CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Gouania
1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gouania
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Gouania có vị trí phân loại như sau: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidase) Liên bộ Táo ta (Rhamnanae)
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Gouania
1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Gouania
Theo Flora of China, chi Gouania thuộc cây bụi leo, thường có tua, không có nhánh Lá mọc so le, có lá kèm rất dễ rụng, cuống lá có khía rãnh, mép khía răng cưa Cây có nhiều hoa, mọc ở ngọn hoặc nách lá, chùm xim hoặc chùy, thường có tua ở phần dưới của trục hoặc gốc Đài hoa ngắn, gắn với bầu nhụy: lá đài 5, hình trứng hoặc tam giác, lõm ở phía trong, nứt với các khe dọc Cánh hoa 5, hình thìa Nhị 5, xếp ở lưng, được bao bọc bởi các cánh hoa Đĩa dày, hình ngũ giác hoặc 5 thùy, nhẵn hoặc có lông.Bầu hạ, nằm sâu trong đĩa, có 3 ô, mỗi ô có 1 noãn; phóng noãn theo kiểu nứt một nửa hoặc nứt sâu [40]
Quả nang hình cầu, khuyết ở hai đầu, có 3 cánh, có 3 ngăn tròn tách ra từ nách Khi trưởng thành, các ngăn không nứt hoặc nứt dọc theo gân trong có rãnh nứt hẹp Hạt 3, màu nâu đỏ, bóng, hình trứng ngược Nội nhũ mỏng [40]
Trên thế giới: Theo Medan & Schirarend (2004), chi Gouania có khoảng 50 loài phân bố ở khu cận nhiệt đới Weberbauer ước lượng chi Gouania có khoảng 66 loài ở các khu vực nhiệt đới trên thế giới [33] Theo Mabberley (2008), chi Gouania có 50-
70 loài [38] Kết quả tổng hợp các tài liệu đã công bố về thực vật chi Gouania có khoảng 67 loài trên thế giới Ở Việt Nam: Chi Gouania có 2 loài: Gouania leptostachya DC (tên thường gọi: Dây đòn gánh) và Gouania javanica Miq (tên thường gọi: Dây đòn kẻ cắp) [5], [8] Loài G javanica phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Trị, Kon Tum, Đắk Nông
3 (Đắk Mil, Đức Minh), An Giang (Châu Đốc) và loài G leptostachya phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Hòa Bình, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu [8]
1.1.3 Thành phần hóa học chi Gouania
Hiện nay, trên thế giới và trong nước chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Gouania Các kết quả đã công bố chủ yếu tập trung vào phần trên mặt đất của các loài: G leptostachya, G javanica và G longipetala,… Trong đó có loài G leptostachya đã được nghiên cứu ở Việt Nam [4]
Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của các loài này bao gồm các hợp chất thiên nhiên khác nhau như triterpenoid, flavonoid, saponin, glycosid, alcaloid, benzopyran Trong đó, hai nhóm hợp chất chính của các loài là flavonoid và saponin
Flavonoid là một nhóm lớn của các hợp chất polyphenol có cấu trúc cơ bản là diphenylpropan, thường gặp trong rất nhiều loài thực vật Đây cũng là một trong những nhóm chất chính của các loài thuộc chi Gouania nói riêng và họ Rhamnaceae nói chung Từ các loài thuộc chi Gouania, đã có 19 flavonoid được phân lập và xác định cấu trúc, trong đó chia thành các khung chính là: flavonol, flavan, biflavonoid và triflavonoid a) Khung flavonol
Khung flavonol là một trong những cấu trúc thường gặp nhất của flavonoid Một số flavonol được phân lập từ chi Gouania, là các dẫn xuất của kaempferol và quercetin được trình bày trong Bảng 1.1:
Bảng 1.1 Một số flavonol được phân lập từ chi Gouania
CTCT Tên flavonol Tên loài TLTK
Hình 1.1 CTCT một số flavonol được phân lập từ chi Gouania b) Khung flavan
Năm 2011, Chong Yao và cộng sự phân lập ra 2 flavan là epi-gallocatechin (15) và gallocatechin (16) từ thân cây Gouania leptostachya DC [39]
Năm 2023, Nguyễn Thị Hằng cũng phân lập được catechin (17) từ phần trên mặt đất của loài này [4]
Hình 1.2 CTCT một số flavan được phân lập từ chi Gouania c) Khung biflavonoid và triflavonoid
Chong Yao và cộng sự (2011) phân lập được triflavonoid prodelphinidin C (18) và biflavonoid prodelphinidin B3 (19) từ thân cây G leptostachya [39]
Hình 1.3 CTCT biflavonoid và triflavonoid được phân lập từ chi Gouania
Triterpenoid là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư,… Đây cũng là một trong những nhóm chất chủ yếu của chi Gouania, tạo tiền đề cho nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi này Các triterpenoid đã công bố được trình bày trong
Bảng 1.2 Một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania
CTCT Tên triterpenoid Tên loài TLTK
Hình 1.4 CTCT một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania
Saponin là các triterpen glycosid, có nhiều trong tự nhiên, có ở cả thực vật và một số động vật Saponin có hai nhóm chất chính là triterpenoid và steroid Các bài báo đã công bố chủ yếu phân lập ra các saponin triterpenoid từ chi Gouania Cụ thể được trình bày trong Bảng 1.2 sau:
Bảng 1.3 Một số saponin được phân lập từ chi Gouania
CTCT Tên saponin Tên loài TLTK
Hình 1.5 CTCT một số saponin được phân lập từ chi Gouania
1.1.3.4 Các nhóm hợp chất khác
Năm 2011, Chong Yao và cộng sự phân lập hai dẫn xuất benzopyran là 1-[(rel-
2S,3R)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-2-yl]ethanol và 1-[(rel-2S,3S)-
3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-2-yl]ethanol từ thân cây Gouania leptoschya DC [39]
Năm 2023, Nguyễn Thị Hằng đã phân lập từ phần trên mặt đất của cây Gouania leptostachya DC được các chất: daucosterol, n-butyl-β-D-fructopyranosid [4]
Năm 2014, E Ekuadzia và cộng sự báo cáo glycerol monotricosanoate, palmarumycin BG1 và De-O-methyllasiodiplodin từ Gouania longipetala Hemsl
1.1.4 Tác dụng sinh học chi Gouania
Cho đến nay, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Gouania rất ít, một số công trình thử nghiệm hoạt tính sinh học ở các loài G leptostachya, G longipetala và G javanica,… Một số hợp chất phân lập từ các loài này, chủ yếu là flavonoid, triterpenoid, khung pyran có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa,… a) Chống viêm
