phạm ánh ngọc bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học lá ổi psidium guajava thu hái ở hưng yên

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Ổi (Psidium guajava L.)

1.1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên khoa học: Psidium guajava L [3]

Tên gọi khác: Phan thạch lựu [4]

Tên nước ngoài: Common guava (Anh), goyavier (Pháp) [11]

Theo hệ thống dữ liệu đa dạng sinh học quốc gia Việt Nam [6], cây Ổi có vị trí phân loại như sau:

Bộ Đào kim nương (Myrtales)

Cây Ổi có nguồn gốc từ Trung Mỹ phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhập trồng ăn quả và phát tán rộng [2] Ở Việt Nam, Ổi mọc hoang tại nhiều vùng núi phía bắc và được trồng phổ biến ở hầu hết các địa phương của nước ta, từ đồng bằng đến miền núi Cây ưa sáng, phát triển tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [7] Nhiệt độ phát triển thích hợp từ 15-45 o C , nhiệt độ cho cây ra quả là từ 23-28 o C, lượng mưa 1.000-2.000 mm/năm và không sống được ở độ cao 1.500 m trở lên Ổi ra hoa và quả nhiều năm, thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Vòng đời của cây ổi có thể tồn tại từ 40-60 năm [11]

Cây ổi cao 4 -5 m, cành non có 4 cạnh Lá đơn, mọc đối [3] có cuống ngắn, hình bầu dục, gốc tròn, đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ [7] Lá non phủ lông trắng nhạt, vị chát [3] Lá trưởng thành nhẵn hoặc hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, phiến nguyên, khi soi lên thấy có túi tinh dầu trong; vị chát [10] Vỏ thân nhẵn, khi già bong ra từng mảng [11]

3 Hoa trắng mọc riêng lẻ 2-3 cái ở một kẽ lá [3], cuống có lông mịn, cuống dài, nụ phù ở đầu [10]; 4-5 lá đài, dày, không đều; 4-5 cánh hoa trắng; rất nhiều nhị [3], xếp thành nhiều dãy, chỉ nhị rời; bao phấn có trung đới rộng; bầu hạ, dính vào ống đài, 5 ô [11]

Quả hình cầu, nạc trắng, hạt nhiều, to 2-3 mm, cứng, vàng [10], khi xanh có vị chua và chát, chín có vị ngọt Ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại [3]

Hình 1.1 Cây, lá và hoa ổi Psidium guajava L.

Tổng quan về lá Ổi (Folium Psidii guajavae)

1.2.1 Thành phần hoá học Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về phân lập các thành phần hoá học của lá ổi Psidium guajava L được công bố trên thế giới và Việt Nam Các nhóm chất chủ yếu được tìm thấy trong thành phần hoá học của P guajava bao gồm: các flavonoid, triterpenoid, tanin, saponin, tinh dầu,… và một số polyphenol khác không thuộc các nhóm kể trên

Trong búp và lá ổi có chứa các flavonoid đã được tìm thấy từ rất sớm Các hợp chất phân lập được trong thành phần hoá học của lá P guajava đã công bố gồm: a, Nhóm flavon và flavonol

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Babatola và cộng sự đã phân lập được luteolin (1) là hoạt chất thuộc nhóm flavon của P guajava [15]

Hình 1.2 Công thức hoá học của hợp chất thuộc nhóm flavon

Theo tổng quan tài liệu, những flavonol nổi bật có trong lá Ổi bao gồm: quercetin (2), avicularin (3), quercetin-3-O-β-D-(2’-O-galloyl glucosid)-4’O- vinylpropyonat (4), morin-3-O-α-L-lysopyranosid (5) [3]; guajaverin (6), morin-3-O- β-D- glucopyranosid (7) [11]

Năm 2013, Eidenberger cùng cộng sự đã phân lập được các chất gồm: hyperoside (8), quercetin- 3-O-β-glucoside (9), guaijaverin (10), quercetin-3-O-α-L- arabinopyranoside (11) [24]

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Babatola và cộng sự cũng đã phân lập được thêm 5 hoạt chất thuộc phân nhóm flavonol Các hợp chất này gồm có: rutin (12), kaempferol (13), myricetin (14), isoquercetin (15), reynoutrina (16) [15]

