vũ thị nga bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây dây đòn kẻ cắp gouania javanica miq rhamnaceae

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ NGA BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY DÂY ĐÒN

KẺ CẮP (Gouania javanica Miq.,

Rhamnaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoàng

Tuấn, bộ môn Dược Liệu – khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền – Trường Đại học

Dược Hà Nội đã luôn tận tâm hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Lê Thị Loan, người đã trực tiếp

hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cô đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm, kĩ năng, cùng em thực hiện đề tài, xử lý số liệu, giải đáp thắc mắc giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn tới cô Nguyễn Thị Hồng Anh cùng với các cán bộ khác

đang làm việc tại khoa Hóa Thực vật, các anh chị, các bạn, các em cùng làm nghiên cứu tại khoa; tuy không trực tiếp hướng dẫn nhưng các cán bộ, các bạn đã giúp em rất nhiều trong việc chia sẻ công việc, giải đáp thắc mắc, giúp em có nhiều kiến thức hơn và có nhiều kỉ niệm đáng nhớ trong quá trình thực hiện khóa luận của mình

Em xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất

Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.)” – đề tài nghiên cứu cấp cơ sở, Viện Dược

liệu, Bộ Y tế, đã tạo điều kiện và tài trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn đồng hành, động viên, giúp đỡ em vượt qua những lúc khó khăn trong quá trình hoàn thành khóa luận

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2024

Sinh viên

1.1 Tổng quan về chi Gouania 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gouania 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Gouania 2

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Gouania 2

1.1.2.2.Phân bố chi Gouania 2

1.1.3 Thành phần hóa học chi Gouania 3

1.2.Khái quát về loài Dây đòn kẻ cắp (Gouania Javanica Miq.) 14

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Gouania Javanica Miq 14

1.2.2 Phân bố 14

2.CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 152.1.2.1 Hóa chất 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 21

3 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.2.1 Chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn 26

3.2.2 Phân lập và xác định các hợp chất trong cao phân đoạn DCM 28

3.3.1 Về kết quả định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu 35

3.3.2 Về kết quả chiết xuất 35

3.3.3 Về kết quả phân lập và xác định các hợp chất 37

3.3.3.1 Về hợp chất GJS01 (lupeol) 37

3.3.3.2 Về hợp chất DKT04 (betulin) 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ

hạt nhân carbon 13) 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt

IC50 Half-maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%)

LD50 Lethal dose, 50% (Nồng độ gây chết 50%)

m/z Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/ điện tích)

TLTK Tài liệu tham khảo tt/tt Thể tích/ thể tích

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số flavonol được phân lập từ chi Gouania 3

Bảng 1.2 Một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania 7

Bảng 1.3 Một số sponin được phân lập từ chi Gouania 8

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học trong

thân G javanica

23

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất GJS01 và lupeol 31

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất GJS04 và betulin 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 CTCT một số flavonol được phân lập từ chi Gouania 5

Hình 1.2 CTCT một số flavan được phân lập từ chi Gouania 6

Hình 1.3 CTCT biflavonoid và triflavonoid được phân lập từ chi Gouania 6

Hình 1.4 CTCT một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania 8

Hình 1.5 CTCT một số saponin được phân lập từ chi Gouania 9

Hình 3.1 Sắc ký đồ của hợp chất GJS01 và GJS04 so với cao DCM 30

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất lupeol 31

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất betulin 33

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ G javanica 26

Sơ đồ 3.2 Quy trình phân lập các hợp chất từ cao DCM G javanica 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hóa dược, công tác nghiên cứu, phát triển thuốc và sản phẩm thiên nhiên mới có nguồn gốc cây cỏ đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, với điều kiện tự nhiên đa dạng, Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có mức độ đa dạng sinh học cao với hơn 20.000 loài thực vật khác nhau [9] Đặc biệt trong đó có gần 5.117 loài thực vật bậc cao cũng như bậc thấp được các cộng đồng dân tộc sử dụng trong chăm sóc sức khỏe, phòng và trị bệnh [8] Tuy nhiên, phần lớn nguồn tài nguyên này được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, hoặc theo Y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu đầy đủ

