(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học một số loài thuộc chi ficus ở việt nam

-1- MỞ ĐẦU Lãnh thổ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Có tới 3/4 diện tích nước rừng núi trùng điệp, địa hình chia cắt nên điều kiện khí hậu đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu đặc trưng Đất đai nước thể tính chất nhiệt đới ẩm điển hình, phức tạp, đa dạng loại hình, phân bố chất lượng Những yếu tố tạo nên điều kiện sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới rậm, ẩm, thường xanh, thưa, nửa rụng thảm thực vật mang tính cận nhiệt đới khu vực núi cao Theo ước tính, Việt Nam có khoảng gần 13000 lồi thực vật bậc cao có mạch có khoảng 4000 lồi sử dụng làm thuốc Đa số loài thực vật sống hoang dại Một số thuốc quý nhập trồng phổ biến nhiều địa phương bạc hà, bạch chỉ, bạch truật, đương quy, huyền sâm, ngưu tất, vân mộc hương, xuyên khung trở nên quen thuộc h Ngoài phong phú thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam cịn có giá trị to lớn chỗ chúng sử dụng rộng rãi cộng đồng để chữa nhiều chứng bệnh khác Các thuốc sử dụng hình thức độc vị hay phối hợp với tạo nên thuốc cổ phương, tồn thịnh hành đến ngày Ngoài ra, hàng trăm thuốc khoa học y - dược đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng Nhiều loại thuốc chiết xuất từ dược liệu Việt Nam rutin, D-strophantin, berberin, palmatin, L- tetrahydropalmatin, artermisinin, sản phẩm từ tinh dầu sử dụng rộng rãi nước xuất Xu hướng sâu nghiên cứu xác minh Y học cổ truyền tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc từ dược liệu ngày giới quan tâm Việc sử dụng hợp chất thiên nhiên sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên làm dược phẩm chữa bệnh ngày thu hút quan tâm nhà khoa học cộng đồng ưu điểm chúng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể so với dược phẩm tổng hợp -2Mặc dù Ficus chi lớn, nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu thể nhiều hoạt tính sinh học quý báu, nước ta, chưa có nhiều nghiên cứu mang tính hệ thống để tạo sở khoa học phục vụ lâu dài Xuất phát từ thực tế đó, thực đề tài "Nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học số loài thuộc chi Ficus Việt Nam", với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thành phần hợp chất trao đổi thứ cấp theo định hướng hoạt tính sinh học số loài thuộc chi Sung (Ficus L.) Đánh giá hoạt tính sinh học (secondary bioassay) hợp chất phân lập nhằm tìm kiếm dược chất có triển vọng Nội dung nghiên cứu: h Thu thập mẫu lượng lớn 04 loài Ficus là: F callosa, F elastica, F drupacea F microcarpa để tiến hành nghiên cứu Nghiên cứu phân lập hợp chất trao đổi thứ cấp theo định hướng hoạt tính sinh học lồi F callosa, F elastica, F drupacea F microcarpa sử dụng phương pháp sắc ký Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp phổ Đánh giá hoạt tính chống ơxi hóa (phương pháp ORAC) hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase hợp chất -3- CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CHI SUNG (FICUS L.) Chi Sung (Ficus L.) chi lớn họ Dâu tằm (Moraceae), gồm gỗ lớn, gỗ nhỏ, bụi dây leo, phân bố rộng rãi khắp vùng nhiệt đới Nam Bắc