phạm ánh ngọc bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học lá ổi psidium guajava thu hái ở hưng yên

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM ÁNH NGỌC

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HOÁ HỌC LÁ ỔI Psidium guajava

THU HÁI Ở HƯNG YÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM ÁNH NGỌC

MÃ SINH VIÊN: 1901504 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HOÁ HỌC LÁ ỔI Psidium guajava

THU HÁI Ở HƯNG YÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Vũ Xuân Giang 2 TS Nguyễn Thị Hồng Anh

Nơi thực hiện:

2 Viện Dược Liệu

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em, bạn bè và gia đình

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS Vũ Xuân Giang và TS Nguyễn Thị Hồng Anh, người thầy và người chị đã

trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, bồi dưỡng kiến thức và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này cũng như trong suốt quá trình em tham gia nghiên cứu khoa học tại Viện Dược Liệu

Bên cạnh đó, em còn nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều anh, chị, em khác

Em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Th.S Đoàn Minh Sang, người

cố vấn luôn sẵn sàng hỗ trợ, chỉ bảo, truyền kinh nghiệm và góp ý tận tình cho em trong suốt quá trình em thực hiện và hoàn thành khoá luận này

Bằng tất cả sự yêu quý và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cùng các

bạn, các em sinh viên nghiên cứu khoa học, thực hiện khóa luận tại Khoa Hoá Thực Vật Đặc biệt là chị Lương Thị Lan và anh Chu Quang Trí đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo

điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình tham gia nghiên cứu khoa học cũng

như thực hiện khóa luận tại Viện Dược Liệu Khoá luận được hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài cấp sở Khoa học và Công nghệ Hưng Yên “Nghiên cứu phát triển sản phẩm từ

cao định chuẩn lá ổi (Psidium guajava L.) trồng tại Hưng Yên có tác dụng hỗ trợ

điều trị tiểu đường”, em xin gửi lời cảm ơn tới sở KHCN Hưng Yên đã tạo điều kiện để

em thực hiện khoá luận này

Cảm ơn DS Phạm Thị Nga, bạn Hà Minh Cường đã luôn sẵn sàng hỗ trợ, động

viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Cảm ơn gia đình, đặc biệt là mẹ đã luôn đồng hành bên con, là chỗ dựa vững chắc,

tiếp thêm sức mạnh để con có điều kiện tiếp tục thực hiện và hoàn thành khoá luận

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn bộ thầy cô

Trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, dìu dắt, truyền tải những kiến thức quý báu

cho em trong suốt 5 năm qua Do điều kiện chủ quan và khách quan, khoá luận khó có thể tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của thầy cô và hội đồng để khoá luận này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Sinh viên

Phạm Ánh Ngọc

1.1 Tổng quan về cây Ổi (Psidium guajava L.) 2

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại 2

1.1.2 Phân bố, sinh thái 2

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Định tính bằng phản ứng hoá học 16

2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Kết quả định tính bằng phản ứng hoá học 22

3.2 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 23

3.2.1 Kết quả chiết xuất 23

4.2 Đề xuất 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC CỦA KHOÁ LUẬN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic

Hep G2 Dòng tế bào ung thư gan người (Human hepatocellular carcinoma cell line)

HSQC Phổ tương tác dị nhân lượng tử đơn (Heteronuclear Singer Quantum Coherence)

MeOH Methanol

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

P guajava Psidium guajava L

PGEt Phân đoạn Ethyl acetat

ppm Phần triệu

SKLM Sắc ký lớp mỏng

STZ Streptozotocin

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UA Acid ursolic

UV Tử ngoại (Ultra violet)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học bằng phản ứng hoá học 22

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất OD1 và hợp chất tham khảo [8] 26

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất OD2 và hợp chất tham khảo [49] 28

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây, lá và hoa ổi Psidium guajava L 3

Hình 1.2 Công thức hoá học của hợp chất thuộc nhóm flavon 4

Hình 1.3 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavonol 5

Hình 1.4 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavanol 6

Hình 1.5 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavan-3-ol 7

Hình 1.6 Công thức hợp chất thuộc nhóm flavan-3-4-diol 7

Hình 1.7 Công thức các hợp chất thuộc nhóm oleanan 8

Hình 1.8 Công thức các hợp chất thuộc nhóm ursan 9

Hình 1.9 Công thức các hợp chất thuộc nhóm taraxasteran 9

Hình 1.10 Công thức các hợp chất thuộc nhóm lupan 10

Hình 1.11 Công thức các hợp chất thuộc nhóm tanin 10

Hình 1.12 Công thức các hợp chất tinh dầu trong lá P guajava 11

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn 23

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình phân lập chất từ cao phân đoạn diclomethan 25