Chi Gouania là một chi thực vật có hoa trong họ Rhamnaceae Khoảng 50 đến 70

loài trong đó có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, bao gồm Châu Phi, Madagascar, các đảo ở Ấn Độ Dương, Nam Á, Châu Mỹ và Hawaii

Chúng là cây bụi hoặc dây leo Tại Việt Nam, chi Gouania có 2 loài là Gouania

leptostachya DC và Gouania javanica Miq [5] Hai loài này được dùng trong dân

gian để chữa vết thương do bị đánh, ngã…

Các loài đã được nghiên cứu trong chi Gouania hầu hết đều có cùng khung cấu

trúc với các nhóm chất chính là saponin, triterpenoid khung lupan, flavonoid,…

So với G leptostachya, G javanica chưa được công bố nhiều về đặc điểm thực

vật, thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học Nhận thấy đây là loài cây tiềm

năng có thể mang đến nhiều ứng dụng trong y học, khóa luận “Bước đầu nghiên

cứu thành phần hóa học của cây Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.,

Rhamnaceae)” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Định tính các hợp chất chính có trong loài Gouania javanica Miq

2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập từ loài

Gouania javanica Miq

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Gouania

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gouania

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Gouania có vị trí phân loại như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidase)

Liên bộ Táo ta (Rhamnanae) Bộ Táo ta (Rhamnales)

Họ Táo ta (Rhamnaceae)

Chi Gouania Jacq [1], [10]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Gouania

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Gouania

Theo Flora of China, chi Gouania thuộc cây bụi leo, thường có tua, không có

nhánh Lá mọc so le, có lá kèm rất dễ rụng, cuống lá có khía rãnh, mép khía răng cưa Cây có nhiều hoa, mọc ở ngọn hoặc nách lá, chùm xim hoặc chùy, thường có tua ở phần dưới của trục hoặc gốc Đài hoa ngắn, gắn với bầu nhụy: lá đài 5, hình trứng hoặc tam giác, lõm ở phía trong, nứt với các khe dọc Cánh hoa 5, hình thìa Nhị 5, xếp ở lưng, được bao bọc bởi các cánh hoa Đĩa dày, hình ngũ giác hoặc 5 thùy, nhẵn hoặc có lông.Bầu hạ, nằm sâu trong đĩa, có 3 ô, mỗi ô có 1 noãn; phóng noãn theo kiểu nứt một nửa hoặc nứt sâu [40]

Quả nang hình cầu, khuyết ở hai đầu, có 3 cánh, có 3 ngăn tròn tách ra từ nách Khi trưởng thành, các ngăn không nứt hoặc nứt dọc theo gân trong có rãnh nứt hẹp Hạt 3, màu nâu đỏ, bóng, hình trứng ngược Nội nhũ mỏng [40]

1.1.2.2 Phân bố chi Gouania Trên thế giới: Theo Medan & Schirarend (2004), chi Gouania có khoảng 50 loài

phân bố ở khu cận nhiệt đới Weberbauer ước lượng chi Gouania có khoảng 66 loài ở các khu vực nhiệt đới trên thế giới [33] Theo Mabberley (2008), chi Gouania có 50-70 loài [38] Kết quả tổng hợp các tài liệu đã công bố về thực vật chi Gouania có

khoảng 67 loài trên thế giới

Ở Việt Nam: Chi Gouania có 2 loài: Gouania leptostachya DC (tên thường gọi:

Dây đòn gánh) và Gouania javanica Miq (tên thường gọi: Dây đòn kẻ cắp) [5], [8] Loài G javanica phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Trị, Kon Tum, Đắk Nông

(Đắk Mil, Đức Minh), An Giang (Châu Đốc) và loài G leptostachya phân bố ở các

tỉnh Lạng Sơn, Hòa Bình, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu [8]

1.1.3 Thành phần hóa học chi Gouania

Hiện nay, trên thế giới và trong nước chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần

hóa học của các loài thuộc chi Gouania Các kết quả đã công bố chủ yếu tập trung vào phần trên mặt đất của các loài: G leptostachya, G javanica và G longipetala,… Trong đó có loài G leptostachya đã được nghiên cứu ở Việt Nam [4]

Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của các loài này bao gồm các hợp chất thiên nhiên khác nhau như triterpenoid, flavonoid, saponin, glycosid, alcaloid, benzopyran Trong đó, hai nhóm hợp chất chính của các loài là flavonoid và saponin

số flavonol được phân lập từ chi Gouania, là các dẫn xuất của kaempferol và

quercetin được trình bày trong Bảng 1.1:

Bảng 1.1 Một số flavonol được phân lập từ chi Gouania

CTCT Tên flavonol Tên loài TLTK 1 Quercetin 3-O-β- Dxylopyranosyl-(1→2)-α-

L-rhamnopyranosid

2

Quercetin glucopyranosyl-(1→2)-α-L-

Kaempferol-3-O-(6-O-E-caffeoyl)-β-D-rhamnopyranosid

G leptostachya

[4]

9 Kaempferol-3-O-(1→6)-β-D-glucopyranosid

Hình 1.1 CTCT một số flavonol được phân lập từ chi Gouania

b) Khung flavan

Năm 2011, Chong Yao và cộng sự phân lập ra 2 flavan là epi-gallocatechin (15)

và gallocatechin (16) từ thân cây Gouania leptostachya DC [39]

Năm 2023, Nguyễn Thị Hằng cũng phân lập được catechin (17) từ phần trên mặt

đất của loài này [4]

Hình 1.2 CTCT một số flavan được phân lập từ chi Gouania

c) Khung biflavonoid và triflavonoid

Chong Yao và cộng sự (2011) phân lập được triflavonoid prodelphinidin C (18)

và biflavonoid prodelphinidin B3 (19) từ thân cây G leptostachya [39]

Hình 1.3 CTCT biflavonoid và triflavonoid được phân lập từ chi Gouania

1.1.3.2 Nhóm triterpenoid

Triterpenoid là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư,… Đây cũng là một trong

những nhóm chất chủ yếu của chi Gouania, tạo tiền đề cho nghiên cứu hoạt tính sinh

học của các loài thuộc chi này Các triterpenoid đã công bố được trình bày trong

Bảng 1.2.:

Bảng 1.2 Một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania

CTCT Tên triterpenoid Tên loài TLTK

Hình 1.4 CTCT một số triterpenoid được phân lập từ chi Gouania

1.1.3.3 Nhóm saponin

Saponin là các triterpen glycosid, có nhiều trong tự nhiên, có ở cả thực vật và một số động vật Saponin có hai nhóm chất chính là triterpenoid và steroid Các bài

báo đã công bố chủ yếu phân lập ra các saponin triterpenoid từ chi Gouania Cụ thể

được trình bày trong Bảng 1.2 sau:

Bảng 1.3 Một số saponin được phân lập từ chi Gouania

CTCT Tên saponin Tên loài TLTK

Hình 1.5 CTCT một số saponin được phân lập từ chi Gouania

Năm 2023, Nguyễn Thị Hằng đã phân lập từ phần trên mặt đất của cây Gouania

leptostachya DC được các chất: daucosterol, n-butyl-β-D-fructopyranosid [4]

Năm 2014, E Ekuadzia và cộng sự báo cáo glycerol monotricosanoate,

palmarumycin BG1 và De-O-methyllasiodiplodin từ Gouania longipetala Hemsl

triterpenoid, khung pyran có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa,… a) Chống viêm

Năm 2023, trong nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính cây G leptostachya, Nguyễn Thị Hằng sử dụng mô hình in vitro đánh giá ảnh hưởng của cao chiết và các

chất tinh khiết lên sự sản sinh PGE2, NO và các cytokin tiền viêm IL-1β, IL-6 và mức độ biểu hiện của COX-2 trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 được kích thích viêm bởi Lipopolysaccharid Kết quả cho thấy các cao chiết phân đoạn nồng độ

dụng ức chế sản sinh PGE2, giảm biểu hiện mARN và protein COX-2 phụ thuộc nồng độ, tỉ lệ ức chế ở nồng độ cao nhất lần lượt là là 64,5  3,3 %; 58,3  4,9 % và