Năm 2023, trong nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính cây G leptostachya,
Nguyễn Thị Hằng sử dụng mô hình in vitro đánh giá ảnh hưởng của cao chiết và các chất tinh khiết lên sự sản sinh PGE2, NO và các cytokin tiền viêm IL-1β, IL-6 và mức độ biểu hiện của COX-2 trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 được kích thích viêm bởi Lipopolysaccharid Kết quả cho thấy các cao chiết phân đoạn nồng độ
20 – 25 g/mL có tác dụng ức chế sản sinh PGE2, IL-1β, IL-6, NO Các hợp chất tinh khiết cũng cho thấy tỏc dụng rừ rệt Acid alphitolic nồng độ 3, 10 và 30 àM cú tỏc
12 dụng ức chế sản sinh PGE2, giảm biểu hiện mARN và protein COX-2 phụ thuộc nồng độ, tỉ lệ ức chế ở nồng độ cao nhất lần lượt là là 64,5 3,3 %; 58,3 4,9 % và 47,5 4,4 % (p < 0,001); ở nồng đồ 10 àM làm giảm hoạt động COX-2 luciferase 55,4 3,5 % (p < 0,001) và giảm sản sinh IL-1β, IL-6 45,1 3,4 % và 39,8 3,6 % (p < 0,001); ức chế sản sinh NO phụ thuộc nồng độ trong khoảng độ 2, 10, 50 àM
Acid epigouanic nồng độ 10 àM làm giảm sản sinh PGE2, IL-1β, IL-6 lần lượt là 52,8 7,3 %, 61,5 3,2 % và 57,1 3,3 % (p < 0,001); làm giảm biểu hiện mARN, ức chế hoạt động COX-2 luciferase lần lượt là 54,4 2,1 % và 42,1 5,7 % (p < 0,001) Gouaniosid A nồng độ 10 àM ức chế sản sinh PGE2, làm giảm biểu hiện mARN và hoạt động COX-2 luciferase lần lượt là 52,3 6,0 %, 48,7 5,7 %, và 41,0 4,6 % (p < 0,001), ức chế sản sinh NO (nồng độ 5 và 25 àM) Acid ceanothenic và lupeol chế sản sinh IL-1β, IL-6 (nồng độ 10 àM) Ngoài ra, lupeol cũn ức chế ức chế sản sinh NO (nồng độ 25 àM) Gouaniasid VII ức chế sản sinh PGE2, IL-1β, IL-6 (nồng độ 10 àM) và NO (nồng độ 5, 25 àM) Gouaniasid VIII ức chế sản sinh NO ở nồng độ 5 và 25 àM Gouaniasid IX ức chế sản sinh NO (nồng độ
5, 25 àM) và IL-6 (nồng độ 10 àM) [4]
Khái quát về loài Dây đòn kẻ cắp (Gouania Javanica Miq.)
1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Gouania javanica Miq
Cây bụi leo Cành, cuống lá, trục, cuống và đài hoa có nhiều lông màu nâu nhạt
Lá mọc xen kẽ; cuống lá 0,8 – 1,7 cm, có lông dày hoặc thưa thớt; phiến lá hình trứng hoặc hình trứng rộng, 4 – 11 × 2 – 6 cm, dạng giấy, có lông tơ màu nâu ở phía dưới; có lông mọc dày đặc trên các gân chính, gân bên 5 – 7 cặp, phía dưới nổi rõ, phía gần trục phẳng, gân đáy có 3 – 6 gân thứ cấp bên ngoài, gốc hình tim hoặc tròn, mép nguyên hoặc có răng cưa tù, đỉnh nhọn hoặc nhọn ngắn Hoa nhiều, 5 chùm, đơn độc hoặc mọc thành xim có cuống ngắn, chùm xim ở nách lá hoặc ở ngọn, hoặc chùm xim hoa dài tới 30 cm Các lá đài hình tam giác, hình thoi ở gân giữa Cánh hoa hình trứng ngược Đĩa hình ngũ giác, bao quanh bầu nhụy, mỗi góc thuôn dài thành một phần phụ hình lưỡi liềm Kiểu dáng dài, 3 khía hoặc chẻ đôi [40]
Quả nang khi trưởng thành màu vàng, đường kính 8 – 10 mm có 3 cánh, hai đầu lõm, đỉnh có đài hoa dai dẳng, có 3 múi tròn, có cánh, nứt dọc theo nách Hạt 3, màu nâu đỏ, bóng, hình trứng, khoảng 3 × 2,5 mm, nổi lên ở mặt sau [40]
Thu hoạch: tháng 7 – 9 hoặc tháng 11 – 3 hàng năm
Gouania obtusifolia Vent Ex Brongn
Tên Việt Nam: Dây đòn kẻ cắp, Dây đòn gánh, Dây Gồ-an Java [8]
Loài Gouania javanica Miq thường phân bố ở rừng thưa, leo trên cây, ven sông, nơi có độ cao thấp đến trung bình [7]
Các quốc gia tập trung: Trung Quốc, Campuchia, Lào, Philippines, Thái Lan, Việt Nam [40] Ở nước ta, loài G javanica Miq phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Trị, Kon
Tum, Đắk Nông (Đắk Mil, Đức Minh), An Giang (Châu Đốc) [8]
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu thân của loài Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.) được thu hái tại xã Mã Đà, huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai
Mẫu được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và ThS Đặng Minh Tú được lưu tại Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu [Phụ lục 1]
Mẫu nghiên cứu có hoa sau khi thu hái được làm tiêu bản khô với mã số tiêu bản 06.2023.HTV
Mẫu nghiên cứu được phơi khô, xay thô, bảo quản trong túi nilon ở nơi khô ráo để nghiên cứu về định tính thành phần hóa học và phân lập chất trong mẫu
2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu
• Hóa chất dùng cho định tính thành phần hóa học đạt tiêu chuẩn phân tích gồm:
- Các dung môi: ethanol, n-hexan, ether dầu hỏa, ethyl acetat, cloroform, n-butanol, aceton
- Các thuốc thử dùng cho phản ứng định tính: Thuốc thử Bouchardat, thuốc thử Dragendroff, thuốc thử Mayer, dung dịch acid picric 1%, dung dịch FeCl3 5%, NaOH, bột Mg, dung dịch HCl, dung dịch H2SO4…
• Hóa chất dùng cho phân lập các chất đạt tiêu chuẩn phân tích gồm: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, ethanol, aceton, methanol,…
2.1.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ
• Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); Bruker AM500 FT – NRM Spectrometer (Billerica, Masachusetts, Hoa Kỳ)
• Máy siêu âm Power sonic 450 (Hàn Quốc)
• Tủ sấy UFB 500 (Memmert, Đức), FD115 (Binder, Đức)
• Máy cất quay Rotary evaporator WEV-1020 Daihan Scientific (Hàn Quốc)
• Cân kỹ thuật, cân phân tích
• Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm
• Silica gel pha thường (0,040 – 0,063 mm, Merck)
• Bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60G G254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25mm)
• Các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm như: cột sắc ký, bình gạn, bình nón, bộ sinh hàn hồi lưu, bình cầu, bếp cách thủy, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…
2.1.2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• Thời gian nghiên cứu: Tháng 8/2023 đến tháng 5/2024
• Địa điểm nghiên cứu: Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu
Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu
• Định tính các nhóm chất chính trong thân loài Gouania javanica bằng các phản ứng hóa học đặc trưng
• Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn DCM của loài
