TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Heracleum L
1.1.1 Vị trí phân loại của chi Heracleum L
Theo hệ thống phân loại thực vật hiển hoa (Flowering plants) của tác giả A Takhtajan (2009) [57] và M Liu, S R Downie (2017) [33], vị trí của chi Heracleum L trong giới thực vật như sau:
1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Heracleum L
Chi Heracleum có cây hai năm hoặc lâu năm Rễ hình thoi hoặc hình trụ, phình to, hiếm khi có xơ Thân mọc thẳng, hình trụ và thường có gân hoặc rãnh, phân nhánh
Lá ở gốc và lá phía dưới có cuống; bẹ cuống lá thường rộng dễ thấy; lá thường phân nhánh thành ba lá hoặc lá phân ba, có lông hoặc nhẵn Chùm hoa rộng ở đỉnh và hai bên, ở đỉnh thường mang cả hoa đực và hoa cái, còn ở hai bên thường chỉ có hoa đực; lá bắc ít hoặc không có, thường rụng; tia hoa nhiều, mở rộng và hướng lên; nhiều lá bắc, hình dải hoặc hình mác, nguyên vẹn; chùm nhiều hoa Đài hoa có răng hình tam giác, hình mũi mác hoặc không có Cánh hoa màu trắng, hiếm khi màu hồng hoặc vàng nhạt, hình tim ngược hoặc hình tim, dưới hình nêm, đỉnh có khía với một thùy cong hẹp; các bông hoa ở rìa thường to lớn với cánh hoa bên ngoài phình to, hình tim ngược, đỉnh sâu 2 thùy Phần chóp bầu nhụy hình nón; kiểu ngắn, thẳng đứng hoặc cong xuống Quả hình trứng ngược, hình trứng, hình trứng thuôn hoặc gần bầu dục, lưng dẹt, có lông hoặc nhẵn; các gân phụ và gân trung tâm quả có rãnh sợi, đôi khi phình lên, các gân bên thường có cánh; 1-2 ống tinh dầu trong mỗi rãnh, 2 (-6) hoặc không có ở mép, hẹp, dọc theo đến gốc của quả mầm hoặc hình gậy và ngắn hơn nhiều so với quả mầm Mặt hạt phẳng, hiếm khi hơi lõm Thân quả chia ra gốc, thường bền vững Đây là một chi phân bố rộng, phức tạp về phân loại với Dãy núi Hengduan tạo thành một trong hai trung tâm đa dạng Việc xác định phân loại của chi này gặp khó khăn, cả trong Heracleum (nghiên cứu phân tử gần đây đã chỉ ra rằng nó không phải là đơn nguyên) và với một số chi khác có quả bằng phẳng ở mặt trên (ví dụ như Angelica, Peucedanum và Semenovia) Các ống dầu rõ ràng dạng gậy, ngắn hơn chiều dài của quả mầm, là đặc điểm của nhiều loài Heracleum, nhưng điều này không đúng với một số loài của Trung Quốc Các vấn đề còn khó thêm bởi sự khan hiếm nói chung của các mẫu cây có cơ sở dữ liệu tốt (Herbarium) và sự không đầy đủ của vật liệu phân loại học cổ điển Nhiều loài là cây to và cao, trong đó các cụm hoa chính và lá gốc lớn và do đó khó có thể chứa được trong một tiêu bản mẫu Thật không may, các nhà sưu tập thường chọn các nhánh nhỏ hơn, lá phía trên, không cung cấp nhiều thông tin hữu ích Mẫu trái tốt
3 cũng thường thiếu, và một số loài chỉ được ghi nhận từ một số ít bộ sưu tập Các phân loại đã được sửa đổi cho một phần của phạm vi của chi, nhưng do kiến thức hiện tại vẫn chưa hoàn chỉnh cho các loài Trung Quốc nên ở đây sẽ tuân theo một cách tiếp cận truyền thống [12]
1.1.3 Vị trí phân bố và sinh thái của chi Heracleum L
Khoảng 70 loài: chủ yếu ở châu Á và châu Âu, một loài ở Bắc Mỹ, một số loài ở Đông Phi; 29 loài (21 loài đặc hữu) ở Trung Quốc
Các loài Heracleum mọc chủ yếu ở vùng núi ven suối, các vườn bảo tồn, thảo nguyên và đất ngập nước Chúng được tìm thấy khá phổ biến ở bán cầu bắc ôn đới và các dãy núi cao như Ethiopia Hai trung tâm chính của Heracleum được ghi nhận: khu vực Cáp-ca và Hi-ma-lay-a Theo dữ liệu được tổng hợp trong cơ sở dữ liệu ASIUM của Vườn thực vật Đại học Quốc gia Moscow, có 30 loài thuộc chi Heracleum ở khu vực Cáp-ca và nam Cáp-ca; 24 loài được báo cáo từ Thổ Nhĩ Kỳ và 11 từ Iran 32 loài của chi này đã được ghi nhận ở khu vực Trung Quốc-Himalaya (25 trong Tây Nam Trung Quốc, 9 trong dãy núi Himalaya Ấn Độ và 8 ở Nepal) [51]