47,5  4,4 % (p < 0,001); ở nồng đồ 10 µM làm giảm hoạt động COX-2 luciferase

55,4  3,5 % (p < 0,001) và giảm sản sinh IL-1β, IL-6 45,1  3,4 % và 39,8  3,6 %

(p < 0,001); ức chế sản sinh NO phụ thuộc nồng độ trong khoảng độ 2, 10, 50 µM Acid epigouanic nồng độ 10 µM làm giảm sản sinh PGE2, IL-1β, IL-6 lần lượt là 52,8  7,3 %, 61,5  3,2 % và 57,1  3,3 % (p < 0,001); làm giảm biểu hiện mARN, ức chế hoạt động COX-2 luciferase lần lượt là 54,4  2,1 % và 42,1  5,7 % (p < 0,001) Gouaniosid A nồng độ 10 µM ức chế sản sinh PGE2, làm giảm biểu hiện mARN và hoạt động COX-2 luciferase lần lượt là 52,3  6,0 %, 48,7  5,7 %, và 41,0  4,6 % (p < 0,001), ức chế sản sinh NO (nồng độ 5 và 25 µM) Acid

ceanothenic và lupeol chế sản sinh IL-1β, IL-6 (nồng độ 10 µM) Ngoài ra, lupeol

còn ức chế ức chế sản sinh NO (nồng độ 25 µM) Gouaniasid VII ức chế sản sinh

PGE2, IL-1β, IL-6 (nồng độ 10 µM) và NO (nồng độ 5, 25 µM) Gouaniasid VIII ức chế sản sinh NO ở nồng độ 5 và 25 µM Gouaniasid IX ức chế sản sinh NO (nồng độ 5, 25 µM) và IL-6 (nồng độ 10 µM) [4]

Năm 2012, trong nghiên cứu về tính chất kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy

hóa của G longipetala, Ekuadzi và cộng sự sử dụng phương pháp làm phù nề gà con

do carrageenan gây ra, kết quả khi so sánh với đối chứng, cao chiết ethanol 70% thân

G longipetala, diclofenac và dexamethason làm giảm đáng kể chứng phù chân Hiệu

quả phụ thuộc vào liều lượng của cao chiết, cho tác dụng ức chế phù nề toàn thân tối đa là 93,78% ở liều 300 mg/kg Cơ chế được cho là ức chế sự tổng hợp, giải phóng hoặc hoạt hóa các hoạt chất trung gian gây viêm: histamin, serotonin, kinin, prostaglandin và cyclooxygenase [19]

b) Kháng nấm

Năm 2008, Alma B Segismundo và cộng sự thử hoạt tính kháng nấm in vitro cao chiết MeOH của lá cây G javanica sử dụng phương pháp đĩa thạch Kirby – Bauer Cao chiết lá cho thấy hoạt tính kháng nấm mạnh đối với Aspergillus niger, hoạt tính kháng nấm vừa phải chống lại Candida albicans, và hoạt tính kháng nấm yếu với

Tricophyton mentagrophytes có đường kính vùng ức chế trung bình lần lượt là

21,16mm, 12,08 mm và 8,55 mm Kết quả trên cho thấy cao chiết xuất từ lá của loài

này có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do nấm Aspergillus niger và Candida albicans gây ra [31]

Năm 2012, Ekuadzi và cộng sự sử dụng phương pháp thử nghiệm hoạt tính

kháng nấm in vitro cho thấy cao chiết ethanol 70% của thân G longipetala có tác dụng chống lại Bacillus subtilis NCTC 10073 với MIC = 125 g/mL [19]

c) Chống oxy hóa Năm 2012, Ekuadzi nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cao chiết ethanol

70% từ loài G longipetala cho thấy khả năng chống oxy hóa tổng số tương đương

với acid ascorbic 0,80 mg/g, khả năng dọn gốc tự do tốt trên mô hình DPPH với giá trị IC50 là 0,004 mg/mL Kết quả thu được cho thấy tiềm năng của chất chiết xuất như tác nhân chống oxy hóa [19]

