đỗ thị bích điệp nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu một số loài thuộc chi elsholtzia willd ở việt nam

VẬT CỦA TINH DẦU MỘT SỐ LOÀI

THUỘC CHI ELSHOLTZIA WILLD Ở

VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ BÍCH ĐIỆP MÃ SINH VIÊN: 1901110

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA TINH DẦU MỘT SỐ LOÀI THUỘC

CHI ELSHOLTZIA WILLD Ở MIỀN BẮC

VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em, bạn bè và gia đình

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

thành tới PGS TS Đỗ Quyên, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo

và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này cũng như quá trình tham gia nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược liệu

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh

Tùng, người thầy đã hướng dẫn tôi phân tích thành phần hóa học tinh dầu, xử lý,

phân tích kết quả

Các anh chị kỹ thuật viên cùng các bạn sinh viên nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược liệu đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian tham gia nghiên cứu khoa học cũng như thực hiện khóa luận này

DS Phạm Thị Nga và HTX Dược liệu Y Tý đã giúp đỡ tôi thu mẫu

nghiên cứu tại xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã chỉ dạy, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm qua

Cảm ơn gia đình, bạn bè luôn là chỗ dựa và động viên tôi mỗi khi khó khăn trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Đỗ Thị Bích Điệp

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan chi Elsholtzia Willd 2

1.1.1 Vị trí phân loại họ Lamiaceae và chi Elsholtzia Willd 2

1.1.2 Đặc điểm chi Elsholtzia Willd – Kinh giới 3

1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu các loài Elsholtzia Willd 7

1.3 Tác dụng sinh học của thành phần tinh dầu chi Elsholtzia Willd 8

1.4 Sử dụng các cây thuộc chi Elsholtzia Willd theo kinh nghiệm dân gian 8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 10

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.1.2 Hóa chất, dung môi 11

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3.2 Thu tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước 12

2.3.3 Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ 12

2.3.4 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 13

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Kết quả thực nghiệm 15

3.1.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu 16

3.1.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu tinh dầu 23

3.2 Bàn luận 24

3.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu 24

3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

Kết luận 28

Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Ý nghĩa

MBC Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt

khuẩn tối thiểu) MFC Minimum Fungicidal Concentration (Nồng độ diệt nấm

tối thiểu) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế

tối thiểu) MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu

vàng khángmethicillin)

MSSA Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus (Tụ cầu

vàng nhạy cảm với methicillin)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Khái quát hệ thống phân loại họ Bạc hà ở Việt Nam……… 2

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam……… 5 Bảng 3.1 Thể tích và tính chất của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Wild ……….15 Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu loài E blanda phân tích bằng GC-MS………18 Bảng 3.3 Thành phần hóa học tinh dầu loài E ciliata phân tích bằng GC-MS……….19 Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu loài E communis phân tích bằng GC-MS… 19 Bảng 3.5 Thành phần hóa học tinh dầu loài E flava phân tích bằng GC-MS……… 20 Bảng 3.6 Thành phần hóa học tinh dầu loài fruticosa phân tích bằng GC-MS……….21 Bảng 3.7 Thành phần hóa học tinh dầu loài E penduliflora phân tích bằng GC-MS 22 Bảng 3.8 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 6 tinh dầu Elsholtzia Willd ….23 Bảng 3.9 Tóm tắt kết quả thành phần hóa học tinh dầu của 6 loài Elsholtzia Willd….24 Bảng 3.10 Tỷ lệ MBC/MIC của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Willd với các chủng vi khuẩn,

nấm ………27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Phân bố chi Elsholtzia Willd trên thế giới………4

Hình 2.1 Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm ……… 12 Hình 2.2 Bộ dụng cụcất tinh dầu ……… ………12

Hình 3.1 Sắc ký đồ của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Willd triển khai bằng GC-MS……17

Hình 3.2 Cấu trúc các thành phần chính của chemotype acylfurans……….26

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ Lamiaceae, còn gọi là họ Bạc hà, chủ yếu gồm các cây thân cỏ, cây thường

có tinh dầu thơm, có nhiều giá trị sử dụng khác nhau như hương liệu thực phẩm, trà thảo

dược, gia vị, đồ uống, mỹ phẩm và làm thuốc Chi Elsholtzia Willd (chi Kinh giới) là 1

chi trong tổng số 40 chi thuộc họ Bạc hà được ghi nhận tại Việt Nam [10] Danh lục các

loài thực vật Việt Nam đã ghi nhận chi Elsholtzia Willd gồm có 7 loài [2] Trong những

năm gần đây có 3 loài mới thuộc chi này được ghi nhận có ở Việt Nam, gồm: loài

Elsholtzia kachinensis Prain ở Cao Bằng (năm 2020) [29], năm 2022 tiếp tục công bố 2

loài Elsholtzia flava Benth và Elsholtzia fruticosa (D.Don) Rehder ở Lào Cai [9]