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp định tính bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học thường quy theo các tài liệu [3], [6]
2.3.1.1 Định tính flavonoid a) Chuẩn bị
Chiết siêu âm 2 g bột dược liệu G javanica ethanol 80% với tỷ lệ dung môi 1:10 Lọc qua giấy lọc và thực hiện các phản ứng định tính b) Tiến hành
- Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô, quan sát thấy có vết màu vàng, hơ giấy lọc trên NH3
- Phản ứng dương tính khi màu vàng đậm hơn
- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết và vài giọt NaOH 10%
- Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt, có tủa nâu
- Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt FeCl3 5%
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh đen
- Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng NaOH 10% thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam, có tủa màu đỏ cam
2.3.1.2 Đính tính alcaloid a) Chuẩn bị
Lấy khoảng 2 g dược liệu G javanica cho vào bình dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, để nguội Lọc, kiềm hóa NH3 đặc, sau đó chiết lỏng lỏng trên bình gạn với cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gạn lấy lớp dung môi hữu cơ, cách thủy tới khô Hòa tan cắn alcaloid base bằng 4 ml dung dịch H2SO4 1N b) Tiến hành
Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết
• Phản ứng thuốc thử Mayer:
- Cho 3 giọt thuốc thử Mayer
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng
• Phản ứng thuốc thử Dragendorff:
- Cho 3 giọt thuốc thử Dragendorff
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam
• Phản ứng thuốc thử acid picric 1%:
- Cho 3 giọt dung dịch acid picric 1%
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu vàng
• Chuẩn bị: cho vào ống nghiệm to khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên quan sát hiện tượng tạo bọt
• Phản ứng dương tính khi thấy cột bọt còn bễn vững sau 15 phút
2.3.1.4 Định tính tanin a) Chuẩn bị:
Lấy 1 g bột dược liệu G javanica + 10 ml nước cất, đun sôi 2 phút Để nguội, lọc b) Tiến hành:
• Phản ứng với dd gelatin (1%):
- Cho 2 ml dịch lọc + 5 giọt gelatin 1%
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông màu trắng
- Cho 2 ml dịch lọc + 2 giọt dung dịch FeCl3 5%
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện nhiều tủa xanh đen
• Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%:
- Cho 2 ml dịch lọc + 2 giọt dung dịch Pb(CH3COO)2 10%
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông màu trắng, mịn
2.3.1.5 Định tính glycosid tim a) Chuẩn bị
Lấy 10 g bột dược liệu G javanica cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml ethanol 25%, ngâm trong 24h Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Thử lại bằng cách nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat, không thấy xuất hiện tủa nữa Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng hỗn hợp cloroform:ethanol (4:1) 2 lần, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform, chia đều vào 4 ống nghiệm, bốc hơi cách thủy, thu cắn b) Tiến hành
- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 1 ml anhydric acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc
- Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá
- Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm 1 ml acid picric 1% và 9 ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều
- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam
- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ từng giọt FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều, nghiêng ống 45 o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc
- Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ thấy lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá
2.3.1.6 Định tính coumarin a) Chuẩn bị
Cân 2,0 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml ethanol 90%, khuấy đều Đun cách thủy sôi 3 phút, lọc nóng Bay dung môi, hòa tan cắn
19 bằng nước nóng, lọc vào bình gạn, để nguội Chiết lỏng lỏng trong bình gạn với cloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml Gạn lấy dịch cloroform, bốc hơi hết dung môi, hòa tan cắn bằng 5 ml ethanol để làm phản ứng định tính b) Tiến hành
• Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
- Ống nghiệm 1: 10 ml dịch chiết + 0,5 ml NaOH 10%
- Ống nghiệm 2: 10 ml dịch chiết
- Đun 2 ống trong 2 phút, để nguội
- Sau đó thêm 2 ống mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc
- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết + 1 ml dd NaOH 10% lắc kỹ, nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch
• Chuẩn bị: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi 3 phút, để nguội, lọc qua bông
• Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc + 1 ml NaOH
• Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ sim
2.3.1.8 Định tính acid hữu cơ a) Chuẩn bị
Cân 2,0 g dược liệu + 10 ml nước cất, đun cách thủy 10 phút Lọc lấy dịch làm các phản ứng định tính b) Tiến hành
- Cho 1 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Ninhydrin, đun 3 phút
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh tím
• Định tính acid hữu cơ:
- Cho 1 ml dịch chiết + 1 vài tinh thể Na2CO3
- Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí
• Chuẩn bị: cân 2,0 g dược liệu + cloroform trong 2h, lấy dịch chiết lên mảnh giấy lọc, để khô quan sát
• Phản ứng dương tính khi thấy vết mờ đọng lại trên mảnh giấy lọc
Lấy 10g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 40 ml ethanol Ngâm 24h, gạn lấy dịch chiết Loại tạp bằng chì acetat 30%, lọc bỏ tủa Dịch lọc chiết lỏng lỏng trong bình gạn với cloroform 2 lần, mỗi lần 10 ml Gạn lấy dịch cloroform đem làm phản ứng b) Tiến hành:
- Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm, thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc
- Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp có vòng màu đỏ thẫm
- Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm Cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 1 ml anhydric acetic, lắc đều Đặt nghiêng ống 45 o rồi thêm từ từ 1 ml
- Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp có vòng tím đỏ
2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Dược liệu được chiết bằng phương pháp chiết nóng với dung môi EtOH 70% Điều kiện chiết: nhiệt độ 70 o C, tốc độ quay 20 vòng/ phút, máy cô quay 20 lít
Dịch chiết ethanol được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ
70 o C để thu được cao tổng
Cao tổng được phân tán với nước nóng, chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, n- butanol Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm với nhiệt độ tương ứng, dịch chiết nước còn lại được cô cách thủy ở nhiệt độ 80 o C, thu được cao các phân đoạn tương ứng: cao n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, n- butanol và cắn nước
2.3.2.2 Phương pháp phân lập chất
Trước khi tiến hành phân lập chất, khảo sát cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động phù hợp Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các chất Các bước tiến hành như sau:
Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh): Silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck)
Dung môi rửa giải (pha động): Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng: n-hexan, dichloromethan, aceton, ethyl acetat, methanol theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát trước đó bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng chất đưa lên cột, được rửa sạch, tráng bằng aceton, phơi khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng Lót một lớp bông dưới đáy cột
Nhồi cột: Đưa lượng silica gel phù hợp vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải, khuấy đều để phân tán silica gel thấm đều dung môi và đuổi hết bọt khí Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị Mở khóa cột, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định Sau khi cột ổn định, giữ lại một ít dung môi (cao khoảng 3 – 5 cm tính từ bề mặt trên của lớp silica gel) để cột không bị khô trước khi khóa cột lại và chuẩn bị đưa mẫu lên cột
Chuẩn bị mẫu: Mẫu cao phân đoạn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel (tối thiểu), phân tán đều trong lượng silica gel trên; làm khô để loại bỏ dung môi và nghiền, trộn đều đến khi thu được bột khô, tơi, mịn
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Định tính bằng phản ứng hóa học
- Kết quả: thấy màu vàng đậm hơn (dương tính)
- Kết quả: màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt, có tủa nâu (dương tính)
- Kết quả: xuất hiện tủa xanh đen (dương tính)
- Kết quả: xuất hiện màu đỏ cam, có tủa màu đỏ cam (dương tính)
→ Nhận xét: Dược liệu chứa flavonoid
• Phản ứng thuốc thử Mayer:
- Kết quả: không xuất hiện tủa trắng (âm tính)
• Phản ứng thuốc thử Dragendorff:
- Kết quả: không xuất hiện tủa vàng cam (âm tính)
• Phản ứng thuốc thử acid picric 1%:
- Kết quả: không xuất hiện tủa màu vàng (âm tính)
→ Nhận xét: không có alcaloid
3.1.3 Định tính saponin (hiện tượng tạo bọt)
• Kết quả: thấy cột bọt còn bễn vững sau 15 phút (dương tính)
• Phản ứng với dd gelatin (1%):
- Kết quả: có xuất hiện tủa bông màu trắng (dương tính)
- Kết quả: có xuất hiện nhiều tủa xanh đen (dương tính)
• Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%:
- Kết quả: có xuất hiện tủa bông màu trắng, mịn (dương tính)
- Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá (dương tính)
- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha
- Kết quả: không xuất hiện màu đỏ cam (âm tính)
- Kết quả: mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng không xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ không thấy lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (âm tính)
→ Nhận xét: không có glycosid tim
• Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
- Kết quả: Hai ống không thay đổi Sau đó thêm 2 ống mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều Hai ống không thay đổi Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc, không thấy ống 1 thay đổi (âm tính)
- Kết quả: không xuất hiện tủa đỏ gạch (âm tính)
→ Nhận xét: không có coumarin
3.1.7 Định tính anthranoid (phản ứng Borntraeger)
• Kết quả: không xuất hiện màu đỏ sim (âm tính)
→ Nhận xét: không có anthranoid
3.1.8 Định tính acid hữu cơ
- Kết quả: không xuất hiện tủa xanh tím (âm tính)
→ Nhận xét: không có acid hữu cơ
• Định tính acid hữu cơ:
- Kết quả: không xuất hiện bọt khí (âm tính)
→ Nhận xét: không có acid hữu cơ
• Kết quả: không thấy vết mờ đọng lại trên mảnh giấy lọc (âm tính)
→ Nhận xét: không có chất béo
- Kết quả: thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp có vòng màu đỏ thẫm (dương tính)
- Kết quả: thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp có vòng tím đỏ (dương tính)
Kết quả định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học đặc trưng được thể hiện qua Bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học trong thân loài G javanica
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả
Pư với NaOH 10% + Có tủa nâu
Pư Diazo hoá ++ Có tủa đỏ cam
Pư với dd Acid picric 1% -
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt ++ Có saponin steroid
Pư với dd Pb(CH3COO)2
Pư Liebermann + Không có glycosid tim
6 Coumarin Pư đóng mở vòng lacton - Không có coumarin
7 Anthranoid Pư Borntraeger - Không có anthranoid
8 Acid hữu cơ Acid amin: Pư với TT
Ninhydrin - Không có acid amin
26 Acid hữu cơ: Pư với
Na2CO3 - Không có acid hữu cơ
9 Chất béo Để lại vết mờ trên giấy lọc - Không có chất béo
(++): phản ứng dương tính rõ
→ Nhận xét: Qua các phản ứng định tính, sơ bộ thấy trong thân của loài Gouania javanica có chứa flavonoid, saponin, tanin, sterol Không chứa alcaloid, glycosid tim, coumarin, anthranoid, acid amin, acid hữu cơ, chất béo.