Năm 2015, Gossan cũng có kết luận cao chiết ether dầu mỏ, EtOAC và MeOH

của loài Gouania leptostachya có khả năng chống oxy hóa đáng kể [23] Các hợp chất được phân lập từ loài G longipetala có tác dụng chống oxy hóa

trung bình trên mô hình ức chế hoạt động của lipoxygenase với giá trị IC50 từ 52,5 ± 0,12 đến 69,5 ± 0,87 M, chứng dương là butylated hydroxyanisol (BHA) có IC50 = 44,2 ± 0,06 M [18]

d) Hạ đường huyết Năm 2011, Chong Yao và cộng sự đã nghiên cứu thành phần prodelphinidin C

trong thân cây G leptostachya thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể đối với

α-glucosidase Trong đó, prodelphindin C ở nồng độ 10 mol/L làm giảm đáng kể hoạt

tính của α-glucosidase với khả năng ức chế tỷ lệ 66,26% (IC50 = 5,52 ± 0,24 mol/L,

acarbose là đối chứng dương, trong khi acarbose có IC50 = 73,6 ± 4,1 mol/L, acarbose (95%) [39]

Năm 2015, theo Ezeja và cộng sự công bố cao chiết MeOH phần trên mặt đất của

G longipetala đã thể hiện tác dụng chống đái tháo đường, hạ lipid máu và chống oxy

hóa trên mô hình chuột bị gây đái tháo đường bởi alloxan monohydrat (160 mg/kg) Cao chiết với liều 3 thử nghiệm (50, 100 và 150 mg/kg/ngày/21 ngày) làm giảm mức đường huyết lúc đói của chuột xuống lần lượt là 62,0%, 74,8% và 75,0% Ngoài ra, cao chiết cũng cải thiện đặc tính lipid huyết thanh và phục hồi những thay đổi mô bệnh học bị tổn thương của tuyến tụy của chuột được điều trị Trong khi đó, LD50 của

cao chiết G longipetala > 4000 mg/kg [21]

1.1.4.2 Công dụng

1.2 Khái quát về loài Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica Miq.)

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Gouania javanica Miq

Cây bụi leo Cành, cuống lá, trục, cuống và đài hoa có nhiều lông màu nâu nhạt Lá mọc xen kẽ; cuống lá 0,8 – 1,7 cm, có lông dày hoặc thưa thớt; phiến lá hình trứng hoặc hình trứng rộng, 4 – 11 × 2 – 6 cm, dạng giấy, có lông tơ màu nâu ở phía dưới; có lông mọc dày đặc trên các gân chính, gân bên 5 – 7 cặp, phía dưới nổi rõ, phía gần trục phẳng, gân đáy có 3 – 6 gân thứ cấp bên ngoài, gốc hình tim hoặc tròn, mép nguyên hoặc có răng cưa tù, đỉnh nhọn hoặc nhọn ngắn Hoa nhiều, 5 chùm, đơn độc hoặc mọc thành xim có cuống ngắn, chùm xim ở nách lá hoặc ở ngọn, hoặc chùm xim hoa dài tới 30 cm Các lá đài hình tam giác, hình thoi ở gân giữa Cánh hoa hình trứng ngược Đĩa hình ngũ giác, bao quanh bầu nhụy, mỗi góc thuôn dài thành một phần phụ hình lưỡi liềm Kiểu dáng dài, 3 khía hoặc chẻ đôi [40]

Quả nang khi trưởng thành màu vàng, đường kính 8 – 10 mm có 3 cánh, hai đầu lõm, đỉnh có đài hoa dai dẳng, có 3 múi tròn, có cánh, nứt dọc theo nách Hạt 3, màu nâu đỏ, bóng, hình trứng, khoảng 3 × 2,5 mm, nổi lên ở mặt sau [40]

Thu hoạch: tháng 7 – 9 hoặc tháng 11 – 3 hàng năm Tên đồng nghĩa:

Clematoclethra racemosa H Léveillé Gouania obtusifolia Vent Ex Brongn Naegelia tomentosa Hassk

Gouania mauritiana sensu Blume [41]