Hình 3.3 Sắc kí đồ của hợp chất OD1 và OD2 so với cao DCM 25

Hình 3.4 Công thức cấu tạo của hợp chất 1 26

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của hợp chất 2 28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, thuốc phòng và chữa bệnh được điều chế từ hai nguồn: dược liệu và hoá chất tổng hợp Trong đó, nhiều hoạt chất quan trọng cần phải chiết xuất từ dược liệu mà chưa thể điều chế bằng con đường tổng hợp Có tới hơn 21.000 loài cây cỏ được các nước trên thế giới sử dụng, không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu Đặc biệt, ở Việt Nam, dược liệu có một vai trò quan trọng Là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, chịu ảnh hưởng của gió mùa, Việt Nam được thiên nhiên ưu ái sở hữu hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật có mạch, trong đó có trên 4.000 loài cây thuốc [3] Đứng trước nhu cầu lớn về dược liệu, đây sẽ là nguồn tài nguyên đóng góp rất nhiều cho ngành dược nước ta trong nghiên cứu, chiết xuất phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó phát triển các thuốc mới

Ổi (Psidium guajava L.) là một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta Ngoài

việc đem lại giá trị dinh dưỡng rất tốt cho sức khoẻ, Ổi còn được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian Trong kháng chiến chống thực dân Pháp, cao búp ổi được dùng để chữa đi lỏng, lỵ; nước sắc để rửa các vết loét, vết thương [3] Bên cạnh đó, Ổi còn được biết đến bởi tác dụng rất tốt trong điều trị đái tháo đường-một căn bệnh đã trở nên phổ biến ở nước ta nói riêng cũng như toàn thế giới nói chung [45], [52] Mặc dù có nhiều công dụng tốt cùng với nguồn nguyên liệu dồi dào, nhưng dược liệu Ổi tại nước ta lại chưa được quan tâm khai thác hiệu quả

Tại Việt Nam hiện nay, đã có một số nghiên cứu về các tác dụng sinh học từ cao chiết lá Ổi Tuy nhiên, các thông tin cụ thể về thành phần hoá học cũng như các nghiên cứu về tác dụng dược lý của loại dược liệu này còn rất hạn chế Bởi vậy, cần có thêm nghiên cứu sâu và đầy đủ về thành phần hoá học, cấu trúc các hoạt chất tạo ra những tác dụng sinh học từ dược liệu Ổi tại Việt Nam

Do đó, với mục đích đóng góp vào cơ sở dữ liệu về thành phần hoá học, cấu trúc các hợp chất có tác dụng sinh học, từ đó làm cơ sở để phát triển thêm các nghiên cứu về

tác dụng sinh học cũng như công dụng của lá Ổi trong tương lai, đề tài “Bước đầu

nghiên cứu thành phần hoá học lá Ổi Psidium guajava thu hái ở Hưng Yên” được

thực hiện với các mục tiêu sau:

➢ Phân lập 1-2 hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn ➢ Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được

Chi Ổi (Psidium)

Loài Ổi (Psidium guajava L.)

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Cây Ổi có nguồn gốc từ Trung Mỹ phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhập trồng ăn quả và phát tán rộng [2]

Ở Việt Nam, Ổi mọc hoang tại nhiều vùng núi phía bắc và được trồng phổ biến ở hầu hết các địa phương của nước ta, từ đồng bằng đến miền núi Cây ưa sáng, phát triển tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [7] Nhiệt độ phát triển thích hợp từ 15-45oC , nhiệt độ cho cây ra quả là từ 23-28oC, lượng mưa 1.000-2.000 mm/năm và không sống được ở độ cao 1.500 m trở lên Ổi ra hoa và quả nhiều năm, thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Vòng đời của cây ổi có thể tồn tại từ 40-60 năm [11]

1.1.3 Đặc điểm thực vật

Cây ổi cao 4 -5 m, cành non có 4 cạnh Lá đơn, mọc đối [3] có cuống ngắn, hình bầu dục, gốc tròn, đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ [7] Lá non phủ lông trắng nhạt, vị chát [3] Lá trưởng thành nhẵn hoặc hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, phiến nguyên, khi soi lên thấy có túi tinh dầu trong; vị chát [10] Vỏ thân nhẵn, khi già bong ra từng mảng [11]

3 Hoa trắng mọc riêng lẻ 2-3 cái ở một kẽ lá [3], cuống có lông mịn, cuống dài, nụ phù ở đầu [10]; 4-5 lá đài, dày, không đều; 4-5 cánh hoa trắng; rất nhiều nhị [3], xếp thành nhiều dãy, chỉ nhị rời; bao phấn có trung đới rộng; bầu hạ, dính vào ống đài, 5 ô [11]

Quả hình cầu, nạc trắng, hạt nhiều, to 2-3 mm, cứng, vàng [10], khi xanh có vị chua và chát, chín có vị ngọt Ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại [3]

Hình 1.1 Cây, lá và hoa ổi Psidium guajava L 1.2 Tổng quan về lá Ổi (Folium Psidii guajavae)

