đỗ bích hằng nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi elsholtzia willd ở việt nam

Đã có một số nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Elsholtzia Willd., ví dụ như nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong tông Elsholtzieae ở Trung Quốc dựa trên ch

ELSHOLTZIA WILLD Ở VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

ELSHOLTZIA WILLD Ở VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Đỗ Quyên

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Thực vật – Trường ĐH Dược Hà Nội

HÀ NỘI- 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể các giảng viên của Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy, người cô tâm huyết đã truyền tải những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô PGS.TS Đỗ Quyên, TS Hoàng Quỳnh Hoa, ThS Phạm Thị Linh Giang, cùng toàn thể các thầy cô và các kỹ thuật viên Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khoá luận

Em xin cảm ơn chị Bùi Thị Kim Oanh, Nguyễn Thu Hiền cùng các anh chị cao học của Bộ môn Thực Vật, những người đi trước đã tận tình chỉ bảo và giải đáp thắc mắc cho em trong suốt thời gian thực hiện khoá luận Cảm ơn các bạn sinh viên nghiên cứu của Bộ môn Thực vật đã luôn đồng hành cùng em, cũng như đưa ra những góp ý chân thành giúp em có thể hoàn thành nghiên cứu này

Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người luôn đứng phía sau hỗ trợ, tiếp thêm niềm tin và động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đỗ Bích Hằng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chi Elsholtzia Willd 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Elsholtzia Willd 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Elsholtzia Willd 2

1.1.3 Khoá phân loại chi Elsholtzia Willd 2

1.1.4 Công dụng và tác dụng dược lý của chi Elsholtzia Willd 3

1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS (Internal Transcribed Spacer) 4

1.2.1 Vùng phiên mã nội thuộc DNA ribosom nhân (ITS-rDNA) 4

1.2.1.1 Cấu trúc và chức năng vùng ITS-DNA ribosom 4

1.2.1.2 Ưu điểm của vùng ITS 6

1.2.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 6

1.2.3 Các phương pháp giải trình tự gen 8

1.2.4 Ứng dụng chỉ thị ITS trong nghiên cứu 8

1.2.5 Nghiên cứu đa dạng chi Elsholtzia trên thế giới 9

1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP (Exon Based Amplified Polymorphism) 13

1.3.1 Chỉ thị EBAP 13

1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi 13

1.3.3 Ứng dụng của chỉ thị EBAP trong nghiên cứu đa dạng di truyền 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 15

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 15

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 16

2.1.2.1 Dung môi, hoá chất 16

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu 17

2.2.2 Nội dung 2: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS 17

2.2.3 Nội dung 3: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu 17

2.3.1.1 Dung môi tách chiết DNA 17

2.3.1.2 Khảo sát một số yếu tố của phương pháp tách chiết DNA tổng số 18

2.3.1.3 Khảo sát một số yếu tố của quy trình tách chiết DNA tổng số 19

2.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS 20

2.3.2.1 Thành phần của một phản ứng PCR 20

2.3.2.2 Chương trình chạy PCR 20

2.3.2.3 Quy trình điện di trên gel agarose 21

2.3.2.4 Phương pháp thôi gen theo kit Qiagen 21

2.3.2.5 Giải trình tự 21

2.3.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP 21

2.3.3.1 Thành phần phản ứng PCR 21

2.3.3.2 Chương trình PCR 22

2.3.3.3 Điện di và phân tích dữ liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 23

3.1 Khảo sát phương pháp và điều kiện tách chiết DNA 23

3.1.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA 23

3.1.2 Khảo sát điều kiện tách chiết 24

3.1.2.1 Khảo sát khối lượng bột lá 24

3.1.2.2 Khảo sát lượng enzym RNase 25

3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS 25

3.2.1 Kết quả khuếch đại DNA 25

3.2.2 So sánh trình tự DNA ribosom vùng ITS 26

3.2.3 Xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa các mẫu Elsholtzia nghiên cứu dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 28

3.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP 29

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 32

4.1 Về phương pháp và khảo sát điều kiện tách chiết 32

4.2 Về đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS 32

4.3 Về đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP 33

4.4 So sánh kết quả cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề xuất 37

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ Diễn giải

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc

CDS Coding DNA Sequence Gen mã hoá protein

CIPRES Cyberinfrastructure for

Phylogenetic Research Science

Cơ sở dữ liệu thông tin khoa học nghiên cứu phát sinh loài

EBAP Exon based amplified

polymorphism Đa hình khuếch đại dựa trên exon

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic acid

ETS External transcribed spacer Vùng đệm được phiên mã ngoài

GC Gas chromatography Sắc ký khí

IGS Intergenic spacer Vùng liên thế hệ

ISSR Inter Simple Sequence Repeat Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản

giữa

ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội

LSU Large subunit Tiểu đơn vị lớn

MS Mass Spectrometry Khối phổ

NaCl Sodium Chloride Natri Clorid

NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NTS Non-transcribed spacer Vùng đệm không được mã hoá

ORF Open reading frame Khung đọc mở

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

rDNA Ribosomal Deoxyribose Nucleic

RNA Ribonucleic Acid Acid ribonucleic RNase A Ribonuclease A Ribonuclease A

SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

SRAP Sequence-related amplified

Tris(hydroxymethyl)aminometh-UV Ultraviolet Radiation Tia cực tím

Bảng 2.6.Chương trình PCR cho mồi EBAP 22

Bảng 3.1.Độ dài các trình tự 8 mẫu Elsholtzia Willd 26

Bảng 3.2.Thành phần bốn loại nucleotid của 8 mẫu Elsholtzia Willd 27

Bảng 3.3.Khoảng cách di truyền giữa 8 mẫu Elsholtzia Willd 27

Bảng 3.4.Hệ số tương đồng của từng cặp mẫu 28

Bảng 3.5.Tỷ lệ băng đa hình của các mồi nghiên cứu 30

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Cấu trúc vùng ITS-DNA ribosom của sinh vật nhân chuẩn 5 Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế phản ứng PCR 7 Hình 1.3.Cây phát sinh loài dựa trên các vùng gen mã hoá(CDS) 9 Hình 1.4.Cây phân loại dendrogram thu được bằng phương pháp phân tích cụm

10

Hình 1.5.Cây phân loại một số loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam dựa trên

phân tích đặc điểm hình thái 11

Hình 1.6.Cây phân loại phát sinh 34 loài thuộc chi Elsholtzia dựa trên trình tự vùng

ITS và ETS 12 Hình 3.1.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA của 5 phương pháp tách chiết

23

Hình 3.2.Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA sau tách chiết theo PP4 24 Hình 3.3.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát khối lượng để tách DNA 24

Hình 3.4.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát lượng RNase

25

Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm DNA khuếch đại 25

Hình 3.6.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia dựa trên chỉ thị ITS 29

Hình 3.7.Kết quả điện di và phân tích dữ liệu của EBAP4 30

Hình 3.8.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia dựa trên chỉ thị EBAP

31

Hình 4.1.Một phần trình tự Nucleotid của mẫu E_01-ITS1 33

Hình 4.2.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia Willd dựa trên chỉ thị

EBAP 6 (a) và EBAP 8 (b) 34 Hình 4.3.So sánh cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP 35 Hình 4.4.Cây phân loại 10 mẫu Kinh giới dựa trên so sánh đặc điểm hình thái 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Elsholtzia Willd và các chi khác thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae) là nhóm thực vật

quan trọng về mặt sinh thái cũng như kinh tế Chi Elsholtzia Willd bao gồm trên 40

loài, hầu như phân bố ở Đông Á, một số phân bố ở Bắc Mỹ Ở Việt Nam đến nay mới chỉ ghi nhận được 8 loài thuộc chi này [5], [21] Kinh giới được sử dụng rộng rãi trong đời sống và y học dân gian với các tác dụng như làm gia vị, trị cảm lạnh, sốt, tiêu chảy Ngoài ra, trong y học hiện đại, tác dụng chống viêm, kháng khuẩn và kháng virus của thành phần tinh dầu và các thành phần hoá học khác trong các loài thuộc chi này cũng rất được quan tâm nghiên cứu

