ngô hồng duy nghiên cứu thành phần phenolic trong một số loài thuộc họ apiaceae ở miền bắc việt nam

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

HÀ NỘI - 2024

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Người hướng dẫn:

TS Vũ Xuân Giang TS Nguyễn Quang Hưng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến

TS Nguyễn Quang Hưng, TS Vũ Xuân Giang những người thầy đã luôn quan tâm,

dìu dắt tôi từ những ngày đầu thực hiện khóa luận, người đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, tư duy giải quyết vấn đề, niềm đam mê và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học Luôn sẵn sàng lắng nghe, giải đáp, động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi để hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thanh Tùng - giảng viên Bộ

môn Dược Liệu - người đã hỗ trợ, chỉ bảo tận tình, giúp tôi hoàn thiện khóa luận

Tôi chân thành cảm ơn NCS Lê Hương Giang - Đại học Y Đài Bắc đã giúp đỡ tôi trong phần nội dung phân tích nội dung GNPS

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cô, các anh chị, các

bạn, các em tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội; tuy không trực

tiếp hướng dẫn nhưng các thầy cô, các anh chị, các bạn, các em đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc sử dụng dụng cụ, thiết bị và giúp kiến thức, kỹ năng thực nghiệm của tôi ngày một hoàn thiện hơn

Tôi cũng trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các phòng ban cùng toàn

thể các thầy cô đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 2 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Ngô Hồng Duy

Mục lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Heracleum L 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Heracleum L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Heracleum L 2

1.1.3 Vị trí phân bố và sinh thái của chi Heracleum L 3

1.1.4 Công dụng 3

1.1.5 Thành phần hóa học 3

1.1.7 Tổng quan về loài Heracleum bivittatum 5

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của Heracleum bivittatum 5

1.2.2 Thành phần hóa học 6

1.3 Tổng quan về loài Cryptotaenia japonica 6

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân loại 6

1.3.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 6

1.3.3 Thành phần hóa học 6

1.4 Tổng quan về loài Xyloselinum vietnamense và Xyloselinum leonidii

91.4.1 Đặc điểm thực vật, phân loại và phân bố 9

1.4.2 Thành phần hóa học 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 163.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu 163.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 193.3 Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS 22 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Việt (giải nghĩa) Tiếng Anh

Spectrometry

HSQC tương quan lượng tử đơn hạt nhân Heteronuclear single quantum

chromatography

japonica Hassk)

vietnamense Pimenov &

Kljuykov)

H Boissieu)

leonid (Xyloselinum leonidii

Pimenov & Kljuykov)

LC-MS/MS (Sắc ký lỏng kết nối khối phổ hai

lần)

chromatography with tandem mass spectrometry

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp nhóm chất Furanocoumarins một số loài của chi

Heracleum

4

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Áp nhĩ cần và Cần dại

bằng phương pháp thường quy

16

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong TLTG Việt và TLTG

Leonid bằng phương pháp thường quy

18

Bảng 3.3 Kết quả dự đoán thành phần hóa học của Thìa là thân gỗ Việt và

Thìa là thân gỗ Leonid dựa trên mạng dữ liệu phân tử GNPS

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung

môi I: ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước

(100:11:11:26) sau khi phun TT NP/PEG, quan sát ở bước sóng 366nm

21

Hình 3.2 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung

môi II: toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) quan sát

ở: A Bước sóng 254 nm B Bước sóng 366 nm sau khi phun

TT NP/PEG

22

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ Hoa tán (Apiaceae), là một trong những họ thực vật đa dạng và phong phú ở Việt Nam Các loài trong họ này không chỉ đóng vai trò quan trọng trong ngành nông nghiệp, thực phẩm, mà còn có giá trị lớn trong y học cổ truyền Sự đa dạng sinh học của Việt Nam, đặc biệt là ở miền Bắc, cung cấp một môi trường phong phú cho sự phát triển của nhiều loài cây thuộc họ Apiaceae Mặc dù vậy, cho đến nay, nghiên cứu về thành phần hóa học của nhiều loài trong họ Apiaceae ở Việt Nam vẫn còn hạn chế

Do đó, nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam trở nên cần thiết để cung cấp kiến thức quan trọng trong việc hiểu biết và tận dụng tối đa tiềm năng y học và dinh dưỡng của các loài cây này

Hiện nay, loài Cần dại (Heracleum bivitttum H Boissieu); loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk); loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov) và Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov &

Kljuykov) vẫn chưa có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cũng như trên thế giới trong khi

loài Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk) cũng đã được ghi nhận ở Việt Nam

nhưng chưa được nghiên cứu

Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần

Phenolic trong một số loài thuộc họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam” nhằm mục tiêu

cung cấp các cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học để tìm ra các hợp chất có tác dụng sinh học từ các loài này

Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài tiến hành các nội dung sau: - Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu - Chiết xuất cao chiết ethanol 70% từ 4 mẫu nghiên cứu