bán cầu Người ta ước tính có khoảng 1000 loài thuộc chi phân bố nơi giới Các nước vùng Đông Nam Nam châu nơi tập trung nhiều loài Việt Nam chưa có nghiên cứu đầy đủ chi Sung (Ficus L.) Phạm Hoàng Hộ nghiên cứu mơ tả 75 lồi, phân lồi 46 thứ Theo nghiên cứu gần Nguyễn Tiến Bân chi có từ 100 đến 200 lồi Việt Nam (Đỗ Huy Bích et al., 2004; Nguyễn Tiến Bân et al., 2003) Theo Lã Đình Mỡi, lồi thuộc chi Sung (Ficus L.) có mủ, nguồn nguyên liệu làm thuốc có giá trị Nhựa của nhiều loài Ficus dân địa phương nhiều nơi sử dụng để điều trị vết thương, chỗ bầm giập, mụn nhọt cho h kết tốt Ngồi ra, chúng cịn sử dụng để chữa viêm thấp khớp, chữa ho tiêu chảy Vỏ loài thường dùng y học cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đường (Lã Đình Mỡi et al., 2005), rối loạn tiêu hóa kháng viêm chữa lỵ Dưới mô tả sơ lược số loài Ficus phổ biến Việt Nam: - Cây sung Ficus racemosa Cây thân gỗ cao tới 25-30 m, đường kính thân tới 60-90 cm; hoa đơn tính gốc Vỏ thân màu nâu ánh xám, nhẵn Các cành nhỏ, phiến non chùm với sợi lông cong xuống hay che phủ rậm rạp lông tơ mềm màu trắng Các cành nhỏ màu nâu Các kèm hình trứng-mũi mác, dài 1,5-2 cm, có màng lơng tơ Các sớm rụng, mọc so le; cuống dài 2-3 cm; phiến hình elip-trứng ngược, elip hay elip hẹp Quả mọc thành chùm cành nhỏ ngắn thân già, -4đôi nách cành non hay cành nhỏ không già, mọc thành cặp, màu cam ánh đỏ chín, hình lê, đường kính 2-2,5 cm, phần gốc thu nhỏ thành cuống, lỗ chân lông đỉnh hình rốn, phẳng; cuống dài khoảng cm; bắc tổng bao hình tam giác-trứng Các hoa đực vú mọc Hoa đực: lỗ chân lông cận đỉnh, không cuống; thùy đài hoa hay 4; nhị Ra hoa khoảng tháng tới tháng - Cây Gừa Ficus microcarpa Cây gỗ nhỏ trung bình, thường xanh, cao 15-20(25) m, có hệ rễ khí sinh phát triển mạnh; vỏ màu xám Lá mọc cách, phiến hình bầu dục - trứng gần hình trứng - bầu dục, kích thước 3-12 ´ 1,5-9 cm; gốc hình nêm, chóp tù nhọn, mép nguyên, 5-9 đôi h gân bên, thường nhẵn Sung mọc nách lá, thường đôi một, không cuống, gần hình cầu, đường kính chừng 8-12 mm, nhẵn, chín có màu tím thẫm Cả hoa đực hoa không cuống, bao hoa 3(4) mảnh, hoa đực có nhị - Cây Đa Ficus bengalensis Cây gỗ to, cao 10-30 m, có nhiều rễ phụ khí sinh; cành non có lơng ngắn, dày Lá có phiến xoan, dài 10-22 cm, gốc trịn hay hình tim, gân phụ 5-7 cặp, cuống dài 1-7 cm Quả sung cặp nách rụng, tròn hay xoan, to 1,5 cm, không lông, màu đỏ đậm; bắc 3, có lơng dày, hoa có bao mẫu 3-4, nhị Cây trồng từ hạt nhanh chóng phát triển rễ khí từ cành rễ khí phát triển thành thân thực thụ chúng chạm tới mặt đất -5- Cây ngái Ficus hispida Cây nhỡ, cao 5-7 m Cành non có nhiều lơng, nháp, màu nâu xám, cành già nhẵn Lá mọc đối, hình bầu dục trái xoan, dài 11-20 cm, rộng 5-12 cm, gốc trịn, đầu tù có mũi nhọn ngắn, mép khía răng, có lơng nháp hai mặt; kèm hình tam giác, có lơng ngắn Cụm hoa gốc thân cành già gồm hoa đực hoa cái; hoa đực nhiều đỉnh cụm hoa, có đài lõm, nhị 1; hoa có đài bao bọc lấy bầu, vịi có lơng mềm Quả phức, mềm, hình cầu, thót lại gốc, đầu bẹt vỏ có lơng nháp Mùa hoa tháng 5-10 - Cây vú bò Ficus hirta Cây nhỡ, cao 1-2 m Ngọn non có lơng h Thân phân cành, có lơng dày Lá mọc