1.2.1 Thành phần hoá học

Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về phân lập các thành phần hoá học của lá

ổi Psidium guajava L được công bố trên thế giới và Việt Nam Các nhóm chất chủ yếu được tìm thấy trong thành phần hoá học của P guajava bao gồm: các flavonoid,

triterpenoid, tanin, saponin, tinh dầu,… và một số polyphenol khác không thuộc các nhóm kể trên

1.2.1.1 Flavonoid

Trong búp và lá ổi có chứa các flavonoid đã được tìm thấy từ rất sớm Các hợp

chất phân lập được trong thành phần hoá học của lá P guajava đã công bố gồm:

a, Nhóm flavon và flavonol

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Babatola và cộng sự đã phân lập được luteolin

(1) là hoạt chất thuộc nhóm flavon của P guajava [15]

4

Hình 1.2 Công thức hoá học của hợp chất thuộc nhóm flavon

Theo tổng quan tài liệu, những flavonol nổi bật có trong lá Ổi bao gồm:

quercetin (2), avicularin (3), quercetin-3-O-β-D-(2’-O-galloyl vinylpropyonat (4), morin-3-O-α-L-lysopyranosid (5) [3]; guajaverin (6), morin-3-O-

glucosid)-4’O-β-D- glucopyranosid (7) [11]

Năm 2013, Eidenberger cùng cộng sự đã phân lập được các chất gồm:

hyperoside (8), quercetin- 3-O-β-glucoside (9), guaijaverin (10),

quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside (11) [24]

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Babatola và cộng sự cũng đã phân lập được thêm 5 hoạt chất thuộc phân nhóm flavonol Các hợp chất này gồm có: rutin (12), kaempferol (13), myricetin (14), isoquercetin (15), reynoutrina (16) [15]

5

Hình 1.3 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavonol

6

b, Nhóm flavanon, flavan-3-ol và flavan-3-4-diol

Năm 2021, Huang cùng nhóm nghiên cứu lần đầu tiên phân lập được 2 flavanon là đối quang của nhau: Psiflavanon A (17), psiflavanon B (18) [30]

Năm 2016, Díaz-de-cerio cùng cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất thuộc nhóm flavan-3-ol bao gồm: Prodelphinidin dimer isomer (19), gallocatechin (20), catechin (21), procyanidin (22) [22]

Năm 2023, nhóm nghiên cứu Đại học Cần Thơ đã phân lập được Leucomyanidin (23) thuộc nhóm flavan-3-4-diol [9]

Hình 1.4 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavanol

7

Hình 1.5 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavan-3-ol

Hình 1.6 Công thức hợp chất thuộc nhóm flavan-3-4-diol

1.2.1.2 Triterpenoid

Triterenoid là nhóm chất nổi bật trong thành phần hoá học của lá P guajava Đã

có rất nhiều triterpenoid đã được tìm thấy và phân lập, có thể được phân loại thành các nhóm sau đây:

a, Triterpenoid pentacyclic

Nhóm oleanan nổi bật với acid oleanolic (24) [11] Năm 2012, Shao M cùng cộng sự

đã tách được acid eucalyptolic (25) từ cao chiết lá Ổi P guajava [43] Cùng với đó, năm

2021, Li Y và các cộng sự cũng đã phân lập thêm được 8 triterpenoid mới bao gồm: acid

maslinic (26), acid arjunolic (27), acid terminolic (28), oleanoaldehyde (29), acid

coumaroyl maslinic (30), acid 3-β-O-trans-coumaroyl maslinic (31), acid

3-β-O-cis-p-coumaroyl arjunolic (32), acid 3-β-O-trans-p-3-β-O-cis-p-coumaroyl arjunolic (33) [34]

Năm 2004, Begum S và cộng sự đã phân lập được uvaol (35) vào [16] Bổ sung

thêm trong danh sách các chất đã tách được từ P guajava, năm 2015, Flores và cộng sự

phân lập được thêm acid madecassiac (36) [26]

Bên cạnh 8 hoạt chất được phân lập có khung oleanan nói trên, năm 2021, Li Y và các cộng sự cũng đã phân lập thêm được 12 triterpenoid mới có khung ursan bao gồm:acid corosolic (37), acid asiatic (38), ursaldehyde (39), acid corosolic 3-β-O-cis-

p-coumaroyl (40), acid jacoumaric (41), acid asiatic 3-β-O-cis-p-coumaroyl (42), acid

asiatic 3-β-O-trans-p-coumaroyl (43), guajavolide (44), ehretiolide (45), ilelatifol D

(46), acid guavenoic (47), acid 3-β-O-cis-p-coumaroyl Actinidic (48)[34]

9

Hình 1.8 Công thức các hợp chất thuộc nhóm ursan

➢ Nhóm Taraxasteran: Có acid guavanoic (49) được Begum và cộng sự phân lập

vào năm 2002 [17]