- Định tính cao chiết bằng sắc ký lớp mỏng - Sơ bộ dự đoán một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Heracleum L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Heracleum L

Theo hệ thống phân loại thực vật hiển hoa (Flowering plants) của tác giả A

Takhtajan (2009) [57] và M Liu, S R Downie (2017) [33], vị trí của chi Heracleum L

trong giới thực vật như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Hoa tán (Apiaceae)

Chi: Heracleum L

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Heracleum L

Chi Heracleum có cây hai năm hoặc lâu năm Rễ hình thoi hoặc hình trụ, phình

to, hiếm khi có xơ Thân mọc thẳng, hình trụ và thường có gân hoặc rãnh, phân nhánh Lá ở gốc và lá phía dưới có cuống; bẹ cuống lá thường rộng dễ thấy; lá thường phân nhánh thành ba lá hoặc lá phân ba, có lông hoặc nhẵn Chùm hoa rộng ở đỉnh và hai bên, ở đỉnh thường mang cả hoa đực và hoa cái, còn ở hai bên thường chỉ có hoa đực; lá bắc ít hoặc không có, thường rụng; tia hoa nhiều, mở rộng và hướng lên; nhiều lá bắc, hình dải hoặc hình mác, nguyên vẹn; chùm nhiều hoa Đài hoa có răng hình tam giác, hình mũi mác hoặc không có Cánh hoa màu trắng, hiếm khi màu hồng hoặc vàng nhạt, hình tim ngược hoặc hình tim, dưới hình nêm, đỉnh có khía với một thùy cong hẹp; các bông hoa ở rìa thường to lớn với cánh hoa bên ngoài phình to, hình tim ngược, đỉnh sâu 2 thùy Phần chóp bầu nhụy hình nón; kiểu ngắn, thẳng đứng hoặc cong xuống Quả hình trứng ngược, hình trứng, hình trứng thuôn hoặc gần bầu dục, lưng dẹt, có lông hoặc nhẵn; các gân phụ và gân trung tâm quả có rãnh sợi, đôi khi phình lên, các gân bên thường có cánh; 1-2 ống tinh dầu trong mỗi rãnh, 2 (-6) hoặc không có ở mép, hẹp, dọc theo đến gốc của quả mầm hoặc hình gậy và ngắn hơn nhiều so với quả mầm Mặt hạt phẳng, hiếm khi hơi lõm Thân quả chia ra gốc, thường bền vững

Đây là một chi phân bố rộng, phức tạp về phân loại với Dãy núi Hengduan tạo thành một trong hai trung tâm đa dạng Việc xác định phân loại của chi này gặp khó

khăn, cả trong Heracleum (nghiên cứu phân tử gần đây đã chỉ ra rằng nó không phải là

đơn nguyên) và với một số chi khác có quả bằng phẳng ở mặt trên (ví dụ như Angelica, Peucedanum và Semenovia) Các ống dầu rõ ràng dạng gậy, ngắn hơn chiều dài của quả

mầm, là đặc điểm của nhiều loài Heracleum, nhưng điều này không đúng với một số

loài của Trung Quốc Các vấn đề còn khó thêm bởi sự khan hiếm nói chung của các mẫu

cây có cơ sở dữ liệu tốt (Herbarium) và sự không đầy đủ của vật liệu phân loại học cổ

điển Nhiều loài là cây to và cao, trong đó các cụm hoa chính và lá gốc lớn và do đó khó có thể chứa được trong một tiêu bản mẫu Thật không may, các nhà sưu tập thường chọn các nhánh nhỏ hơn, lá phía trên, không cung cấp nhiều thông tin hữu ích Mẫu trái tốt

cũng thường thiếu, và một số loài chỉ được ghi nhận từ một số ít bộ sưu tập Các phân loại đã được sửa đổi cho một phần của phạm vi của chi, nhưng do kiến thức hiện tại vẫn chưa hoàn chỉnh cho các loài Trung Quốc nên ở đây sẽ tuân theo một cách tiếp cận truyền thống [12]

1.1.3 Vị trí phân bố và sinh thái của chi Heracleum L

Khoảng 70 loài: chủ yếu ở châu Á và châu Âu, một loài ở Bắc Mỹ, một số loài ở Đông Phi; 29 loài (21 loài đặc hữu) ở Trung Quốc

Các loài Heracleum mọc chủ yếu ở vùng núi ven suối, các vườn bảo tồn, thảo

nguyên và đất ngập nước Chúng được tìm thấy khá phổ biến ở bán cầu bắc ôn đới và

các dãy núi cao như Ethiopia Hai trung tâm chính của Heracleum được ghi nhận: khu

vực Cáp-ca và Hi-ma-lay-a Theo dữ liệu được tổng hợp trong cơ sở dữ liệu ASIUM

của Vườn thực vật Đại học Quốc gia Moscow, có 30 loài thuộc chi Heracleum ở khu

vực Cáp-ca và nam Cáp-ca; 24 loài được báo cáo từ Thổ Nhĩ Kỳ và 11 từ Iran 32 loài của chi này đã được ghi nhận ở khu vực Trung Quốc-Himalaya (25 trong Tây Nam Trung Quốc, 9 trong dãy núi Himalaya Ấn Độ và 8 ở Nepal) [51]