so le, thường tập trung thân, hình bầu dục, gốc trịn hình tim, đầu thn nhọn, có 3-5 thùy (thường 3), mặt nháp, mặt có lơng nhỏ, mép khía răng, gân gốc 3; cuống có lơng dày, cứng; kèm hình giáo Cụm hoa mọc kẽ gồm hoa đực hoa cái; hoa đực khơng cuống, đài 4, hình giải, dính gốc, nhị 2, hoa có cuống, đài 4, thn tù, bầu hình trái xoan Quả phức hình cầu, chín màu vàng Mùa hoa quả: tháng 9-12 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CHI SUNG (FICUS L.) 1.2.1 Các nghiên cứu giới Các nghiên cứu hóa học mối liên hệ với hoạt động sinh-dược học loài thuộc chi Sung (Ficus L.) thực khoảng 50 năm gần -6đây Nhìn chung, lồi thuộc chi Sung (Ficus L.) thường có nhóm hợp chất steroid, flavonoid, triterpene, saponin, megastigman, hợp chất phenol số hợp chất dễ bay a Các nghiên cứu theo hướng kháng tế bào ung thư Năm 2001, nhà khoa học Israel nghiên cứu thành phần hóa học từ mẫu nhựa lồi F carica phân lập hỗn hợp hợp chất 6-O-acyl-b-Dglucopyranosyl-b-sitosterol, với nhánh acyl chủ yếu palmitoyl linoleyl với lượng nhỏ stearyl oleyl Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hợp chất có tác dụng ức chế phát triển nhiều dòng tế bào ung thư khác như: MCF-7 (ung thư vú), Jurkat HD-MAR (ung thư máu), DU-145 (ung thư tuyến tiền liệt) (Rubnov et al., 2001) Cũng năm 2001, hợp chất norisoprenoid mới, ficustriol alkaloid dạng throindolizidine biết Omethyltylophorinidine phân lập từ cành loài F hispida mọc Thái Lan Hợp chất O-methyltylophorinidine thể hoạt tính gây độc tế bào cao h dòng tế bào ung thư thử nghiệm Col2 (ung thư ruột kết, ED50 = 0,02 mg/ml), Lu1 (ung thư phổi, ED50 = 0,018 mg/ml), KB (ung thư biểu mô, ED50 = 0,02 mg/ml) LNCap (ung thư tuyến tiền liệt, ED50 = 0,03 mg/ml) (Peraza-Sasnchez et al., 2002) Vào năm 2005, ba hợp chất chromen, sáu hợp chất flavonoid, hợp chất benzopyran hợp chất isocoumarin tiếp tục nhà khoa học Đài Loan phân lập từ mẫu thân F formosana f formosana Trong ba hợp chất flavonoid carpachromene, apigenin norartocarpetin thể hoạt tính gây độc tế bào ấn tượng dòng tế bào ung thư Hep-G2, PLC/PRF/5 Raji với giá trị IC50 từ 0,016 đến 0,076 mM Một điều đáng quan tâm hoạt tính hợp chất tương đương mạnh chất chuẩn dương (Sheu et al., 2005) b Các nghiên cứu theo hướng hoạt tính kháng viêm chống ơxi hóa Hoạt động chống ơxi hóa anthocyanin từ lồi F carica chứng minh thông qua nghiên cứu Solomon cộng Theo đó, phân đoạn dịch chiết giàu anthocyanin đóng góp tới 36% hoạt tính chống ôxi hóa -7dịch chiết tổng (Solomon et al., 2006) Bên cạnh đó, hai flavonoid phân lập từ F bengalensis cho hoạt động chống ơxi hóa rõ ràng thử nghiệm với chuột bị nhiễm mỡ máu Hoạt động so sánh với hoạt động chất chống ơxi hóa chuẩn quercetin (Daniel et al., 1998) Nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học dịch chiết etanol Sung F racemosa dẫn tới phân lập hợp chất axit racemosic Hợp chất thể hoạt tính kìm hãm mạnh enzym COX-1 (cyclooxygenase-1) 5-LOX (5lipoxygenase) với giá trị IC50 90 18 mM thể hoạt tính chống ơxi hóa thu dọn gốc tự ABTS ấn tượng với giá trị IC50 =19 mM (Li et al., 2004) Hoạt động chống viêm loét dày dịch chiết cồn loài F glomerata Roxb số mơ hình sinh