Một số loài Heracleum đã được sử dụng trong y học cổ truyền châu Á và đã được chứng minh là có tác dụng chữa bệnh đáng chú ý Một số loài Heracleum đã được sử dụng theo truyền thống cho nhiều mục đích ở các quốc gia khác nhau Trong y học cổ truyền, một số loài Heracleum được sử dụng làm thuốc hạ sốt, giảm đau, toát mồ hôi, sát trùng, tống hơi và tiêu hóa, đồng thời làm hương liệu và gia vị cho thực phẩm chữa bệnh thấp khớp, đau thắt lưng, đau dạ dày và các vết thương do té ngã, gãy xương, nhiễm trùng Quả và lá của chi này cũng được sử dụng làm thuốc sát trùng, thuốc tống hơi, tiêu hóa và giảm đau trong y học dân gian Iran [54], [55], [69], [17], [39]
Thành phần tinh dầu của Heracleum platytaeniurn ở Thổ Nhĩ Kỳ được báo cáo: octyl acetat (87.8 %), octyl hexanoat (4.7 %), (Z)-4-octenyl acetat (2.1 %), octanol (1.0
%) and decanal (1.2 %) là thành phần chính [28], [45]
Quả nghiền của Heracleum papblagonicum, một loài đặc hữu của Thổ Nhĩ Kỳ, sử dụng phương pháp cất kéo bằng hơi nước và dầu, được phân tích bằng GC/MS Chín mươi bảy hợp chất được xác định chiếm 95.4% thành phần tinh dầu với octyl acetat (31.5%), hexyl butyrat (17.0%) and octyl hexanoat (10.2%) là thành phần chủ yếu [7]
Kết quả thành phần tinh dầu thu được từ loài Heracleum candicans ở Ấn Độ với
28 hợp chất: germacren D (29.5%), sabinen (12.4%), α-pinen (5.7%), β-pinen (4.4%), α-humulen (4.6%), pentanoic acid 2-methylbutyl ester (3.5%), bicyclogermacren (3.1%), myrcen (2.9%), Z-β-ocimen (2.2%), terpinen-4-ol (2.0%), α-muurolen (1.9%) and limonen (0.8%) [11]
Bộ phận trên mặt đất của loài Heracleum moellendorffii ở Trung Quốc đã xác định được 41 hợp chất trong đó chủ yếu là: apiol (11.0%), β-pinen (9.2%), α-terpineol
4 (7.5%), myristicin (7.1%), osthol (6.1%) và (E)-anethol (5.2%) Có sự khác biệt lớn về thành phần tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của Heracleum moellendorffii Thành phần chính của rễ Heracleum moellendorffii là: β-pinen (24.3%), α-pinen (8.2%) và limonen (8.1%) [50]
Thành phần hóa học tinh dầu của chi Heracleum L tương đối khác nhau về thành phần hóa học tùy thuộc vào vị trí địa lý, bộ phận sử dụng
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài và bộ phận khác nhau trong chi Heracleum L bao gồm: coumarin, furocoumarin, glycosylated coumarins, flavonoid, polyacetylenes, lignan … [6]
Năm 2017, Benedec D và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học các bộ phận của loài Heracleum sphondylium được thu từ vùng Ciucea ở Romania bằng kỹ thuật HPLC-MS [8]
Năm 2018, Wang Z và cộng sự đã chiết xuất và phân lập rễ của loài Heracleum dissectum được thu hái ở Trung Quốc kết hợp với các phổ NMR, DEPT, HMBC, COSY và ROESY xác định một hợp chất mới gọi là Dissectumoside cùng 8 hợp chất phenolic và dẫn chất phenolic [65]
Năm 2019, Gürbüz P và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và ghi nhận 7 flavanoid glycosid: isoquercetin, rutin, afzelin, astragalin, isorhamnetin 3-O- glucosid, nicotiflorin, narcissosid của loài Heracleum pastinaca được thu từ vùng
Maden với độ cao 2600m ở Thổ Nhĩ Kỳ bằng kỹ thuật LC/MS và phổ NMR [22]
Năm 2019, Uysal A và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu thành phần phenolic của các bộ phận trên mặt đất trong loài Heracleum sphondylium được thu từ vùng
Başarakavak (Thổ Nhĩ Kỳ) bằng kỹ thuật HPLC [61]
Hai hợp chất: p-coumaric acid, ferulic acid cũng được tìm thấy ở loài Heracleum lanatum [23], [16] và loài Heracleum persicum [23]
Bảng công thức cấu tạo một số hợp chất phenolic của chi Heracleum: Phụ lục 5
Bảng 1.1: Tổng hợp nhóm chất Furanocoumarin một số loài của chi Heracleum
STT Tên chất Loài [TLTK]
1 Sphondin Heracleum Sphondylium; Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]
2 Isobergapten Heracleum Sphondylium; Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]
3 Isopimpinellin Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum;
4 Bergapten Heracleum Sphondylium; Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum orphanidis; Heracleum montanum; Heracleum candicans [60], [21]
5 Pimpinellin Heracleum Sphondylium; Heracleum verticillatum; Heracleum ternatum; Heracleum sibiricum; Heracleum orphanidis [60]