1.1.4 Công dụng

Một số loài Heracleum đã được sử dụng trong y học cổ truyền châu Á và đã được chứng minh là có tác dụng chữa bệnh đáng chú ý Một số loài Heracleum đã được sử

dụng theo truyền thống cho nhiều mục đích ở các quốc gia khác nhau Trong y học cổ

truyền, một số loài Heracleum được sử dụng làm thuốc hạ sốt, giảm đau, toát mồ hôi,

sát trùng, tống hơi và tiêu hóa, đồng thời làm hương liệu và gia vị cho thực phẩm chữa bệnh thấp khớp, đau thắt lưng, đau dạ dày và các vết thương do té ngã, gãy xương, nhiễm trùng Quả và lá của chi này cũng được sử dụng làm thuốc sát trùng, thuốc tống hơi, tiêu hóa và giảm đau trong y học dân gian Iran [54], [55], [69], [17], [39]

1.1.5 Thành phần hóa học

1.1.5.1 Tinh dầu

Thành phần tinh dầu của Heracleum platytaeniurn ở Thổ Nhĩ Kỳ được báo cáo:

octyl acetat (87.8 %), octyl hexanoat (4.7 %), (Z)-4-octenyl acetat (2.1 %), octanol (1.0 %) and decanal (1.2 %) là thành phần chính [28], [45]

sử dụng phương pháp cất kéo bằng hơi nước và dầu, được phân tích bằng GC/MS Chín mươi bảy hợp chất được xác định chiếm 95.4% thành phần tinh dầu với octyl acetat (31.5%), hexyl butyrat (17.0%) and octyl hexanoat (10.2%) là thành phần chủ yếu [7]

Kết quả thành phần tinh dầu thu được từ loài Heracleum candicans ở Ấn Độ với

28 hợp chất: germacren D (29.5%), sabinen (12.4%), α-pinen (5.7%), β-pinen (4.4%), α-humulen (4.6%), pentanoic acid 2-methylbutyl ester (3.5%), bicyclogermacren (3.1%), myrcen (2.9%), Z-β-ocimen (2.2%), terpinen-4-ol (2.0%), α-muurolen (1.9%) and limonen (0.8%) [11]

Bộ phận trên mặt đất của loài Heracleum moellendorffii ở Trung Quốc đã xác

định được 41 hợp chất trong đó chủ yếu là: apiol (11.0%), β-pinen (9.2%), α-terpineol

(7.5%), myristicin (7.1%), osthol (6.1%) và (E)-anethol (5.2%) Có sự khác biệt lớn về

thành phần tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của Heracleum moellendorffii Thành phần chính của rễ Heracleum moellendorffii là: β-pinen (24.3%), α-pinen (8.2%) và

limonen (8.1%) [50]

Thành phần hóa học tinh dầu của chi Heracleum L tương đối khác nhau về thành

phần hóa học tùy thuộc vào vị trí địa lý, bộ phận sử dụng

1.1.5.2 Phenolic

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài và bộ

phận khác nhau trong chi Heracleum L bao gồm: coumarin, furocoumarin, glycosylated

coumarins, flavonoid, polyacetylenes, lignan … [6]

Năm 2017, Benedec D và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học

các bộ phận của loài Heracleum sphondylium được thu từ vùng Ciucea ở Romania bằng

kỹ thuật HPLC-MS [8]

Năm 2018, Wang Z và cộng sự đã chiết xuất và phân lập rễ của loài Heracleum

dissectum được thu hái ở Trung Quốc kết hợp với các phổ NMR, DEPT, HMBC, COSY

và ROESY xác định một hợp chất mới gọi là Dissectumoside cùng 8 hợp chất phenolic và dẫn chất phenolic [65]

Năm 2019, Gürbüz P và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và ghi nhận 7 flavanoid glycosid: isoquercetin, rutin, afzelin, astragalin, isorhamnetin 3-O-

glucosid, nicotiflorin, narcissosid của loài Heracleum pastinaca được thu từ vùng

Maden với độ cao 2600m ở Thổ Nhĩ Kỳ bằng kỹ thuật LC/MS và phổ NMR [22]

Năm 2019, Uysal A và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần phenolic

của các bộ phận trên mặt đất trong loài Heracleum sphondylium được thu từ vùng

Başarakavak (Thổ Nhĩ Kỳ) bằng kỹ thuật HPLC [61]

Hai hợp chất: p-coumaric acid, ferulic acid cũng được tìm thấy ở loài Heracleum

lanatum [23], [16] và loài Heracleum persicum [23]

Bảng công thức cấu tạo một số hợp chất phenolic của chi Heracleum: Phụ lục 5

1.1.5.3 Furanocoumarin

Bảng 1.1: Tổng hợp nhóm chất Furanocoumarin một số loài của chi Heracleum

verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]

