syringyl-glycerol (9) [6] 10 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo cho thí nghiệm xác định hàm lượng MDA gan Đồng thời phần gan lại được cố định Formol 10% cho thí nghiệm làm tiêu mơ gan Xác định hàm lượng MDA gan: Xác định hàm lượng MDA gan tiến hành theo phương pháp củaOkawa H, et al., (1979) có hiệu chỉnh Cụ thể sau: Gan nghiền tạo thành dịch đồng thể dung dịch KCl 1.15% theo tỉ lệ 1:10 (Gan: KCl 1.15%) nhiệt độ -50C Lấy ml dịch đồng thể, thêm vào ml dung dịch Tris - HCl, ủ 370C Kết thúc phản ứng ml tricloacetic acid 10%, ly tâm 5000 vòng/phút phút, lấy ml dịch cho phản ứng với ml thiobarbituric acid 0.8 % 95-1000C 15 phút đo màu λ = 532 nm Tính tốn kết quả: Hàm lượng MDA (nM/ml) tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0.0637x – 0.0029 (R2 = 0.9981) CnMMDA/ml dịch đồng thể= (ODthử + 0.0029)/0.0637 Sau tính hàm lượng MDA (nM/ml dịch đồng thể) Phương pháp làm tiêu mô gan: Được tiến hành theo phương pháp Robert Domitrović et al., (2009) Cụ thể sau: Gan chuột thí nghiệm sau mổ cố định Formol 10%, nhúng paraffin cắt thành lát dày khoảng µm nhuộm hematoxylin and eosin (H&E) Quan sat tiêu nhuộm kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 200X Tiêu đạt u cầu phải có nhân bắt màu tím xanh Hematoxylin, tế bào chất bắt màu hồng Eosin Xử lý số liệu Các số liệu xử lý Excell, thuật toán thống Student's t-test, F’test Nếu p0.05 sai khác khơng có ý nghĩa thống kê 31 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều tra thực vật Rễ Nhó đơng (Morinda longissima) thu hái vào tháng 12 Sơn La (số tiêu C-520) Tên nhà thực vật học Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu giám định Mẫu rễ lấy rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, sấy khô râm nhiệt độ 40 0C, xay nhỏ thành bột 3.2 Xác định cấu trúc phân lập Từ cao chiết etylaxetat, phương pháp sắc ký mỏng sắc ký cột phân lập xác định cấu trúc hợp chất bao gồm: 3.2.1 Cấu trúc hợp chất (MO-1) H-NMR (500 MHz, CDCl3,δ ppm): 4.13 (3H, s, 1-OCH3), 7.68 (1H, s, H-4), 7.77 (1H, t, 7.5 Hz, H-6), 7.83 (1H, t, 7.5 Hz, H-7), 8.25 (1H, d, 7.5 Hz, H-5), 8.3 (1H, d, 7.5 Hz, H-8), 10.47 (1H, s, H-11), 12.28 (1H, s, 3-OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm): 64.74 (q, 1-OMe), 113.14 (d, C4), 117.72 (s, C-9a), 118.11 (s, C-2), 127.14 (d, C-5), 127.42 (d, C-8), 132.55 (s, C-10a), 133.67 (d, C-6), 134.85 (d, C-7), 134.94 (s, C-8a), 141.71 (s, C-4a), 166.68 (s, C-3), 166.71 (s, C-1), 180.21 (s, C-9), 181.96 (s, C-10), 195.48 (d, C11) 32 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo 3.2.2 Cấu trúc hợp chất (MO-5) H-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 