6 Heraclenin Heracleum dissectum; Heracleum Sphondylium;
7 Byakangelicol Heracleum Sphondylium; Heracleum ternatum
8 Imperatorin Heracleum dissectum; Heracleum Sphondylium;
9 Phellopterin Heracleum dissectum; Heracleum Sphondylium;
10 Heraclenol Heracleum Sphondylium; Heracleum sibiricum;
11 Byakangelicin Heracleum Sphondylium; Heracleum ternatum
12 Xanthotoxin Heracleum Sphondylium; Heracleum sibiricum;
1.2 Tổng quan về loài Heracleum bivittatum
1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của Heracleum bivittatum
Tên khoa học: Heracleum bivittatum Boissieu
Tên Tiếng Việt: Vũ thảo, Cần dại
Cỏ đa niên, cao đến 2m, có lông Lá to; thứ diệp mọc đối, thứ diệp chót 3 thùy, bìa có răng; cuống thành bẹ to ôm thân Tán kép; tổng bao do phiến cao 1cm; tổng bao phụ nhỏ; cọng hoa dài 1cm; hoa to 7mm; cánh hoa trắng, các cánh hoa ngoài dài hơn phía trong phát hoa; tiểu nhụy 5, dài cỡ cánh hoa Trái tròn, dẹp, cao 3,5mm
Phân bố: chủ yếu ở Trung Quốc và Sapa (Việt Nam), độ cao 1700m [2]
Hiện nay chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Heracleum bivittatum.
Tổng quan về loài Cryptotaenia japonica
1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân loại
Cây cao 20-100cm Cuống lá ở gốc và dưới dài 5-20cm, có bẹ thuôn dài; phiến hình tam giác đến hình trứng, 2-14 x 3-7cm; lá chét ở giữa hình thoi – hình trứng ngược hoặc hình tim, 2-9 x 1.5-10cm; các lá chét bên dài hình trứng đến hình trứng ngược, 1.5-
8 × 1-6cm Không có lá bắc hoặc 1, thẳng, 4-10 x 0.5-1.5mm; tia 2-3, 0.5-3.5 cm, rất không đều nhau; lá bắc ở cuống hoa 1-3, hình kim, 4-10mm; 2-4 cuống, 1-14mm, rất không đều Răng đài 0.1-0.3mm, không đều nhau Cánh hoa từ 1 -1.2 x 0.6-1mm Quả 4-6 x 1-1.5mm Hoa và quả từ tháng 2 đến tháng 10 [12]
1.3.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố
Những nơi ẩm ướt trong rừng, hào; độ cao 200-2400m Ở các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Cát Lâm, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hà Bắc, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tây, Giang Tây, Thiên Tân, Thiên Tân, Sơn Tây, Tân Tây, Tuyên Quang của Trung Quốc Ngoài ra còn có ở Nhật Bản và Hàn Quốc [12]
Chưa có nghiên cứu được công bố ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài
Cryptotaenia japonica Một số báo cáo được ghi nhận trên thế giới:
Okuno Y và cộng sự đã sử dụng phương pháp cất kéo hơi nước từ 3 mẫu tươi Itomitsuba, Kirimitsuba, Neromitsuba (Nhật Bản) và sử dụng phương pháp phân tích GC-MS đã ghi nhận 53 hợp chất tinh dầu [42]
7 Năm 2011, Yao Y và cộng sự đã xác định được 6 hợp chất: luteolin, kaempferol, apigenin, acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric [68]; Đến năm 2018, Lu J và cộng sự đã bổ sung thêm: diosmetin, acid chlorogenic, acid gallic, acid vanillic từ hạt của
Cryptotaenia japonica [35] Và 12 hợp chất phenolic đã được tìm thấy ở lá [53]
Bảng 1.2 Thành phần phenolic của Cryptotaenia japonica
STT Hoạt chất Công thức cấu tạo
1.4 Tổng quan về chi Xyloselinum Pimenov & Kljuykov
1.4.1 Đặc điểm thực vật, phân loại và phân bố
Xyloselinum Pimenov & Kljuykov là chi mới cho khoa học và đặc hữu của Việt
Nam, được Pimenov & Kljuykov (2006) [48] mô tả năm 2006 Chi Xyloselinum gồm ba loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov); Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) và loài Xyloselinum laoticum
Pimenov & Aver [1], [47] Thìa là thân gỗ việt phân bố ở khu BTTN Bát Đại Sơn, huyện Quản Bạ và xã Lao Và Chải, huyện Yên Minh Thìa là hóa gỗ leonid có phạm vi phân bố rộng hơn; ngoài tỉnh Hà Giang (xã Sính Lủng, huyện Đồng Văn; xã Sủng Trà, huyện Mèo Vạc) còn gặp ở tỉnh Sơn La (xã Mường Lụm, huyện Yên Châu; và xã Chiềng Cọ, thành phố Sơn La) [1,2]
Xyloselinum vietnamense và Xyloselinum leonidii thường mọc rải rác hay thành đám nhỏ dưới tán rừng thông có ít ánh sáng hoặc ở chân các tảng đá trên đường đỉnh hay gần đường đỉnh núi đá vôi Thìa là hóa gỗ leonid đã được đưa vào Danh lục một số loài thực vật bị đe doạ tuyệt chủng điển hình ở cao nguyên đá vôi Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) [1]