Hiện nay vấn đề bảo tồn nguồn gen cây thuốc đang rất được quan tâm do người dân thường tập trung phát triển một số loài có tính thương mại và cho năng suất cao, một số loài hoang dã đã bị khai thác quá mức, làm mất tính đa dạng của quần thể Một

số loài Kinh giới tại Việt Nam được liệt vào danh sách nguy cấp như loài Elsholtzia

rugulosa Hemsl và Elsholtzia communis (Collett & Hemsl.) Diels [6], [8] Thông tin

về đa dạng di truyền là cần thiết cho việc phát triển các chiến lược thích hợp trong đánh

giá cũng như bảo tồn tính đa dạng loài

Đã có một số nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Elsholtzia

Willd., ví dụ như nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong tông Elsholtzieae ở Trung Quốc dựa trên chỉ thị lục lạp [48] Ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về tính đa dạng

loài của chi Elsholtzia Willd phân bố ở miền Bắc Việt Nam dựa trên đặc điểm thực vật

và cho ra được cây phân loại của các loài này [1] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào sử dụng chỉ thị DNA để đánh giá về tính đa dạng di truyền của các loài trong chi

Elsholtzia Willd ở Việt Nam Chỉ thị DNA hiện nay được sử dụng rộng rãi trong nghiên

cứu di truyền và được đánh giá là vượt trội hơn so với các loại chỉ thị truyền thống, giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu cũng như cho hiệu quả tốt hơn

Từ thực tế nêu trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi

Elsholtzia Willd ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp tối ưu để tách chiết DNA từ mẫu khô của các loài thuộc chi

Elsholtzia Willd

2 Xây dựng cây phân loại một số loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam dựa trên

chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Elsholtzia Willd

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Elsholtzia Willd

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), chi Elsholtzia Willd được phân

loại như sau [45]: Giới thực vật – Plantae

Ngành Ngọc lan – Magnoliophyta Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida

Phân lớp Hoa môi – Lamiidae

Bộ Hoa môi – Lamiales

Họ Bạc hà – Lamiaceae

Chi Kinh giới – Elsholtzia Willd

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Elsholtzia Willd

Cây cỏ, cây bụi hay cây bụi nhỏ Thân thường vuông, nhẵn hay có lông Lá nguyên hay xẻ răng cưa, nhẵn hay có lông Cụm hoa dạng chùm hay dạng bông ở đỉnh cành, gồm các xim co tạo thành vòng giả, giãn cách hay không giãn cách, hoa tạt về một phía hay thành vòng Lá bắc tồn tại hình nét hoặc hình trứng Đài hình chuông hay hình ống, 5 thùy gần đều nhau hoặc 2 thuỳ trước dài hơn Tràng màu trắng, hơi vàng hoặc tía, có ống thẳng hoặc cong hơi thò khỏi đài, 2 môi: môi trên 2 thùy, môi dưới 3 thùy Nhị 4, hướng về 2 phía hay hướng thẳng; chỉ nhị thò dài hay ngắn khỏi tràng; 2 nhị dưới dài hơn hai nhị trên Bao phấn 2 ô, lúc đầu giãn ra sau chụm lại Bầu nhẵn hay có lông; vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa phát triển mạnh ở phần phía sau của bầu Quả hình bầu dục hay hình thuôn, nhẵn hay có lông, có nốt sần [5], [25]

1.1.3 Khoá phân loại chi Elsholtzia Willd

Theo Thực vật chí Việt Nam, xác định được 7 loài thuộc chi Elsholtzia, bao gồm

Elsholtzia ciliata, E.winitiana, E.blanda, E.rugulosa, E.communis, E.penduliflora và E.pilosa [5], trong đó phổ biến nhất là loài Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.:

1A Cụm hoa gồm các hoa tạt về một phía

2A Lá bắc lớn, hình trứng rộng hay gần tròn (cỡ 4-5x3-4mm) 1 E.ciliata

2B Lá bắc nhỏ, hình mác hẹp hay hình đường 3A Hoa màu trắng Lá bắc hình mác hẹp (cỡ 1,5-2 mm), ngắn hơn hoa

5A Hoa rủ xuống phía dưới sau khi hoa nở Lá gần như nhẵn

cụm hoa thường không mọc đối 6 E.communuis

6B Lá bắc hình mác ngược, hẹp (dài 2,5-3mm), thường dài hơn hoa Các

bông trong cụm hoa mọc đối nhau 7 E.winitiana Năm 2020, Hoàng Thanh Sơn và cộng sự đã ghi nhận thêm loài Elsholtzia

kachinensis Prain có mặt ở Việt Nam Như vậy, tổng số loài thuộc chi Elsholtzia Willd

ở Việt Nam là 8 loài Trong nghiên cứu này cũng đưa ra khoá phân loại mới gồm 7 loài

(trừ loài E.penduliflora W W Smith) [21]:

trên của lá 5 E.rugulosa

5b Mặt dưới của lá có lông nhung màu xám hoặc trắng, cùng màu với mặt trên của lá

6a Tràng hoa màu trắng 6 E.winitiana 6b Tràng hoa màu hồng tím 7 E.communis

1.1.4 Công dụng và tác dụng dược lý của chi Elsholtzia Willd

Chi Elsholtzia Willd thuộc họ Lamiaceae có khoảng 40 loài phân bố trên khắp

thế giới, trong số đó có tới 33 loài phân bố ở Đông Á, chủ yếu ở Trung Quốc [25], ở Việt Nam hiện ghi nhận được 8 loài thuộc chi này [5], [21] Trong số các loài này, có một số loài được dùng làm thuốc, một số được dùng làm thực phẩm hoặc nguồn hoa để sản xuất mật ong [5], [25]

Các loài trong chi Elsholtzia từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian, công

dụng phổ biến nhất của chi này là điều trị cảm lạnh, sốt, tiêu chảy, kiết lị, rối loạn tiêu hoá, say nắng, thải độc,… [41], chủ yếu được dùng dưới dạng thuốc sắc Một số loài

được sử dụng làm thuốc chữa cảm lạnh như E.ciliata, E.blanda, E.communis,

E.penduliflora, E.rugulosa Loài E.ciliata cũng thường được dùng để trị cảm lạnh, hạ

sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, phù nề [49], làm gia vị và làm nguồn nuôi ong mật [5]

Một số loài Elsholtzia được dùng làm thuốc chống viêm và giảm đau, chẳng hạn như E.rugulosa, E.penduliflora, E.blanda và E.ciliata Ngoài trị cảm sốt, E.rugulosa

còn được dùng để trị chứng khó tiêu, đau bụng, đầy bụng, viêm dạ dày – ruột, kiết lỵ,

chảy máu cam, ho ra máu, đau bụng sau sinh, vết loét, trị rắn cắn Loài E.blanda có tác

dụng chữa viêm gan, kiết lỵ, viêm amidan, đau răng, viêm dạ dày ruột cấp tính, viêm bể thận cấp và mãn tính [28]

E.penduliflora thường được dùng làm thuốc chữa bệnh than, vết thương nhiễm

trùng, cúm, viêm họng, viêm amidan, viêm phổi, viêm phế quản, sốt rét, viêm tuyến sữa

và dùng làm thực phẩm [5], [36] E.communis được dùng làm thuốc trị đau đầu, khó tiêu E.kachinensis còn được dùng làm thực phẩm [11]