2 Isobergapten Heracleum Sphondylium; Heracleum

verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]

3 Isopimpinellin Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum;

Heracleum orphanidis [60]

verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum orphanidis; Heracleum montanum; Heracleum candicans [60], [21]

verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]

Heracleum ternatum; Heracleum candicans [60],

[21], [43]

[60]

Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis

Heracleum montanum; Heracleum orphanidis

[60]

1.2 Tổng quan về loài Heracleum bivittatum

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của Heracleum bivittatum

Tên khoa học: Heracleum bivittatum Boissieu

Tên Tiếng Việt: Vũ thảo, Cần dại

Cỏ đa niên, cao đến 2m, có lông Lá to; thứ diệp mọc đối, thứ diệp chót 3 thùy, bìa có răng; cuống thành bẹ to ôm thân Tán kép; tổng bao do phiến cao 1cm; tổng bao phụ nhỏ; cọng hoa dài 1cm; hoa to 7mm; cánh hoa trắng, các cánh hoa ngoài dài hơn phía trong phát hoa; tiểu nhụy 5, dài cỡ cánh hoa Trái tròn, dẹp, cao 3,5mm

Phân bố: chủ yếu ở Trung Quốc và Sapa (Việt Nam), độ cao 1700m [2]

1.2.2 Thành phần hóa học

Hiện nay chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Heracleum

bivittatum

1.3 Tổng quan về loài Cryptotaenia japonica

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân loại

Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Hoa tán (Apiaceae)

Chi: Cryptotaenia DC

Cây cao 20-100cm Cuống lá ở gốc và dưới dài 5-20cm, có bẹ thuôn dài; phiến hình tam giác đến hình trứng, 2-14 x 3-7cm; lá chét ở giữa hình thoi – hình trứng ngược hoặc hình tim, 2-9 x 1.5-10cm; các lá chét bên dài hình trứng đến hình trứng ngược, 1.5-8 × 1-6cm Không có lá bắc hoặc 1, thẳng, 4-10 x 0.5-1.5mm; tia 2-3, 0.5-3.5 cm, rất không đều nhau; lá bắc ở cuống hoa 1-3, hình kim, 4-10mm; 2-4 cuống, 1-14mm, rất không đều Răng đài 0.1-0.3mm, không đều nhau Cánh hoa từ 1 -1.2 x 0.6-1mm Quả 4-6 x 1-1.5mm Hoa và quả từ tháng 2 đến tháng 10 [12]

1.3.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Những nơi ẩm ướt trong rừng, hào; độ cao 200-2400m Ở các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Cát Lâm, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hà Bắc, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tây, Giang Tây, Thiên Tân, Thiên Tân, Sơn Tây, Tân Tây, Tuyên Quang của Trung Quốc Ngoài ra còn có ở Nhật Bản và Hàn Quốc [12]

1.3.3 Thành phần hóa học

Chưa có nghiên cứu được công bố ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài

Cryptotaenia japonica Một số báo cáo được ghi nhận trên thế giới:

Okuno Y và cộng sự đã sử dụng phương pháp cất kéo hơi nước từ 3 mẫu tươi Itomitsuba, Kirimitsuba, Neromitsuba (Nhật Bản) và sử dụng phương pháp phân tích GC-MS đã ghi nhận 53 hợp chất tinh dầu [42]

Năm 2011, Yao Y và cộng sự đã xác định được 6 hợp chất: luteolin, kaempferol, apigenin, acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric [68]; Đến năm 2018, Lu J và cộng sự đã bổ sung thêm: diosmetin, acid chlorogenic, acid gallic, acid vanillic từ hạt của

Cryptotaenia japonica [35] Và 12 hợp chất phenolic đã được tìm thấy ở lá [53]

Bảng 1.2 Thành phần phenolic của Cryptotaenia japonica

1.4 Tổng quan về chi Xyloselinum Pimenov & Kljuykov

1.4.1 Đặc điểm thực vật, phân loại và phân bố

Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae)

Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Hoa tán (Apiaceae)

Chi: Xyloselium Pimenov & Kljuykov

Xyloselinum Pimenov & Kljuykov là chi mới cho khoa học và đặc hữu của Việt

Nam, được Pimenov & Kljuykov (2006) [48] mô tả năm 2006 Chi Xyloselinum gồm ba loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov); Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) và loài Xyloselinum laoticum

Pimenov & Aver [1], [47] Thìa là thân gỗ việt phân bố ở khu BTTN Bát Đại Sơn, huyện Quản Bạ và xã Lao Và Chải, huyện Yên Minh Thìa là hóa gỗ leonid có phạm vi phân bố rộng hơn; ngoài tỉnh Hà Giang (xã Sính Lủng, huyện Đồng Văn; xã Sủng Trà, huyện Mèo Vạc) còn gặp ở tỉnh Sơn La (xã Mường Lụm, huyện Yên Châu; và xã Chiềng Cọ, thành phố Sơn La) [1,2]