Hình 1.3 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavonol

6 b, Nhóm flavanon, flavan-3-ol và flavan-3-4-diol

Năm 2021, Huang cùng nhóm nghiên cứu lần đầu tiên phân lập được 2 flavanon là đối quang của nhau: Psiflavanon A (17), psiflavanon B (18) [30]

Năm 2016, Díaz-de-cerio cùng cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất thuộc nhóm flavan-3-ol bao gồm: Prodelphinidin dimer isomer (19), gallocatechin (20), catechin (21), procyanidin (22) [22]

Năm 2023, nhóm nghiên cứu Đại học Cần Thơ đã phân lập được Leucomyanidin (23) thuộc nhóm flavan-3-4-diol [9]

Hình 1.4 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavanol

Hình 1.5 Công thức các hợp chất thuộc nhóm flavan-3-ol

Hình 1.6 Công thức hợp chất thuộc nhóm flavan-3-4-diol

Triterenoid là nhóm chất nổi bật trong thành phần hoá học của lá P guajava Đã có rất nhiều triterpenoid đã được tìm thấy và phân lập, có thể được phân loại thành các nhóm sau đây: a, Triterpenoid pentacyclic

Nhóm oleanan nổi bật với acid oleanolic (24) [11] Năm 2012, Shao M cùng cộng sự đã tách được acid eucalyptolic (25) từ cao chiết lá Ổi P guajava [43] Cùng với đó, năm

2021, Li Y và các cộng sự cũng đã phân lập thêm được 8 triterpenoid mới bao gồm: acid maslinic (26), acid arjunolic (27), acid terminolic (28), oleanoaldehyde (29), acid 3-β-O-cis- p-coumaroyl maslinic (30), acid 3-β-O-trans-p-coumaroyl maslinic (31), acid 3-β-O-cis-p- coumaroyl arjunolic (32), acid 3-β-O-trans-p-coumaroyl arjunolic (33) [34]

Hình 1.7 Công thức các hợp chất thuộc nhóm oleanan

Theo tổng quan tài liệu, chất thuộc nhóm ursan phân lập được từ P guajava có acid ursolic (34) [11]

Năm 2004, Begum S và cộng sự đã phân lập được uvaol (35) vào [16] Bổ sung thêm trong danh sách các chất đã tách được từ P guajava, năm 2015, Flores và cộng sự phân lập được thêm acid madecassiac (36) [26]

Bên cạnh 8 hoạt chất được phân lập có khung oleanan nói trên, năm 2021, Li Y và các cộng sự cũng đã phân lập thêm được 12 triterpenoid mới có khung ursan bao gồm: acid corosolic (37), acid asiatic (38), ursaldehyde (39), acid corosolic 3-β-O-cis- p-coumaroyl (40), acid jacoumaric (41), acid asiatic 3-β-O-cis-p-coumaroyl (42), acid asiatic 3-β-O-trans-p-coumaroyl (43), guajavolide (44), ehretiolide (45), ilelatifol D (46), acid guavenoic (47), acid 3-β-O-cis-p-coumaroyl Actinidic (48) [34]

Hình 1.8 Công thức các hợp chất thuộc nhóm ursan

➢ Nhóm Taraxasteran: Có acid guavanoic (49) được Begum và cộng sự phân lập vào năm 2002 [17]

Hình 1.9 Công thức các hợp chất thuộc nhóm taraxasteran

➢ Nhóm lupan: Năm 2010, Ghosh cùng cộng sự phân lập được acid betulinic (50), lupeol (51) [28] Sau đó, Li Y cùng cộng sự đã phân lập thêm được acid alphitolic (52) vào năm 2021[34]

Hình 1.10 Công thức các hợp chất thuộc nhóm lupan

Búp và lá non của ổi chứa khoảng 10% tanin Thành phần tanin của búp và lá ổi gồm cả 3 loại tanin: thuỷ phân được, không thuỷ phân được và loại hỗn hợp

Các tanin thuỷ phân được trong búp và lá ổi gồm: Gallotannin 3,4,5- trimethoxyphenol 1-O-β-D-(2’,6’-di-O-galloyl)-glucopyranosi, ellargitanin (2,3-(S)- hexanhydroxydiphenoyl-6-O-galloyl-D-glucopyranoisd, pedunculagin) và các ellargitanin C-glycosid (castalagin, sasuarictin, casuarinin, acid valolaginic , acid vescalagin carboxylic) Các ellargitanin C-glycosid là thành phần chính trong tanin của búp và lá ổi