Tên Việt Nam: Dây đòn kẻ cắp, Dây đòn gánh, Dây Gồ-an Java [8]

1.2.2 Phân bố

Loài Gouania javanica Miq thường phân bố ở rừng thưa, leo trên cây, ven sông,

nơi có độ cao thấp đến trung bình [7] Các quốc gia tập trung: Trung Quốc, Campuchia, Lào, Philippines, Thái Lan, Việt Nam [40]

Ở nước ta, loài G javanica Miq phân bố ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Trị, Kon

Tum, Đắk Nông (Đắk Mil, Đức Minh), An Giang (Châu Đốc) [8]

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu thân của loài Dây đòn kẻ cắp (Gouania javanica

Miq.) được thu hái tại xã Mã Đà, huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai Mẫu được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và ThS Đặng Minh Tú được lưu tại Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu [Phụ lục 1]

Mẫu nghiên cứu có hoa sau khi thu hái được làm tiêu bản khô với mã số tiêu bản 06.2023.HTV

Mẫu nghiên cứu được phơi khô, xay thô, bảo quản trong túi nilon ở nơi khô ráo để nghiên cứu về định tính thành phần hóa học và phân lập chất trong mẫu

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất

• Hóa chất dùng cho định tính thành phần hóa học đạt tiêu chuẩn phân tích gồm:

- Các dung môi: ethanol, n-hexan, ether dầu hỏa, ethyl acetat, cloroform, n-butanol,

aceton - Các thuốc thử dùng cho phản ứng định tính: Thuốc thử Bouchardat, thuốc thử Dragendroff, thuốc thử Mayer, dung dịch acid picric 1%, dung dịch FeCl3 5%, NaOH, bột Mg, dung dịch HCl, dung dịch H2SO4…

• Hóa chất dùng cho phân lập các chất đạt tiêu chuẩn phân tích gồm: n-hexan,

dicloromethan, ethyl acetat, ethanol, aceton, methanol,…

• Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 366 nm

• Silica gel pha thường (0,040 – 0,063 mm, Merck)

• Bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60G G254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và

• Các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm như: cột sắc ký, bình gạn, bình nón, bộ sinh hàn hồi lưu, bình cầu, bếp cách thủy, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…

2.1.2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

• Thời gian nghiên cứu: Tháng 8/2023 đến tháng 5/2024 • Địa điểm nghiên cứu: Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

• Định tính các nhóm chất chính trong thân loài Gouania javanica bằng các phản

ứng hóa học đặc trưng • Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn DCM của loài

Lọc qua giấy lọc và thực hiện các phản ứng định tính

b) Tiến hành

• Phản ứng với NH3: - Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô, quan sát thấy có vết màu vàng, hơ giấy lọc trên NH3

- Phản ứng dương tính khi màu vàng đậm hơn • Phản ứng với NaOH 10%:

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết và vài giọt NaOH 10% - Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt, có tủa nâu • Phản ứng với FeCl3:

- Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt FeCl3 5% - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh đen

• Phản ứng Diazo hóa:

- Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng NaOH 10% thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy

- Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam, có tủa màu đỏ cam

2.3.1.2 Đính tính alcaloid

a) Chuẩn bị

Lấy khoảng 2 g dược liệu G javanica cho vào bình dung tích 50 ml, thêm 15 ml

dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, để nguội Lọc, kiềm hóa NH3 đặc, sau đó chiết lỏng lỏng trên bình gạn với cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gạn lấy lớp dung môi hữu cơ, cách thủy tới khô Hòa tan cắn alcaloid base bằng 4 ml dung dịch H2SO4 1N

b) Tiến hành Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết • Phản ứng thuốc thử Mayer:

- Cho 3 giọt thuốc thử Mayer - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng • Phản ứng thuốc thử Dragendorff:

- Cho 3 giọt thuốc thử Dragendorff - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam • Phản ứng thuốc thử acid picric 1%:

- Cho 3 giọt dung dịch acid picric 1% - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu vàng

• Phản ứng với dd gelatin (1%): - Cho 2 ml dịch lọc + 5 giọt gelatin 1% - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông màu trắng