Xyloselinum vietnamense và Xyloselinum leonidii thường mọc rải rác hay thành

đám nhỏ dưới tán rừng thông có ít ánh sáng hoặc ở chân các tảng đá trên đường đỉnh hay gần đường đỉnh núi đá vôi Thìa là hóa gỗ leonid đã được đưa vào Danh lục một số loài thực vật bị đe doạ tuyệt chủng điển hình ở cao nguyên đá vôi Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) [1]

1.4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kliuykov)

Cây bụi, cao 1-1,5 m, cành màu xanh đậm, khía dọc, có lóng ngắn Lá nhẵn ôm thân hình tam giác, có lớp màng mỏng, cuống dài 4,5-7 cm, không có rãnh ở mặt gần trục Phiến lá dài 10-13 cm, rộng 6-10 cm, hình tam giác rộng, kép lông chim 2-3 lần, cuống bẹ dài 2-3 cm Cụm hoa ở chót cành, hình cầu, đường kính 7-9 cm, trên lóng thon dài, tách xa nhau khi tạo quả, hoa tán nhỏ có đường kính 2-2,5 cm Quả nhẵn, hình elip, dài 7-7,5 mm, rộng 4,5-5 mm Cây ra hoa tháng 5, quả tháng 9-10

Cây sống lâu năm, mọc rải rác dưới tán rừng trong các kẽ đá có đất Phân bố: Khu BTTN Bát Đại Sơn, huyện Quản Bạ; xã Lao Và Chải, huyện Yên

Cây sống lâu năm, mọc rải rác dưới tán rừng trong các kẽ đá có đất Phân bố: xã Sính Lủng, huyện Đồng Văn; xã Sủng Trà, huyện Mèo Vạc, tỉnh Hà Giang Cây còn gặp ở xã Mường Lụm, huyện Yên Châu và xã Chiềng Cọ thành phố Sơn La

1.4.2 Thành phần hóa học

Bằng phương pháp sắc ký khối phổ (GC/MS), 19 hợp chất trong tinh dầu đã được

xác định Thành phần chính của tinh dầu từ lá Thìa là thân gỗ việt là các hợp chất sau:

sabinen (75,0%), γ-terpinen (2,5%), Z-β-ocimen (2,4%), myrcen (2,4%), α-pinen (2,2%)

và 42 hợp chất trong tinh dầu từ thân rễ Thìa là thân gỗ việt là các hợp chất sau: sabinen

(36,5%), terpinene-4-ol (10,3%), Z-β-ocimen (9,7%), γ-terpinen (3,0%), α-pinen (2,9%), myrcen (2,2%)

Bằng phương pháp sắc ký khối phổ 26 hợp chất trong tinh dầu đã được xác định

Thành phần chính của tinh dầu từ lá Thìa là gỗ leonid là các hợp chất: sabinen (29,3%),

β-phellandren (17,8%), myrcen (12,9%), α-pinen (7,6%), terpinene-4-ol (4,1%), γ-

terpinene (1,5%) và 52 hợp chất của tinh dầu từ thân rễ Thìa là hóa gỗ leonid là các hợp

chất: β-pinen (13,7%), Z-β-ocimen (12,9%), sabinen (10,0%), β-thujen (9,52%), pinen (9,8%), terpinene-4-ol (3,5%) [3]

α-Hiện nay, mới xác định được 8 hợp chất từ dịch chiết methanol của loài Thìa là

gỗ leonid bằng phổ NMR và HSQC bao gồm: xyloselin, decursinol, decursinol

glucoside, pteryxin, praeroside I, angelicain, cimifugin, hesperidin [40]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Cần dại (Heracleum bivittatum H Boissieu) được thu

hái tại xã Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào ngày 12/10/2023; cây Áp nhĩ cần

(Cryptotaenia japonica Hassk) được thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023; loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov)

được thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023 và Thìa là hóa gỗ

leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) được thu hái tại huyện Đồng Văn,

tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023 Tên khoa học của các mẫu nghiên cứu được giám định tại Phòng Tài nguyên Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số tiêu bản đối với loài Heracleum

bivittatum H Boissieu là CSCL.03/23-24-SP06, đối với loài Cryptotaenia japonica Hassk là CSCL.03/23-24-HG01, đối với loài Xyloselinum vietnamense Pimenov &

Kljuykov là CSCL.03/23-24-HG02 và đối với loài Xyloselinum leonidii Pimenov &

Kljuykov là CSCL.03/23-24-HG03

Sau khi thu hái, mẫu được làm khô tự nhiên trong bóng râm để cất tinh dầu, một phần mẫu đã sấy được xay thành bột, bảo quản trong túi PE kín để nghiên cứu thành phần hóa học

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

Dùng trong định tính sơ bộ thành phần hóa học: NaOH 10 %, FeCl3 5 %, H2SO4

đặc, chì acetat, amoniac đặc, HCl đặc, TT Diazo, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric, TT Fehling A, TT Fehling B, Na2CO3, …