Phân lập chất
3.2.1 Chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn
10,0 kg dược liệu khô là thân của loài G javanica sau khi thái nhỏ và xay thô, được chiết nóng với EtOH 70%, tỷ lệ dung môi/ dược liệu là 7:1 (l/kg), 3 lần, mỗi lần 3 giờ Lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết các lần và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được 1,234 kg cao ethanol 70% Lưu mẫu 34,0 g
Phân tán 1,2 kg cao ethanol 70% trong nước nóng, chia thành nhiều mẻ, chiết phân bố lỏng – lỏng trong bình gạn (tỷ lệ 1:1) với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là n – hexan, DCM, ethyl acetat, n – butanol Gộp các dịch chiết tương ứng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được các phân đoạn với khối lượng tương ứng là 20,8 g cao n – hexan, 89,5 g cao DCM, 53,3 g cao ethyl acetat, 300 g cao n – butanol và 720 g cao nước
Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn được thể hiện qua Sơ đồ 3.1
Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ G javanica
Dịch chiết nước Cao phân đoạn n-hexan 20,8 g
1 Chiết nóng với EtOH 70%, tỷ lệ dung môi/ dược liệu = 7/1 Chiết 3 lần × 3h/lần
2 Lọc, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi EtOH
1 Phân tán cao tổng (1,2 kg) trong nước nóng
2 Chiết phân đoạn với n-hexan, 3 lần/ mẻ × 1,5 lít/ lần
1 Chiết phân đoạn với DCM, 3 lần/ mẻ × 1,5 lít/ lần
1 Chiết phân đoạn với EtOAC, 3 lần/ mẻ × 1,5 lít/ lần
1 Chiết phân đoạn với n-butanol, 3 lần/ mẻ × 1,5 lít/ lần
2 Thu hồi n-butanol Dịch chiết nước
3.2.2 Phân lập và xác định các hợp chất trong cao phân đoạn DCM
3.2.2.1 Sắc ký cột cao DCM
Chuẩn bị mẫu: 89,5 g cao phân đoạn DCM (lưu mẫu 9,5 g) được hòa tan hoàn toàn bằng dung môi thích hợp, sau đó hấp phụ vào lượng silica gel vừa đủ
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký bằng thủy tinh được làm sạch và treo trên giá thẳng đứng, cột cao 100 cm, đường kính 15 cm, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột
Chuẩn bị chất nhồi cột: Chất nhồi cột là hạt silica gel pha thuận, kích thước hạt
0,040 0,063 mm (Merck) Silica gel được ngâm với DCM
Nhồi cột: Cho chất nhồi cột vào cột Sau khi đưa hết lượng silica gel lên cột, tiếp tục gõ nhẹ, đều xung quanh cho tới khi lớp silica gel ổn định Cho dung môi qua cột
2 – 3 lượt cho cột ổn định, thu được cột với lớp silica gel cao 15 cm, đường kính 15 cm
Nạp mẫu: Sau khi cột ổn định, tiến hành nạp mẫu bằng phương pháp nạp mẫu khô, bề mặt dung môi cách bề mặt lớp silica gel khoảng 5 cm thì bắt đầu nạp mẫu lên cột Dùng một lớp bông để bảo vệ bề mặt sau khi nạp mẫu, tránh xáo trộn bề mặt khi bổ sung dung môi các lần sau
Dung môi khai triển: Hệ dung môi gradient DCM - MeOH (tỷ lệ 100:0 – 0:100, tt/tt)
• Triển khai sắc ký với hệ dung môi đã chọn, thu dịch rửa giải vào các ống nghiệm dung tớch 50 ml, hứng ắ ống, thu được cỏc phõn đoạn riờng biệt
• Khảo sát dịch rửa giải bằng phương pháp SKLM, tiến hành gộp dịch ở các ống có sắc ký đồ giống nhau, cất thu hồi dung môi tại áp suất giảm, thu được 16 phân đoạn: D1 – D16
• Phân đoạn D2 (10,5 g) được chọn để triển khai sắc ký cột
• Phân đoạn D5 (4,1 g) được chọn để triển khai sắc ký cột
3.2.2.2 Sắc ký cột phân đoạn D2
Chuẩn bị sắc ký cột pha thường, chất nhồi cột là silica gel, kích thước hạt
0,040 0,063 mm (Merck) Cột thủy tinh trong suốt dài 80 cm, đường kính 5 cm, chiều cao silica gel 15 cm
Phân lập phân đoạn D2 (10,5 g) bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan – EtOAC (tỷ lệ 50:1 – 1:1, tt/tt), thu được 15 phân đoạn (D2.1
29 – D2.15) Phân đoạn D5.5 (4,8 g) được kết tinh lạnh trong n-hexan, thu được hợp chất GJS01 (3,05 g)
3.2.2.3 Sắc ký cột phân đoạn D5
Chuẩn bị sắc ký cột pha thường, chất nhồi cột là silica gel, kích thước hạt 0,040
0,063 mm (Merck) Cột thủy tinh trong suốt dài 80 cm, đường kính 3 cm, chiều cao silica gel 20 cm
Phân lập phân đoạn D5 (4,1 g) bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient DCM – Aceton (tỷ lệ 100:1 – 1:1, tt/tt), thu được 10 phân đoạn (D5.1 –
D5.10) Phân đoạn D5.4 (150 mg) được kết tinh lạnh trong aceton, thu hợp chất GJS04 (35 mg)
Quy trình phân lập các hợp chất từ cao DCM được thể hiện qua Sơ đồ 3.2
Sơ đồ 3.2 Quy trình phân lập các hợp chất từ cao DCM G javanica
CC DCM – MeOH (100:0 – 0:100, tt/tt)
CC DCM – Aceton (50:1 – 1:1, tt/tt)
Hình 3.1 Sắc ký đồ của hợp chất GJS01 và GJS04 so với cao DCM
(Sắc ký đồ của hợp chất GJS01 và GJS04 so với cao DCM, quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun dung dịch acid sulfuric 10% trong EtOH 96% (TT) và sấy nóng)
A: hệ dung môi n-hexan – EtOAC (3:1, tt/tt) B: hệ dung môi n-hexan – Aceton (4:1, tt/tt) C: hệ dung môi DCM – Methanol (20:1, tt/tt) 3.2.2.4 Xác định cấu trúc các hợp chất a) GJS01
Hợp chất GJS01 thu được dưới dạng bột màu trắng
Phổ MS cho pic ion giả phân tử tại m/z = 427,39 [M+H] + (Phụ lục 3.1) phù hợp với công thức phân tử C30H50O (M = 426,39)
Phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ H: 4,69 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-29b), 4,57 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-29a), 3,18 (1H, dd, J = 11,40; 4,80 Hz, H-3), 2,37 (1H, m, H-19),
32 Phổ 1 H-NMR của GJS01 cho thấy các tín hiệu đặc trưng của một triterpenoid khung lupan với 7 nhóm methyl tại δ H 1,68 (3H, s, H-30), 1,03 (3H, s, H-26), 0,97 (3H, s, H-23), 0,95 (3H, s, H-27), 0,79 (3H, s, H-28), 0,83 (3H, s, H-25) và 0,76 (3H, s, H-24); hai proton olefinic tại δ H 4,69 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-29b) và 4,57 (1H, d, J
= 2,4 Hz, H-29a) và một nhóm hydroxymethin tại δ H 3,18 (1H, dd, J = 11,4; 4,8 Hz, H-3) Phổ 13 C-NMR của GJS01 cho thấy tín hiệu của 30 carbon trong đó có 7 nhóm methyl tại δ C 28,0 (C-23), 15,4 (C-24), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26), 14,6 (C-27), 18,0 (C-28) và 19,3 (C-30) Tín hiệu tại δ C 150,9 (C-20) và 109,3 (C-29) cho thấy có sự hiện diện của một nối đôi Cấu hình β-OH tại C-3 được xác định dựa trên hằng số tương tác lớn của H-3 (J =11,4 Hz) Trên cơ sở dữ liệu phổ thu được và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất GJS01 được xác định là lupeol Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ Gouania javanica
Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất lupeol Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất GJS01 và lupeol
Hợp chất GJS01 Lupeol [4] δ H a,b (độ bội, J = Hz)
(ppm) δ C a,c (ppm) δ H a,d (độ bội, J = Hz)
Ghi chú: a đo trong CDCl3, b 600 MHz, c 150 MHz, d 500 MHz, e 125 MHz b) GJS04
Hợp chất GJS04 thu được dưới dạng tinh thể hình kim không màu
Phổ MS cho pic ion giả phân tử tại (+)m/z = 425.25 [M-H2O+H] + ; m/z = 443.65
[M+H] + (Phụ lục 4.3) phù hợp với công thức phân tử C30H50O2 (M = 442,38)
Phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ H: 4,82 (1H, d, J =1,8 Hz, H-29b), 4,58 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-29a), 3,80 (1H, dd, J = 10,8; 1,0 Hz, H-28a), 3,33 (1H, d, J ,8
Dữ liệu phổ 13 H-NMR và 13 C-NMR của GJS04 tương tự như GJS01 ngoại trừ sự vắng mặt của 1 nhóm methyl và thay vào đó là sự xuất hiện của một nhóm hydroxymethylen tại δ H 3,80 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-28a), 3,33 (1H, d, J = 10,8 Hz,
H-28b) và δ C 60,6 (C-28) Bên cạnh đó, phổ 13 C-NMR của GJS04 chỉ xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm methyl tại δ C 28,0 (C-23), 15,4 (C-24), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26),
14,8 (C-27) và 19,1 (C-30) thay vì 7 tín hiệu của nhóm methyl như GJS01 Cấu hình β-OH của nhóm hydoxymethin tại C-3 được xác định dựa trên hằng số tương tác lớn
J = 12,0 Hz Dựa trên các dữ liệu phổ, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất GJS04 được xác định là betulin Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ chi Gouania
Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất betulin Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất GJS04 và betulin
Hợp chất GJS04 Betulin [25] δ H a,b (độ bội, J = Hz)
(ppm) δ C a,c (ppm) δ H a,b (độ bội, J = Hz)
Ghi chú: a đo trong CDCl3, b 600 MHz, c 150 MHz.