Trong y học hiện đại, một số loài Elsholtzia được cho rằng có chứa nhiều thành

phần có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm, giảm đau, chống oxy hoá, ngừa thiếu máu cơ tim và tăng cường miễn dịch [13], [19], [28]

Tinh dầu trong một số loài Elsholtzia có hoạt tính ức chế một số vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gram âm (Esherichia coli) và nấm men (Candida albicans) [22] Ngoài ra, tinh dầu hoặc nước sắc của một số loài Elsholtzia cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Shigella

flexneri, Bacterium paratyphosum B, Bacillus typhi murium, Bacillus dysenteriae, Bacillus diphtheriae, Bacillus meningitidis purulentae, Bacillus proteus, anthrax Bacillus, Neisseria intracellularis [28]

Flavonoid từ E.blanda có tác dụng ức chế hoạt tính creatine kinase-MB

(CK-MB) và malondialdehyd trong huyết thanh, làm giảm huyết áp và áp lực lên mạch vành

[26] Flavonoid từ E.rugulosa có tác dụng ức chế hoạt động của virus cúm [29] Hợp chất phenolic có trong E.ciliata có khả năng chống viêm và chống oxy hoá hiệu quả

[37]

1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS (Internal Transcribed Spacer)

1.2.1 Vùng phiên mã nội thuộc DNA ribosom nhân (ITS-rDNA)

1.2.1.1 Cấu trúc và chức năng vùng ITS-DNA ribosom

DNA ribosom nhân hay rDNA là nhóm gen mã hoá rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hoá cho bất kì protein nào Các gen bản sao của ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra tương đồng và các

khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các đoạn mồi thiết kế dựa trên những oligonucleotid có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả các vi sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều đoạn mồi cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật

Các gen DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại được sắp xếp theo thứ tự DNA ribosome nhân có hai vùng sao mã: ITS-1 nằm giữa tiểu phần nhỏ (16S-18S) và 5,8S của gen và ITS-2 nằm giữa 5,8S và tiểu phần lớn (23S-28S) của gen Hai vùng này và tiểu phần 5,8S được gọi chung là vùng sao mã bên trong (ITS)

Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng ITS và các vùng ETS Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lặp lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm [18] rDNA 18S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi song rRNA 5S là thành phần không thể thiếu của nu-LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein [43]

Hình 1.1.Cấu trúc vùng ITS-DNA ribosom của sinh vật nhân chuẩn

Hình 1.1 cho thấy cấu trúc vùng ITS-rDNA của rDNA chứa các vùng 18S, 5,8S và 28S, tạo thành một cụm lặp đi lặp lại song song, rDNA 5S được mã hoá riêng biệt, vùng đệm không được mã hoá (NTS), vùng đệm được phiên mã ngoài (ETS), vùng đệm được phiên mã trong (ITS)

Các vùng ITS có kích thước từ 500 đến 750bp là các vùng tiến hóa nhanh nên có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài [10] Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS Số bản sao các đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30000 trong một tế bào ITS trở thành đối tượng quan trọng trong các nghiên cứu phân loại các taxon có mối liên hệ gần, do ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau Nghiên cứu về ITS cho phép hiểu biết sâu về tiến hoá và sự lai tạo ở các loài thực vật khác nhau Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài

Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng vùng ITS có thể tiến hành bằng cách khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu sử dụng ITS marker, sau đó sản phẩm khuếch đại được giải trình tự bằng máy tự động, từ đó xây dựng cây phân loại dựa vào số liệu so sánh các trình tự Có thể xác định sự thay đổi của các chuỗi bằng cách sử dụng enzym cắt hạn chế với vùng ITS, sau đó phân tách các phân đoạn bằng gel agarose hoặc polyacrylamide để xác định các gen khác biệt

1.2.1.2 Ưu điểm của vùng ITS

Vùng ITS là đối tượng được khai thác phổ biến trong các nghiên cứu về di truyền, do nó có nhiều ưu điểm như [10], [27], [32], [40]:

- Mang đặc tính di truyền của cả “bố” và “mẹ”, khác với các chỉ thị lục lạp và ty thể chỉ mang đặc tính di truyền của “mẹ”

- Dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại, với một số mồi phổ biến có sẵn và không cần phải thiết kế mồi riêng cho từng nghiên cứu, sử dụng được cho nhiều loại sinh vật khác nhau

- Có cấu trúc đa bản - Khoảng cách di truyền có thể được xác định rõ ràng giữa các loài có cùng nguồn gốc

- Kích thước vừa phải (500-750bp) cho phép giải trình tự dễ dàng

Với những ưu điểm trên, trình tự nucleotid vùng ITS của rất nhiều loài đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới rất phong phú, thuận lợi cho phân tích và đối chiếu trình tự gen

1.2.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp số nhân, tạo ra số lượng bản sao gần như vô hạn của một trình tự DNA nào đó, là nguồn vật liệu cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo

PCR được phát triển năm 1983 bởi Kary B.Mullis, là kỹ thuật phổ biến trong các nghiên cứu y học, thú y, sinh học, tội phạm học, lịch sử, khảo cổ học [23], với nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản DNA để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về DNA [20], xác định kiểu gen sinh vật [44], xác định dấu vân tay DNA [12], phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm [16], [47], chẩn đoán các bệnh di truyền ở trẻ sơ sinh như hội chứng Down và bệnh Thalassemia [14], [46]

Phản ứng PCR được coi là một phiên bản đơn giản của quá trình sao chép DNA trong tế bào, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ lặp đi lặp lại trong phản ứng biến tính và tái bản các đoạn ngắn của chuỗi DNA hoặc RNA bằng cách sử dụng enzym chịu nhiệt Taq polymerase Sự khuếch đại tuân theo nguyên tắc ghép cặp bổ sung base [35],

quá trình này nói chung được thực hiện như các quy trình lặp lại gồm 3 giai đoạn như sau [17], [31]:

1) Giai đoạn biến tính DNA khuôn: Biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ đến 94-96oC khiến các liên kết hydro giữa các base bị phá vỡ, tạo thành phân tử DNA sợi đơn

2) Giai đoạn gắn mồi: giảm nhiệt độ xuống còn 55oC để mồi gắn vào sợi DNA đơn, polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA

3) Giai đoạn kéo dài: duy trì nhiệt độ 72oC để kéo dài chuỗi Giai đoạn biến tính ban đầu có thể kéo dài khoảng 3 phút ở nhiệt độ 94oC, mục đích để hoạt hoá Taq DNA polymerase và làm nóng phản ứng Số chu kỳ ba bước lặp lại là khoảng 25-35 chu kỳ Sau khi kết thúc các chu kỳ nhiệt, tiếp tục ủ ở 72oC trong thời gian trên 5 phút, bước này cho phép hoàn thiện các sản phẩm khuếch đại và bổ sung lượng adenin vào đầu 3’ của tất cả các sản phẩm PCR Cuối cùng, kết thúc phản ứng bằng cách làm lạnh hỗn hợp ở 4oC trong máy PCR [31]

Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế phản ứng PCR

Chu kỳ biến tính ba bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỗi chu kỳ số lượng sản phẩm tăng lên gần gấp đôi Hệ số khuếch đại được tính theo công thức n(1+E)x, trong đó n là lượng DNA ban đầu, E là hiệu suất khuếch đại và x là số chu kỳ PCR Phản ứng PCR cũng có thể áp dụng được cho RNA [30]

Thể tích một phản ứng PCR thường là 25-100µl, bao gồm dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ở nồng độ khoảng 200µM mỗi loại, 10 đến 100pmol mỗi mồi, chất đệm, Taq DNA polymerase và DNA khuôn [30]