Theo khảo sát của chúng tôi, người Mông ở Sapa, Bát Xát (Lào Cai) sử dụng loài Kinh giới núi, Chùa dù, Ngùng lải làm thuốc tắm chữa bệnh ngoài da, dị ứng Người Dao Chàm ở Hà Giang dùng Chùa dù chữa cảm sốt, thuốc tắm chữa đau nhức xương khớp,… Bên cạnh đó, người dân còn lợi dụng mùi thơm của cây thuộc họ Bạc hà nói chung, cũng như chi Kinh giới nói riêng trong việc thu hút ong, xua đuổi côn trùng có hại cho cây và ứng dụng trong ngành nuôi ong lấy mật, cho ra sản phẩm mật ong bạc hà, trở thành nét đặc trưng trong hệ sinh thái thực vật tại vùng núi phía Bắc Việt Nam Có thể nói một trong những thành phần hóa học chính của các cây thuộc chi Kinh giới có hoạt tính sinh học, được khai thác để sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian là thành phần tinh dầu [10], [36]

Để đóng góp vào việc nghiên cứu các loài thuộc chi Elsholtzia ở Việt Nam, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần tinh hóa học và tác dụng kháng khuẩn của

tinh dầu một số loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở miền Bắc Việt Nam” với các mục tiêu:

- Nghiên cứu được thành phần tinh dầu của một số loài thuộc chi Elsholtzia

Wild mọc hoang ở miền Bắc Việt Nam bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS)

- Thử tác dụng kháng khuẩn của các mẫu tinh dầu thu được từ một số loài thuộc

chi Elsholtzia Wild mọc hoang ở miền Bắc Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan chi Elsholtzia Willd

1.1.1 Vị trí phân loại họ Lamiaceae và chi Elsholtzia Willd [10]

Linnaeus (1753) là người đầu tiên đặt tên cho họ Bạc Hà, gồm 33 chi, 223 loài và xếp chúng vào 2 phân lớp: 2 nhị (Diandria) và 4 nhị với 2 nhị dài và 2 nhị ngắn (Didynamia) Sau Linnaeus, các tác giả khác như H Adanson (1763), C.Moench (1794) đã công bố thêm các taxon và sắp xếp chúng vẫn theo kiểu của Linnaeus Mãi tới A Jussieu (1789) họ Bạc Hà mới chính thức được coi là một taxon riêng dưới tên gọi là

Labiatae Juss (họ Hoa môi) Về sau J Lindley (1836) đặt tên khác cho họ này là

Lamiaceae Lindl (lấy từ tên chi Lamium) Theo luật Danh pháp hiện hành, họ này có thể dùng cả 2 tên Labiatae (họ Hoa môi) và Lamiaceae (họ Bạc Hà)

Sau đó, có hàng loạt các hệ thống mới ra đời, có thể tóm tắt thành 2 kiểu chính dưới đây:

Kiểu 1: Phân chia họ trực tiếp thành các tông (tribus) Tiêu biểu là các hệ thống của Bentham (1829, 1832-1836), Endlicher (1836-1840), Bentham (1848, 1876) và Baillon (1892-1894)

Kiểu 2: Phân chia họ thành các phân họ (subfamilia) với các tông (tribus) và các phân tông (subtribus) Hệ thống đầu tiên của kiểu phân loại này là hệ thống Briquet (1897) Sau Briquet là Hệ thống của H Melchior (1964), được coi là hoàn chỉnh hơn hệ thống của Briquet cả về vị trí sắp xếp cũng như việc nâng bậc các taxon Sau Melchior còn có một số hệ thống đáng chú ý khác như Hệ thống của Wunderlich (1967), Efimova (1976) và Takhtajan (1980) Các hệ thống này về cơ bản vẫn dựa trên hệ thống của Briquet (1897) và Melchior (1964) trong đó cũng có những thay đổi trong việc nhập hay tách các taxon

Nghiên cứu họ Bạc Hà ở Đông Dương, Doãn Khắc Minh (1936) dựa vào hệ thống Bentham (1876) để sắp xếp các taxon Họ Bạc hà ở Việt Nam hiện nay được sắp xếp theo hệ thống phân loại của Melchior (1964)

Bảng 1.1 Khái quát hệ thống phân loại họ Bạc hà ở Việt Nam Phân họ

(Subfamilia)

Tông (Tribus)

Phân tông (Subtribus)

Chi (Genus)

Ocimoideae -Hyptideae

-Plectrantheae -Ocimeaea

11 chi

Lamioideae -Salvieae

-Nepeteae -Lamieae → -Saturejneae → -Pogostemoneae

-Prynellinae/-Lamiinae -Melissinae/Menthinae/Perillinae

24 chi

Họ Bạc hà (Lamiaceae) gồm có 5 phân họ với 11 tông và 14 phân tông Tại Việt Nam họ này gồm 40 chi, 143 loài và 12 taxon dưới loài Chi Elsholtzia Willd là chi thứ

38, được xếp vào phân họ Lamioideae, tông Pogostemeneae

1.1.2 Đặc điểm chi Elsholtzia Willd – Kinh giới

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Elsholtzia Willd – Kinh giới