Hình 1.9 Công thức các hợp chất thuộc nhóm taraxasteran

10 ➢ Nhóm lupan: Năm 2010, Ghosh cùng cộng sự phân lập được acid betulinic (50),

lupeol (51) [28] Sau đó, Li Y cùng cộng sự đã phân lập thêm được acid alphitolic (52)vào năm 2021[34]

Hình 1.10 Công thức các hợp chất thuộc nhóm lupan

1.2.1.3 Tanin

Búp và lá non của ổi chứa khoảng 10% tanin Thành phần tanin của búp và lá ổi gồm cả 3 loại tanin: thuỷ phân được, không thuỷ phân được và loại hỗn hợp

Các tanin thuỷ phân được trong búp và lá ổi gồm: Gallotannin

3,4,5-trimethoxyphenol 1-O-β-D-(2’,6’-di-O-galloyl)-glucopyranosi, ellargitanin hexanhydroxydiphenoyl-6-O-galloyl-D-glucopyranoisd, pedunculagin) và các ellargitanin

(2,3-(S)-C-glycosid (castalagin, sasuarictin, casuarinin, acid valolaginic , acid vescalagin carboxylic)

Các ellargitanin C-glycosid là thành phần chính trong tanin của búp và lá ổi

Tanin không thuỷ phân được trong búp và lá ổi gồm: Procyanidin-B1, prodelphinidin-B1

Tanin hỗn hợp trong búp và lá ổi gồm: Acutissimin A, B; eugenigrandin A; mongolicain A; guajavin A và B; psidinin A, B và C; psiguavin; guavin A (53), guavin C (54) và guavin D [3]

Hình 1.11 Công thức các hợp chất thuộc nhóm tanin

β-2020 gồm: linalool, α-terpineol, epiglobulol, spathulenol, globulol, viridiflorol, ledol [29]

b, Terpen

Năm 2018, De Souza và cộng sự đã tách được 9 tinh dầu thuộc nhóm terpen bao

gồm: Limonen (56), caryophyllen (57), humulene, c-muurolen, selinen, β-selinen, bisabonen, β-bisabonen, α-cedren [21] Năm 2019, Weli và cộng sự đã tác được các tinh dầu bao gồm: Iso-caryphyllene, d-cadinen, aromadendren [48]; Nhóm nghiên cứu của tác giả Hasan cũng đã phân lập được một số tinh dầu từ P guajava bằng phân tích GC-MS gồm: α-pinen, β-myrcen, d-3 caren [29] Ngoài ra còn có một số tinh dầu thuộc nhóm terpen khác đã được phân lập bao gồm α-cadinol, α-copaene, [19]; α-bulnesene [14]

α-Hình 1.12 Công thức các hợp chất tinh dầu trong lá P guajava 1.2.2 Tác dụng dược lý

1.2.2.1 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2005, tác giả Sanches và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn của dịch chiết nước và ethanol:nước từ lá rễ và vỏ thân P Guajava Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng ức chế vi khuẩn gram (+), Staphylococcus aureus và Bacillus

chiết nước Hỗn hợp flavonoid của phân đoạn ethanol:nước thu được qua sắc kí cột silica

gel cho thấy có tác dụng trên S.aureus qua kết quả với MIC là 25µg/ml [41]

12 Trên cao chiết aceton của lá Ổi, nhóm nghiên cứu đại học Cần Thơ (2023) cho

kết quả về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết kháng mạnh đối với Listeria innocua và

Enterococcus faecalis Bên cạnh đó, kết quả cho thấy tất cả các đĩa thạch đều xuất hiện

vòng vô khuẩn trên tất cả các chủng Escherichia Coli ATCC 25922, Listeria innocua

ATCC 33090, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27583, Staphylococcus aureus ATCC 2592, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus

cereus ATCC 14579 [9]

Năm 2021, Wang cùng cộng sự đã phân lập được psidinone từ cao P guajava Qua nghiên cứu của nhóm tác giả, hoạt chất này thể hiện rõ hoạt tính kháng khuẩn chống lại

Staphylococcus epidemidis và Myco-bacterium Smegmatis [47] Cao chứa tanin catechin

chiết từ lá ổi ức chế các vi khuẩn E.coli, E.poarcoli, Citrobacter diversus, Klebsiella

pneumoniae, Samonella enteritidis, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus [11] 1.2.2.2 Tác dụng trên hệ tiêu hoá

Năm 2006, Prabu và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu chứng minh dịch chiết

nước của P guajava có hiệu quả trong việc chống lại vi khuẩn E.Coli, các vi khuẩn đường ruột, Vibrio cholera, Vibrio cholera [39] Nghiên cứu của Birdi cùng cộng sự

năm 2010 đã khẳng định flavonoid trong cao chiết lá ổi có tác dụng chống tiêu chảy [18]