1.4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kliuykov)
Cây bụi, cao 1-1,5 m, cành màu xanh đậm, khía dọc, có lóng ngắn Lá nhẵn ôm thân hình tam giác, có lớp màng mỏng, cuống dài 4,5-7 cm, không có rãnh ở mặt gần trục Phiến lá dài 10-13 cm, rộng 6-10 cm, hình tam giác rộng, kép lông chim 2-3 lần, cuống bẹ dài 2-3 cm Cụm hoa ở chót cành, hình cầu, đường kính 7-9 cm, trên lóng thon dài, tách xa nhau khi tạo quả, hoa tán nhỏ có đường kính 2-2,5 cm Quả nhẵn, hình elip, dài 7-7,5 mm, rộng 4,5-5 mm Cây ra hoa tháng 5, quả tháng 9-10
Cây sống lâu năm, mọc rải rác dưới tán rừng trong các kẽ đá có đất
Phân bố: Khu BTTN Bát Đại Sơn, huyện Quản Bạ; xã Lao Và Chải, huyện Yên Minh, tỉnh Hà Giang
1.4.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh học của loài Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kliuykov)
Cây bụi, cao 0,8-1,8 m Cành màu xám Lá mọc tập trung dày ở ngọn thân, thùy lá hình tam giác, cuống lá dài 2-9 cm, phiến lá dài 9,5-12 cm, rộng 6-8 cm, hình trứng, xẻ 2-3 lần lông chim, thùy lá gần gốc có cuống dài 1-2 cm Cụm hoa ở chót cành, tròn, nhẵn với lóng kéo dài, đường kính cụm hoa 10-11 cm, tách xa nhau khi tạo quả, mang 15-22 hoa tán nhỏ không đều Quả nhẵn, ít khi chia múi, dẹt ở mặt lưng, dài 6,5-6,7 mm, rộng 2,8-3,0 mm, hình thoi dài đến hình mác Mùa hoa tháng 6-7, quả tháng 9-10.
Tổng quan về loài Xyloselinum vietnamense và Xyloselinum leonidii 9 1 Đặc điểm thực vật, phân loại và phân bố
Phân bố: xã Sính Lủng, huyện Đồng Văn; xã Sủng Trà, huyện Mèo Vạc, tỉnh Hà Giang Cây còn gặp ở xã Mường Lụm, huyện Yên Châu và xã Chiềng Cọ thành phố Sơn
Bằng phương pháp sắc ký khối phổ (GC/MS), 19 hợp chất trong tinh dầu đã được xác định Thành phần chính của tinh dầu từ lá Thìa là thân gỗ việt là các hợp chất sau: sabinen (75,0%), γ-terpinen (2,5%), Z-β-ocimen (2,4%), myrcen (2,4%), α-pinen (2,2%) và 42 hợp chất trong tinh dầu từ thân rễ Thìa là thân gỗ việt là các hợp chất sau: sabinen (36,5%), terpinene-4-ol (10,3%), Z-β-ocimen (9,7%), γ-terpinen (3,0%), α-pinen (2,9%), myrcen (2,2%)
Bằng phương pháp sắc ký khối phổ 26 hợp chất trong tinh dầu đã được xác định Thành phần chính của tinh dầu từ lá Thìa là gỗ leonid là các hợp chất: sabinen (29,3%), β-phellandren (17,8%), myrcen (12,9%), α-pinen (7,6%), terpinene-4-ol (4,1%), γ- terpinene (1,5%) và 52 hợp chất của tinh dầu từ thân rễ Thìa là hóa gỗ leonid là các hợp chất: β-pinen (13,7%), Z-β-ocimen (12,9%), sabinen (10,0%), β-thujen (9,52%), α- pinen (9,8%), terpinene-4-ol (3,5%) [3]
Hiện nay, mới xác định được 8 hợp chất từ dịch chiết methanol của loài Thìa là gỗ leonid bằng phổ NMR và HSQC bao gồm: xyloselin, decursinol, decursinol glucoside, pteryxin, praeroside I, angelicain, cimifugin, hesperidin [40]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây Cần dại (Heracleum bivittatum H Boissieu) được thu hái tại xã Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào ngày 12/10/2023; cây Áp nhĩ cần (Cryptotaenia japonica Hassk) được thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023; loài Thìa là thân gỗ việt (Xyloselinum vietnamense Pimenov & Kljuykov) được thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023 và Thìa là hóa gỗ leonid (Xyloselinum leonidii Pimenov & Kljuykov) được thu hái tại huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang vào ngày 31/7/2023 Tên khoa học của các mẫu nghiên cứu được giám định tại Phòng Tài nguyên Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số tiêu bản đối với loài Heracleum bivittatum H Boissieu là CSCL.03/23-24-SP06, đối với loài Cryptotaenia japonica Hassk là CSCL.03/23-24-HG01, đối với loài Xyloselinum vietnamense Pimenov &
Kljuykov là CSCL.03/23-24-HG02 và đối với loài Xyloselinum leonidii Pimenov &