Cây cỏ hay cây bụi nhỏ Thân thường vuông, nhẵn hay có lông Lá nguyên hay xẻ răng cưa, nhẵn hay có lông Cụm hoa dạng chùm hay dạng bông ở đỉnh cành, gồm các xim co tạo thành vòng giả, giãn cách hay không giãn cách, hoa tạt về một phía hay thành vòng Lá bắc tồn tại hình nét hoặc hình trứng Đài hình chuông hay hình ống, 5 thùy gần đều nhau Tràng có ống thẳng hoặc cong hơi thò khỏi đài, 2 môi: môi trên 2 thùy, môi dưới 3 thùy Nhị 4, hướng về 2 phía hay hướng thẳng; chỉ nhị thò dài hay ngắn khỏi tràng; 2 nhị dưới dài hơn hai nhị trên Bao phấn 2 ô, lúc đầu giãn ra sau chụm lại Bầu nhẵn hay có lông; vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa phát triển mạnh ở phần phía sau của bầu Quả hình bầu dục hay hình thuôn, nhẵn hay có lông, có nốt sần [10]

1.1.2.2 Phân bố các loài thuộc chi Elsholtzia Willd trên thế giới

Trên thế giới đến nay có 43 loài đã được xác định và 7 loài chưa được xác định

thuộc chi Elsholtzia Willd.[40] Sự đa dạng các loài thuộc chi Kinh giới chủ yếu tập

trung ở châu Á và châu Âu (hình 1.1) Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc là khu vực phân bố rộng rãi và phong phú nhất của chi này, với 26 loài và 11 thứ được phát hiện, riêng

loài E communis được trồng có quy mô lớn tại tỉnh Vân Nam [36] Loài E ciliata có

vùng phân bố tương đối rộng (từ Nam Á đến Đông Á, du nhập vào châu Âu, Bắc Mỹ) Một số loài khác phân bố hẹp hơn, chỉ gặp ở một số quốc gia Nam Á và Đông Nam Á,

Trung Quốc hoặc ở dãy Himalaya [36], [39]

Hình 1.1 Phân bố chi Elsholtzia Willd trên thế giới [40]

1.1.2.3 Đặc điểm chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã xây dựng được khóa phân loại 7 loài thuộc chi Elsholtzia Willd

Khóa phân loại 7 loài thuộc chi Elsholtzia Willd [10] [11]

1A Cụm hoa gồm các hoa tạt về một phía

2A Lá bắc lớn, hình trứng rộng hay gần tròn (cỡ 4-5 x 3-4 mm)… 1.E ciliata

2B Lá bắc nhỏ, hình mác hẹp hay hình đường 3A Hoa màu trắng Lá bắc hình mác hẹp (cỡ 1,5-2mm), ngắn hơn

cụm hoa thường không mọc đối……….6 E communis

6B Lá bắc hình mác ngược, hẹp (dài 2,5-3 mm), thường dài hơn hoa Các

bông trong cụm hoa mọc đối nhau………7 E winitiana

Từ năm 2005 cho đến nay liên tục có các nghiên cứu bổ sung các loài mới thuộc

chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam: năm 2020 ghi nhận lần đầu tiên sự có mặt của loài E

kachinensis Prain ở tỉnh Cao Bằng [29] Năm 2022 tiếp tục công bố 2 loài Elsholtzia flava Benth.và E fruticosa (D.Don) Rehder ở tỉnh Lào Cai [9]

Thông tin các loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam được trình bày ở

bảng 1.2

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam

TT Tên khoa học Tên thường

gọi Đặc điểm, phân bố TKTL

1

Elsholtzia blanda

(Benth.) Benth

Kinh giới rừng, Ngùng

lải

Cây mọc tự nhiên ở các vùng núi phía Bắc, Tây Nguyên hoặc vùng Duyên hải Nam Trung Bộ

[5], [8], [10]

2

Elsholtzia ciliata

(Thunb.) Hyland

Kinh giới trồng, Kinh giới rìa, Kinh giới núi

Cây mọc tự nhiên ở các vùng núi phía Bắc hoặc được trồng khắp cả nước làm rau ăn

[5], [8], [10], [12]

Cây mọc tự nhiên ở các vùng núi phía Bắc: Lào Cai, Hà Giang

[5], [8], [10]

8

Elsholtzia pilosa

(Benth.) Benth

Kinh giới lông

Cây mọc tự nhiên ở Lào Cai [5], [8],

[10]

9

Elsholtzia rugulosa

Hemsl

Kinh giới sần, Kinh giới nhám, Kinh giới nhăn

Cây mọc tự nhiên ở Hà Giang, Lào Cai

Kinh giới dày Cây mọc tự nhiên ở vùng Tây

Nguyên: Kon Tum Gia Lai, Lâm Đồng

[5], [8], [10]

Elsholtzia winitiana

var Dongvanensis Phuong

Kinh giới Đồng Văn

Cây mọc tự nhiên, chỉ có ở vùng

Đồng Văn (Hà Giang)

[5], [8],

[10]

1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu các loài Elsholtzia Willd

Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Elsholtzia Willd cho thấy thành phần

hóa học chính gồm: tinh dầu, flavonoids, terpenoids và các thành phần khác Trong khuôn khổ của khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi trình bày tổng quan về thành phần tinh dầu của các loài thuộc chi Kinh giới đã được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

Cho đến hiện nay có nhiều công bố về thành phần hóa học của tinh dầu các loài

thuộc chi Elsholtzia Willd tập trung chủ yếu ở các nước châu Á và châu Âu [36]

1.2.1 Elsholtzia blanda (Benth.) Benth (Ngùng lải)

Thành phần tinh dầu loài E blanda đã được báo cáo trong 4 nghiên cứu tại Việt

Nam và 3 nghiên cứu trên thế giới tại một số nước Nam Á (Ấn Độ, Nepal) Thành phần chính được công bố chủ yếu là các monoterpenoid như: 1,8-cineol, linalool, geranyl acetat ở Việt Nam và Ấn Độ hoặc dihydrotagetone ở Nepal [24], [28], [34] Ngoài ra, ở Việt Nam còn ghi nhận tinh dầu loài này có thể chứa chủ yếu là các hợp chất sesquiterpen (tới 99%) với mẫu mọc hoang tại Sa Pa (Lào Cai) [34]

1.2.2 Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland (Kinh giới núi, Kinh giới trồng)

Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland là loài chủ yếu được trồng ở các nước châu Á

làm rau gia vị, ở châu Âu thường là cây mọc hoang Hiện nay có khoảng 20 nghiên cứu

trên thế giới và 7 nghiên cứu tại Việt Nam về thành phần tinh dầu Elsholtzia ciliata

(Thunb.) Hyland Thành phần hóa học chủ yếu là các hợp chất thuộc nhóm

monoterpenoid Tổng hợp các nghiên cứu về thành phần tinh dầu loài E ciliata cho thấy

loài này có 3 chemotype: citral, limonen và acylfurans [27], [37] Các nghiên cứu loài này

ở Việt Nam cho thấy tinh dầu Kinh giới có thành phần chính là β-citral và α-citral [1],

[6], [7], [20], [21], [35] Trong khi đó, thành phần chính thu nhận nghiên cứu loài này mọc hoang ở Lithunia là các acylfuran (dehydroelsholtzia ketone và elsholtzia ketone) [27]

1.2.3 Elsholtzia communis (Collett & Hemsl.) Diels (Kinh giới bông)

Chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần tinh dầu của loài E communis Các

nghiên cứu đều chỉ ra các monoterpenoid là thành phần chính Theo nghiên cứu của

Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự, loài E communis thu hái tại Sa Pa có thành phần chính

là elsholtziaketon chiếm tới 82,3 % [34] Trong khi đó, các mẫu tại Ấn Độ và Thái Lan cho kết quả thành phần tinh dầu khá đồng nhất với thành phần chính trong tinh dầu là

α-citral (24,10%-45,43%) và β-citral (28,85%-35,53%) [23], [25], [30]

1.2.4 Elsholtzia flava Benth (Kinh giới hoa vàng)

Loài E flava là một loài thuộc chi Kinh giới mới được ghi nhận có mặt tại Việt

Nam vào năm 2022 Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào về thành phần tinh dầu của loài này ở Việt Nam Trên thế giới chỉ có 2 công bố nghiên cứu về loài này thu tại dãy Himalaya cho thành phần chính là các monoterpenoid có nhóm acylfuran (rose furan và estragol) hoặc pipertenone [14], [22]

1.2.5 Elsholtzia fruticosa (D.Don) Rehder (Kê cốt sài)

Loài E fruticosa cũng là loài mới được phát hiện tại Lào Cai, Việt Nam cùng với loài E flava cho nên chưa có nghiên cứu về thành phần tinh dầu của loài này ở nước ta

Trên thế giới có 3 công bố nghiên cứu loài này tại Trung Quốc, Nepal và Italy, kết quả

cho thấy tinh dầu loài E fruticosa có thành phần chính là 1,8-cineol (23,7%- 50,1%)

[15], [19], [26]

1.2.6 Elsholtzia penduliflora W.W Smith (Chùa dù)

Loài Elsholtzia penduliflora hiện nay có khá ít nghiên cứu về thành phần tinh dầu,

là loài cây quý có tên trong sách đỏ Việt Nam (Sách đỏ Việt Nam, tập 2) Hiện chỉ có 2 nghiên cứu tại Việt Nam và 1 nghiên cứu tại Trung Quốc về loài này, kết quả công bố khá thống nhất với thành phần chính trong tinh dầu là 1,8-cineol chiếm tỷ lệ khá lớn (60,0% - 71,7%) [6], [33]

1.3 Tác dụng sinh học của thành phần tinh dầu chi Elsholtzia Willd

Tác dụng kháng khuẩn được xem là tác dụng sinh học chính của tinh dầu các loài

thuộc chi Elsholtzia Willd.[36]

Tại Việt Nam hiện nay chỉ có các nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của 2 loài

E ciliata và E blanda, trên thế giới có thêm nghiên cứu của một số loài khác như E communis và E stachyodes [19], [36] Các nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của

một số loài E ciliata, E blanda, E communis cho thấy tinh dầu các loài này có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Bacillus subtilis,

S.aureus) tốt hơn trên các chủng vi khuẩn Gram âm (Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Escherichia coli, Shigella flexneri), ngoài ra một số loài còn

có tác dụng kháng nấm Candida albicans [1], [7], [21], [31], [35]

Một số loài như E flava hoăc E penduliflora được sử dụng trong y học dân gian

chưa ghi nhận nghiên cứu về tác dụng sinh học của tinh dầu

1.4 Sử dụng các cây thuộc chi Elsholtzia Willd theo kinh nghiệm dân gian

Ở Việt Nam, nhiều loài trong chi Elsholtzia Willd được sử dụng theo kinh nghiệm

dân gian, trong số đó loài E ciliata là loài được ghi nhận sớm nhất trong chi này dùng

để làm thuốc [36] Chuyên luận Kinh giới của Dược điển Việt Nam V là đoạn ngọn cành

mang lá, hoa của cây Kinh giới (Elsholtzia ciliata) có vị cay, tính ấm, được sử dụng để

điều trị cảm mạo, phong hàn, mụn nhọt, dị ứng, sởi hoặc băng huyết, thổ huyết, đại tiện

ra máu Loài E blanda mọc hoang vùng Sìn Hồ — Lai Châu, được người Mông và người

Dao dùng toàn cây tươi giã nát đắp vào ngực rồi day xoa để chữa ho và sốt ở trẻ em Rễ của loài này còn được dùng để chữa sốt rét dưới dạng thuốc sắc [11]

Loài E penduliflora cũng là một thảo dược phổ biến ở Việt Nam, theo kinh nghiệm

của dân tộc Dao, thường thu hái những cây mọc hoang, ép lấy dầu để chữa cảm cúm (đốt và châm vào lưng) [12]

Trên thế giới, việc sử dụng các loài thuộc chi Elsholtzia Willd để làm thuốc không

chỉ dừng lại theo kinh nghiệm dân gian mà một số loài đã được nghiên cứu phát triển

thành các chế phẩm dược phẩm dùng trong điều trị bệnh như: loài E ciliata được sử dụng trong bài thuốc “Xin-Jia-Xiang-Ru-Yin” điều trị rối loạn tiêu hóa, loài E

penduliflora là thành phần chính của sản phẩm “Huangshi Cold Tablet” điều trị nhiễm

trùng đường hô hấp trên tại Trung Quốc [36]

Ngoài ra, hầu hết các loài trong chi Elsholtzia đều có thành phần tinh dầu nên được

sử dụng trong hương liệu thực phẩm, trà thảo dược, gia vị, đồ uống và mỹ phẩm [16], [36] Đặc biệt, vì thành phần tinh dầu rất phong phú và đa dạng có mùi thơm nên hoa

của một số loài Kinh giới như E ciliata, E rugulosa,… được người dân sử dụng trong

nuôi ong lấy mật [5], [12], [16], [32]

Sự đa dạng các loài thuộc chi Elsholtzia Willd góp phần tạo nên sự đa dạng về

thành phần hóa học, tác dụng sinh học và công dụng Đề tài nghiên cứu thành phần

tinh dầu một số loài Elsholtzia Willd mọc hoang tại Việt Nam góp phần cung cấp

dữ liệu về sự đa dạng thành phần tinh dầu và tác dụng kháng khuẩn của chi này ở Việt Nam

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

- Elsholtzia blanda (Tên địa phương: Ngùng lải) (ký hiệu EB): là đoạn ngọn cành mang

lá, hoa Elsholtzia blanda (Benth.) Benth được thu hái mọc hoang ở xã Y Tý, huyện Bát

Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 11 năm 2023 Tên địa phương: Ngùng lải Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18669/22

- Elsholtzia ciliata (Tên địa phương: Kinh giới núi) (ký hiệu ECI): là đoạn ngọn cành

mang lá, hoa Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl được thu hái mọc hoang ở xã Y Tý, huyện

Bát Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 11 năm 2023 Tên địa phương: Kinh giới núi Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18672/22

- Elsholtzia communis (Tên địa phương: Kinh giới bông) (ký hiệu ECO): là đoạn ngọn

cành mang lá, hoa Elsholtzia communis (Collett & Hemsl.) Diels được thu hái mọc hoang ở Xã Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 11 năm 2021 Tên địa phương: Kinh giới bông Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18674/22

- Elsholtzia flava (Tên địa phương: Kinh giới hoa vàng) (ký hiệu EFL): là đoạn ngọn

cành mang lá, hoa Elsholtzia flava Benth được thu hái mọc hoang ở xã Y Tý, huyện

Bát Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 11 năm 2023 Tên địa phương: Kinh giới hoa vàng Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18675/22

- Elsholtzia fruticosa (Tên địa phương: Kê cốt sài) (ký hiệu EFR): là đoạn ngọn cành

mang lá, hoa Elsholtzia fruticosa (D.Don) Rehder được thu hái mọc hoang ở xã Y Tý,

huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 11 năm 2023 Tên địa phương: Kê cốt sài Mẫu tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18676/22

- Elsholtzia penduliflora (Tên địa phương: Chùa dù) (ký hiệu EP): là đoạn ngọn cành

mang lá, hoa Elsholtzia penduliflora W W Smith được thu hái mọc hoang ở xã Y Tý,

huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 11 năm 2023 Tên địa phương: Chùa dù Mẫu

tiêu bản đã được giám định tên khoa học bởi TS Hoành Quỳnh Hoa, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mã số HNIP/18677/22 Nguyên liệu nghiên cứu được được sấy ở nhiệt độ 40°C - 50°C đến hàm ẩm khoảng ≤ 12%, cắt thành đoạn 1-2 cm, bảo quản trong túi PE kín, để nơi khô ráo

2.1.2 Hóa chất, dung môi

- Dung môi: n-hexan - Hóa chất: dãy đồng đẳng alkan C8-C20 - Chủng vi sinh vật kiểm định

+ Vi khuẩn Gram (-) Escherichia coli ATCC 25922 + Vi khuẩn Gram (+) Staphyloccocus aureus ATCC 33591 (MRSA), Staphyloccocus

aureus ATCC 25923 (MSSA)

+ Nấm men Candida albicans ATCC 10231

- Môi trường nuôi cấy: + Canh thang Mueller-Hinton Both (MHB, từ Sigma-Aldrich) cho vi khuẩn + Canh thang Sabouraud dextrose (SD, từ Merck) cho nấm men

Tất cả các hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn phân tích, kiểm nghiệm

Các thiết bị sử dụng tại Bộ môn Dược liệu- trường Đại học Dược Hà Nội.- Hệ thống sắc ký khí GC In tuvo 9000 kết nối với khối phổ MSD 5977B, Agilent Technologies, Mỹ, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu mẫu nguyên liệu, xử lý mẫu, cất tinh dầu của 6 loài thuộc chi Elsholtzia Willd để

nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

- Phân tích thành phần hóa học của 6 mẫu tinh dầu thu được bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC – MS)

- Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của 6 mẫu tinh dầu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu nghiên cứu

Với nguyên liệu nghiên cứu chứa tinh dầu, độ ẩm được xác định theo phụ lục 12.13 Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi của DĐVN V [4]

2.3.2 Thu tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước

Tinh dầu được thu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng bộ dụng cụcất tinh dầu theo DĐVN V [4] Nguyên liệu nghiên cứu được cho vào bình cầu (V = 1L), thêm nước tới 2/3 thể tích bình cầu Lắp dụng cụ hứng tinh dầu d <1 và sinh hàn Đun sôi trực tiếp trên nguồn nhiệt, trong 3 giờ Để nguội, tách riêng phần tinh dầu Tinh dầu được làm khô bằng natri sulfat khan, bảo quản trong lọ kín, tránh ánh sáng và giữ trong tủ mát (khoảng 5 °C) chờ phân tích và thử tác dụng sinh học

Hình 2.1 Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm Hình 2.2 Bộ dụng cụcất tinh dầu

2.3.3 Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ

Cấu tạo sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) bao gồm thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Sau khi phân tách mẫu tinh dầu bằng sắc ký khí, detector khối phổ sẽ giúp xác định các cấu tử trong tinh dầu bằng cách so sánh phổ khối của chất cần phân tích với thư viện phổ Đây là phương pháp được ứng dụng phổ biến hiện nay để định tính hay định lượng các thành phần trong tinh dầu

Hệ thống máy sắc ký GC-MS gồm các bộ phận: hệ thống GC In tuvo 9000 kết nối với khối phổ MS 5977B (Agilent, Hoa Kỳ), sử dụng cột DB-5MS không phân cực (30 m x 0.25 mm x 0.25 mm) Chương trình nhiệt độ được cài đặt như sau: Nhiệt độ giữ ở 50 oC trong 3 phút đầu, sau đó tăng từ 50oC – 280oC với tốc độ 8oC/ phút, nhiệt độ inlet

là 250oC Helium (1 ml/phút) được sử dụng làm khí mang Phương pháp ion hóa là Electron Ionization (EI) với năng lượng ion hóa là 70 eV, phạm vi quét từ 45-450 amu Dùng dung môi n-hexan để pha loãng tinh dầu, thể tích tiêm mẫu 1 μl, chế độ chia dòng 300:1

Các chỉ số lưu giữ (RI) được xác định bằng cách sử dụng dãy đồng đẳng n-ankan

(C8 – C20) được phân tích trong cùng điều kiện sắc ký Việc xác định thành phần tinh dầu dựa trên việc so sánh độ trùng lặp về phổ khối của các chất có sẵn trong thư viện Thêm vào đó, giá trị RI được so sánh với các dữ liệu trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố (W09N08), WebBook Chemistry NIST [38] và cơ sở dữ liệu Adams (Adams 2017) [13]