Một số thử nghiệm trên chuột do Lozoya và nhóm nghiên cứu (2002) cho thấy cao chiết nước lá ổi có tác dụng giảm tần suất mắc bệnh tiêu chảy và giảm mức độ nghiêm trọng do bệnh tiêu chảy gây ra [36]

Cao chiết lá ổi có tác dụng rất tốt trong việc chống loét và tăng tiết acid của dạ dày Kết quả nghiên cứu của nhóm thí nghiệm gồm Uduak và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết methanol của lá ổi có đặc tính kháng acid và chữa lành vết loét hiệu quả trên

thí nghiệm in vivo Các flavonoid và saponin trong cao chiết methanol của P guajava

làm giảm đáng kể tình trạng loét dạ dày trên chuột mắc bệnh do ethanol [46]

1.2.2.3 Tác dụng trên chuyển hoá glucose huyết

Có khá nhiều phân đoạn của cao chiết lá ổi có tác dụng chống ĐTĐ Năm 2013, Khan cùng cộng sự (2013) đã thực hiện nghiên cứu dùng đường uống

dịch chiết P guajava đã được khử béo bằng ether dầu mỏ trong ethanol 95% cho chuột

mắc bệnh tiểu đường do Streptozotocin gây ra Sau 30 ngày, chuột được điều trị ĐTĐ

bằng cao P guajava trong nước cho thấy nồng độ glucose và insulin được đưa về gần

mức bình thường So sánh kết quả với chuột được điều trị ĐTĐ bằng Glyclazide cho

thấy P guajava có tác dụng tương tự Glyclazide [33] Nghiên cứu của Subramania năm

2023 cùng cộng sự một lần nữa nghiên cứu tác dụng trên chuyển hoá glucose huyết đối với cao Ổi chiết bằng ethanol cũng cho kết quả tương tự [45]

13

Trong các phân đoạn của cao chiết P guajava, phân đoạn ethyl acetat của cao

chiết cho thấy khả năng hạ đường huyết tốt nhất Thí nghiệm được thực hiện bởi Soman và nhóm nghiên cứu (2013) tiến hành trên chuột mắc bệnh tiểu đường do tiêm STZ qua phúc mạc màng bụng Kết quả cho thấy cả hai nhóm được điều trị bằng PGEt đều cho mức đường huyết lúc đói của chuột đã giảm đáng kể Nồng độ Hemoglobin A1c (HbA1c) và Fructosamine của những con chuột trong hai nhóm được điều trị bằng PGEt cũng giảm xuống gần mức bình thường [44]

Flavonoid từ lá Ổi được chứng minh có tác dụng chống tăng đường huyết Năm 2020, Zhu cùng nhóm nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm trên chuột mắc ĐTĐ do STZ liều thấp gây ra Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung flavonoid từ lá Ổi làm giảm đáng kể đường huyết lúc đói, khả năng dung nạp glucose và chỉ số kháng insulin so với nhóm đối chứng tiểu đường (p < 0,05) [52]; Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Cần Thơ (2023) cũng cho thấy việc bổ sung flavonoid từ cao chiết lá Ổi có tác dụng ứcc chế enzym α-amylase và α-glucosidase trong kiểm soát mức đường huyết sau bữa ăn của bệnh nhân tiểu đường typ II [9]

1.2.2.4 Tác dụng chống oxy hoá

P guajava được chiết xuất bằng ethanol 70% trong nước được đánh giá hoạt tính

chống oxi hoá qua ba thí nghiệm: khả năng loại bỏ gốc tự do 2,2'-zinobis ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), khả năng chống oxy hóa làm giảm sắt (FRAP) và khả năng hấp thụ gốc oxy (ORAC), khả năng nhặt gốc tự do 1,1-diphenyl-

(3-2-picrylhydrazyl (DPPH) Kết quả cho thấy chiết xuất cô đặc và sấy phun của P guajava

là nguồn chất giàu chất chống oxy hoá tự nhiên [25], [53]

Cao chiết aceton lá Ổi cho thấy có khả năng ức chế 74,4 ± 0,224% các gốc tự do ở nồng độ 100 µg/mL Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết lá ổi tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết [9]

Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Cheon cùng công sự cho thấy chiết xuất lá ổi còn có tác dụng ức chế các loại oxy phản ứng (ROS) được tạo ra trong tế bào Hep G2 Chiết xuất từ lá Ổi làm tăng hoạt động của glutathione (GSH), glutathione

reductase (GR) và glutathione peroxidase (GPx) chống lại stress oxy hóa [20]

1.2.2.5 Tác dụng khác

Nghiên cứu của Kafle cùng cộng sự (2018) cho thấy lá Ổi còn có những lợi ích sức khoẻ tiềm ẩn, như ngăn ngừa ung thư, điều hoà huyết áp, cải thiện độ săn chắc của da, điều trị ho, cảm lạnh [54]; giảm đau, hạ sốt, chống co thắt, trị sưng nướu, loét miệng, ức chế thần kinh trung ương [37]