lt dày chuột Rao cộng thực Nghiên cứu chứng minh dịch chiết cồn loài cho thấy hoạt động chống loét phụ thuộc vào nồng độ thử nghiệm Dịch chiết cho thấy hoạt động bảo vệ cao mơ hình thử nghiệm gây lt dày cồn Các tác giả h cho hoạt động có có mặt thành phần phenolic có F glomerata Hoạt tính kháng viêm dịch chiết F racemosa thử nghiệm mơ hình gây viêm chuột khác gây viêm carrageenin, serotonin, histamine dextran Ở nồng độ 200 400 mg/kg, dịch chiết loài cho thấy hoạt động kháng viêm rõ rệt mơ hình thử nghiệm Ở nồng độ 400 mg/kg, dịch chiết cho hoạt động tốt với khả kìm hãm 30.4, 32.2, 33.9, 32.0% sau gây viêm với carrageenin, serotonin, histamine dextran Thử nghiệm hoạt tính trường diễn nồng độ cho thấy dịch chiết F racemosa làm giảm đến 41% khối lượng u hạt Hoạt động so sánh với hoạt động chất chống viêm phenylbutazone (Rao et al., 2008) c Các nghiên cứu theo hướng kháng vi sinh vật Các nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật loài Ficus nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ sớm Năm 1990, nhà khoa học Thụy Sỹ phát dịch chiết metanol F spetica thể hoạt tính kháng khuẩn -8và kháng nấm mạnh Các nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học từ F septica nhóm nghiên cứu xác định hai hợp chất alkanoid Ficuseptine antofine Các hợp chất thể hoạt tính mạnh kháng chủng vi khuẩn B subtilis, M luteus, E coli kháng chủng nấm P oxalicum (Baumgartner et al., 1990) Các hoạt động kháng sinh, chống nấm, chống kí sinh trùng dịch chiết số lồi thuộc chi Sung (Ficus L.) nghiên cứu Dịch chiết vỏ F asperifolia sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Staphylococcus aureus, B subtilis, Micrococcus flavus, E coli, Pseudomonas aeruginosa dòng kháng S aureus SA1199B, RN4220 XU212 Thêm vào đó, hoạt động chống ơxi hóa với thử nghiệm nguyên bào sợi da dịch chiết chứng minh (Annan, Houghton, 2008) Tương tự vậy, hoạt động kháng sinh dịch chiết hai loài F chlamydocarpa (FCR) F cordata (FCB) với thành phần mang hoạt tính công bố Các nghiên cứu cho thấy h hoạt động kháng sinh dòng vi sinh vật thử nghiệm hai loài chủ yếu thành phần flavonoid có hoạt tính định Các hợp chất alpinumisoflavone, gaenistein, laburnetin, luteolin (phân lập từ FCR) epiafzelechin (phân lập từ FCB) có hoạt tính mạnh dịng Mycobacterium smegmatis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC khoảng từ 0,61 đến 312,50 mg/ml Đáng ý hợp chất laburnetin cho hoạt động kìm hãm M tuberculosis mạnh Bên cạnh đó, dịch chiết F chlamydocarpa cho hiệu kìm hãm cao 10 số 16 chủng vi khuẩn thử nghiệm Dịch chiết methanol FCB cho tác dụng kìm hãm tốt so với FCR dòng vi sinh vật (Kuete et al., 2008) Hoạt tính diệt giun số loài Ficus cho định phân đoạn chứa enzim ficin Thử nghiệm chuột bị gây nhiễm với Syphacia obvelata, Aspiculuris tetraptera Vampirolepis nana cho thấy nhựa F insipida F carica loại trừ 38.6% 41.7% tổng số dịng S obvelata khơng hiệu dòng lại Tuy nhiên, nghiên -9cứu độc tính cấp cho thấy khả gây chảy máu ruột non cao thử nghiệm lồi Ficus (De Amorin et al., 1999) d Một số nghiên cứu theo hướng khác Thử nghiệm sơ thành phần hóa học lồi F sycomorus cho kết dương tính với thành