Sau khi thu hái, mẫu được làm khô tự nhiên trong bóng râm để cất tinh dầu, một phần mẫu đã sấy được xay thành bột, bảo quản trong túi PE kín để nghiên cứu thành phần hóa học
Dùng trong định tính sơ bộ thành phần hóa học: NaOH 10 %, FeCl3 5 %, H2SO4 đặc, chì acetat, amoniac đặc, HCl đặc, TT Diazo, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric, TT Fehling A, TT Fehling B, Na2CO3, …
- Bản mỏng Silicagel 60-F254 và bản mỏng Silica gel F254 (Merck, Đức)
- Dung môi: toluen, ethyl acetat, n-hexan, acid formic, aceton, cloroform, ethanol 70 %, acid acetic băng …
- Chất chuẩn chấm sắc ký: Luteolin, acid caffeic, Apigenin, acid clorogenic Tất cả được cung cấp bởi công ty Biopurify phytochemical (Trung Quốc)
Tất cả các hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V
2.1.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Dùng trong phản ứng định tính: Cốc có mỏ, phễu thủy tinh, bình gạn, pipet, ống nghiệm, đũa thủy tinh…
- Cân kỹ thuật SARORIUS TE42
- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ)
- Bể siêu âm Daihan Scientific (WUC-A10H)
- Hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao HPTLC (CAMAG, Thụy Sĩ) gồm: Máy chấm sắc ký CAMAG Linomat 5, hệ thống triển khai sắc ký tự động ADC-2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy tính cài đặt phần mềm visionCATS 2.2
- Detector khối phổ phân giải cao X500R QTOF
- Hệ thống thống sắc ký lỏng Exion LC TM
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu
- Phân tích thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
-Phân tích thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu sau khi đã thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [4], [5]
2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên liệu: Các mẫu Cần dại, Áp nhĩ cần, Thìa là thân gỗ Việt, Thìa là thân gỗ Leonid được cắt nhỏ, sấy ở 55℃, xay nhỏ thành bột bảo quản trong túi zip
Cao chiết: Các mẫu bột được chiết với ethanol 70% (1:20) bằng phương pháp đun hồi lưu Sau đó lọc qua giấy lọc, chuyển dịch chiết qua cô cạn thành cao trên nồi đun cách thủy Sấy cao ở tủ sấy 55℃ một ngày Thu cao chiết
Bảng 2.1: Thống kê khối lượng cao chiết của 4 mẫu
STT Tên mẫu Ký hiệu Bộ phận dùng
1 Áp nhĩ cần HG01 Toàn cây 60 8,1
3 Thìa là hóa gỗ Việt HG02 Toàn cây 60 6,52
Dung dịch thử (A): Cân khoảng 0,05g cao chiết ethanol 70% vào cốc có mỏ, thêm 3ml methanol, đậy kín Siêu âm trong 10 phút, lọc dung dịch, cho vào cột pha rắn C18 để loại bỏ chlorophyll Dung dịch sau khi lọc qua cột dùng làm dung dịch thử (A) Sắc ký đồ được thực hiện trên hệ dung môi khai triển sắc ký: Hệ (I) ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) và hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1)
Dung dịch thử (B): Để xác định sự tương đồng/khác biệt về các aglycon trong các mẫu nghiên cứu Cân khoảng 50mg cao chiết ethanol 70% vào bình nón, thêm 10ml HCl 2N đun hồi lưu ở 100℃ trong 1 giờ Lọc dung dịch qua giấy lọc và chuyển vào bình gạn Thêm 10ml ethyl acetat lắc đều, lấy lớp ethyl acetat Sau đó thêm Na2SO4 để loại nước, thu được dung dịch thử (B) Sắc ký đồ được thực hiện trên hệ pha động: Hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1)
Quy trình triển khai sắc ký:
- Hệ (I): ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26)
• Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 °C trong
30 phút Chấm đồng thời dung dịch A của 4 mẫu nghiên cứu, chất đối chiếu sử dụng là acid chlorogenic (nồng độ) Sau khi triển khai, phun TT NP/PEG và quan sát, chụp ảnh ở bước sóng 366 nm
- Hệ (II): Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (14:10:1)
• Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck) hoạt hoá ở 110 °C trong
30 phút Kích thước bản mỏng: 16 x 10cm
• Đưa mẫu lên bản mỏng: Dung dịch A và Dung dịch B của cả 4 mẫu nghiên cứu được đưa lên bản mỏng bằng máy Linomat 5, chất đối chiếu bao gồm luteolin, apigenin và acid caffeic Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 10,0mm Khoảng cách giữa tâm vết và mép ngoài bản mỏng là 20,0mm Khoảng cách giữa các vết 12,0mm