Mồi sử dụng trong phản ứng có độ dài 18-30 nucleotid, hàm lượng GC khoảng 50%, đầu 3’ của mồi không nên chứa quá nhiều GC do khả năng tạo dimer-primer [30] Mỗi mồi chỉ có duy nhất một trình tự trên sợi DNA đích và không bắt cặp trên các trình

tự DNA khác, trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc [3]

Ưu điểm của công nghệ PCR là khả năng khuếch đại hiệu quả các chuỗi acid nucleic, thiết kế kỹ thuật đơn giản cho phép công nghệ PCR được sử dụng rộng rãi và đóng vai trò quan trọng trong đời sống và các lĩnh vực liên quan [38]

1.2.3 Các phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là việc xác định thứ tự sắp xếp của các nucleotid trên phân tử DNA Thông qua giải trình tự gen sẽ cho biết trong một đoạn DNA cụ thể có mang loại thông tin di truyền nào không, trong nghiên cứu về di truyền, việc xác định được trình tự của đoạn gen đặc trưng đối với loài có thể giúp xác định và phân biệt giữa các loài

Hai phương pháp giải trình tự ra đời sớm nhất là phương pháp hoá học của Maxam Gilbert (1977) [9], [34] và phương pháp enzym của Sanger (1977) [39] Giữa các phương pháp có nhiều sự khác biệt nhưng cơ bản vẫn là thực hiện các phản ứng sử dụng các tác nhân hoá học hay enzym để xúc tác, tạo ra tập hợp các đoạn oligonucleotid có chiều dài khác nhau mà nucleotid tận cùng các đoạn này có thể xác định được, sau đó phân tách các đoạn oligonucleotid bằng điện di và xác định trình tự dựa trên tín hiệu huỳnh quang hay đánh dấu phóng xạ Hiện nay, phương pháp giải trình tự phổ biến nhất được sử dụng là phương pháp giải trình tự bằng máy tự động Cơ sở của phương pháp này tương tự phương pháp enzym của Sanger, sử dụng các dioxynucleotid, đánh dấu huỳnh quang lên các dNTPs hay primer, kết quả giải trình tự được đọc thông qua hệ thống máy tính tự động [7]

1.2.4 Ứng dụng chỉ thị ITS trong nghiên cứu

Vùng đệm phiên mã nội bộ (ITS) được sử dụng rất phổ biến trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền và định danh loài Nghiên cứu của Huỳnh Thị Trúc Phương (2021)

đã phân biệt được 10 mẫu Lan Hoàng thảo (Dendrobium) dựa vào mã vạch DNA vùng

ITS Kết quả giải trình tự của chúng được đưa lên Genbank, kết quả định danh bằng phương pháp BLAST cho độ tương đồng về trình tự cao từ 99,85 đến 100% Phân tích

mối quan hệ di truyền của 10 mẫu lan thuộc chi Dendrobium cho thấy sự thay thế cùng

kiểu base cao hơn sự thay thế khác kiểu base với tỷ lệ lần lượt là 14,83% và 5,09% Khoảng cách di truyền giữa các mẫu thấp nhất là 0,000 và cao nhất là 0,047 Khoảng cách di truyền biến động mạnh cho thấy mối quan hệ di truyền khá phân tán trong các mẫu nghiên cứu, khoảng cách di truyền thấp có thể do các mẫu có chung nguồn gốc Nghiên cứu kết luận rằng việc sử dụng mã vạch DNA dựa trên vùng ITS có khả năng phân biệt được các loài lan trong chi Hoàng thảo, cho thấy vùng ITS hoàn toàn có khả năng nhận diện và phân tích mối quan hệ di truyền đối với các loài trong cùng một chi [4]

Nghiên cứu của Yara Barros Feitosa và cộng sự trên 67 chủng nấm Tricoderma,

phân tích đa dạng di truyền nguồn gen của chúng chỉ dựa trên trình tự vùng đệm phiên mã nội bộ (ITS) Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự trong Genbank thông qua chương trình BlastN, cho thấy 67 chủng nấm trên thuộc 11 loài, trong đó nhóm lớn nhất bao gồm 27 chủng (40,3%) có quan hệ gần gũi với nhau Tuy nhiên, chỉ thị ITS không thực sự hữu ích trong việc phân loại các chủng có mối liên hệ gần gũi, trong nghiên cứu trên khoảng cách di truyền từ 0,05 đến 0,1, toàn bộ tương đồng giữa các mẫu đều ở mức cao, khác biệt nhỏ này chỉ đủ để phân biệt ở mức độ loài trong cùng một chi [15]

1.2.5 Nghiên cứu đa dạng chi Elsholtzia trên thế giới

Một nghiên cứu về mối đa dạng di truyền trong tông Elsholtzieae (họ Lamiaceae) ở Trung Quốc được tiến hành năm 2023 đã tiến hành trên 7 chi thuộc tông Elsholtzieae

[48], trong đó chi Elsholtzia là chi có số lượng đông đảo nhất với 40/70 loài Bộ gen

plastid hoàn chỉnh, gen mã hoá protein (CDS), vùng liên thế hệ (IGC) và CDS+IGC của các mẫu được sử dụng để so sánh phát sinh gen

Hình 1.3.Cây phát sinh loài dựa trên các vùng gen mã hoá(CDS)

Đa dạng loài của chi Elsholtzia còn được nghiên cứu dựa trên sự đa dạng hoá học

của thành phần tinh dầu của chúng Một nghiên cứu về tính đa dạng hoá học các loài

Elsholtzia phân bố ở Himalaya được tiến hành với các mẫu từ năm loài Elsholtzia eriostachya, E.cristata, E.polystachya, E.flava và E.pilosa được thu hái từ khu vực

Himalaya (Ấn Độ) [33] Thành phần terpenoid trong tinh dầu của các loài này được kiểm tra bằng phân tích GC, GC/MS và NMR, sau đó kết quả được phân tích cụm để phân biệt những tương đồng, từ đó xác định được cây phân loại của chúng

Hình 1.4.Cây phân loại dendrogram thu được bằng phương pháp phân tích cụm

Chú thích: EE: E.eriostachya (lá); EEP: E.eriostachaya var.pusilla (toàn phần

trên mặt đất); EPL-I: E.polystachya (lá); EPL-II và EPL-III: E.polystachya (lá); EP-I: E.pilosa (lá); EP-II: E.pilosa (toàn phần trên mặt đất); EF-I: E.flava (lá); EF-II: E.flava (lá); EC: E.cristata (lá); ES: E.strobilifera (lá); ED: E.densa (toàn phần trên mặt đất); EB: E.blanda (toàn phần trên mặt đất); EI: E.incisa (toàn phần trên mặt đất)

Năm 2022, Phạm Thị Nga đã xây dựng cây phân loại phát sinh loài của một số

loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở miền Bắc Việt Nam dựa trên phương pháp so sánh đặc điểm hình thái thực vật giữa các loài thuộc chi này [1] 10 mẫu cây thuộc chi Elsholtzia

Willd được thu hái tại cùng thời điểm, các đặc điểm thực vật về lá, hoa, quả được quan

sát và được gắn biến định lượng hay định tính Sau khi xử lý bằng phần mềm SPSS cho ra cây phân loại của 10 mẫu Kinh giới dựa trên so sánh đặc điểm hình thái

Hình 1.5.Cây phân loại một số loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam dựa

trên phân tích đặc điểm hình thái

Chú thích: N01, N02, N03: E.blanda; N04, N05, N06: E.ciliata; N07:

E.communis; N08: E.flava; N09: E.fruticosa; E.penduliflora

Năm 2022, một nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá phát sinh chủng loại