Bàn luận
3.3.1 Về kết quả định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu
Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong dược liệu bằng phương pháp hóa học cho thấy trong thân của loài G javanica có chứa các chất: flavonoid, saponin, tanin, sterol Kết quả này tương tự với thông tin được công bố trong nghiên cứu [31] Kết quả định tính cũng phù hợp với các nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học của chi Gouania với nhóm chất chính là flavonoid và saponin
Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ giúp phân tích sơ bộ các thành phần hóa học có trong dược liệu và là cơ sở định hướng cho việc định tính bằng sắc ký lớp mỏng, chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong dược liệu
3.3.2 Về kết quả chiết xuất
Dược liệu được chiết bằng phương pháp chiết nóng với dung môi sử dụng là EtOH 70% Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm Ethanol là dung môi với ưu điểm có giá thành rẻ, dễ sử dụng, an toàn với môi trường, ít độc hơn methanol, chiết xuất được hầu hết các nhóm chất, dễ thu hồi và tái sử dụng Tuy vậy có nhược điểm là chiết không chọn lọc
36 Dược liệu sau khi chiết thu được 1, 234 kg cao ethanol, hiệu suất 12%, đây là mức hiệu suất trung bình từ dược liệu
Cao tổng thu được tiếp tục được chiết phân bố thành các phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, DCM, EtOAC, n-butanol để thu được các cao phân đoạn tương ứng
3.3.3 Về kết quả phân lập và xác định các hợp chất Đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.)” là một phần của đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.)” – Đề tài nghiên cứu cấp cơ sở, Viện Dược liệu, Bộ Y tế, dự kiến nghiên cứu thành phần hóa học của tất cả các phân đoạn, tuy nghiên đây là khởi đầu nghiên cứu, bên cạnh đó từ kết quả định tính cho thấy sự tồn tại của triterpenoid là một trong những nhóm chất chính của mẫu nghiên cứu, nhóm chất này phân bố chủ yếu trong phân đoạn DCM và ethyl acetat
Từ phân đoạn DCM đã phân lập được hai chất tinh khiết là GJS01 và GJS04
Dựa trên các đặc điểm về dạng thù hình, khối phổ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, so sánh với các dữ liệu đã được công bố, xác định được hai hợp chất GJS01 và GJS04 lần lượt là lupeol và betulin Trong đó, lupeol lần đầu được phân lập trong loài G javanica và betulin lần đầu được phân lập trong chi Gouania
3.3.3.1 Về hợp chất GJS01 (lupeol)
Lupeol lần đầu tiên được phân lập từ loài Lupinus luteus vào năm 1891 [26] Hợp chất này được tìm thấy ở nhiều họ khác nhau như Anacardiaceae [30], Papilionaceae [15], Capparaceae [29],… Lupeol có khung triterpenoid dạng lupan tương tự các hợp chất triterpenoid đã được báo cáo có mặt ở chi Gouania như G longipetala [18], G leptostachya [4], G ulmifolia [22] và các chi khác trong họ Táo ta (Rhamnaceae) như chi Ziziphus [16] Đây là lần đầu tiên lupeol được phân lập trong loài G javanica Điều đặc biệt lupeol là hợp chất phân lập được với khối lượng khá nhiều (3,05 g) và cũng thể hiện là hợp chất chính trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng (Hình 3.1.) Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng lupeol có nhiều tác dụng dược lý có lợi, bao gồm tác dụng chống oxy hóa [28], chống viêm [27], chống tăng đường huyết [36], chống rối loạn lipid máu [32], chống ung thư [27]… Cơ chế được cho là lupeol nhắm vào các protein và con đường khác nhau, bao gồm -glucosidase, -amylase, protein tyrosin phosphatase 1B (PTP 1B), thụ thể giống như kinase qua trung gian thụ thể IL-1 (IRAK-TLR4), họ Bcl-2, yếu tố hạt nhân kappa B, phosphatidylinositol-3-kinase (PI3-K)/Akt và đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin [34] Như vậy, những thông tin đã được công bố về tác dụng của hợp chất này gợi ý có thể thân Dây đòn kẻ cắp có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống tăng đường huyết,… – là một tác nhân đa mục tiêu với hiệu lực dược lý đa dạng, khiến nó trở thành một hợp chất có giá trị
38 để phát triển thuốc tiềm năng trong các lĩnh vực như thuốc chống viêm, chống tiểu đường, bảo vệ gan và chống ung thư
3.3.3.2 Về hợp chất DKT04 (betulin)
Betulin là một triterpene tự nhiên, lần đầu tiên được phân lập dưới dạng chất hóa học tinh khiết vào năm 1788 từ vỏ cây Bạch dương (Betula L.), cũng là một trong những sản phẩm tự nhiên đầu tiên được xác định từ thực vật [37] Hợp chất này được tìm thấy trong nhiều họ khác nhau như Fagaceae, Rosaceae, Dilleniaceae, Platanaceae, Betulaceae,…[17] Betulin có khung triterpenoid tương tự như các hợp chất đã phân lập được trong chi Gouania [4] Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên betulin được xác định trong chi này