Tanin không thuỷ phân được trong búp và lá ổi gồm: Procyanidin-B1, prodelphinidin-B1

Tanin hỗn hợp trong búp và lá ổi gồm: Acutissimin A, B; eugenigrandin A; mongolicain A; guajavin A và B; psidinin A, B và C; psiguavin; guavin A (53), guavin

Hình 1.11 Công thức các hợp chất thuộc nhóm tanin

Tuỳ theo từng loại Ổi, hàm lượng tinh dầu có trong lá nằm trong khoảng 0,2- 0,31% [11] Các nghiên cứu bằng phân tích GC-MS cho thấy một số hợp chất chính có trong tinh dầu P guajava thuộc terpenoid và terpen: a, Terpenoid

Các tinh dầu gồm eucalyptol, caryphyllene oxit, trans-nerolidol (55), hinesol, β- bisabolol, α-bisabolol, c-eudesmol là những tinh dầu được tách bởi De Souza và cộng sự năm 2018 [21] Bên cạnh đó còn có các tinh dầu khác được phát hiện gồm: α-terpinyl acetate [19]; c-cadinol [48] và 7 tinh dầu được xác định bởi Hassan và nhóm cộng sự năm

2020 gồm: linalool, α-terpineol, epiglobulol, spathulenol, globulol, viridiflorol, ledol [29] b, Terpen

Năm 2018, De Souza và cộng sự đã tách được 9 tinh dầu thuộc nhóm terpen bao gồm: Limonen (56), caryophyllen (57), α-humulene, c-muurolen, α-selinen, β-selinen, α- bisabonen, β-bisabonen, α-cedren [21] Năm 2019, Weli và cộng sự đã tác được các tinh dầu bao gồm: Iso-caryphyllene, d-cadinen, aromadendren [48]; Nhóm nghiên cứu của tác giả Hasan cũng đã phân lập được một số tinh dầu từ P guajava bằng phân tích GC-MS gồm: α-pinen, β-myrcen, d-3 caren [29] Ngoài ra còn có một số tinh dầu thuộc nhóm terpen khác đã được phân lập bao gồm α-cadinol, α-copaene, [19]; α-bulnesene [14]

Hình 1.12 Công thức các hợp chất tinh dầu trong lá P guajava

Năm 2005, tác giả Sanches và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước và ethanol:nước từ lá rễ và vỏ thân P Guajava Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng ức chế vi khuẩn gram (+), Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis Dịch chiết ethanol:nước cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với dịch chiết nước Hỗn hợp flavonoid của phân đoạn ethanol:nước thu được qua sắc kí cột silica gel cho thấy cú tỏc dụng trờn S.aureus qua kết quả với MIC là 25àg/ml [41]

12 Trên cao chiết aceton của lá Ổi, nhóm nghiên cứu đại học Cần Thơ (2023) cho kết quả về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết kháng mạnh đối với Listeria innocua và

Enterococcus faecalis Bên cạnh đó, kết quả cho thấy tất cả các đĩa thạch đều xuất hiện vòng vô khuẩn trên tất cả các chủng Escherichia Coli ATCC 25922, Listeria innocua

ATCC 33090, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC

27583, Staphylococcus aureus ATCC 2592, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 14579 [9]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là lá của cây Ổi (Folium Psidii guajavae) thu hái vào ngày 17/3/2024 tại xã Thắng Lợi, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên, đã được giám định tên khoa học là Psidium guajava L (Phụ lục 1)

Tiêu bản hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc-Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu-Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP/18837/24)

Xử lý mẫu: Mẫu lá Ổi được thu hái về phơi trong bóng râm tới khô

Hoá chất dùng trong định tính: Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Diazo, Baljet, Ninhydrin, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 5%, amoniac, cloroform, NaOH 10%,

H2SO4 đ, acid picric 1%, vanilin 1%, HClđ, Na2CO3,…

Các dung môi: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM, aceton, n-hexan,…

Chất chuẩn: Acid ursolic, acid corosolic

Bản sắc kí lớp mỏng Silica gel GF254 (Merck)