34 loài thuộc chi Elsholtzia thông qua xác định trình tự gen các vùng đệm phiên mã

ngoài (ETS) và trong (ITS) [42], trình tự hai vùng này được cho là có nhiều thông tin hơn so với trình tự plastid Các trình tự được tập hợp bằng phần mềm Generious v.11.0.4, sau đó sử dụng MAFFT để căn chỉnh trình tự hoặc điều chỉnh thủ công bằng PhyDE-1 khi cần thiết Kết quả thu được trình tự đoạn nucleotid có chiều dài 1044bp bao gồm đoạn ITS có chiều dài 643bp và đoạn ETS có chiều dài 401bp Sử dụng phương pháp Bayesian Inference để tái cấu trúc gen trên CIPRES, sử dụng phần mềm MrBayer v.3.2.6 cho ra cây phân loại phát sinh loài như sau:

Hình 1.6.Cây phân loại phát sinh 34 loài thuộc chi Elsholtzia dựa trên trình tự

vùng ITS và ETS

1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP (Exon Based Amplified Polymorphism)

1.3.1 Chỉ thị EBAP

Exon là một phần quan trọng trong bộ gen của sinh vật nhân thực, tuy chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ (trên 1%) trong bộ gen nhưng có chức năng quan trọng là mã hoá thông tin di truyền [24] Tuy nhiên, cho tới nay có rất ít nghiên cứu sử dụng kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa trên khuếch đại mồi đơn được phát hiện cho vùng exon

Vùng ITS có tính bảo thủ cao trong loài, do vậy đối với các nghiên cứu mức độ dưới loài nó khó có thể phân biệt được Một kỹ thuật mới trong lĩnh vực nghiên cứu di truyền mang tên Kỹ thuật đa hình khuếch đại dựa trên exon (EBAP), là kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa trên sự đa dạng hoá của exon Kỹ thuật EBAP được thực hiện cũng dựa trên phản ứng khuếch đại gen (PCR), tuy nhiên mồi được sử dụng là mồi đơn được thiết kế dựa trên các vùng giàu base GC trong vùng exon [50]

Kỹ thuật đa hình khuếch đại dựa trên exon (EBAP) ra đời mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khám phá và ứng dụng các dấu ấn phân tử dựa trên vùng exon, là sự lựa chọn mới trong kho công cụ phân tích đa dạng di truyền hiện nay

1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi

Exon là các trình tự nucleotid trong DNA và RNA được bảo tồn trong quá trình tổng hợp mRNA Tuy chiếm tỷ lệ nhỏ (khoảng 2%) trong DNA nhưng nó mang thông tin di truyền và có thể biểu hiện gen, exon là một phần của khung đọc mở (ORF), được định nghĩa là một phần của DNA, không chứa bộ ba kết thúc nào và có khả năng mã hoá cho protein

Mồi đơn sử dụng trong kỹ thuật EBAP được thiết kế nhằm mục đích liên kết với các exon giàu base GC tại các ORF [24] Chiều dài của mồi đơn là 17bp, bao gồm 3 chuỗi [50]:

- Trình tự lấp đầy: là phần đầu của mồi, có độ dài là 6 base, có hàm lượng AT từ 66,67%, tỷ lệ A:T là 1:1

- Trình tự lõi trung gian: phần giữa của mồi, có độ dài 8 base, hàm lượng GC là 100%, tỷ lệ G:C là 1:3 trở lên

- Trình tự base chọn lọc: nằm ở đầu 3’, là 3 base cuối của mồi, trong đó base thứ nhất phải là A hoặc T, còn hai base còn lại thì có thể là một trong bốn loại base A, T, G hoặc C

1.3.3 Ứng dụng của chỉ thị EBAP trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Phương pháp EBAP được thực hiện dựa trên phản ứng khuếch đại gen, sử dụng mồi đơn làm mồi ngược cũng như mồi xuôi, gắn vào các vị trí đặc hiệu trên DNA và cho ra các bản sao DNA có các độ dài khác nhau, mỗi vạch thu được tương ứng với 1 DNA có kích thước khác nhau Kết quả điện di thu được là các băng đa hình đặc trưng

cho từng loài, qua phân tích các băng đa hình này có thể rút ra được khoảng cách di truyền giữa các loài và xây dựng được cây phân loại để phân biệt các loài, giống với nhau

Nghiên cứu của Xiong và cộng sự (2022) trên sáu loại cây trồng đã cho thấy hiệu quả của chỉ thị EBAP khi cho ra được nhiều dải đa hình đa dạng đặc trưng cho từng giống cây, chứng tỏ chỉ thị EBAP có tiềm năng lớn trong phân tích đa dạng di truyền [50]

Năm 2023, Nguyễn Thị Kim Anh đã sử dụng 2 loại chỉ thị lục lạp và chỉ thị trên nhân (EBAP) để phân tích đa dạng di truyền các giống Actiso trồng tại Việt Nam

(Cynara cardunculus var scolymus L.) Kết quả thu được chỉ thị trên nhân có ưu thế

vượt trội hơn ở cấp độ các giống, trong khi chỉ thị lục lạp chỉ phân biệt được sự pha trộn giống trong một nhóm hạt Kết luận này cũng chỉ ra chỉ thị EBAP có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu sự khác biệt ở cấp độ dưới loài [2]

Chỉ thị EBAP có một số ưu điểm vượt trội so với các chỉ thị khác như : a) thiết kế mồi đơn giản, giảm đáng kể chi phí tổng hợp mồi ; b) dù kỹ thuật EBAP dựa trên các kỹ thuật trước đó như RAPD và ISSR nhưng nó có khả năng tạo ra các chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng ; c) quá trình khuếch đại PCR được thực hiện ở nhiệt độ ủ cao hơn (50oC), khắc phục nhược điểm của kỹ thuật SRAP và TRAP là dễ tạo dải dương tính giả do nhiệt độ ủ ban đầu thấp (35oC), vì vậy kỹ thuật EBAP có ưu điểm là tính đặc hiệu tốt và độ lặp cao ; d) sử dụng mồi tương đối dài, khả năng nhân bản và ổn định cao hơn so với kỹ thuật RAPD truyền thống ; e) EBAP là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, hoạt động đơn giản, hiệu suất khuếch đại cao, cho dải khuếch đại tương đối phong phú [50]

Từ những nghiên cứu đã được thực hiện, nhận thấy rằng chỉ thị EBAP rất có khả năng trong việc phân tích đa dạng di truyền ở mức độ loài và dưới loài, cho kết quả có tính đặc hiệu cao, phù hợp trong nghiên cứu này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 8 mẫu Kinh giới được thu hái tại các địa phương khác nhau tại miền Bắc Việt Nam vào tháng 11 năm 2021, gồm cả mẫu trồng và mẫu mọc hoang dại

Các mẫu đã được giám định tên khoa học

Bảng 2.1.Ký hiệu và nguồn gốc của các mẫu nghiên cứu

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Dung môi, hoá chất

- Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB); 1M Tris pH 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0; 5M NaCl; nước cất pha tiêm

- Dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS) 5% - Nito lỏng, hạt silica gel

- CE buffer (G-spinTM Total DNA Extraction Mini Kit) - Mercaptoethanol, ethanol tuyệt đối, ethanol 70%, chloroform, isopropanol - Enzym RNase (3mg/300µ nước cất pha tiêm)

- Dung dịch đệm TAE1X: pha loãng với tỷ lệ 1/50 từ dung dịch gốc TAE50X (có thành phần như sau: tris base (Sigma): 121g, acid acetic glacial (Sigma): 28,6ml, EDTA (Sigma) 0,5M pH 8,0: 50ml, nước khử ion vừa đủ: 500ml)

- Chất hiện màu RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution - Gel agarose 1,2%: cân 0,6g agarose, thêm 50ml đệm TAE1X, đun trong lò vi sóng khoảng 90 giây cho tan hoàn toàn, để nhiệt độ hạ xuống 60-65oC, thêm 2,5μl RedSafe, lắc đều rồi đổ ra khay điện di (đã chuẩn bị sẵn khay và lược tạo giếng tra mẫu)

- Kit Qiagen - Thang DNA 1kp chuẩn, thang 100bp chuẩn (Thermo Scientific) - Dung dịch Loading dye 2X

- Hoá chất chạy PCR: nước cất pha tiêm, PCR buffer, dNTPs mix (2,5mM), enzyme Taq DNA polymerase (1U/µl), các cặp mồi ITS (ITS1 và ITS4) và mồi EBAP 4, 6, 8, 17, 18, 22, 23 có trình tự nucleotid như sau:

Bảng 2.2.Danh sách các mồi sử dụng

ITS1 5 pmol CTTATCATTTAGAGGAAGGAGA ITS4 5 pmol TCCTCCGCTTATTGATATGC EBAP4 20 pmol GAATTCCGGCGGCGTAC EBAP6 20 pmol GAATTCCGGCGGCGTGA EBAP8 20 pmol GAATTCCGGCGGCGAAC EBAP17 20 pmol GAATTCCGGCGGCGAAA EBAP18 20 pmol GAATTCCGGCGGCGTTT EBAP22 20 pmol GAATTCCGGCGGCGAAT EBAP23 20 pmol GAATTCCGGCGGCGATT

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Bộ chày, cối sứ - Máy PCR eppendorf mastercycler pro S - Máy li tâm eppendorf

- Máy soi UV UVP PhotiDoc-It Imaging System (UV254) - Ống eppendorf (2,0ml; 1,5ml; 0,2ml), micropippette (1000, 200, 100, 20, 10μl), đầu côn (tip 1000, 200, 10μl)

- Lò vi sóng Saiko, máy điện di Consort EV222, bể điều nhiệt Memmert - Cân phân tích AY 220 Shimadzu

- Máy lắc vortex - Tủ lạnh âm sâu Sanyo Biomedical freezer MDF-U333 - Máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems) - Các dụng cụ thường quy khác trong phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu

Khảo sát một số phương pháp và điều kiện tách chiết DNA bao gồm: khối lượng

bột lá sử dụng để tách chiết DNA và lượng enzym RNase sử dụng trong quá trình ủ loại

RNA Sau đó xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu nhất nhằm thu được DNA có chất lượng tốt, nồng độ DNA đủ lớn, ít lẫn RNA và tiết kiệm hoá chất

2.2.2 Nội dung 2: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS

Tiến hành phản ứng PCR các mẫu nghiên cứu sử dụng mồi ITS theo quy trình đã được khảo sát, sau đó tách lấy đoạn DNA tinh sạch và đem đi giải trình tự So sánh trình tự các đoạn DNA bằng phần mềm MEGA11 thu được cây phân loại phát sinh loài dựa trên chỉ thị ITS

2.2.3 Nội dung 3: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP

Tiến hành phản ứng PCR các mẫu nghiên cứu sử dụng mồi EBAP theo quy trình đã được khảo sát Trên sản phẩm điện di, xác định sự có mặt các băng di truyền tương ứng với các kích thước khác nhau Tổng hợp dữ liệu, xử lý bằng phần mềm SPSS theo phương pháp Hierarchical Data (phân cấp dữ liệu) để thu được cây phân loại phát sinh loài dựa trên chỉ thị EBAP

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu

2.3.1.1 Dung môi tách chiết DNA

a Dung môi SDS 0,5% 0,1ml SDS 5%; 0,2ml 1M Tris pH 8,0; 0,05ml 0,5M EDTA pH 8,0; 0,1ml 2,5M NaCl; 0,55ml nước cất pha tiêm

b Dung môi CTAB 4% CTAB buffer 4%: 0,6g Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB); 3ml 1M Tris pH 8,0; 1,2ml 0,5M EDTA pH 8,0; 16,8ml 2,5M NaCl; 9ml nước cất pha tiêm

2.3.1.2 Khảo sát một số yếu tố của phương pháp tách chiết DNA tổng số

a Thu thập và chuẩn bị mẫu - Mẫu lá được thu hái là lá bánh tẻ (lá không quá non, không quá già), được làm khô bằng silica gel trong túi zip kín ở nhiệt độ phòng (25oC), bảo quản lâu dài ở -22oC - Mẫu lá khô được nghiền thành bột mịn bằng chày cối sứ cùng với nito lỏng, cân khoảng 0,1mg bột lá đã nghiền mịn vào ống eppendorf 2,0ml Riêng với phương pháp SDS thì không cần nghiền mẫu

b Các phương pháp tách chiết DNA

(1) Phương pháp 1: phương pháp SDS (PP1)

- Bước 1: Cắt lấy mẩu lá có diện tích khoảng 3x3mm cho vào ống eppendorf 0,2ml, gõ nhẹ cho mẩu lá rơi xuống đáy ống, cho dung dịch SDS buffer vào sao cho mẩu lá chìm hoàn toàn trong dung dịch buffer

- Bước 2: Đưa ống vào máy PCR và ủ ở 96oC trong 10 phút, lấy ống ra và chuyển toàn bộ dịch vào ống 1,5ml khác

- Bước 3: Thêm 100μl isopropanol vào ống, trộn đều bằng vortex - Bước 4: Ly tâm ở tốc độ 13rpm trong 20 phút, hút bỏ hoàn toàn dịch, giữ lại phần cắn ở dưới đáy ống Để khô cắn hoàn toàn

- Bước 5: Thêm 50μl CE để hoà tan cắn Bảo quản ở -22oC

(2) Phương pháp 2: phương pháp CTAB không sử dụng mercaptoethanol (PP2)

- Bước 1: Cân khoảng 20mg bột lá đã nghiền mịn vào ống eppendorf dung tích 2ml - Bước 2: Thêm 500μl CTAB buffer vào mỗi ống

- Bước 3: Ủ trong bể điều nhiệt ở 65oC trong 1 giờ, cứ 15 phút lắc đều ống 1 lần Lấy ống ra, thêm 500 μl chloroform, lắc mạnh đến khi tạo dạng nhũ tương trắng như sữa Ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4oC trong 15 phút

- Bước 4: Hút 300μl dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml khác, chú ý chỉ hút dịch không hút cắn Thêm 300μl isopropanol, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4oC trong 15phút

- Bước 5: Hút bỏ toàn bộ dịch Thêm 300μl ethanol 70%, ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4oC trong 15 phút Hút bỏ toàn bộ dịch, để tủa khô tự nhiên qua đêm

- Bước 6: Thêm 50μl CE để hoà tan Bảo quản ở -22oC

(3) Phương pháp 3: phương pháp CTAB (PP3)

- Bước 1: Chuẩn bị các mẫu bột lá đã được nghiền mịn, lấy vào mỗi ống khoảng 20mg bột lá

- Bước 2: Thêm mercaptoethanol vào đệm CTAB với tỷ lệ 60μl mercaptoethanol cho 30ml đệm

- Tiến hành chiết tương tự với các bước 2-6 của PP2

(4) Phương pháp 4: phương pháp CTAB kết hợp ủ với enzym RNase sau khi

chiết DNA (PP4) - Tiến hành chuẩn bị mẫu bột lá, đệm và tiến hành tách chiết DNA tương tự các bước ở PP3