Betulin có tác dụng bảo vệ chống lại các bệnh tim mạch và gan, ung thư, tiểu đường, stress oxy hóa và viêm [14] Theo Wen và cộng sự, betulin được dùng cho chuột đực bị tiểu đường trong 12 tuần ở liều 20 và 40 mg/kg làm giảm đáng kể lượng đường trong máu, insulin huyết thanh, tổng lượng chất béo trung bình và tổng mức cholesterol [13] Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng betulin phục hồi tình trạng kháng insulin bằng cách cải thiện khả năng dung nạp glucose, ức chế quá trình peroxid hóa lipid ở vùng hải mã, giảm các cytokin gây viêm (IL-6, IL-1β, TNF) và ức chế trục truyển tín hiệu NFκB ở chuột mắc bệnh tiểu đường [12] Betulin có độc tính tế bào thấp, có khả năng giảm viêm thông qua việc giảm tiết IL-6, có tác dụng mạnh hơn cả dexamethasone [37] Ngoài ra, betulin còn được cho là chất có tiềm năng trong việc ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, vú, đại trực tràng và phổi [14] Trong một nghiên cứu khác, betulin, acid betulinic và acid oleanolic (nồng độ 1M) đã được nghiên cứu về hoạt tính bảo vệ gan chống lại độc tế bào do ethanol gây ra trong tế bào HepG2, trong đó betulin là chất bảo vệ tích cực nhất của tế bào HepG2 chống lại độc tế bào do ethanol gây ra [11] Betulin còn được nghiên cứu có tác dụng tích cực trong việc giúp tăng cường chữa lành vết thương và tái tạo biểu mô [14] Vì vậy, đây cũng có thể là một trong những hợp chất tạo nên tác dụng chính của thân cây Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.), có tiềm năng trong điều trị các bệnh tim mạch và gan, ung thư, tiểu đường, stress oxy hóa và viêm
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Sau thời gian tiến hành nghiên cứu, khóa luận đã thu được những kết quả sau:
1 Từ kết quả định tính, đã kết luận được rằng thân loài G javanica có chứa flavonoid, saponin, tanin và sterol
2 Từ phân đoạn DCM đã phân lập được hai chất tinh khiết là GJS01 và GJS04 Từ các dữ liệu khối phổ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, so sánh với các dữ liệu đã được công bố, xác định được GJS01 là lupeol và GJS04 là betulin Đây là nghiên cứu đầu tiên phân lập được lupeol từ loài Gouania javanica Miq và betulin từ chi
Do thời gian có hạn, các kết quả nghiên cứu thu được còn khiêm tốn Cần tiếp tục thực hiện nghiên cứu các nội dung sau:
- Tiếp tục phân lập các hợp chất trong phân đoạn DCM và các phân đoạn còn lại (n- hexan, EtOAC, n-butanol, nước) của thân loài G javanica
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của lá loài G javanica
- Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao tổng, các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được từ thân loài G javanica
1 Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông
Nghiệp, Hà Nội, Tập II, tr.869-875
2 Bộ môn Dược liệu (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.72-77
3 Bộ môn Dược liệu (2019), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.64-129
4 Nguyễn Thị Hằng (2023), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống viêm in vitro của cây dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.), họ Táo ta Rhamnaceae, Luận án Tiến sĩ Dược học, Viện Dược liệu
5 Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, Nhà Xuất Bản Trẻ, tr.440-441
6 Trần Hùng, Ngô Vân Thu (2011), Dược liệu học NXB Y học, tr.228
7 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr.126
8 Viện Dược Liệu (2017), Danh mục cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật tr.8
9 Bộ tài nguyên và môi trường (2021), "Ngày Quốc tế Đa dạng sinh học 2021:
Công tác bảo tồn loài tại Việt Nam - Nhìn lại quá khứ, hướng tới tương lai ",
UBND tỉnh Thái Nguyên Sở Tài nguyên và môi trường,
10 Lecomte H., Humbert H., F G (1923), Flore Génerale de L’indo – chine,
Paris mason et c, éditeurs 120, boulevard saint – germain(vie), pp.932-934
11 Szuster-Ciesielska A., Kandefer-Szerszeủ M (2005), "Protective effects of betulin and betulinic acid against ethanol-induced cytotoxicity in HepG2 cells", Pharmacol Rep, 57(5), pp.588
12 Ma C., Long H (2016), "Protective effect of betulin on cognitive decline in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats", Neurotoxicology, 57, pp.104-111
13 Wen Y., Geng L., Zhou L., Pei X., Yang Z., Ding Z (2020), "Betulin alleviates on myocardial inflammation in diabetes mice via regulating Siti1/NLRP3/NF- κB pathway", International Immunopharmacology, 85, pp.106653
14 Adepoju F.O., Duru K.C., Li E., Kovaleva E.G., Tsurkan M.V (2023),
"Pharmacological Potential of Betulin as a Multitarget Compound", 13(7), pp.1105
15 Abdullahi S., Musa A., Abdullahi M., Sule M., Sani Y (2013), "Isolation of
Lupeol from the Stem-bark of Lonchocarpus sericeus (Papilionaceae)", Scholars Acad J Biosci1(1), pp.9-18
16 Bae G.-H., Lee S.-M., Lee E.-S., Lee J.-S., Gang J.-S.J.Y.H (1996), "Isolation and quantitative analysis of betulinic acid and alphitolic acid from Zyziphi fructus", Yakhak Hoeji, 40(5), pp.558-562
"Methods of Betulin Extraction from Birch Bark", Molecules, 27(11), pp.3621
18 Désiré S., Ernestine N., Bruno T.B., Lazare S.S., Ulrich D.D., Lateef M.,
Schneider B., Ali M.S., Barthélemy N (2021), "A new dammarane type triterpene glucoside from the aerial parts of Gouania longipetala
(Rhamnaceae)", Natural Product Research, 35(19), pp.3192-3203
19 Ekuadzi E., Dickson R.A., Fleischer T.C (2012), "Antibacterial, anti- inflammatory and antioxidant properties of Gouania longipetala Hemsl", International journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 3, pp.5
20 Ekuadzi E., Dickson R.A., Fleischer T.C., Amponsah I.K., Pistorius D.,
Oberer L (2014), "Chemical constituents from Gouania longipetala and Glyphaea brevis", Natural Product Research, 28(15), pp.1210-1213