phần tannin, saponin, đường khử, alcaloid flavonoid Đây thành phần mang dược tính cao có khả phát triển nghiên cứu tạo thuốc Bên cạnh đó, thí nghiệm hoạt động chống teo dịch chiết loài cho kết đáng ý (Sandabe et al., 2006) Phân đoạn giàu saponin từ vỏ rễ F platyphylla gần thể hoạt động chống co giật cao, hoạt động tương tự dòng thuốc chống co giật dựa chế khóa kênh natri (Chindo et al., 2009) Điều gợi mở cho việc phát phân lập saponin có hoạt động chống co giật cao tương lai 1.2.2 Các nghiên cứu nước h Hiện nay, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc chi Sung (Ficus L.) Việt Nam cơng bố Năm 1998, nhóm nghiên cứu nhà khoa học thuộc Viện Hóa học công bố phân lập xác định cấu trúc hai hợp chất triectpen 3-acetyl ursa-14:15en-16-one lanosterol-11-one acetate từ loài F fistulosa thu thập Vườn quốc gia Cúc Phương (Tuyen et al., 1998) Tiếp theo, hợp chất sesquitecpen verrucarin L acetate xác định từ loài vào năm 2002 Một điều đáng quan tâm hợp chất có tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum cao với giá trị IC50 < ng/ml Hoạt tính hợp chất cao chloroquine, artemisinin quinine (Zhang et al., 2002) Gần đây, dịch chiết metanol đề F religiosa chứng minh có hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ Dịch chiết lồi có tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại viêm, kìm hãm sản sinh tác nhân điều tiết viêm NO cytokine tiền viêm tế bào thần kinh đệm (macroglia) chuột hoạt hóa Các kết gợi mở cho nghiên cứu phát triển dược phẩm có tác dụng phịng -10ngừa số bệnh thối hóa thần kinh chẳng hạn bệnh Parkinson (Jung et al., 2008) Các nghiên cứu thành phần hóa học đề nhóm nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên xác định số hợp chất nor-isoprenoid lignan Trong hợp chất lignan (+)-pinoresinol syringaresinol O-b-D-glucopyranoside thể hoạt tính chống ơxi hóa mạnh hệ DPPH với giá trị ED50 tương ứng 16,90 16,93 mM (Hoàng Thanh Hương et al., 2009; Cầm Thị Ính et al., 2009) 1.3 CÂY GỪA F MICROCARPA 1.3.1 Mô tả, phân bố sinh thái Gừa gỗ nhỏ trung bình, thường xanh, cao 15-20(25) m, có hệ rễ khí sinh phát triển mạnh; vỏ màu xám Lá mọc cách, phiến hình bầu dục trứng gần hình trứng - bầu dục, kích thước 3-12 ´ 1,5-9 cm; gốc hình nêm, chóp tù nhọn, mép nguyên, 5-9 đôi gân bên, thường nhẵn Sung mọc h nách lá, thường đôi một, không cuống, gần hình cầu, đường kính chừng 8-12 mm, nhẵn, chín có màu tím thẫm Cả hoa đực hoa không cuống, bao hoa 3(4) mảnh, hoa đực có nhị Gừa có vùng phân bố rộng từ Sri Lanka, Ấn Độ đến Đông Dương, Thái Lan, khu vực Malesia, miền Nam Trung Quốc, quần đảo Ryukyu, quần đảo Solomon, Australia, quần đảo Caroline Mariana, New Caledonia, quần đảo Lovalty Palau Ở nước ta, loài mọc hoang trồng tỉnh Hà Tây, Hịa Bình, Hà Nội, Ninh Bình, Thừa Thiên - Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Bình Dương, Bình Phước, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa - Vũng Tàu (Mỡi et al., 2005) Gừa sinh trưởng nhiều điều kiện sinh thái khác từ hốc đá ven bờ biển đến đồi núi đá, từ khu vực đầm lầy ven biển đến vùng rừng núi Thường gặp mọc ven theo sơng suối, kênh rạch, vùng có triều Cây hoa kết quanh năm