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Burker AM500 FT-NMR Spectrometer, máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap, máy cất quay Buchi R-200, cân xác định độ ẩm Precisa XM120, bể siêu âm VEVOR Ultrasonic Cleaner 10L, máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ), bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức), tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức), cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sỹ), đèn tử ngoại VL- 6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp), bộ dụng cụ chiết hồi lưu…

Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), Sephadex LH-20

Các dụng cụ thuỷ tinh: Buret, bình gạn, cốc có mỏ, ống nghiệm, cột sắc ký, bình nón, phễu lọc, ống đong, pipet, mao quản,…

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu thành phần hoá học thông qua:

➢ Định tính các nhóm chất chính của lá Ổi bằng phản ứng hoá học

➢ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất trong lá

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định tính bằng phản ứng hoá học

2.3.1.1 Định tính bằng phản ứng hoá học

Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm ethanol 90% với tỉ lệ dung môi là 1:10 Chiết siêu âm 3-5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu được dịch lọc đem đi thực hiện các phản ứng:

Phản ứng hơi amoniac: Nhỏ 2-3 giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, để khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp Phản ứng dương tính khi màu vàng của dịch chiết được tăng lên

Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện kết tủa vàng Thêm khoảng 1-2 ml nước cất Phản ứng dương tính khi tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm

Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% rồi lắc Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện tủa xanh đen

Phản ứng với thuốc thử Diazo: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hoá bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa màu đỏ

Cân khoảng 2 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun sôi Để nguội, lọc Dịch lọc được kiềm hoá bằng NH3 đặc đến pH= 7-8 Chuyển dịch lọc đã kiềm hoá vào bình gạn, chiết alcaloid base bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp dịch chiết cloroform và cô cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn bằng 4 ml dung dịch H2SO4 1N Lấy 3 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ổng khoảng 1 ml dịch chiết, lần lượt thực hiện các phản ứng:

Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu trắng đến vàng

Phản ứng với dung dịch acid picric 1%: Thêm 3 giọt dung dịch acid picric 1% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa vàng

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ

Cho khoảng 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm khoảng 20 ml ethanol 80%, đun cách thuỷ trong vòng 5 phút và lọc lấy dịch chiết

Quan sát hiện tượng tạo bọt: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước Lắc mạnh theo chiều đứng của ống nghiệm trong vòng 1 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Phản ứng dương tính khi cột bọt còn bền vững sau 15 phút

Phản ứng sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid:

Lấy 2 ống nghiệm, bố trí thí nghiệm như sau: Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2

Dung dịch NaOH 0,1 N (pH) 5 ml 0

Dung dịch HCl 0,1 N (pH=1) 0 5 ml

Dịch chiết dược liệu 5 giọt 5 giọt

Saponin steroid cột bọt cao cột bọt thấp Saponin triterpenoid Cột bọt 2 ống bằng nhau Phản ứng Rosenthaler

Cho 3 ml dịch chiết cồn vào trong ống nghiệm, bốc hơi cách thuỷ đến gần khô, thêm vanilin 1%/HCl, đun nóng Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu tím

Cân khoảng 1 g bộ dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất Đun sôi trong 2-3 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc nếp gấp thu lấy dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính

Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông trắng

Phản ứng với dung dịch FeCl 3 : Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch FeCl3

5% Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

Phản ứng với dung dịch Pb(CH 3 COO) 2 10 %: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch Pb(CH3COO)2 10 % Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa bông

Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 10 ml ethanol 90%, đun cách thuỷ sôi trong 3-5 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp thu được dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính

Phản ứng mở đóng vòng lacton: lấy 2 ống nghiệm đánh số thứ tự 1-2 Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch lọc Thực hiện phản ứng theo quy trình bên dưới, phản ứng dương tính nếu đáp ứng các điều kiện

+ Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2: Để nguyên Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội và quan sát:

+ Ống 1: Xuất hiện tủa đục

Thêm vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát:

+ Ống 2: Xuất hiện tủa đục

Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ xuất hiện tủa đục

Phản ứng với thuốc thử Diazo: Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi, để nguội Nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử Diazo mới pha Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam

Xác định sự có mặt của nhóm chất anthranoid trong dược liệu bằng phản ứng Borntrọger:

Cân khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 5-10 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc, thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp kiềm có màu đỏ sim