1.2.3 Sử dụng trong y học cổ truyền

1.2.3.1 Tính vị

14 Vị đắng, chát [4], hơi chua, tính ấm [5]

1.2.3.2 Quy kinh

Quy vào hai kinh: đại tràng, vị [4]

1.2.3.3 Công năng chủ trị

Thanh tràng, chỉ tả: Dùng trong bệnh ỉa chảy cấp hoặc mạn tính Để chữa ỉa chảy

do tính hàn thì phối hợp với các vị thuốc khác có vị cay tính ấm như Hương phụ, Trần bì, Xả, Riềng Nếu ỉa chảy do chứng thấp nhiệt thì phối hợp với Rau má, Lá mơ, Mã đề, Cát căn, Bạch biển đậu [4]

Làm săn da, sát khuẩn: Dùng khi mụn nhọt, lở ngứa, có thể giã nát hoặc búp ổi

lấy dịch chấm vào chỗ vết bị bệnh; cũng có thể nấu nước, rửa vết thương hoặc chốc đầu, ghẻ lở, có thể dùng phối hợp với lá trầu không [3]

Chủ trị: Đau bụng tiêu chảy, lỵ [5] Dùng ngoài: Nấu nước rửa vết thương, mụn nhọt lở loét với lượng thích hợp [5] 1.2.3.4 Liều dùng

Ngày dùng 15g đến 20g búp non hay lá non, dạng thuốc sắc, hoặc hãm [5]; thường phối hợp với các vị thuốc khác như Chè, Gừng [7]

1.2.3.5 Bài thuốc có chứa lá ổi

Bài thuốc chữa tiêu chảy: Búp Ổi 12g, vỏ thân Ổi 8g, Tô mộc 8g, Gừng 2g Sắc

uống mỗi ngày một thang [11]

Bài thuốc chữa thổ tả: Vỏ rộp Ổi sao đen, lá Phèn đen, mỗi vị 40g Hoài sơn sao

đen, Liên nhục sao đen, mỗi vị 20g, Trạch tả sao, Trư linh, Bạch truật sao vàng, Bạch linh, Hoắc hương, mỗi vị 12g Tất cả phơi khô, tán bột rây mịn Mỗi lần uống 1 thìa café, ngày 2 lần [11]

Chữa lỵ: vỏ rộp Ổi, hạt Mã đề, hoa Hoè, rễ Mơ lông, mỗi vị 8g, sao vàng Sắc

uống mỗi ngày 1 thang [11]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là lá của cây Ổi (Folium Psidii guajavae) thu hái vào

ngày 17/3/2024 tại xã Thắng Lợi, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên, đã được giám định

tên khoa học là Psidium guajava L (Phụ lục 1)

Tiêu bản hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc-Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu-Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP/18837/24)

Các dung môi: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM, aceton, n-hexan,…

Chất chuẩn: Acid ursolic, acid corosolic Bản sắc kí lớp mỏng Silica gel GF254 (Merck) ➢ Thiết bị

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Burker AM500 FT-NMR Spectrometer, máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap, máy cất quay Buchi R-200, cân xác định độ ẩm Precisa XM120, bể siêu âm VEVOR Ultrasonic Cleaner 10L, máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ), bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức), tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức), cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sỹ), đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp), bộ dụng cụ chiết hồi lưu…

Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), Sephadex LH-20 Các dụng cụ thuỷ tinh: Buret, bình gạn, cốc có mỏ, ống nghiệm, cột sắc ký, bình nón, phễu lọc, ống đong, pipet, mao quản,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hoá học thông qua: ➢ Định tính các nhóm chất chính của lá Ổi bằng phản ứng hoá học ➢ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất trong lá

Phản ứng hơi amoniac: Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, để khô rồi đặt lên

miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp Phản ứng dương tính khi màu vàng của dịch chiết được tăng lên

Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 3-5 giọt

dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện kết tủa vàng Thêm khoảng 1-2 ml nước cất Phản ứng dương tính khi tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% rồi lắc Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện tủa xanh đen

Phản ứng với thuốc thử Diazo: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hoá

bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương

tính khi xuất hiện kết tủa màu đỏ

➢ Định tính alcaloid [1]

Cân khoảng 2 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun sôi Để nguội, lọc Dịch lọc được kiềm hoá bằng NH3 đặc đến pH= 7-8 Chuyển dịch lọc đã kiềm hoá vào bình gạn, chiết alcaloid base bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp dịch chiết cloroform và cô cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn bằng 4 ml dung dịch H2SO4 1N Lấy 3 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ổng khoảng 1 ml dịch chiết, lần lượt thực hiện các phản ứng:

Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương

tính khi xuất hiện tủa màu trắng đến vàng

Phản ứng với dung dịch acid picric 1%: Thêm 3 giọt dung dịch acid picric 1% Phản ứng

dương tính khi xuất hiện kết tủa vàng

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Phản

ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ ➢ Định tính saponin [1]

Cho khoảng 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm khoảng 20 ml ethanol 80%, đun cách thuỷ trong vòng 5 phút và lọc lấy dịch chiết

17

Quan sát hiện tượng tạo bọt: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml

nước Lắc mạnh theo chiều đứng của ống nghiệm trong vòng 1 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Phản ứng dương tính khi cột bọt còn bền vững sau 15 phút

Phản ứng sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid:

Lấy 2 ống nghiệm, bố trí thí nghiệm như sau:

Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2 Dung dịch NaOH 0,1 N (pH=13) 5 ml 0

Lắc mạnh trong 1 phút Hiện tượng

tạo bọt

Saponin steroid cột bọt cao cột bọt thấp Saponin triterpenoid Cột bọt 2 ống bằng nhau Phản ứng Rosenthaler

Cho 3 ml dịch chiết cồn vào trong ống nghiệm, bốc hơi cách thuỷ đến gần khô, thêm vanilin 1%/HCl, đun nóng Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím

➢ Định tính tanin [1]

Cân khoảng 1 g bộ dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất Đun sôi trong 2-3 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc nếp gấp thu lấy dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính

Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch

gelatin 1% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông trắng

Phản ứng với dung dịch FeCl3: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

Phản ứng với dung dịch Pb(CH3COO)2 10 %: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt

dung dịch Pb(CH3COO)2 10 % Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông ➢ Định tính coumarin [1]

Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 10 ml ethanol 90%, đun cách thuỷ sôi trong 3-5 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp thu được dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính

Phản ứng mở đóng vòng lacton: lấy 2 ống nghiệm đánh số thứ tự 1-2 Cho vào 2

ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch lọc Thực hiện phản ứng theo quy trình bên dưới, phản ứng dương tính nếu đáp ứng các điều kiện

+ Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% + Ống 2: Để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội và quan sát: + Ống 1: Xuất hiện tủa đục

18 + Ống 2: Trong suốt

Thêm vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát: + Ống 1: Trong suốt

+ Ống 2: Xuất hiện tủa đục Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ xuất hiện tủa đục

Phản ứng với thuốc thử Diazo: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2 ml

dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi, để nguội Nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử Diazo mới pha Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp kiềm có màu đỏ sim

➢ Định tính glycosid tim [1]

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp và một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Đến khi xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và và thử Dừng lọc khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform hai lần trên bình gạn, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô Gộp các dịch chiết cloroform

Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

Phản ứng Liebermann-Burchard của khung steroid: Cho vào ống nghiệm có

chứa cắn glycosid tim 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o, cho từ từ vào thành ống 1 ml acid sulfuric đặc tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi ở giữa mặt tiếp xúc của hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng tròn màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá

19

Phản ứng Baljet của vòng lacton 5 cạnh: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn

glycosid tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam

Phản ứng Keller-kilian: Hoà tan cắn glycosid tim trong ống nghiệm bằng 0,5 ml

ethanol 90% Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều Nghiên ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

➢ Định tính acid amin, acid hữu cơ, đường khử [1]

Cân 1g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 10 ml nước cất Đun cách thuỷ 10 phút Lọc lấy dịch thực hiện các phản ứng

Định tính acid amin bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin: Cho 1 ml dịch chiết

vào ống nghiệm nhỏ, thêm 5 giọt thuốc thử Nihydrin, đun 3 phút Phản ứng dương tính khi có kết tủa xanh tím

Định tính acid hữu cơ bằng phản ứng với Na2CO3: Cho 1 ml dịch chiết vào ống

nghiệm, thêm vài tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

Định tính đường khử bằng thuốc thử fehling A, B: Cho 1 ml dịch chiết vào ống

nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử fehling A, 3 giọt thuốc thử felhing B, đun cách thuỷ 5 phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch

➢ Định tính chất béo [1]

Cân 2 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 10 ml cloroform đun cách thuỷ trong vòng 2 giờ Lấy dịch chiết lên mảnh giấy lọc, để khô, quan sát Phản ứng dương tính khi thấy vết mờ còn đọng lại trên mảnh giấy lọc

➢ Định tính Sterol [1]

Cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 40 ml cồn, ngâm 24 giờ, gạn lấy dịch chiết Loại tạp bằng chì acetat 30%, lọc bỏ tủa Dịch lọc cho vào bình gạn, lắc kỹ với cloroform 2 lần, mỗi lần 10 ml Gạn lấy dịch cloroform đem thực hiện phản ứng:

Phản ứng Salkowski: Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm, thêm từ từ

1 ml H2SO4 đặc Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp có vòng tròn đỏ thẫm

Phản ứng lieberman: Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm Cô cách

thuỷ đến cắn, hoà tan bằng 1 ml anhydric acetic, lắc đều Đặt nghiên ống 45o rồi thêm từ từ H2SO4 đặc Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp có vòng tím đỏ