Dùng trong SKLM:

- Bản mỏng Silicagel 60-F254 và bản mỏng Silica gel F254 (Merck, Đức)

- Dung môi: toluen, ethyl acetat, n-hexan, acid formic, aceton, cloroform, ethanol 70 %,

acid acetic băng … - Thuốc thử: NP/PEG - Chất chuẩn chấm sắc ký: Luteolin, acid caffeic, Apigenin, acid clorogenic Tất cả được cung cấp bởi công ty Biopurify phytochemical (Trung Quốc)

Dùng trong LC-MS: - acid formic 0,1% trong nước - acid formic 0,1% trong acetonitril

Tất cả các hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V

2.1.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

Dụng cụ: - Dùng trong phản ứng định tính: Cốc có mỏ, phễu thủy tinh, bình gạn, pipet, ống nghiệm, đũa thủy tinh…

- Bộ dụng cụ Soxhlet Máy móc, thiết bị: - Cân kỹ thuật SARORIUS TE42 - Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) - Máy xay

- Bếp cách thủy HH-2 - Bếp bảo ôn

- Tủ sấy Memmert (Đức) - Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H) - Hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao HPTLC (CAMAG, Thụy Sĩ) gồm: Máy chấm sắc ký CAMAG Linomat 5, hệ thống triển khai sắc ký tự động ADC-2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy tính cài đặt phần mềm visionCATS 2.2

- Bình xịt thuốc thử - Detector khối phổ phân giải cao X500R QTOF - Hệ thống thống sắc ký lỏng Exion LCTM

- Cột pha rắn C18 - Cột Hypersil GOLD Dim

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu - Phân tích thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

-Phân tích thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu sau khi đã thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [4], [5]

Bảng 2.1: Thống kê khối lượng cao chiết của 4 mẫu

dùng

Khối lượng mẫu (g)

Khối lượng cắn (g)

4 Thìa là hóa gỗ Leonid

Dung dịch thử (A): Cân khoảng 0,05g cao chiết ethanol 70% vào cốc có mỏ, thêm 3ml methanol, đậy kín Siêu âm trong 10 phút, lọc dung dịch, cho vào cột pha rắn C18 để loại bỏ chlorophyll Dung dịch sau khi lọc qua cột dùng làm dung dịch thử (A) Sắc ký đồ được thực hiện trên hệ dung môi khai triển sắc ký: Hệ (I) ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) và hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1)

Dung dịch thử (B): Để xác định sự tương đồng/khác biệt về các aglycon trong các mẫu nghiên cứu Cân khoảng 50mg cao chiết ethanol 70% vào bình nón, thêm 10ml HCl 2N đun hồi lưu ở 100℃ trong 1 giờ Lọc dung dịch qua giấy lọc và chuyển vào bình gạn Thêm 10ml ethyl acetat lắc đều, lấy lớp ethyl acetat Sau đó thêm Na2SO4 để loại nước, thu được dung dịch thử (B) Sắc ký đồ được thực hiện trên hệ pha động: Hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1)

Quy trình triển khai sắc ký: - Hệ (I): ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26)

• Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 °C trong 30 phút Chấm đồng thời dung dịch A của 4 mẫu nghiên cứu, chất đối chiếu sử dụng là acid chlorogenic (nồng độ) Sau khi triển khai, phun TT NP/PEG và quan sát, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm

- Hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1) • Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 °C trong

30 phút Kích thước bản mỏng: 16 x 10cm • Đưa mẫu lên bản mỏng: Dung dịch A và Dung dịch B của cả 4 mẫu nghiên cứu

được đưa lên bản mỏng bằng máy Linomat 5, chất đối chiếu bao gồm luteolin, apigenin và acid caffeic Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 10,0mm Khoảng cách giữa tâm vết và mép ngoài bản mỏng là 20,0mm Khoảng cách giữa các vết 12,0mm

- Sau khi triển khai sắc ký, sấy nhẹ bản mỏng cho bay hơi hết dung môi Quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở 2 bước sóng 254 và 366 nm Phun thuốc thử hiện màu NP/PEG Sau khi hiện màu bằng thuốc thử, quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm

2.3.2.3 Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS

Cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu nghiên cứu được phân tích sắc ký lỏng khối phổ sử dụng hệ thống thống sắc ký lỏng Exion LCTM kết nối với detector khối phổ phân giải cao X500R QTOF (Sciex, USA) sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử Cắn được hòa tan trong methanol và xử lý chiết pha rắn qua cột C18 Các hợp chất được phân tách sử dụng cột Hypersil GOLD Dim 150 mm x 2.1 mm, 3µm (Thermo Scientific, USA) trong gradient pha động từng bước của acid formic 0,1% trong nước (dung môi A) và acid formic 0,1% trong acetonitril (dung môi B) ở tốc độ dòng 0,4 mL/phút Chương trình máy được thiết lập như sau: 0-1 phút, 100% A; 1-20 phút, 98% A; 20-25 phút, 2% A Thể tích tiêm mẫu là 2,0 µL Phát hiện MS/MS được thực hiện ở chế độ ion âm trong khoảng m/z là 50-2000 amu