- Sau khi triển khai sắc ký, sấy nhẹ bản mỏng cho bay hơi hết dung môi Quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở 2 bước sóng 254 và 366 nm Phun thuốc thử hiện màu NP/PEG Sau khi hiện màu bằng thuốc thử, quan sát và chụp ảnh sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm
2.3.2.3 Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS
Cao chiết ethanol 70% của 4 mẫu nghiên cứu được phân tích sắc ký lỏng khối phổ sử dụng hệ thống thống sắc ký lỏng Exion LCTM kết nối với detector khối phổ phân giải cao X500R QTOF (Sciex, USA) sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử Cắn được hòa tan trong methanol và xử lý chiết pha rắn qua cột C18 Các hợp chất được phân tách sử dụng cột Hypersil GOLD Dim 150 mm x 2.1 mm, 3àm (Thermo Scientific, USA) trong gradient pha động từng bước của acid formic 0,1% trong nước (dung môi A) và acid formic 0,1% trong acetonitril (dung môi B) ở tốc độ dòng 0,4 mL/phút Chương trình máy được thiết lập như sau: 0-1 phút, 100% A; 1-20 phút, 98% A; 20-25 phút, 2%
A Thể tớch tiờm mẫu là 2,0 àL Phỏt hiện MS/MS được thực hiện ở chế độ ion õm trong khoảng m/z là 50-2000 amu
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu
Tiến hành như phụ lục 1, kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong 4 mẫu nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Áp nhĩ cần và Cần dại bằng phương pháp thường quy
STT Nhóm chất Tên phản ứng Áp nhĩ cần Cần dại
Phản ứng với dd kiềm +
Dương tính Phản ứng với hơi amoniac
Phản ứng với dd FeCl3 + +
Phản ứng với TT Diazo
Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Dương tính Phản ứng với TT
Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt
Phản ứng với TT Mayer
- Âm tính Phản ứng với TT
Phản ứng với TT Dragendorff
Phản ứng với dd FeCl3 5%
5 Tanin Phản ứng với dd gelatin 1%
Phản ứng với dd chì acetat 10%
6 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Âm tính - Âm tính
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Âm tính - Âm tính
9 Đường khử Phản ứng với TT
10 Acid amin Phản ứng với TT
11 Polysaccharid Phản ứng với TT
12 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc
Chú thích: (+++): Dương tính rất rõ; (++) : Dương tính rõ; (+) : Dương tính;
Từ kết quả định tính bằng các phản ứng thường quy có thể thấy mẫu Áp nhĩ cần và Cần dại đều phát hiện sự có mặt của 4 nhóm chất là: flavonoid, coumarin, đường khử, polysaccharid; không phát hiện sự có mặt của 5 nhóm chất là: glycosid tim, anthranoid, alcaloid, tanin, acid hữu cơ Nhóm chất: caroten, saponin chỉ xuất hiện ở mẫu Áp nhĩ cần Và nhóm chất: acid amin chỉ xuất hiện ở mẫu cần dại
Bảng 3.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong TLTG Việt và TLTG Leonid bằng phương pháp thường quy
STT Nhóm chất Tên phản ứng
Phản ứng với dd kiềm +
Dương tính Phản ứng với hơi amoniac
Phản ứng với dd FeCl3 ++ ++
Phản ứng với TT Diazo
Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Dương tính Phản ứng với TT
Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt
Phản ứng với TT Mayer
- Âm tính Phản ứng với TT
Phản ứng với TT Dragendorff
Phản ứng với dd FeCl3 5%
+ Âm tính Phản ứng với dd gelatin 1%
Phản ứng với dd chì acetat 10%
6 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Âm tính - Âm tính
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Âm tính - Âm tính
9 Đường khử Phản ứng với TT
10 Acid amin Phản ứng với TT
11 Polysaccharid Phản ứng với TT
12 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc
Chú thích: (+++): Dương tính rất rõ; (++) : Dương tính rõ; (+) : Dương tính; (-) : Âm tính
Từ kết quả định tính bằng các phản ứng thường quy có thể thấy mẫu TLTG Việt và TLTG Leonid đều phát hiện sự có mặt của 4 nhóm chất là: flavonoid, coumarin, đường khử, polysaccharid; không phát hiện sự có mặt của 7 nhóm chất là: glycosid tim, anthranoid, alcaloid, tanin, acid hữu cơ, saponin, caroten Và nhóm chất: acid amin chỉ xuất hiện ở mẫu TLTG Việt.