20

2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi

2.3.1.2 Phương pháp phân lập

Nghiên cứu này thực hiện phân lập các phân đoạn của lá Ổi bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột rây phân tử Sephadex Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck) Sử dụng sắc ký lớp mỏng để theo dõi các vết chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

Nguyên tắc: Sắc ký cột phấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành

phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn Trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhòi trong côt thuỷ tinh Chất nhồi cột là silica gel pha thường

• Cột thuỷ tinh: Chọn cột thuỷ tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3

lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập

• Pha tĩnh: Lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc và độ phân cực của mẫu cần tách a, Phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck)

Cách tiến hành: Bước 1: Xác định khối lượng cao cần lên cột Bước 2: Khảo sát hệ dung môi lựa chọn lên cột bằng cách chấm TLC pha thường

với các tỉ lệ dung môi khác nhau Lựa chọn một hệ dung môi thích hợp ban đầu để lên cột

Bước 3: Cân một lượng slilica gel pha thường vừa đủ, lựa chọn cột Hoà lượng

silica gel trên vào một lượng dung môi thích hợp đã được lựa chọn để lên cột ban đầu thu được hỗn dịch dung môi-silica gel Cao mẫu đưa lên cột được phối hợp với một lượng silica gel tối thiểu để cho hỗn hợp cao-silica gel tơi xốp Hỗn hợp này được đem vào tủ sấy 50oC, sấy trong 8 h

Bước 4: Lót bông dưới cột đã chọn, cho hỗn dịch dung môi-silica gel lên cột, mở

khoá, thu dung môi Cần bổ sung dung môi liên tục tránh làm khô cột Nạp mẫu sau khi ổn định silica gel trong dung môi trên cột Hỗn hợp cao-silica gel được nghiền nhẹ trước khi bổ sung lên cột

Bước 5: Hứng dịch rửa bằng ống nghiệm, gom dịch rủa giải Dung môi sẽ được

thay đổi tỷ lệ phù hợp trong suốt quá trình chạy sắc ký cột Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

b, Phương pháp TLC

Là phương pháp được sử dụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình rửa giải, kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của chất

21

Nguyên tắc: Dựa trên cơ chế hấp phụ, chất phân tích sau khi chấm trên bản mỏng

sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Quá trình chạy sắc ký phụ thuộc và hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

Bản mỏng: Sắc kí TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thường silica

gel F254 (Merck), được hoạt hoá bằng cách sấy ở 105oC trong ít nhất 30 phút

Hiện màu bản mỏng: Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh đèn tử ngoại ở hai bước

sóng 254 nm và 366 nm Bản mỏng được nhúng dung dịch acid sulfuric 10% và sấy nóng bản mỏng ở 150oC trong khoảng 1-3 phút

2.3.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hoá lý (trạng thái, màu sắc,…) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR) kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo

a, Phổ 1H-NMR và 13C-NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp phổ dựa trên mức năng lượng của các spin hạt nhân trong các nguyên tử định hướng theo một từ trường của một nam châm vĩnh cửu Do tương tác của các spin này với một điện từ trường bổ sung, các hạt nhân chuyển lên một mức năng lượng cao hơn Tín hiệu sinh ra do sự thay đổi vị trí từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức năng lượng thấp hơn được ghi lại và cường độ của tín hiệu tỷ lệ với mức chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái

Các phổ NMR phổ biến nhất trong xác định cấu trúc các chất hữu cơ, là phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) Trong phổ 1H-NMR, các thông số quan trọng là độ lệch chuyển hóa học cường độ tín hiệu và hằng số tương tác (J) Phổ 13C-NMR cho biết thông tin về số lượng nguyên tử carbon có trong chất hữu cơ Khi đo phổ NMR, để có tín hiệu tốt thì mẫu cần được pha loãng trong dung môi ít ảnh hưởng đến tín hiệu của chất Khi đó để đo phổ 1H-NMR thì cần dùng dung môi không chứa hydro như CCl4, CS2 hoặc dùng dung môi đã được deuteri hóa Độ dịch chuyển (δ) được biểu thị theo ppm Tetramethylsilan (TMS) là chất chuẩn nội cho phổ 1H-NMR (δ)

Phản ứng với TT Dragendorff -

3 Saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt +

Có saponin triterpenoid Phản ứng sơ bộ phân biệt

S.triterpenoid và S.steroid

2 ống có cột bọt cao bằng

nhau Phản ứng Rosenthaler +

Phản ứng với dd gelatin 1% +

Có tanin Phản ứng với dd FeCl3 +

Phản ứng với dd Pb(CH3COO)2

5 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không có

coumarin Phản ứng với TT Diazo -

Phản ứng Keller – kilian - 8 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin + Có acid amin

acid hữu cơ