- Sau khi có được dung dịch DNA/ CE buffer, thêm vào mỗi ống 5μl RNase Ủ các

ống trong bể điều nhiệt ở 37oC trong 2 giờ, cứ 10 phút lắc đều ống 1 lần Bảo quản ở -22oC

DNA (PP5) - Tiến hành chuẩn bị mẫu bột lá và đệm như ở PP3 - Thêm 500μl đệm vào các ống, thêm 5μl RNase vào mỗi ống

- Tiến hành tương tự như các bước 3-6 ở PP2 c Phương pháp điện di

Kết quả tách chiết được tiến hành điện di để kiểm tra nồng độ DNA Tiến hành như sau:

- Chuẩn bị bản gel agarose 1,2%, thêm đệm TAE1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel 0,5-1,0cm

- Trải tấm parafilm lên một mặt phẳng Hút 1μl dung dịch loading dye tạo thành các giọt trên miếng parafilm, số giọt tương ứng với số mẫu

- Hút mỗi mẫu 5μl DNA, hoà trộn với một giọt loading dye vừa tạo rồi tra vào các giếng theo thứ tự

- Chạy điện di với điều kiện 120V, 200mA, 20W trong 30 phút Kết quả điện di được quan sát dưới đèn tử ngoại Đánh giá kết quả tách chiết dựa trên tiêu chí: có quan sát được vạch DNA đậm và rõ nét hay không; có còn tạp RNA hay không

2.3.1.3 Khảo sát một số yếu tố của quy trình tách chiết DNA tổng số

Quá trình tách chiết DNA tổng số được tối ưu hơn bằng cách khảo sát một số yếu

tố như khối lượng bột lá sử dụng và lượng enzym RNase thêm vào Để thuận tiện cho

quá trình khảo sát, nhóm nghiên cứu lựa chọn 3 mẫu có thể chất lá khác biệt là E_01, E_07 và E_08 để tiến hành khảo sát

a Khảo sát khối lượng bột lá Khảo sát với các lượng bột lá lần lượt là 10mg, 20mg, 30mg và 40mg cho mỗi thí nghiệm Tiến hành nghiền mịn mẫu lá và tách chiết DNA theo PP4 nêu trên, lượng

enzym RNase sử dụng cho thí nghiệm trong khảo sát này là 3μl Sau đó tiến hành điện

di để kiểm tra DNA sau khi tách chiết Ta sẽ chỉ đánh giá chất lượng của vạch DNA thu được mà không đánh giá hiệu quả loại RNA

b Khảo sát lượng enzym RNase

Cố định lượng bột lá sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 20mg Tiến hành nghiền mịn

mẫu lá và tách chiết DNA theo PP4 nêu trên Lượng RNase sử dụng được khảo sát lần

lượt là là 1μl, 2μl, 3μl, 4μl và 5μl Sau đó tiến hành điện di để kiểm tra chất lượng DNA

và hiệu quả loại RNA của RNase

2.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS

2.3.2.1 Thành phần của một phản ứng PCR

Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 với tổng thể tích phản ứng là 10μl bao gồm: 3,5μl nước cất pha tiêm, 1μl buffer PCR, 1μl mồi ITS1, 1μl mồi ITS4, 1μl dNTPs mix, 0,5μl enzym Taq DNA polymerase và 2μl DNA mẫu

Bảng 2.4.Chương trình PCR cho mồi ITS

2.3.2.3 Quy trình điện di trên gel agarose

Các sản phẩm PCR được phối hợp với 2μl loading dye 2X, sau đó được tra vào các giếng trên gel Tiến hành điện di trên gel agarose 1,2% có chứa chất nhuộm màu phát quang RedSafe trong dung môi TAE1X Điều kiện thiết lập máy chạy điện di như sau: 120V, 200mA, 20W, tiến hành chạy trong 30 phút Sau đó nhấc bản gel ra và quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 302nm, DNA sẽ phát sáng dưới ánh sáng UV nhờ liên kết với chất nhuộm Chất lượng sản phẩm PCR được đánh giá bằng cách quan sát vạch điện di xem có sáng, đậm và rõ nét hay không

2.3.2.4 Phương pháp thôi gen theo kit Qiagen

- Cắt lấy đoạn DNA mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml

- Bổ sung buffer Qiagen theo tỷ lệ 3 thể tích Qiagen : 1 thể tích gel (100mg :100μl) - Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn

- Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5

- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút

- Bổ sung 500 μl buffer Qiagen vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa

- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút

- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5ml sạch - Để hoà tan DNA, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút, thu lượng DNA tinh sạch

2.3.2.5 Giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, được giải trình tự hai chiều (chiều xuôi và ngược) tại công ty TNHH DNA Sequencing (Việt Nam) Trình tự DNA được xử lý bằng phần mềm MEGA11, sau đó xây dựng cây phát sinh loài để đánh giá đa dạng di truyền

2.3.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP

2.3.3.1 Thành phần phản ứng PCR

Thực hiện phản ứng PCR sử dụng mồi EBAP với tổng thể tích phản ứng là 10μl bao gồm: 3μl nước cất pha tiêm, 1μl buffer PCR, 0,5μl mồi EBAP, 1μl dNTPs mix, 0,5μl enzym Taq DNA polymerase và 4μl DNA mẫu

Bảng 2.6.Chương trình PCR cho mồi EBAP

37 chu kì 50 1’15s

72 1’30s

2.3.3.3 Điện di và phân tích dữ liệu

Tiến hành điện di tương tự như mục 2.3.2.3, chỉ các dải rõ nét mới được sử dụng để phân tích thống kê Mỗi dải khuếch đại có thể phân biệt rõ ràng được đánh số 1, nếu không có dải nào ở kích thước tương tự được đánh số 0, tạo thành ma trận dữ liệu nhị phân Kết quả sau đó được xử lý bằng phần mềm SPSS áp dụng phương pháp Hierarchical Data (phân cấp dữ liệu), kết quả được thể hiện qua biểu đồ dendrogram

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Khảo sát phương pháp và điều kiện tách chiết DNA

3.1.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA

Từ các mẫu DNA tách chiết theo các phương pháp khác nhau, chọn các mẫu E_03, E_04 và E_08 là các mẫu đại diện để đánh giá hiệu quả tách chiết của các phương pháp Các sản phẩm DNA điện di trên gel agarose 1,2%

Kết quả điện di kiểm tra DNA sau tách chiết bằng 5 phương pháp trong phần phương pháp nghiên cứu được thể hiện trong hình 3.1

Hình 3.1.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA của 5 phương pháp tách chiết

Nhận xét:

Các phương pháp chiết tách DNA tổng số khác nhau cho chất lượng DNA là khác nhau Phương pháp 1 (PP1) không tách được DNA từ các mẫu Các phương pháp còn lại nhìn chung có tách được DNA, sau khi điện di cho ra vạch gọn, đạt yêu cầu về khả năng tách DNA

Về độ tinh sạch của DNA: PP4 và PP5 có sử dụng enzym RNase để thuỷ phân

RNA lẫn vào dịch chiết cho kết quả thuỷ phân ARN tốt PP4 gần như đã loại hoàn toàn RNA PP5 chỉ loại được một phần RNA do nhiệt độ ủ với enzym cao nên làm giảm hiệu suất thuỷ phân PP2 và PP3 không sử dụng enzym thì sản phẩm còn lẫn nhiều RNA

Do vậy, PP4 được lựa chọn để tách chiết toàn bộ các mẫu DNA trong các nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành tách chiết DNA bằng PP4 trên toàn bộ mẫu nghiên cứu Kết quả điện

di kiểm tra nồng độ DNA được thể hiện trong hình 3.2

Hình 3.2.Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA sau tách chiết theo PP4

Nhận xét: Các băng DNA của 8 mẫu đều gọn và đồng đều, không có tạp chất

Điều này chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Khảo sát điều kiện tách chiết

3.1.2.1 Khảo sát khối lượng bột lá

Tiến hành khảo sát khối lượng bột lá (10mg, 20mg, 30mg, 40mg) của các mẫu E_01, E_07 và E_08 cần cho quá trình tách chiết DNA theo PP4 Kết quả điện di các mẫu khảo sát được thể hiện trong hình 3.3

Hình 3.3.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát khối lượng

để tách DNA

Nhận xét: Tất cả các vạch DNA đều lên đẹp, rõ ràng Với lượng bột lá là 10mg

cho vạch DNA đủ đậm, rõ, không lẫn RNA Với lượng bột lá từ 20mg đến 40mg cho vạch DNA rõ, tuy nhiên lượng RNA còn sót lại khá lớn Do đó, lựa chọn lượng bột lá là 10mg để có thể tách được DNA với chất lượng đủ tốt, ít lẫn ARN, tiết kiệm được hoá chất

3.1.2.2 Khảo sát lượng enzym RNase

Tiến hành chiết tách DNA từ các mẫu E_01, E_07 và E_08 bằng phương pháp

4 với lượng enzym RNase khác nhau (1µl, 2µl, 3µl, 4µl và 5µl) Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA khi khảo sát lượng enzym RNase được thể hiện ở hình 3.4

Hình 3.4.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát lượng RNase

Nhận xét: Các băng DNA thu được đều rõ ràng Ở các thí nghiệm sử dụng 5µl

enzym, lượng ARN rất ít, hầu như không thấy Ở các thí nghiệm còn lại vẫn thấy xuất hiện ARN, lượng ARN giảm tuyến tính từ các ống 1µl đến các ống 4µl Như vậy càng tăng lượng enzym thì lượng ARN được loại đi càng nhiều, khả năng thuỷ phân ARN tốt nhất ở ống chứa 5µl enzym tương ứng với 20mg bột lá

3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS

3.2.1 Kết quả khuếch đại DNA

Sản phẩm PCR được điện di trên agarose 1,2% để kiểm tra Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.5

Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm DNA khuếch đại

L: ladder (thang đo); 1 – 8: đường chạy của các mẫu E_01 – E_08

Nhận xét: Sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1-ITS4 cho kết quả 8 mẫu E_01

– E_08 đều có băng đơn hình với kích thước khoảng 700-800bp Các băng lên vạch gọn, rõ, đều, cho thấy phản ứng PCR đã diễn ra tốt, đoạn trình tự đủ điều kiện để tiến hành tinh sạch và giải trình tự nucleotid vùng ITS

3.2.2 So sánh trình tự DNA ribosom vùng ITS

Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự tại công ty TNHH DNA Sequencing Trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của các mẫu được so sánh với nhau bằng công cụ gióng hàng trình tự MUSCLE của phần mềm MEGA11 Kết quả gióng hàng được trình bày trong phụ lục 4.2

Thông qua quá trình khuếch đại và giải trình tự đối với các mẫu khảo sát, xác định độ dài của trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 trong bảng 3.1

Bảng 3.1.Độ dài các trình tự 8 mẫu Elsholtzia Willd

Nhận xét: Số lượng nucleotid của đoạn trình tự ITS trong 8 mẫu nghiên cứu dao

động từ 740 đến 756 nucleotid, cho thấy có sự khác biệt trong di truyền giữa các mẫu nghiên cứu Ngoài ra, độ nhiễu của máy giải trình tự có thể khiến một đoạn trình tự đầu và cuối vùng ITS1-5,8S-ITS2 có sự sai khác lớn

Khảo sát thành phần nucleotid thuộc trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của các mẫu nghiên cứu thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2.Thành phần bốn loại nucleotid của 8 mẫu Elsholtzia Willd

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy thành phần T (Thymine), C (Cytosine), A

(Adenine) và G (Guanine) của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt Các mẫu nghiên cứu đều có tỷ lệ % của GC cao hơn AT Mẫu E8-ITS1 có tỷ lệ GC cao nhất (62,4%) và AT thấp nhất (37,6%) Tỷ lệ trung bình của GC là 58,4% và AT là 41,6%

Sau khi sử dụng phần mềm MEGA11 để cắt ghép trình tự của hai đoạn DNA xuôi và ngược, kết quả thu được trình tự đoạn ITS-rDNA của 8 mẫu nghiên cứu Khoảng cách di truyền trong trình tự ITS1-5,8S-ITS2 của 8 mẫu nghiên cứu được tính toán thông qua công cụ Compute pairwise distances của phần mềm MEGA11 và được thống kê ở bảng 3.3 Hệ số tương đồng được tính toán bằng công cụ BLAST và được thống kê ở

bảng 3.4

Bảng 3.3.Khoảng cách di truyền giữa 8 mẫu Elsholtzia Willd

ITS1

E1-ITS1

E2-ITS1

E3-ITS1

E4-ITS1

E5-ITS1

E6-ITS1

E7-ITS1 E1-ITS1

E8-E2-ITS1 0,1241 E3-ITS1 0,1054 0,1032 E4-ITS1 0,1512 0,1503 0,0803 E5-ITS1 0,0267 0,1160 0,1017 0,1398 E6-ITS1 0,1522 0,1008 0,1182 0,1430 0,1500 E7-ITS1 0,1612 0,1588 0,0928 0,0368 0,1588 0,1483 E8-ITS1 0,1402 0,1541 0,0956 0,1209 0,1356 0,1633 0,1377

Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy các mẫu Kinh giới khá đa dạng về mặt di

truyền Hệ số tương đồng dao động từ 84,95% đến 97,02% Khoảng cách di truyền gần nhất là 0,0267 và xa nhất là 0,1633

Bảng 3.4.Hệ số tương đồng của từng cặp mẫu

ITS1

E1-ITS1

E2-ITS1

E3-ITS1

E4-ITS1

E5-ITS1

E6-ITS1

E7-ITS1

- Nhóm 1.1: E_01 (Elsholtzia penduliflora) và E_05 (Elsholtzia flava) - Nhóm 1.2: E_02 (Elsholtzia blanda) và E_06 (Elsholtzia communis)

Nhóm II gồm 4 mẫu được chia thành 2 nhóm phụ là:

- Nhóm 2.1: E_03 (Elsholtzia fruticosa) - Nhóm 2.2: E_04, E_07 và E_08 (Elsholtzia ciliata)

Hình 3.6.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia dựa trên chỉ thị ITS

Như vậy, kết quả của cây quan hệ phát sinh loài là phù hợp với phân loại định

danh loài ban đầu Các mẫu E_04, E_07 và E_08 được xác định là loài E ciliata đều

thuộc cùng một nhóm

3.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP

Các mẫu nghiên cứu được khuếch đại bằng PCR với 7 mồi EBAP cho sản phẩm điện di sáng và đủ rõ để đọc ở tất cả các mẫu Sản phẩm PCR của 7 marker EBAP được sắp xếp dựa trên Hierarchical Clustering (phân cấp dữ liệu) Hình 3.8 tổng hợp 7 bộ dữ liệu tương ứng với 7 marker EBAP

Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 7 mồi cho 64 băng, trong đó có 59 băng đa hình, chiếm 92,2%, kích thước các băng từ 200bp đến 1500bp So sánh các mồi sử dụng, có 4/7 mồi có tỷ lệ đa hình tuyệt đối Các mồi xuất hiện băng đơn hình là EBAP4, EBAP8 và EBAP23 Mồi EBAP8 cho 3 băng đơn hình

Bảng 3.5.Tỷ lệ băng đa hình của các mồi nghiên cứu

truyền

Số băng đa hình