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp và một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Đến khi xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và và thử Dừng lọc khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform hai lần trên bình gạn, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô Gộp các dịch chiết cloroform

Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả định tính bằng phản ứng hoá học

Qua thực nghiệm bằng phản ứng hoá học, xác định sơ bộ thành phần hoá học có trong lá ổi bao gồm các nhóm chất: Flavonoid, saponin triterpenoid, tanin, acid amin

Bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học bằng phản ứng hoá học

STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

Phản ứng với hơi amoniac +

Có flavonoid Phản ứng với NaOH 10% -

Phản ứng với dd FeCl3 5% +

Phản ứng với TT Mayer -

Không có alcaloid Phản ứng với dd Acid picric 1% -

Phản ứng với TT Dragendorff -

Quan sát hiện tượng tạo bọt +

Có saponin triterpenoid Phản ứng sơ bộ phân biệt

2 ống có cột bọt cao bằng nhau Phản ứng Rosenthaler +

Phản ứng với dd gelatin 1% +

Có tanin Phản ứng với dd FeCl3 +

Phản ứng với dd Pb(CH3COO)2

5 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không có coumarin Phản ứng với TT Diazo -

6 Anthranoid Phản ứng Borntrọger - Khụng cú anthranoid

8 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin + Có acid amin

9 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không có acid hữu cơ

10 Chất béo Để lại vết mờ trên giấy lọc - Không có chất béo

11 Steron Phản ứng Salkowski - Không có steron

12 Đường khử Phản ứng với Fehling A, B + Có đường khử

Phản ứng âm tính : (-) Phản ứng dương tính: (+)

Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn

Lá Ổi (3,0 kg) được chiết ngâm tại nhiệt độ phòng trong ethanol 70% (3 lần×30 lít, mỗi lần 3 ngày) Dịch chiết được lọc qua vải lọc và gộp lại, cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm thu được cao ethanol 70% (589,44 g)

Lấy 579,44 g cao P guajava nói trên hoà tan trong nước ấm, đem đi chiết lỏng lỏng lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan và ethyl acetat bằng 2 bình gạn 2 lít Tại phân đoạn n-hexan và ethyl acetat thu lấy phần bên trên mặt phân lớp, phân đoạn dicloromethan thu lấy phần dịch chiết bên dưới mặt phân lớp Gộp các dịch chiết tương ứng, thu được dịch chiết các phân đoạn n-hexan, dicloromethan và ethyl acetat Tiến hành thu hồi dung môi theo từng phân đoạn bằng máy cô quay dưới áp suất giảm thu được cắn n-hexan (34,90 g), dicloromethan (75,86 g) và ethyl acetat

Cao phân đoạn dicloromethan được tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thuận Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm) Hệ dung môi dicloromethan:aceton (tỷ lệ 100:0 đến 0:100 tt/tt) Khảo sát dịch rửa giải bằng phương pháp SKLM, gom dịch ở các ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau, cất thu hồi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm thu được 21 phân đoạn kí hiệu D01-D021

3.2.2.1 Sắc ký cột phân đoạn D013

Sau khi khảo sát bằng TLC, nhận thấy phân đoạn D013 tách tốt, khối lượng phù hợp để tiếp tục phân lập Lựa chọn tiến hành sắc ký cột pha thuận với chất nhồi cột là silica gel Kieselgel 60, kích thước 0,040-0,063 mm (Merck)

Phân lập phân đoạn D013 với hệ dung môi dicloromethan:acetone theo tỷ lệ giảm dần (10:1-1:1, tt/tt), thu được 5 phân đoạn D13.1 – D13.5 Thông qua sắc ký đồ nhận thấy phân đoạn D13.2 có một vết chính, khả năng xuất hiện hợp chất sạch Tiến hành rửa lần lượt phân đoạn D13.2 với n-hexan, EtOAc, MeOH thu được hợp chất 1 (15 mg) ký hiệu là OD1

3.2.2.2 Sắc ký cột phân đoạn D018

Sau khi khảo sát bằng TLC, nhận thấy phân đoạn D018 tách tốt, khối lượng phù hợp để tiếp tục phân lập Tiến hành sắc ký cột pha thuận với chất nhồi cột là silica gel Kieselgel 60 kích thước 0,040-0,063 mm (Merck)

Phân lập phân đoạn D018 với hệ dung môi n-hexan:acetone theo tỷ lệ giảm dần (5:1-1:1, tt/tt) Sau đó đổi hệ dung môi thành dicloromethan:acetone theo tỷ lệ giảm dần (10:1-1:1, tt/tt) thu được 5 phân đoạn D18.1 – D18.5

Phân đoạn D18.3 tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20, sau đó được rửa lần lượt với n-hexan, EtOAc thu được hợp chất 2 (10 mg) kí hiệu là OD2

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình phân lập chất từ cao phân đoạn diclomethan

Hình 3.3 Sắc kí đồ của hợp chất OD1 và OD2 so với cao DCM

3.2.3 Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất

Hợp chất 1 (ký hiệu: OD1) thu được dưới dạng tinh thể, màu trắng ESI-MS cho kết quả: m/z 457,4 [M+H] + , m/z 455,4 [M-H] - , tương ứng với công thức phân tử C30H48O3

Trên phổ 1 H NMR (Bảng 3.2) cho thấy chất phân lập mang đặc trưng của một triterpen khung ursan với sự xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm methyl tại [δ H 0,79 (3H, s, H-25); 0,99 (3H, s, H-29); 0,84 (3H, s, H-30); 0,95 (3H, s, H-24); 1,07 (3H, s, H-26); 1,20 (3H, s, H-23); 1,14 (3H, s, H-27)], đồng thời xuất hiện tín hiệu của một nối đôi tại [δ H 5,23 (t, J = 6,6 Hz, H-12)] Kết hợp với phổ 13 C NMR, thu được 30 tín hiệu với 2 tín hiệu carbon nối đôi C-12/C-13 đặc trưng tại δ C 126,23 (C-12) và δ C 139,27 (C-13), sự có mặt của một nhóm carbonyl tại δ C 178,52 (C-28) và một oxymethyl carbon tại δ C

78,59 (C-3) Từ dữ liệu phổ thu được dẫn đến kết luận rằng hợp chất là một triterpen thuộc khung ursan-12-en

Kết hợp thông tin các phổ và so sánh với dữ liệu công bố [8] có thể kết luận hợp chất này là acid ursolic (Hình 3.3)

Hình 3.4 Công thức cấu tạo của hợp chất 1 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất OD1 và hợp chất tham khảo [8]

Vị trí δ C * (ppm) δ H * (J, Hz) δ C a,b (ppm) δ H a,c (J, Hz)

30 21,13 0,89 (s) 21,44 0,84 (s) a: Acetone, b : 125 MHz, c : 600 MHz, δ C *của hợp chất UA đo trong CD3OD [8]

Hợp chất 2 (ký hiệu: OD2) thu được dưới dạng tinh thể, màu trắng ESI-MS cho kết quả: m/z 473,4 [M+H] + , m/z 471,3 [M-H] - , tương ứng với công thức phân tử C30H48O4

Trên phổ 1 H NMR (Bảng 3.2) cho thấy chất phân lập mang đặc trưng của một triterpen khung ursan với sự xuất hiện tín hiệu của các nhóm methyl tại [δ H 0,9 (3H, s, H-29); 0,7 (3H, s, H-30); 0,7 (3H, s, H-24); 0,8 (3H, s, H-26); 0,9 (3H, s, H-23); 1,0 (3H, s, H-27)], đồng thời xuất hiện tín hiệu của một nối đôi tại [δ H 5,1 (t, J = 5,1 Hz, H- 12)] Phân tích phổ phổ 13 C-NMR và HSQC của hợp chất OD2 cho thấy tín hiệu của 30

C gồm 2 carbon không liên kết với hydro, 2 tín hiệu carbon nối đôi C-12/C-13 đặc trưng tại δ C 124,5 (C-12) và δ C 124,5 (C-13), sự có mặt của một nhóm carbonyl tại δ C 178,2 (C-28) và hai oxymethyl carbon tại δ C 82,2 (C-3), δ C 67,1 (C-2) Từ dữ liệu phổ thu được dẫn đến kết luận rằng hợp chất là một triterpen thuộc khung ursane-12-en

Dự vào việc phân tích phổ và so sánh với dữ liệu công bố [49] có thể kết luận hợp chất này là acid corosolic (Hình 3.4)

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của hợp chất 2 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất OD2 và hợp chất tham khảo [49]

30 16,9 16,9 0,75 (s) a: DMSO, b : 150 MHz, c : 600 MHz, δ C *của hợp chất UA đo trong DMSO [49].