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng cao chiết ethanol 70% các mẫu nghiên cứu được triển khai với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Sau khi triển khai hệ sắc ký (I) ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) và phun TT NP/PEG, quan sát dưới bước sóng 366nm được kết quả như hình 3.1 Trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu có các vết có huỳnh quang màu vàng đặc trưng cho các hợp chất flavonoid hoặc các vết có huỳnh quang màu xanh có thể là các hợp chất phenolic hoặc coumarin
Hình 3.1 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung môi I: ethyl acetat – acid fomic – acid acetic băng – nước (100:11:11:26) sau khi phun TT
NP/PEG, quan sát ở bước sóng 366nm
(2): HG1-Me – Áp nhĩ cần
(3): SP06b-Me – Rễ cần dại
(4): HG2-Me – Thìa là thân gỗ Việt
(5): HG3a-Me – phần trên mặt đất Thìa là thân gỗ Leonid
Sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG của 4 mẫu nghiên cứu có các khác biệt về vị trí và màu sắc các vết:
- Áp nhĩ cần có vị trí tương đồng về R f và màu sắc với chất chuẩn: Tại R f = 0,49 mẫu Áp nhĩ cần cho vết huỳnh quang màu xanh tương đồng với vết huỳnh quang của chất chuẩn acid chlorogenic Như vậy, có thể kết luận Áp nhĩ cần có chứa acid chlorogenic
- Mẫu Cần dại và TLTG Leonid có hai vết tương đồng ở vị trí R f = 0,39 và R f = 0,28 và chủ yếu là các vết huỳnh quang màu xanh
- Trong khi đó, mẫu Thìa là thân gỗ Leonid và Thìa là thân gỗ Việt có một số khác biệt: Tại vị trí R f = 0,91 mẫu Thìa là thân gỗ Việt cho vết huỳnh quang màu xanh rất rõ còn mẫu Thìa là thân gỗ Leonid lại không cho vết tương ứng Ngoài ra ở vị trí R f = 0,39 mẫu TLTG Việt cho vết huỳnh quang màu vàng và mẫu TLTG Leonid lại không cho vết tương ứng
Hình 3.2 Sắc ký đồ 4 mẫu nghiên cứu sau khi triển khai với hệ dung môi II: toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) quan sát ở: A Bước sóng 254 nm B
Bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG
(2): HG1-Me – Áp nhĩ cần
(3): HG1-EtOAc – Áp nhĩ cần phần aglycon (sau thủy phân)
(6): SP06b-EtOAc – Cần dại phần aglycon (sau thủy phân)
(8): HG2-EtOAc – TLTG Việt phần aglycon (sau thủy phân)
(11): HG3a-EtOAc – TLTG Leonid phần aglycon (sau thủy phân)
Triển khai sắc ký với hệ dung môi (II) Toluen – ethyl acetat – acid formic (14:10:1) Đây là hệ dung môi có độ phân cực trung bình, có thể dùng để định tính các hợp chất flavonoid ở dạng aglycon hoặc một số coumarin và acid phenolic Do đó, để sơ bộ dự đoán sự tương đồng hay khác biệt về thành phần aglycon trong các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chấm trên bản mỏng cả cao chiết ethanol 70% và cao chiết đã thuỷ phân của 4 mẫu nghiên cứu
Sau khi triển khai hệ sắc ký (II) và phun TT NP/PEG, quan sát dưới bước sóng 366nm được kết quả như hình 3.2
Sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun TT NP/PEG của 4 mẫu nghiên cứu có các vị trí tương đồng về R f và màu sắc với chất chuẩn như sau:
- Áp nhĩ cần có các vị trí tương đồng về R f và màu sắc với chất chuẩn luteolin tại R f 0,41 Như vậy, có thể kết luận rằng mẫu Áp nhĩ cần có chứa luteolin Ngoài ra, tại vị trí
R f = 0,50 của mẫu Áp nhĩ cần có chứa Apigenin
- Cả 4 mẫu nghiên cứu đều có vị trí tương đồng về R f và màu sắc với chất chuẩn acid caffeic tại R f = 0,42 Ở hai mẫu Thìa là thân gỗ, có khá nhiều vết tương đồng với nhau về vị trí R f và màu sắc: R f = 0,22; 0,42; 0,7 Điều đó cho thấy sự tương đồng về mặt thành phần hóa học của Thìa là thân gỗ Việt và Thìa là thân gỗ Leonid Ngoài ra, dịch chiết sau thuỷ phân của hai loài thuộc chi Xyloselinum cũng có sự tương đồng ở một số vết tại R f 0,32; 0,39; 0,42; 0,52; 0,65 gợi ý về sự tương đồng của thành phần aglycon của hai loài nghiên cứu.
Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS
Dữ liệu LC-MS/MS được phân tích qua mạng lưới phân tử trên nền tảng GNPS [HG1, ID: 8b67ef4788aa48a381be3e8c81508831 (ion âm);
HG2, ID: ce12669ab4df4783be9fc9710aff3b9a (ion âm);
HG3a, ID: 0da925a77c4d45fbb9162befeae858f7 (ion âm);
SP06b, ID: ce42c135a918421aacb28129b6939b72 (ion âm)] được thu thập vào ngày 23 tháng 4 năm 2024 tại https://gnps.ucsd.edu/) Phổ MS/MS được xử lý bằng cách lọc các dữ liệu dựa trên năm đỉnh ion mạnh nhất trong khoảng ±
50 Da trên toàn phổ Sau đó, mạng lưới phân tử được tạo ra với yêu cầu tối thiểu có bốn đỉnh khớp nhau, với các kết nối giữa các nút được lọc bằng giá trị cosine lớn hơn 0,70
23 Các nút trong mạng lưới phân tử được xây dựng và chú thích dựa trên các phân mảnh MS2 Mạng lưới phân tử được sắp xếp và trực quan hóa bằng phần mềm Cytoscape 3.8.2 (NRNB, Hoa Kỳ) Dữ liệu được xuất ra từ phần mềm Cytoscape cung cấp khả năng truy cập vào thông tin chi tiết liên quan đến việc dự đoán tên hợp chất và phân loại nhóm hợp chất Khi kết hợp với các cơ sở dữ liệu uy tín như Reaxys, PubChem và các công bố khoa học quốc tế, quá trình nhận diện và khẳng định các hợp chất trong mẫu thử được tiến hành Việc này bao gồm việc so sánh và xác minh các hợp chất dựa trên dữ liệu LC-MS/MS, bao gồm thời gian lưu, dữ liệu MS1, MS2 và loại phân mảnh ion
Bảng 3.3: Kết quả dự đoán thành phần hóa học của Thìa là thân gỗ Việt và Thìa là thân gỗ Leonid dựa trên mạng dữ liệu phân tử GNPS
Công thức phân tử (ppm)
16 10.30 acid 3- (benzoylo xy)-2- hydroxypr opyl β-D-
Bảng 3.4: Kết quả dự đoán thành phần hóa học của Áp nhĩ cần dựa trên mạng dữ liệu phân tử GNPS
(phút) Tên hợp chất Ion (+)
Công thức phân tử (ppm)
Bảng 3.5: Kết quả dự đoán thành phần hóa học của Cần dại dựa trên mạng dữ liệu phân tử GNPS
(phút) Tên hợp chất Ion
Công thức phân tử (ppm)
(2S,3S,4S,5R,6R)- 6-(3-benzoyloxy- 2- hydroxypropoxy)- 3,4,5- trihydroxyoxane- 2-carboxylic acid
Từ kết quả được thống kê ở phụ lục 4 và các bảng 3.3; bảng 3.4; bảng 3.5 đã cung cấp những thông tin dự đoán tên hợp chất và phân loại nhóm hợp chất:
- Mẫu Áp nhĩ cần đã xác định được 18 hợp chất Trong đó, có 13 hợp chất thuộc nhóm phenolic Đặc biệt Luteolin và Apigenin là hai hợp chất tương đồng với các nghiên cứu trên thế giới Hợp chất corchorifatty acid F được xác định chưa có nhiều dữ liệu ghi nhận
- Hai loài Xyloselinum có 6 hợp chất giống nhau: acid D-(-)-quinic; acid daucic; acid 5-O-caffeoylquinic; peucedanol; scolymosid; praerosid II Điều đó càng khẳng định hơn về sự tương đồng của thành phần hóa học của hai loài nghiên cứu.
- Mẫu Cần dại xác định được 10 hợp chất Trong đó có hai hợp chất: dinoseb và peucedanol thuộc nhóm phenolic
Do đây là các mẫu chưa được nghiên cứu nhiều, cơ sở dữ liệu còn hạn chế nên số lượng hợp chất dự đoán được còn khá khiêm tốn Vì vậy, cần có các nghiên cứu sâu hơn về hóa thực vật và tác dụng sinh học: Phân lập hợp chất, đánh giá tác dụng của các hợp chất phân lập được, tìm ra được các hoạt chất có hoạt tính…
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Sau quá trình thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và đạt được một số kết quả như sau:
- Định tính sơ bộ về thành phần hóa học một số nhóm hợp chất hữu cơ ở 4 loài nghiên cứu
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Cắn chiết ethanol 70% của Áp nhĩ cần có chứa acid chlorogenic; luteolin; apigenin Hai loài Xyloselinum có sự tương đồng về thành phần hóa học Cả 4 mẫu nghiên cứu đều chứa acid caffeic
- Xác định một số hợp chất trong cao chiết các mẫu nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và mạng dữ liệu phân tử GNPS: Nhóm hợp chất phenolic chiếm ưu thế trong thành phần hóa học của 4 mẫu nghiên cứu Khẳng định sự tương đồng về mặt thành phần hóa học của hai loài Xyloselinum
- Nghiên cứu sâu hơn về hóa thực vật và tác dụng sinh học: Phân lập hợp chất, đánh giá tác dụng của các hợp chất phân lập được, tìm ra được các hoạt chất có hoạt tính…
- Thực hiện đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết xuất, kiểm tra tính kháng khuẩn của các hợp chất, đánh giá mối liên quan giữa thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài thuộc họ Apiaceae
- Định lượng thành phần phenolic và flavanoid trong các mẫu nghiên cứu
- Tiếp tục tiến hành thực nghiệm, nghiên cứu, khảo sát thêm các mẫu thuộc họ Apiaceae ở miền Bắc Việt Nam nếu phát hiện loài chưa từng được báo cáo trước đây để bổ sung cơ sở dữ liệu về họ Apiaceae.