Chỉ số RI được tính như sau:

RI = 100 𝑥 n + RT(x) − RT(n)

RT(n + 1) − RT(n) 𝑥 100

Trong đó: RTx: Thời gian lưu của chất phân tích;

RTn: Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;

RTn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tích;

n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích

2.3.4 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) được xác định theo phương pháp vi pha

loãng trên đĩa 96 giếng theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ [17], [18]

Tất cả các giếng của đĩa được cho 100 µl môi trường nuôi cấy, trừ chứng âm được cho 200 µl Tinh dầu mẫu nghiên cứu được hòa tan trong nước có bổ sung 4 % Tween 80, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc phù hợp với MHB hoặc SD Thêm 100 µl vào giếng 1 Các mẫu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, bằng cách hút 100 µl từ các giếng ở cột 1, pha loãng vào giếng ở cột tiếp theo, lần lượt xuống đến các giếng ở cột 8, loại bỏ 100 µl ở dưới 8, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân bậc 2 Nồng độ tinh dầu được tính theo phần trăm tinh dầu trong nước với nồng độ ban đầu là 1, giá trị MIC được biểu diễn dưới dạng 1/ độ pha loãng hoặc % Các giếng cột 10 chứng dương, là giếng chỉ có môi trường và vi sinh vật, vi sinh vật phải mọc bình thường Cột 11 chứng âm: giếng chỉ chứa môi trường, đánh giá môi trường vô khuẩn, giếng phải trong sau thời gian ủ

Hỗn dịch vi sinh vật có độ đục tương đương 0,5 McFarland được chuẩn bị trong

PBS, với các khuẩn lạc trên đĩa thạch TSA cho vi khuẩn hoặc SDA cho C albicans được

ủ 37°C, qua đêm Hỗn dịch này được pha loãng 100 lần trong MHB hoặc SD để thu được hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x106 vi khuẩn/ml và 1,5x104 vi nấm/ml Hỗn dịch làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 11, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37℃ trong 20 giờ cho vi khuẩn và 30℃ trong 20 giờ cho vi nấm MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật Thử nghiệm được thực hiện 2 lần độc lập

- Xác định nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) hay nồng độ tối thiểu diệt nấm

(MFC) dựa trên đĩa xác định MIC, tất cả các giếng không mọc được cấy lên đĩa thạch TSA cho vi khuẩn và SDA cho vi nấm để xác định MBC/MFC Mẫu được ủ ở 35 °C trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc xuất hiện Nồng độ MBC/MFC là nồng độ thấp nhất có khả năng diệt lớn hơn 99 % số vi khuẩn/vi nấm so với thời điểm ban đầu

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm gồm có 2 kết quả chính:

- Thành phần hóa học của 6 mẫu tinh dầu thu được từ 6 loài thuộc chi Elsholtzia

Wild., phân tích bằng GC-MS - Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn trên 3 dòng vi khuẩn:Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 33591, Escherichia coli ATCC 25922 và kháng nấm trên dòng Candida albicans ATCC 10231 của 6 mẫu tinh dầu bằng phương

pháp pha loãng trong môi trường lỏng

6 mẫu tinh dầu của 6 loài Elsholtzia Wild mọc hoang ở một số tỉnh phía bắc Việt

Nam, thu được bằng phương pháp cất kéo hơi nước (tiến hành cất tinh dầu theo mục

2.3.1) Trong số 6 loài của chi Elsholtzia Wild., loài E flava có khối lượng mẫu thu

được ít nhất (1 kg nguyên liệu tươi) do loài này phân bố rải rác, không tập trung Thể tích và tính chất của 6 mẫu tinh dầu thu được bằng phương pháp cất kéo hơi nước được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Thể tích và tính chất của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Wild

TT Loài NL

tươi (kg)

NL khô (kg, h%)

V tinh dầu (ml)

Tính chất

1 E blanda

1,3 (9,90%) 13,70

d<1, màu vàng sáng, mùi thơm, mát, hơi nồng

2 E ciliata

0,80 (11,4%) 7,25

d<1, màu vàng sáng, mùi thơm, mát, nồng

3 E communis

1,2 (12,1%) 20,0

d<1, màu vàng cam, mùi thơm, mát, hơi nồng

4 E flava

0,20 (15,0%) 0,35

d<1, màu vàng sáng, mùi thơm, mát, hơi nồng

5 E fruticosa

0,80 (11,5%) 1,95

d<1, màu vàng sáng, mùi thơm, mát, hơi nồng

6 E penduliflora

1,1 (11,3%) 8,90

d<1, màu vàng, mùi thơm, mát, hơi nồng

Ghi chú: NL: Nguyên liệu (tính theo kg), V: Thể tích (tính theo ml), h%: Hàm ẩm

(tính theo %)

Nhận xét: Tất cả 6 mẫu tinh dầu đều có tỷ trọng d<1, màu vàng sáng hoặc vàng

cam, mùi thơm đặc trưng, mát nhưng hơi nồng Thể tích tinh dầu thu được bằng phương

pháp cất kéo hơi nước cho thấy hàm lượng tinh dầu từ loài E communis cao nhất, đạt gần 2% (1,9%); tiếp theo là 3 loài E blanda (1,2%); E ciliata (1,0%) và E penduliflora (0,9%) có hàm lượng xấp xỉ 1% Hai loài mới phát hiện ở Việt Nam là E fruticosa (0,3%) và E flava (0,2%) có hàm lượng tinh dầu thấp nhất

3.1.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu

Để phân tích thành phần hóa học của tinh dầu, 6 mẫu tinh dầu và dãy đồng đẳng alkan (C8-C20) được lấy chính xác 15µl, pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỷ lệ 1/1000 (v/v)

Khởi động hệ thống GC-MS, thời gian để hệ thống ổn định trước khi tiến hành triển khai sắc ký khoảng 24 giờ Cài đặt các thông số của chương trình sắc ký theo mục 2.3.1 Các mẫu tinh dầu và dãy đồng đằng alkan được phân tích cùng lúc, thứ tự chạy các mẫu cài đặt trên hệ thống tương ứng với vị trí của mẫu trên khay đựng mẫu

Sắc kí đồ của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Willd được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ của tinh dầu 6 loài Elsholtzia Willd triển khai bằng GC-MS

Nhận xét: Hầu hết các hợp chất được rửa giải trong 25 phút đầu, thời gian triển

khai mỗi mẫu tinh dầu 50 phút có thể đảm bảo phát hiện đầy đủ các hợp chất trong mẫu nghiên cứu

3.1.1.1 Thành phần hóa học của tinh dầu loài Elsholtzia blanda (Benth.) Benth

(Ngùng lải)

Giá trị lưu giữ (RIa) của các thành phần được tính dựa trên thời gian lưu của nó trên cột sắc ký và thời gian lưu của dãy đồng đẳng alkans (C8-C20) theo công thức trong mục 2.3.1

Các hợp chất được xác định bằng cách so sánh giá trị RIa và khối phổ của hợp chất đó với giá trị RIb và khối phổ trong dữ liệu trên phần mềm NIST 14, trên cơ sở dữ liệu NIST Chemistry WebBook [38] và tài liệu của Adams [13], với sai lệch của RIa và RIb là ±10, phần trăm trùng khớp của khối phổ càng lớn càng tốt

Phần trăm các thành phần được tính toán dựa trên diện tích peak sắc ký trên tổng diện tích các peak (% Area)

Thành phần hóa học của tinh dầu loài E blanda phân tích bằng GC-MS được

trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu loài E blanda phân tích bằng GC-MS

TT Thời gian lưu

16 13,1 dihydro caverol 1196 1193 0,54 Monoterpenoid

17 14,7 sabinen hydrat acetat 1253 1256 0,85 Monoterpenoid

18 15,6 bornyl acetat 1285 1285 0,85 Monoterpenoid

19 18,0 linalool isobutanoat 1378 1380 7,81 Monoterpenoid

20 19,1 β-caryophyllen 1421 1419 1,06 Sesquiterpen

Nhận xét: Kết quả phân tích tinh dầu loài E blanda có 20 cấu tử, chiếm 100% Các

monoterpenoid có hàm lượng cao là 1,8- cineol (29,0 %), camphor (17,0 %), linalool

(11,8%) Các monoterpen với tỷ lệ cao bao gồm camphen (12,2%), trans-β-ocimene

(7,10%) Chỉ có 1 hợp chất sesquiterpen là β-caryophyllen được xác định, với hàm lượng

thấp 1,06% và không thấy sự có mặt của nhóm sesquiterpenoid Ngoài ra, còn có 2 hợp

chất hydrocarbon thơm khác nhưng đều có hàm lượng không đáng kể (<1,00%)

3.1.1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu loài Elsholtzia ciliata (Thunb.)

Hyland (Kinh giới núi)

Thành phần hóa học của tinh dầu loài E ciliata phân tích bằng GC-MS được trình

bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Thành phần hóa học tinh dầu loài E ciliata phân tích bằng GC-MS

TT Thời gian lưu

Nhận xét: Kết quả phân tích tinh dầu loài E ciliata thu hái mọc hoang ở vùng núi

phía bắc Việt Nam chỉ có 6 cấu tử, chiếm 100% Trong đó, thành phần limonen là monoterpen chính trong tinh dầu với nổi bật chiếm 71,0% Tiếp đến các monoterpenoid

có tỷ lệ lớn là D- carvon (15,5%) và 1,8-cineol (9,73%) Sesquiterpen được ghi nhận là

α-caryophyllen (1,27%) và không có mặt sesquiterpenoid

3.1.1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu loài Elsholtzia communis (Collett.

& Hemsl.) Diels (Kinh giới bông)

Thành phần hóa học của tinh dầu loài E communis phân tích bằng GC-MS được

trình bày ở bảng 3.4