Bàn luận

3.3.1 Về chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ lá cây Ổi (Psidium guajava L.) a, Về phương pháp chiết xuất cao toàn phần

Lá Ổi được chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với EtOH 70% Đây được đánh giá là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

Việc lựa chọn dung môi trong chiết xuất là rất quan trọng Tính chọn lọc, độ hoà tan, độ an toàn, chi phí nên được xem xét và cân nhắc khi lựa chọn dung môi Dựa trên quy luật dung môi có giá trị độ phân cực gần với độ phân cực của chất tan có khả năng tách chiết tốt hơn và ngược lại EtOH được cho là dung môi phổ biến nhất trong chiết xuất để nghiên cứu thành phần hoá học trong thực vật [51] Ngoài ra, EtOH còn làm tăng tính thấm của thành tế bào, tạo điều kiện cho việc chiết xuất hiệu quả một lượng lớn các thành phần phân cực từ trung bình đến phân cực thấp [42]

Bên cạnh đó, cồn có các ưu điểm khác như: tự bảo quản ở nồng độ trên 20% và cần một lượng nhiệt khá nhỏ để cô đặc dịch chiết [12], là dung môi dễ kiếm, dễ sử dụng, không độc hại và giá thành rẻ b, Về phương pháp chiết cao phân đoạn

Dung môi được sử dụng ở phương pháp chiết xuất này được phân loại theo độ phân cực tăng dần của chúng Từ n-hexan ít phân cực nhất đến nước phân cực nhất [12]

3.3.2 Về phương pháp phân lập

Sau khi thăm dò trên sắc ký lớp mỏng (TLC) cho thấy phân đoạn DCM có khá nhiều vết và tách tốt Tài liệu tham khảo cho thấy các hợp chất chính có mặt ở phân đoạn này thường là triterpenoid Tại khoá luận này, sử dụng kỹ thuật sắc ký cột để phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM của dịch chiết ethanol từ lá của P guajava trong giai đoạn tách ban đầu, do tính đơn giản, công suất cao và chi phí thấp của chất hấp phụ là silica gel (chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu hóa học thực vật)

3.3.3 Về hợp chất phân lập được từ lá Ổi (Psidium guajava L.)

30 Sau khi sử dụng sắc ký cột để phân lập các hợp chất từ phân đoạn dichlomethan Khoá luận đã sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC) và kết hợp so sánh với dữ liệu đã công bố trước đây để xác định cấu trúc hóa học Kết quả đã phân lập được 2 hợp chất là acid ursolic và acid corosolic đều thuộc nhóm triterpenoid a, Với hợp chất Acid ursolic

Acid ursolic (UA) là một hợp chất triterpene tự nhiên chính đã được phân lập từ lá P guajava lần đầu vào năm 1941 bởi Yoshikawa và Ishibashi [50] Đây là một hoạt chất xuất hiện trong nhiều loài dược liệu và trái cây như: Argania spinosa L., Bouvardia ternifolia, Calendula officinalis, coffea arabica L., Cornelian cherry, Eucalyptus grandis, Malus domestica, Melissa officinalis, Nerium oleander L., Ocimum tenuiflorum,… và trong các chi như Panax, Punica,… [35]

Hoạt chất UA được biết đến là hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật với rất nhiều tác dụng dược lý bao gồm: chống viêm, bảo vệ gan, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thần kinh, kháng khuẩn, hạ lipid máu, kháng nấm, virus và đặc biệt là khả năng chống ĐTĐ [32] Năm 2008, nghiên cứu trên lá Bằng lăng nước Lagerstroemia speciosa của Barun Kanti Sahal cùng các cộng sự cho thấy hoạt động hạ đường huyết đáng kể của UA trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế quá trình tân tạo glucose và kích thích tạo glycogen [40] Nghiên cứu do SM Jang và cộng sự năm 2009 cũng cho thấy UA có tiềm năng trong việc phòng chống bệnh tiểu đường và đặc tính điều hoà miễn dịch bằng cách tăng nồng độ insulin đồng thời bảo tồn tế bào β-tuyến tuỵ và điều chỉnh lượng glucose trong máu [31] b, Với hợp chất Acid corosolic

Acid corosolic (CA) cũng là một hợp chất triterpene tự nhiên có cùng khung Ursan với tương tự với UA và là một trong số các chất chính của thành phần hoá học trong lá Ổi Bên cạnh Ổi có chứa CA dồi dảo, các loài thực vật khác như Eriobotrta japonica [49], Crataegus pinnatifida [13], Lagerstromia [27] cũng đã được xác định có chứa CA

CA lần đầu tiên được phân lập từ dịch chiết ethanol của lá P guajava bởi Yoshikawa và Ishibashi (1967) [38] Nghiên cứu năm 2016 của Diaz-de-Cerio và cộng sự chỉ ra rằng, hàm lượng CA trong P guajava tập trung cao nhất ở lá của P guajava [22]

CA được nghiên cứu rộng rãi trong tác dụng đối với ĐTĐ Năm 2006, M Fukushima cùng cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của CA trong chiết xuất của loài Bằng lăng nước (Lagerstromia) qua thiết kế mù đôi và chéo Đây là thử nghiệm in vivo lần đầu tiên chỉ ra rằng CA có tác dụng làm giảm nồng độ glucose huyết tương trên người [27] Nghiên cứu của Xu và cộng sự năm 2019 trên bệnh đái tháo đường type II cho thấy, CA kích thích đáng kể việc tiêu thụ glucose và cải thiện sự tích luỹ glycogen bằng

31 cách ức chế biểu hiện PECPCK mRNA CA đã làm giảm glycogen và tăng mức tiêu thụ glucose bằng cách điều chỉnh một số enzym chính trong chuyển hoá carbon bao gồm GLUT1, GLUT2, GLUT3, LDHA, LDHB, GP, G6Pase, GYS1 và PFKFB3 Ngoài ra, tín hiệu của thụ thể insulin cũng được điều hoà hơn sau khi sử dụng CA Trên mô hình gây bệnh tiểu đường trên chuột do STZ gây ra, so với nhóm kiểm soát bệnh tiểu đường,

CA đã điều chỉnh đáng kể nồng độ lipid huyết thanh, đường huyết, ICAM-1, malonaldehyd và chỉ số kháng insulin [49] Ngoài ra, CA còn được biết đến bởi các tác dụng dược lý khác nổi bật như khả năng chống ung thư [49]

Ngày nay, do chế độ ăn uống sinh hoạt, số lượng bệnh nhân mắc ĐTĐ ngày càng tăng cao Bên cạnh các thuốc có nguồn gốc từ hoá chất tổng hợp, các thuốc cũng như thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu cũng đang rất được ưa chuộng Một số chất quan trọng có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị ĐTĐ có thể kể đến như D-pinitol, B-sitosterol, UA, CA Đặc biệt, hai chất UA và CA đã được đánh giá là những hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong điều trị ĐTĐ Theo tổng quan tài liệu cho thấy, cây Ổi là một trong số những loài thực vật có khả năng cung cấp UA và CA rất hiệu quả với chi phí tương đối thấp Năm 2016, Rajkumar Diwakar và cộng sự đã phân lập được UA, CA và tiến hành định lượng hàm lượng UA,

CA có trong lá, hạt, quả, vỏ ngoài P guajava bằng HPTLC Kết quả cho thấy rằng một lượng đáng kể UA và CA có trong quả Ổi (1,149/0,171 mg/g), lá (0,528/5,050 mg/g) [23] Với kết quả thu được, nghiên cứu này đã cho thấy rằng ngoài việc bổ sung quả Ổi trong thực đơn hằng ngày của người mắc ĐTĐ, lá Ổi còn có tiềm năng trở thành một sự thay thế chi phí thấp cho các loại thuốc điều trị ĐTĐ đắt tiền hiện nay Ổi (Psidium guajava L.) là loài cây được trồng khá phổ biến ở nước ta [3] Đây là loại cây được trồng nhằm mục đích thu hái quả Với mục tiêu hướng tới khai thác và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên dược liệu, lá P guajava có thể được cho là nguồn nguyên liệu tiết kiệm và dồi dào nhưng mang lại đóng góp đáng kể vào chi phí điều trị, quản lí bệnh nhân ĐTĐ hiệu quả