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu

Tiến hành như phụ lục 1, kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên

cứu được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Áp nhĩ cần và Cần dại

bằng phương pháp thường quy

Kết quả

+

Dương tính Phản ứng với hơi

Phản ứng mở, đóng vòng lacton

+

Dương tính

++

Dương tính Phản ứng với TT

Diazo

Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans

-

Âm tính

-

Âm tính Phản ứng với TT

Bouchardat

Phản ứng với TT Dragendorff

Phản ứng với dd FeCl3 5%

5 Tanin Phản ứng với dd

gelatin 1%

Phản ứng với dd chì acetat 10%

7 Glycosid tim

Phản ứng Liebermann-Buchard

Fehling A và Fehling B

Bảng 3.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong TLTG Việt và TLTG Leonid

bằng phương pháp thường quy

Kết quả

+

Dương tính Phản ứng với hơi

Phản ứng mở, đóng vòng lacton

+

Dương tính

+

Dương tính Phản ứng với TT

Diazo

Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans

-

Âm tính

-

Âm tính Phản ứng với TT

Bouchardat

Phản ứng với TT Dragendorff

Phản ứng với dd FeCl3 5%

+

Âm tính

+

Âm tính Phản ứng với dd

gelatin 1%

Phản ứng với dd chì acetat 10%

7 Glycosid tim

Phản ứng Liebermann-Buchard

Fehling A và Fehling B

3.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng cao chiết ethanol 70% các mẫu nghiên cứu được triển khai với

các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Sau khi triển khai hệ sắc ký (I) ethyl acetat

– acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) và phun TT NP/PEG, quan sát

dưới bước sóng 366nm được kết quả như hình 3.1 Trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên

cứu có các vết có huỳnh quang màu vàng đặc trưng cho các hợp chất flavonoid hoặc các vết có huỳnh quang màu xanh có thể là các hợp chất phenolic hoặc coumarin

Hình 3.1 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung môi I: ethyl

acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) sau khi phun TT

NP/PEG, quan sát ở bước sóng 366nm

Chú thích:

(1): ChlA – acid chlorogenic (2): HG1-Me – Áp nhĩ cần (3): SP06b-Me – Rễ cần dại (4): HG2-Me – Thìa là thân gỗ Việt (5): HG3a-Me – phần trên mặt đất Thìa là thân gỗ Leonid

chuẩn acid chlorogenic Như vậy, có thể kết luận Áp nhĩ cần có chứa acid chlorogenic

- Mẫu Cần dại và TLTG Leonid có hai vết tương đồng ở vị trí Rf = 0,39 và Rf = 0,28 và chủ yếu là các vết huỳnh quang màu xanh

- Trong khi đó, mẫu Thìa là thân gỗ Leonid và Thìa là thân gỗ Việt có một số khác biệt: Tại vị trí Rf = 0,91 mẫu Thìa là thân gỗ Việt cho vết huỳnh quang màu xanh rất rõ còn mẫu Thìa là thân gỗ Leonid lại không cho vết tương ứng Ngoài ra ở vị trí Rf = 0,39 mẫu TLTG Việt cho vết huỳnh quang màu vàng và mẫu TLTG Leonid lại không cho vết tương ứng

Hình 3.2 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung môi II:

toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) quan sát ở: A Bước sóng 254 nm B

Bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG

Chú thích:

(1): L – Luteolin (2): HG1-Me – Áp nhĩ cần (3): HG1-EtOAc – Áp nhĩ cần phần aglycon (sau thủy phân) (4): A – Apigenin

(5): SP06b-Me – Cần dại (6): SP06b-EtOAc – Cần dại phần aglycon (sau thủy phân) (7): HG2-Me – TLTG Việt

(8): HG2-EtOAc – TLTG Việt phần aglycon (sau thủy phân)

(9): Ca – acid caffeic (10): HG3a-Me – TLTG Leonid (11): HG3a-EtOAc – TLTG Leonid phần aglycon (sau thủy phân)

❖ Nhận xét:

Triển khai sắc ký với hệ dung môi (II) Toluen – ethyl acetat – acid formic

(14:10:1) Đây là hệ dung môi có độ phân cực trung bình, có thể dùng để định tính các hợp chất flavonoid ở dạng aglycon hoặc một số coumarin và acid phenolic Do đó, để sơ bộ dự đoán sự tương đồng hay khác biệt về thành phần aglycon trong các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chấm trên bản mỏng cả cao chiết ethanol 70% và cao chiết đã thuỷ phân của 4 mẫu nghiên cứu

Sau khi triển khai hệ sắc ký (II) và phun TT NP/PEG, quan sát dưới bước sóng 366nm được kết quả như hình 3.2

Sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG của 4 mẫu nghiên cứu có các vị trí tương đồng về Rf và màu sắc với chất chuẩn như sau:

- Áp nhĩ cần có các vị trí tương đồng về Rf và màu sắc với chất chuẩn luteolin tại Rf = 0,41 Như vậy, có thể kết luận rằng mẫu Áp nhĩ cần có chứa luteolin Ngoài ra, tại vị trí Rf = 0,50 của mẫu Áp nhĩ cần có chứa Apigenin

- Cả 4 mẫu nghiên cứu đều có vị trí tương đồng về Rf và màu sắc với chất chuẩn acid caffeic tại Rf = 0,42

Ở hai mẫu Thìa là thân gỗ, có khá nhiều vết tương đồng với nhau về vị trí Rf và màu sắc: Rf = 0,22; 0,42; 0,7 Điều đó cho thấy sự tương đồng về mặt thành phần hóa học của Thìa là thân gỗ Việt và Thìa là thân gỗ Leonid Ngoài ra, dịch chiết sau thuỷ

phân của hai loài thuộc chi Xyloselinum cũng có sự tương đồng ở một số vết tại Rf = 0,32; 0,39; 0,42; 0,52; 0,65 gợi ý về sự tương đồng của thành phần aglycon của hai loài nghiên cứu

3.3 Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS

Dữ liệu LC-MS/MS được phân tích qua mạng lưới phân tử trên nền tảng GNPS [HG1, ID: 8b67ef4788aa48a381be3e8c81508831 (ion âm);

HG2, ID: ce12669ab4df4783be9fc9710aff3b9a (ion âm); HG3a, ID: 0da925a77c4d45fbb9162befeae858f7 (ion âm); SP06b, ID: ce42c135a918421aacb28129b6939b72 (ion âm)] được thu thập vào ngày 23 tháng 4 năm 2024 tại https://gnps.ucsd.edu/) Phổ MS/MS được xử lý bằng cách lọc các dữ liệu dựa trên năm đỉnh ion mạnh nhất trong khoảng ± 50 Da trên toàn phổ Sau đó, mạng lưới phân tử được tạo ra với yêu cầu tối thiểu có bốn đỉnh khớp nhau, với các kết nối giữa các nút được lọc bằng giá trị cosine lớn hơn 0,70

Các nút trong mạng lưới phân tử được xây dựng và chú thích dựa trên các phân mảnh MS2 Mạng lưới phân tử được sắp xếp và trực quan hóa bằng phần mềm Cytoscape 3.8.2 (NRNB, Hoa Kỳ) Dữ liệu được xuất ra từ phần mềm Cytoscape cung cấp khả năng truy cập vào thông tin chi tiết liên quan đến việc dự đoán tên hợp chất và phân loại nhóm hợp chất Khi kết hợp với các cơ sở dữ liệu uy tín như Reaxys, PubChem và các công bố khoa học quốc tế, quá trình nhận diện và khẳng định các hợp chất trong mẫu thử được tiến hành Việc này bao gồm việc so sánh và xác minh các hợp chất dựa trên dữ liệu LC-MS/MS, bao gồm thời gian lưu, dữ liệu MS1, MS2 và loại phân mảnh ion

Bảng 3.3: Kết quả dự đoán thành phần hóa học của Thìa là thân gỗ Việt và Thìa là

thân gỗ Leonid dựa trên mạng dữ liệu phân tử GNPS

STT tR

(phút)

Tên hợp chất

Ion (+)

Tiền chất/mảnh

ion (m/z)

Công thức phân tử

(ppm)

X vietnam

ense

X leoni

dii

TLTK

181.074 (59, 71, 89,

2M-405.106 (191)

(S)-glutamic

(59, 102, 128, 143,

160)

furaneol 4-(6-malonylglucoside)

M+Na-2H

397.08 (167)

C15H20O11

(12.59)

X

GNPS librarie

s

acid caffeoyl quinic

5-O-M-H

353.092 (135, 148,

3-apiofuranosyl-(1->6)-β-D-glucopyranosid

M+ HCOO

425.171 (89, 149,

s

acid caffeoyl quinic

7-M-H

161.026 (65, 89,

5-p-M-H

337.097 (93, 119, 145, 163, 173, 191)

glucopyranosiduronic

acid feruloyl quinic

3-O-M-H

367.108 (93, 134,

595.163 (285)

H

469.141 (243, 423)

C20H24O10

(12.79)

libraries

593.155 (285)

469.14 (71, 261,

diosmetin-7-O-neohesperidoside

28 13.63 corchorifa

tty acid F M-H

327.222 (171, 211,

29 13.69

trihydroxy-4'-methoxy-2-

4,6,3'-(phenylmethylene)-3(2H)-benzofuranone

s

30 13.74 isoliquiriti

255.07 (119, 218)

butyl-4,6-dinitrophenol

ion (m/z)

Công thức phân tử

(ppm)

TLTK

341.113 (59, 85, 89,