3.33 (3H, s, 11-OMe), 11 (2H, s, H-11), 7.11 (1H, s, H-4), 7.75 (1H, t, 7.5 Hz, H-6), 7.81 (1H, t, 7.5 Hz, H-7), 8.17 (1H, d, 7.5 Hz, H-5), 8.24 (1H, d, 7.5 Hz, H-8) 13 C-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 58.0 (t, C-11), 63.7 (q, 11-OMe), 107.0 (s, C-9a), 114.8 (d, C-4), 117.7 (s, C-2), 127.2 (d, C-8), 127.7 (d, C-5), 134.1 (s, C-10a), 134.8 (s, C-8a), 135.1 (s, C-4a), 135.4 (d, C-6), 136.1(d, C-7), 166.9 (s, C-1), 169.5 (s, C-3), 184.8 (s, C-9), 185.2 (s, C-10) 3.2.3 Cấu trúc hợp chất (MO-7) H-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 2.36 (3H, s, 11-CH3), 7.18 (1H, dd, 8.5; 2.5 Hz, H-7), 7.54 (1H, 2.5 Hz, H-5), 7.57 (1H, d, 8.0 Hz, H-3), 7.68 (1H, d, 7.5 Hz, H-4), 8.20 (1H, d, 8.5 Hz, H-8) 13 C-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 16.02 (q, 11-CH3), 114.13 (d, C5), 116.36 (s, C-9a), 119.80 (d, C-4), 122.62 (d, C-7), 126.07 (s, C-8a), 130.90 (d, C-8), 133.03 (s, C-4a), 135.95 (s, C-2), 137.44 (s, C-10a), 137.56 (d, C-3), 161.86 (s, C-1), 166.53 (s, C-6), 184.04 (s, C-10), 189.32 (s, C-9) 33 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo 3.2.4 Cấu trúc hợp chất (MO-8) H-NMR (500 MHz, CDCl3,δ ppm): 2.37 (3H, s, 11-CH3), 4.03 (3H, s, 5-OMe), 7.34 (1H, d, 8.5 Hz, H-7), 7.51 (1H, d, 7.5 Hz, H-3), 7.69 (1H, d, 9.5 Hz, H-4), 8.14 (1H, d, 8.5 Hz, H-8), 13.01 (1H, s, 1-OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm): 16.07 (q, 11-CH3), 62.36 (q, 5OMe), 114.76 (s, C-2), 118.95 (d, C-4), 119.99 (d, C-7), 125.54 (d, C-8), 125.96 (s, C-10a), 127.15 (s, C-5), 132.43 (s, C-4a), 134.46 (s, C-9a), 136.95 (d, C-3), 146.86 (s, C-8a), 155.99 (s, C-6), 160.69 (s, C-1), 182.00 (s, C-10), 187.87 (s, C9), 3.2.5 Cấu trúc hợp chất (MO-9) O OH 8a 9a 10a 4a 11 CH3 10 OH O Rubiadin H-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 2.18 (3H, s, 11-CH3), 7.28 (1H, s, H-4), 7.82 (1H, m, H-6), 7.86 (1H, m, H-7), 8.21 (1H, dd, 7.0; 1.5 Hz, H-5), 8.30 (1H, dd, 7.0; 1.5 Hz, H-8) 13 C-NMR (500 MHz, DMSO,δ ppm): 8.04 (q, 11-CH3), 107.40 (d, C-4), 117.40 (s, C-2),126.38 (d, C-8), 126.70 (d, C-5), 131.76 (s, C-4a), 132.91 (s, C10a), 133.03 (s, C-8a), 134.44 (d, C-6), 134.55 (d, C-7), 162.46 (s, C-1), 181.87 (s, C-10), 108.97 (s, C-9a), 162.90 (s, C-3), 186.25 (s, C-9) 34 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo 3.2.6 Cấu trúc hợp chất (MO-10) H-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 2.26 (3H, s, 11-CH3), 3.89 (3H, s, 3-OMe), 7.55 (1H, s, H-4), 7.84 (1H, dt, 8.0; 1.5 Hz, H-7), 8.20 (1H, d, 8.0 Hz, H-5), 8.25 (1H, d, 8.0 Hz, H-8) 13 C-NMR (500 MHz, DMSO,δ ppm): 8.99 (q, 11-CH3), 60.59 (q, 3OMe), 109.02 (d, C-4), 117.90 (s, C-2), 126.01 (d, C-5), 126.16 (s, C-9a), 126.61 (d, C-8), 132.06 (s, C-10a), 133.32 (d, C-6), 133.73 (s, C-4a), 134.51 (d, C-7), 134.55 (s, C-8a), 160.62 (s, C-3), 161.65 (s, C-1), 180.16 (s, C-9), 182.61 (s, C-10) 3.2.7 Cấu trúc hợp chất (MO-11) H-NMR (500 MHz, CD3OD,δ ppm): 3.96 (3H, s, 1-OMe), 4.86 (2H, s, H-11), 7.56 (1H, s, H-4), 7.80 (1H, t, 7.5 Hz, H-6), 7.85 (1H, td, 7.5; 1.0 Hz, H7), 8.20 (1H, d, 7.5 Hz, H-5), 8.25 (1H, d, 7.5 Hz, H-8) 13 C-NMR (500 MHz, DMSO,δ ppm): 52.69 (t, C-11), 62.73 (q, 1-OMe), 110.26 (d, C-4), 118.01 (s, C-9a), 126.46 (d, C-5), 127.02 (d, C-8), 128.98 (s, C2), 132.30 (s, C-10a), 133.80 (d, C-6), 134.86 (d, C-7), 135.05 (s, C-8a), 135.75 (s, C-4a), 161.96 (s, C-1), 162.85 (s, C-3), 180.46 (s, C-9), 183.07 (s, C-10) 3.3 Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan HCTN16 35 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo 3.3.1.Kết định lượng AST ALT huyết Sau thời gian gây độc gan CCl4 sau cho uống hoạt chất nghiên cứu nồng độ, chuột thí nghiệm tất lô lấy máu để kiểm tra hàm lượng AST, ALT huyết thanh.Kết nghiên cứu trình bày bảng Bảng 1:Nồng độ AST ALT huyết Lô Sau uống hoạt chất % so với đối chứng bệnh lý AST (UI/L) ALT (UI/L) AST ALT Chứng sinh lý 69.72 ± 6.67 42.57 ± 4.38 - - Chứng bệnh lý 1443.55 ± 146.86 824.73 ± 48.29 0 Chứng tham khảo 196.75 ± 68.52 344.75 ± 83.36 86.37 91.62 HCTN-116: 100 mg 1227.70 ± 118.08 3922.05 ± 39.67 14.86 4.68 HCTN-116: 200 mg 640.75 ± 69.51 1873.75 ± 101.468 55.61 54.46 HCTN-116 liều 200 mg/kgP/ngày có khả làm giảm số AST ALT 55.61% 54.46% so với đối chứng HCTN-116 liều 100 mg/kgP/ngày có khả làm giảm số AST ALT 14.86% 4.68% so với đối chứng 3.3.2.Kết định lượng protein toàn phần huyết Để xác định Protein toàn phần huyết chúng tơi phải pha lỗng huyết 1000 lần, pha đường chuẩn BSA Sau dùng Bradford để xác định nồng độ protein theo hướng dẫn nhà sản xuât Kết xác định dựng đường chuẩn BSA trình bày hình Từ đường chuẩn BSA chúng tơi tính xác định nồng độ protein huyết Kết trình bày bảng 36 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thu Thảo Giá trị OD Đường chuẩn BSA 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 0.025x + 0.020 R² = 0.992 B… 10 20 30 Nồng độ BSA (µg/ml) Hình 2: Đường chuẩn nồng độ BSA Bảng 2: Nồng độ Protein toàn phần huyết sau q trình thí nghiệm Protein TP Lô (mg/ml) Chứng sinh lý 29.26 ± 0.28 Chứng bệnh lý 68.86 ± 0.47 Chứng tham khảo 40.80 ± 3.77 HCTN-116: 100 mg 49.13 ± 3.63 HCTN-116: 200 mg 48.18 ± 6.69 Kết bảng cho thấyProtein toàn phần huyết lô uống HCTN-116 có sự sai khác so với đối chứng bệnh lí (p