21 Ezeja M.I., Anaga A.O., Asuzu I.U (2015), "Antidiabetic, antilipidemic, and antioxidant activities of Gouania longipetala methanol leaf extract in alloxan- induced diabetic rats", Pharmaceutical Biology, 53(4), pp.605-614
22 Giacomelli S.R., Maldaner G., Stücker C., Marasciulo C., Schmidt J.,
Wessjohann L., Dalcol I.I., Morel A.F (2007), "Triterpenoids from Gouania ulmifolia", Planta medica, 53(05), pp.499-501
23 Gossan D.P.A., Magid A.A., Yao-Kouassi P.A., Coffy A.A., Harakat D.,
Voutquenne-Nazabadioko L (2015), "New acylated flavonol glycosides from the aerial parts of Gouania longipetala", Phytochemistry letters, 11, pp.306-
24 Gossan D., Magid A.A., Yao-Kouassi P., Ahibo C., Josse J (2016),
"Triterpene glycosides from the aerial parts of Gouania longipetala", Phytochemistry letters, 134, pp.71-77
25 Nguyen Thi Hue, Vu Van Nam, Pham Thi Hang, Vu Thi Hue, Le Nguyen
Thanh, Pham Van Cuong, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Quoc Vuong (2022),
"Triterpenes from the stems and leaves of Myxopyrum smilacifolium (Wall.) Blume", Vietnam analytical sciences society, 28(4)
26 Likiernik A (1891), "Ueber das Lupeol", Biological chemistry, 15(5), pp.415-
27 Liu K., Zhang X., Xie L., Deng M., Chen H., Song J., Long J., Li X., Luo J
(2021), "Lupeol and its derivatives as anticancer and anti-inflammatory agents: Molecular mechanisms and therapeutic efficacy", Pharmacological research, 164, pp.105373
28 Park J.S., Rehman I.U., Choe K., Ahmad R., Lee H.J., Kim M.O (2023), "A triterpenoid lupeol as an antioxidant and anti-neuroinflammatory agent: impacts on oxidative stress in Alzheimer’s disease", Nutrients, 15(13), pp.3059
29 Rathinavel T., Ammashi S., Shanmugam G (2021), "Analgesic and anti- inflammatory potential of Lupeol isolated from Indian traditional medicinal plant Crateva adansonii screened through in vivo and in silico approaches", Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 19(1), pp.62
30 Ruiz-Montaủez G., Ragazzo-Sỏnchez J., Calderún-Santoyo M., Velazquez-De
La Cruz G., De Leún J.R., Navarro-Ocaủa A (2014), "Evaluation of extraction methods for preparative scale obtention of mangiferin and lupeol from mango peels (Mangifera indica L.)", Food chemistry, 159, pp.267-272
31 Segismundo A.B., Florendo P.E., Pablico A.R.P., Management (2008), "In
Vitro Antifungal Activity and Phytochemical Screening of Gouania javanica
Miq Leaves", The Vector: International Journal of Emerging Science, Technology Management
32 Sohag A.A.M., Hossain M.T., Rahaman M.A., Rahman P., Hasan M.S., Das
R.C., Khan M.K., Sikder M.H., Alam M., Uddin M.J (2022), "Molecular pharmacology and therapeutic advances of the pentacyclic triterpene lupeol",
33 St John H (1969), "Monograph of the Hawaiian Species of Gouania
34 Gupta S.C., Prasad S., Aggarwal B.B (2016), Drug Discovery from Mother
Nature, Advances in Experimental Medicine and Biology, 929, pp.145-175
35 Nguyen Thi Kim Thuy, Do Thi Trang, Mai Thi Nhu Trang, Ninh Khac Bay,
Bui Huu Tai, Phan Van Kiem, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Nhiem (2019),
"Flavonol glycosides and dammarane saponin from Gouania leptostachya", Vietnam Journal of Chemistry, 57(3), pp.277-280
36 Phan Hoang Vinh Truong, Duong Thuc Huy, Pham Duc Dung, Pham Hoang
Anh, Nguyen Van Kieu, Nguyen Thi Phuong, Nguyen Huu Hung, Nguyen Ngoc Hong, Sam-ang P., Phontree K (2021), "Design and synthesis of new lupeol derivatives and their α-glucosidase inhibitory and cytotoxic activities",
37 Tuli H.S., Sak K., Gupta D.S., Kaur G., Aggarwal D., Chaturvedi Parashar N.,
Choudhary R., Yerer M.B., Kaur J., Kumar M (2021), "Anti-inflammatory and anticancer properties of birch bark-derived betulin: Recent developments", Plants, 10(12), pp.2663
38 Wagner M., Kovačić M., Koblmüller S (2021), "Unravelling the taxonomy of an interstitial fish radiation: Three new species of Gouania (Teleostei: Gobiesocidae) from the Mediterranean Sea and redescriptions of G willdenowi and G pigra", Journal of Fish Biology, 98(1), pp.64-88
39 Yao C., Zhang S.J., Bai Z.Z., Zhou T., Xuan L.J (2011), "Two new benzopyran derivatives from Gouania leptostachya DC var tonkinensis
Pitard", Chinese Chemical Letters, 22(2), pp.175-177
40 Zhengyi Wu, Peter H Raven (2007), Flora of China, 12, pp.163
41 https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:1013684-1 truy cập
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
PHỤ LỤC 2 HÌNH ẢNH KẾT QUẢ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH
Phản ứng định tính Kết quả
2 Saponin Hiện tượng tạo bọt
Phản ứng với dd gelatin 1%
Phản ứng với Pb(CH3COO)2
PHỤ LỤC 3 DỮ LIỆU PHỔ CÁC HỢP CHẤT PHỤ LỤC 3.1 DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT GJS01
Cấu trúc của hợp chất GJS01 Phụ lục 3.1.1 Dữ liệu phổ ESI-MS của hợp chất GJS01
Phụ lục 3.1.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) của hợp chất GJS01
Phụ lục 3.1.3 Dữ liệu phổ 13 C-NMR (150 MHz, CDCl3) của hợp chất GJS01
PHỤ LỤC 3.2 DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT GJS04
Cấu trúc của hợp chất GJS04 Phụ lục 3.2.1 Dữ liệu phổ ESI-MS của hợp chất GJS04
Phụ lục 3.2.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) của hợp chất GJS04
Phụ lục 3.2.3 Dữ liệu phổ 13 C-NMR (150 MHz, CDCl3) của hợp chất GJS04
Phụ lục 3.1.1 Dữ liệu phổ ESI-MS của hợp chất GJS01