- Phản ứng dương tính khi xuất hiện nhiều tủa xanh đen • Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%:

- Cho 2 ml dịch lọc + 2 giọt dung dịch Pb(CH3COO)2 10% - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông màu trắng, mịn

2.3.1.5 Định tính glycosid tim

a) Chuẩn bị

Lấy 10 g bột dược liệu G javanica cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50

ml ethanol 25%, ngâm trong 24h Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Thử lại bằng cách nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat, không thấy xuất hiện tủa nữa Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng hỗn hợp cloroform:ethanol (4:1) 2 lần, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform, chia đều vào 4 ống nghiệm, bốc hơi cách thủy, thu cắn

b) Tiến hành • Phản ứng Liebermann: - Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 1 ml anhydric acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc

- Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá

• Phản ứng Baljet: - Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm 1 ml acid picric 1% và 9 ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều

- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha

- Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam • Phản ứng Keller – Kiliani:

- Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ từng giọt FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều, nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc

- Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ thấy lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

2.3.1.6 Định tính coumarin

a) Chuẩn bị Cân 2,0 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml ethanol 90%, khuấy đều Đun cách thủy sôi 3 phút, lọc nóng Bay dung môi, hòa tan cắn

bằng nước nóng, lọc vào bình gạn, để nguội Chiết lỏng lỏng trong bình gạn với cloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml Gạn lấy dịch cloroform, bốc hơi hết dung môi, hòa tan cắn bằng 5 ml ethanol để làm phản ứng định tính

b) Tiến hành • Phản ứng mở, đóng vòng lacton: - Ống nghiệm 1: 10 ml dịch chiết + 0,5 ml NaOH 10% - Ống nghiệm 2: 10 ml dịch chiết

- Đun 2 ống trong 2 phút, để nguội - Sau đó thêm 2 ống mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc

• Phản ứng Diazo: - Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết + 1 ml dd NaOH 10% lắc kỹ, nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo

- Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa đỏ gạch

b) Tiến hành • Định tính acid amin: - Cho 1 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Ninhydrin, đun 3 phút - Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa xanh tím

• Định tính acid hữu cơ: - Cho 1 ml dịch chiết + 1 vài tinh thể Na2CO3 - Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

2.3.1.9 Định tính chất béo

• Chuẩn bị: cân 2,0 g dược liệu + cloroform trong 2h, lấy dịch chiết lên mảnh giấy lọc, để khô quan sát

a) Chuẩn bị Lấy 10g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 40 ml ethanol Ngâm 24h, gạn lấy dịch chiết Loại tạp bằng chì acetat 30%, lọc bỏ tủa Dịch lọc chiết lỏng lỏng trong bình gạn với cloroform 2 lần, mỗi lần 10 ml Gạn lấy dịch cloroform đem làm phản ứng

b) Tiến hành: • Phản ứng Salkowski: - Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm, thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc - Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp có vòng màu đỏ thẫm • Phản ứng Liebermann:

- Cho 2 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm Cô cách thủy đến cắn, hòa tan cắn bằng 1 ml anhydric acetic, lắc đều Đặt nghiêng ống 45o rồi thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc

- Phản ứng dương tính khi thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp có vòng tím đỏ

2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân

lập được

2.3.2.1 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu được chiết bằng phương pháp chiết nóng với dung môi EtOH 70% Điều kiện chiết: nhiệt độ 70oC, tốc độ quay 20 vòng/ phút, máy cô quay 20 lít

Dịch chiết ethanol được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 70oC để thu được cao tổng

Cao tổng được phân tán với nước nóng, chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với

các dung môi có độ phân cực tăng dần: hexan, dicloromethan, ethyl acetat,

n-butanol Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm với nhiệt độ tương ứng, dịch chiết nước còn lại được cô cách thủy ở nhiệt độ 80oC, thu

được cao các phân đoạn tương ứng: cao hexan, dicloromethan, ethyl acetat,

n-butanol và cắn nước

2.3.2.2 Phương pháp phân lập chất

Trước khi tiến hành phân lập chất, khảo sát cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động phù hợp Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các chất Các bước tiến hành như sau:

Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh): Silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck)