Đã có một số nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Elsholtzia Willd., ví dụ như nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong tông Elsholtzieae ở Trung Quốc dựa trên ch
TỔNG QUAN
Chi Elsholtzia Willd
1.1.1 Vị trí phân loại của chi Elsholtzia Willd
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), chi Elsholtzia Willd được phân loại như sau [45]:
Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida Phân lớp Hoa môi – Lamiidae
Chi Kinh giới – Elsholtzia Willd
1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Elsholtzia Willd
Cây cỏ, cây bụi hay cây bụi nhỏ Thân thường vuông, nhẵn hay có lông Lá nguyên hay xẻ răng cưa, nhẵn hay có lông Cụm hoa dạng chùm hay dạng bông ở đỉnh cành, gồm các xim co tạo thành vòng giả, giãn cách hay không giãn cách, hoa tạt về một phía hay thành vòng Lá bắc tồn tại hình nét hoặc hình trứng Đài hình chuông hay hình ống, 5 thùy gần đều nhau hoặc 2 thuỳ trước dài hơn Tràng màu trắng, hơi vàng hoặc tía, có ống thẳng hoặc cong hơi thò khỏi đài, 2 môi: môi trên 2 thùy, môi dưới 3 thùy Nhị 4, hướng về 2 phía hay hướng thẳng; chỉ nhị thò dài hay ngắn khỏi tràng; 2 nhị dưới dài hơn hai nhị trên Bao phấn 2 ô, lúc đầu giãn ra sau chụm lại Bầu nhẵn hay có lông; vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa phát triển mạnh ở phần phía sau của bầu Quả hình bầu dục hay hình thuôn, nhẵn hay có lông, có nốt sần [5], [25]
1.1.3 Khoá phân loại chi Elsholtzia Willd
Theo Thực vật chí Việt Nam, xác định được 7 loài thuộc chi Elsholtzia, bao gồm
Elsholtzia ciliata, E.winitiana, E.blanda, E.rugulosa, E.communis, E.penduliflora và
E.pilosa [5], trong đó phổ biến nhất là loài Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.:
1A Cụm hoa gồm các hoa tạt về một phía
2A Lá bắc lớn, hình trứng rộng hay gần tròn (cỡ 4-5x3-4mm) 1 E.ciliata 2B Lá bắc nhỏ, hình mác hẹp hay hình đường
3A Hoa màu trắng Lá bắc hình mác hẹp (cỡ 1,5-2 mm), ngắn hơn hoa 2 E.blanda 3B Hoa màu đỏ nhạt hay tím nhạt Lá bắc hình đường (dài 5-6mm), dài hơn hoa 3 E.pilosa
1B Cụm hoa có dạng hình trụ, hoa không tạt về một phía
4A Cụm hoa dạng chùm giãn cách
5A Hoa rủ xuống phía dưới sau khi hoa nở Lá gần như nhẵn
5B Hoa hướng lên sau khi nở Lá có lông, mặt trên phiến lá có nhiều nếp nhăn (sần) 5 E.rugulosa 4B Cụm hoa dạng bông xít nhau
6A Lá bắc hình đường (dài 3-5mm) thường ngắn hơn hoa Các bông trong cụm hoa thường không mọc đối .6 E.communuis 6B Lá bắc hình mác ngược, hẹp (dài 2,5-3mm), thường dài hơn hoa Các bông trong cụm hoa mọc đối nhau 7 E.winitiana Năm 2020, Hoàng Thanh Sơn và cộng sự đã ghi nhận thêm loài Elsholtzia kachinensis Prain có mặt ở Việt Nam Như vậy, tổng số loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam là 8 loài Trong nghiên cứu này cũng đưa ra khoá phân loại mới gồm 7 loài (trừ loài E.penduliflora W W Smith) [21]:
1a Lá bắc rộng, hình trứng
2a Cụm hoa hình trụ, bao phấn màu vàng .1 E.kachinensis 2b Cụm hoa tạt về một phía, bao phấn màu tím đen 2 E.ciliata 1b Lá bắc nhỏ, hình mác hẹp, hình dùi hay hình đường
3a Mặt dưới của lá trơn nhẵn hoặc có lông trên các gân lá
4a Tràng hoa màu trắng, nhị chìa ra phía trước 3 E.blanda 4b Tràng hoa màu màu hơi đỏ, nhị phía trước ngắn hơn 4 E.pilosa 3b Mặt dưới của lá có lông nhung dày hoặc thưa
5a Mặt dưới của lá màu hơi trắng, đôi khi hơi vàng khi khô, khác màu với mặt trên của lá 5 E.rugulosa 5b Mặt dưới của lá có lông nhung màu xám hoặc trắng, cùng màu với mặt trên của lá
6a Tràng hoa màu trắng 6 E.winitiana 6b Tràng hoa màu hồng tím 7 E.communis
1.1.4 Công dụng và tác dụng dược lý của chi Elsholtzia Willd
Chi Elsholtzia Willd thuộc họ Lamiaceae có khoảng 40 loài phân bố trên khắp thế giới, trong số đó có tới 33 loài phân bố ở Đông Á, chủ yếu ở Trung Quốc [25], ở Việt Nam hiện ghi nhận được 8 loài thuộc chi này [5], [21] Trong số các loài này, có một số loài được dùng làm thuốc, một số được dùng làm thực phẩm hoặc nguồn hoa để sản xuất mật ong [5], [25]
Các loài trong chi Elsholtzia từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian, công dụng phổ biến nhất của chi này là điều trị cảm lạnh, sốt, tiêu chảy, kiết lị, rối loạn tiêu hoá, say nắng, thải độc,… [41], chủ yếu được dùng dưới dạng thuốc sắc Một số loài được sử dụng làm thuốc chữa cảm lạnh như E.ciliata, E.blanda, E.communis,
E.penduliflora, E.rugulosa Loài E.ciliata cũng thường được dùng để trị cảm lạnh, hạ sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, phù nề [49], làm gia vị và làm nguồn nuôi ong mật [5]
Một số loài Elsholtzia được dùng làm thuốc chống viêm và giảm đau, chẳng hạn như E.rugulosa, E.penduliflora, E.blanda và E.ciliata Ngoài trị cảm sốt, E.rugulosa còn được dùng để trị chứng khó tiêu, đau bụng, đầy bụng, viêm dạ dày – ruột, kiết lỵ, chảy máu cam, ho ra máu, đau bụng sau sinh, vết loét, trị rắn cắn Loài E.blanda có tác dụng chữa viêm gan, kiết lỵ, viêm amidan, đau răng, viêm dạ dày ruột cấp tính, viêm bể thận cấp và mãn tính [28]
E.penduliflora thường được dùng làm thuốc chữa bệnh than, vết thương nhiễm trùng, cúm, viêm họng, viêm amidan, viêm phổi, viêm phế quản, sốt rét, viêm tuyến sữa và dùng làm thực phẩm [5], [36] E.communis được dùng làm thuốc trị đau đầu, khó tiêu E.kachinensis còn được dùng làm thực phẩm [11]
Trong y học hiện đại, một số loài Elsholtzia được cho rằng có chứa nhiều thành phần có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm, giảm đau, chống oxy hoá, ngừa thiếu máu cơ tim và tăng cường miễn dịch [13], [19], [28]
Tinh dầu trong một số loài Elsholtzia có hoạt tính ức chế một số vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gram âm (Esherichia coli) và nấm men (Candida albicans) [22] Ngoài ra, tinh dầu hoặc nước sắc của một số loài Elsholtzia cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Shigella flexneri, Bacterium paratyphosum B, Bacillus typhi murium, Bacillus dysenteriae, Bacillus diphtheriae, Bacillus meningitidis purulentae, Bacillus proteus, anthrax Bacillus, Neisseria intracellularis [28]
Flavonoid từ E.blanda có tác dụng ức chế hoạt tính creatine kinase-MB (CK-MB) và malondialdehyd trong huyết thanh, làm giảm huyết áp và áp lực lên mạch vành [26] Flavonoid từ E.rugulosa có tác dụng ức chế hoạt động của virus cúm [29] Hợp chất phenolic có trong E.ciliata có khả năng chống viêm và chống oxy hoá hiệu quả [37].
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS (Internal Transcribed Spacer)
1.2.1 Vùng phiên mã nội thuộc DNA ribosom nhân (ITS-rDNA)
1.2.1.1 Cấu trúc và chức năng vùng ITS-DNA ribosom
DNA ribosom nhân hay rDNA là nhóm gen mã hoá rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hoá cho bất kì protein nào Các gen bản sao của ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra tương đồng và các
5 khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các đoạn mồi thiết kế dựa trên những oligonucleotid có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả các vi sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều đoạn mồi cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật
Các gen DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại được sắp xếp theo thứ tự DNA ribosome nhân có hai vùng sao mã: ITS-1 nằm giữa tiểu phần nhỏ (16S-18S) và 5,8S của gen và ITS-2 nằm giữa 5,8S và tiểu phần lớn (23S-28S) của gen Hai vùng này và tiểu phần 5,8S được gọi chung là vùng sao mã bên trong (ITS)
Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng ITS và các vùng ETS Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lặp lại là vùng không phiên mã Có một rDNA 5S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm [18] rDNA 18S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi song rRNA 5S là thành phần không thể thiếu của nu- LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein [43]
Hình 1.1.Cấu trúc vùng ITS-DNA ribosom của sinh vật nhân chuẩn
Hình 1.1 cho thấy cấu trúc vùng ITS-rDNA của rDNA chứa các vùng 18S, 5,8S và 28S, tạo thành một cụm lặp đi lặp lại song song, rDNA 5S được mã hoá riêng biệt, vùng đệm không được mã hoá (NTS), vùng đệm được phiên mã ngoài (ETS), vùng đệm được phiên mã trong (ITS)
Các vùng ITS có kích thước từ 500 đến 750bp là các vùng tiến hóa nhanh nên có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài [10] Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS Số bản sao các đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30000 trong một tế bào ITS trở thành đối tượng quan trọng trong các nghiên cứu phân loại các taxon có mối liên hệ gần, do ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau Nghiên cứu về ITS cho phép hiểu biết sâu về tiến hoá và sự lai tạo ở các loài thực vật khác nhau Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài
Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng vùng ITS có thể tiến hành bằng cách khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu sử dụng ITS marker, sau đó sản phẩm khuếch đại được giải trình tự bằng máy tự động, từ đó xây dựng cây phân loại dựa vào số liệu so sánh các trình tự Có thể xác định sự thay đổi của các chuỗi bằng cách sử dụng enzym cắt hạn chế với vùng ITS, sau đó phân tách các phân đoạn bằng gel agarose hoặc polyacrylamide để xác định các gen khác biệt
1.2.1.2 Ưu điểm của vùng ITS
Vùng ITS là đối tượng được khai thác phổ biến trong các nghiên cứu về di truyền, do nó có nhiều ưu điểm như [10], [27], [32], [40]:
- Mang đặc tính di truyền của cả “bố” và “mẹ”, khác với các chỉ thị lục lạp và ty thể chỉ mang đặc tính di truyền của “mẹ”
- Dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại, với một số mồi phổ biến có sẵn và không cần phải thiết kế mồi riêng cho từng nghiên cứu, sử dụng được cho nhiều loại sinh vật khác nhau
- Có cấu trúc đa bản
- Khoảng cách di truyền có thể được xác định rõ ràng giữa các loài có cùng nguồn gốc
- Kích thước vừa phải (500-750bp) cho phép giải trình tự dễ dàng
Với những ưu điểm trên, trình tự nucleotid vùng ITS của rất nhiều loài đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới rất phong phú, thuận lợi cho phân tích và đối chiếu trình tự gen
1.2.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp số nhân, tạo ra số lượng bản sao gần như vô hạn của một trình tự DNA nào đó, là nguồn vật liệu cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo
PCR được phát triển năm 1983 bởi Kary B.Mullis, là kỹ thuật phổ biến trong các nghiên cứu y học, thú y, sinh học, tội phạm học, lịch sử, khảo cổ học [23], với nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản DNA để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về DNA [20], xác định kiểu gen sinh vật [44], xác định dấu vân tay DNA [12], phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm [16], [47], chẩn đoán các bệnh di truyền ở trẻ sơ sinh như hội chứng Down và bệnh Thalassemia [14], [46]
Phản ứng PCR được coi là một phiên bản đơn giản của quá trình sao chép DNA trong tế bào, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ lặp đi lặp lại trong phản ứng biến tính và tái bản các đoạn ngắn của chuỗi DNA hoặc RNA bằng cách sử dụng enzym chịu nhiệt Taq polymerase Sự khuếch đại tuân theo nguyên tắc ghép cặp bổ sung base [35],
7 quá trình này nói chung được thực hiện như các quy trình lặp lại gồm 3 giai đoạn như sau [17], [31]:
1) Giai đoạn biến tính DNA khuôn: Biến tính DNA bằng cách tăng nhiệt độ đến 94-96 o C khiến các liên kết hydro giữa các base bị phá vỡ, tạo thành phân tử DNA sợi đơn
2) Giai đoạn gắn mồi: giảm nhiệt độ xuống còn 55 o C để mồi gắn vào sợi DNA đơn, polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA
3) Giai đoạn kéo dài: duy trì nhiệt độ 72 o C để kéo dài chuỗi
Giai đoạn biến tính ban đầu có thể kéo dài khoảng 3 phút ở nhiệt độ 94 o C, mục đích để hoạt hoá Taq DNA polymerase và làm nóng phản ứng Số chu kỳ ba bước lặp lại là khoảng 25-35 chu kỳ Sau khi kết thúc các chu kỳ nhiệt, tiếp tục ủ ở 72 o C trong thời gian trên 5 phút, bước này cho phép hoàn thiện các sản phẩm khuếch đại và bổ sung lượng adenin vào đầu 3’ của tất cả các sản phẩm PCR Cuối cùng, kết thúc phản ứng bằng cách làm lạnh hỗn hợp ở 4 o C trong máy PCR [31]
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP (Exon Based
Exon là một phần quan trọng trong bộ gen của sinh vật nhân thực, tuy chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ (trên 1%) trong bộ gen nhưng có chức năng quan trọng là mã hoá thông tin di truyền [24] Tuy nhiên, cho tới nay có rất ít nghiên cứu sử dụng kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa trên khuếch đại mồi đơn được phát hiện cho vùng exon
Vùng ITS có tính bảo thủ cao trong loài, do vậy đối với các nghiên cứu mức độ dưới loài nó khó có thể phân biệt được Một kỹ thuật mới trong lĩnh vực nghiên cứu di truyền mang tên Kỹ thuật đa hình khuếch đại dựa trên exon (EBAP), là kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa trên sự đa dạng hoá của exon Kỹ thuật EBAP được thực hiện cũng dựa trên phản ứng khuếch đại gen (PCR), tuy nhiên mồi được sử dụng là mồi đơn được thiết kế dựa trên các vùng giàu base GC trong vùng exon [50]
Kỹ thuật đa hình khuếch đại dựa trên exon (EBAP) ra đời mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khám phá và ứng dụng các dấu ấn phân tử dựa trên vùng exon, là sự lựa chọn mới trong kho công cụ phân tích đa dạng di truyền hiện nay
1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi
Exon là các trình tự nucleotid trong DNA và RNA được bảo tồn trong quá trình tổng hợp mRNA Tuy chiếm tỷ lệ nhỏ (khoảng 2%) trong DNA nhưng nó mang thông tin di truyền và có thể biểu hiện gen, exon là một phần của khung đọc mở (ORF), được định nghĩa là một phần của DNA, không chứa bộ ba kết thúc nào và có khả năng mã hoá cho protein
Mồi đơn sử dụng trong kỹ thuật EBAP được thiết kế nhằm mục đích liên kết với các exon giàu base GC tại các ORF [24] Chiều dài của mồi đơn là 17bp, bao gồm 3 chuỗi [50]:
- Trình tự lấp đầy: là phần đầu của mồi, có độ dài là 6 base, có hàm lượng AT từ 66,67%, tỷ lệ A:T là 1:1
- Trình tự lõi trung gian: phần giữa của mồi, có độ dài 8 base, hàm lượng GC là 100%, tỷ lệ G:C là 1:3 trở lên
- Trình tự base chọn lọc: nằm ở đầu 3’, là 3 base cuối của mồi, trong đó base thứ nhất phải là A hoặc T, còn hai base còn lại thì có thể là một trong bốn loại base A, T, G hoặc C
1.3.3 Ứng dụng của chỉ thị EBAP trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Phương pháp EBAP được thực hiện dựa trên phản ứng khuếch đại gen, sử dụng mồi đơn làm mồi ngược cũng như mồi xuôi, gắn vào các vị trí đặc hiệu trên DNA và cho ra các bản sao DNA có các độ dài khác nhau, mỗi vạch thu được tương ứng với 1 DNA có kích thước khác nhau Kết quả điện di thu được là các băng đa hình đặc trưng
14 cho từng loài, qua phân tích các băng đa hình này có thể rút ra được khoảng cách di truyền giữa các loài và xây dựng được cây phân loại để phân biệt các loài, giống với nhau
Nghiên cứu của Xiong và cộng sự (2022) trên sáu loại cây trồng đã cho thấy hiệu quả của chỉ thị EBAP khi cho ra được nhiều dải đa hình đa dạng đặc trưng cho từng giống cây, chứng tỏ chỉ thị EBAP có tiềm năng lớn trong phân tích đa dạng di truyền [50]
Năm 2023, Nguyễn Thị Kim Anh đã sử dụng 2 loại chỉ thị lục lạp và chỉ thị trên nhân (EBAP) để phân tích đa dạng di truyền các giống Actiso trồng tại Việt Nam (Cynara cardunculus var scolymus L.) Kết quả thu được chỉ thị trên nhân có ưu thế vượt trội hơn ở cấp độ các giống, trong khi chỉ thị lục lạp chỉ phân biệt được sự pha trộn giống trong một nhóm hạt Kết luận này cũng chỉ ra chỉ thị EBAP có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu sự khác biệt ở cấp độ dưới loài [2]
Chỉ thị EBAP có một số ưu điểm vượt trội so với các chỉ thị khác như : a) thiết kế mồi đơn giản, giảm đáng kể chi phí tổng hợp mồi ; b) dù kỹ thuật EBAP dựa trên các kỹ thuật trước đó như RAPD và ISSR nhưng nó có khả năng tạo ra các chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng ; c) quá trình khuếch đại PCR được thực hiện ở nhiệt độ ủ cao hơn (50 o C), khắc phục nhược điểm của kỹ thuật SRAP và TRAP là dễ tạo dải dương tính giả do nhiệt độ ủ ban đầu thấp (35 o C), vì vậy kỹ thuật EBAP có ưu điểm là tính đặc hiệu tốt và độ lặp cao ; d) sử dụng mồi tương đối dài, khả năng nhân bản và ổn định cao hơn so với kỹ thuật RAPD truyền thống ; e) EBAP là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, hoạt động đơn giản, hiệu suất khuếch đại cao, cho dải khuếch đại tương đối phong phú [50]
Từ những nghiên cứu đã được thực hiện, nhận thấy rằng chỉ thị EBAP rất có khả năng trong việc phân tích đa dạng di truyền ở mức độ loài và dưới loài, cho kết quả có tính đặc hiệu cao, phù hợp trong nghiên cứu này.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Mẫu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 8 mẫu Kinh giới được thu hái tại các địa phương khác nhau tại miền Bắc Việt Nam vào tháng 11 năm 2021, gồm cả mẫu trồng và mẫu mọc hoang dại
Các mẫu đã được giám định tên khoa học
Bảng 2.1.Ký hiệu và nguồn gốc của các mẫu nghiên cứu STT Tên mẫu Kí hiệu Số hiệu tiêu bản Nơi thu mẫu
Chùa dù/ Kinh giới rủ
E_01 HNIP/18677/22 Xã Y Tý, huyện Bát
Ngùng lải(Elsholtzia blanda (Benth.)
E_02 HNIP/18670/22 Xã Y Tý, huyện Bát
Kê cốt sài (Elsholtzia fruticosa (D.Don)
E_03 HNIP/18676/22 Xã Y Tý, huyện Bát
E_04 HNIP/18671/22 Xã Y Tý, huyện Bát
E_05 HNIP/18675/22 Xã Y Tý, huyện Bát
Xã Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang
Xã Chàng Sơn, huyện Thạch Thất, thành phố Hà Nội
E_08 HNIP/18672/22 Xã Y Tý, huyện Bát
Các mẫu sau khi thu hái được làm khô bằng hạt silica gel trong túi kín ở nhiệt độ phòng (25 o C), sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -22 o C trong tủ lạnh âm sâu trước khi tiến hành tách chiết DNA
2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu
- Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB); 1M Tris pH 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0; 5M NaCl; nước cất pha tiêm
- Dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS) 5%
- Nito lỏng, hạt silica gel
- CE buffer (G-spin TM Total DNA Extraction Mini Kit)
- Mercaptoethanol, ethanol tuyệt đối, ethanol 70%, chloroform, isopropanol
- Enzym RNase (3mg/300à nước cất pha tiờm)
- Dung dịch đệm TAE1X: pha loãng với tỷ lệ 1/50 từ dung dịch gốc TAE50X (có thành phần như sau: tris base (Sigma): 121g, acid acetic glacial (Sigma): 28,6ml, EDTA (Sigma) 0,5M pH 8,0: 50ml, nước khử ion vừa đủ: 500ml)
- Chất hiện màu RedSafe TM Nucleic Acid Staining Solution
- Gel agarose 1,2%: cân 0,6g agarose, thêm 50ml đệm TAE1X, đun trong lò vi sóng khoảng 90 giây cho tan hoàn toàn, để nhiệt độ hạ xuống 60-65 o C, thêm 2,5μl RedSafe, lắc đều rồi đổ ra khay điện di (đã chuẩn bị sẵn khay và lược tạo giếng tra mẫu)
- Thang DNA 1kp chuẩn, thang 100bp chuẩn (Thermo Scientific)
- Hoá chất chạy PCR: nước cất pha tiêm, PCR buffer, dNTPs mix (2,5mM), enzyme Taq DNA polymerase (1U/àl), cỏc cặp mồi ITS (ITS1 và ITS4) và mồi EBAP 4, 6, 8,
17, 18, 22, 23 có trình tự nucleotid như sau:
Bảng 2.2.Danh sách các mồi sử dụng Tên mồi Nồng độ mồi Trình tự (5’→3’)
2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Máy PCR eppendorf mastercycler pro S
- Máy soi UV UVP PhotiDoc-It Imaging System (UV254)
- Ống eppendorf (2,0ml; 1,5ml; 0,2ml), micropippette (1000, 200, 100, 20, 10μl), đầu côn (tip 1000, 200, 10μl)
- Lò vi sóng Saiko, máy điện di Consort EV222, bể điều nhiệt Memmert
- Cân phân tích AY 220 Shimadzu
- Tủ lạnh âm sâu Sanyo Biomedical freezer MDF-U333
- Máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems)
- Các dụng cụ thường quy khác trong phòng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu 17 1 Nội dung 1: Khảo sát và xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu 17
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu
Khảo sát một số phương pháp và điều kiện tách chiết DNA bao gồm: khối lượng bột lá sử dụng để tách chiết DNA và lượng enzym RNase sử dụng trong quá trình ủ loại RNA Sau đó xây dựng phương pháp tách chiết DNA tối ưu nhất nhằm thu được DNA có chất lượng tốt, nồng độ DNA đủ lớn, ít lẫn RNA và tiết kiệm hoá chất
2.2.2 Nội dung 2: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS
Tiến hành phản ứng PCR các mẫu nghiên cứu sử dụng mồi ITS theo quy trình đã được khảo sát, sau đó tách lấy đoạn DNA tinh sạch và đem đi giải trình tự So sánh trình tự các đoạn DNA bằng phần mềm MEGA11 thu được cây phân loại phát sinh loài dựa trên chỉ thị ITS
2.2.3 Nội dung 3: Xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP
Tiến hành phản ứng PCR các mẫu nghiên cứu sử dụng mồi EBAP theo quy trình đã được khảo sát Trên sản phẩm điện di, xác định sự có mặt các băng di truyền tương ứng với các kích thước khác nhau Tổng hợp dữ liệu, xử lý bằng phần mềm SPSS theo phương pháp Hierarchical Data (phân cấp dữ liệu) để thu được cây phân loại phát sinh loài dựa trên chỉ thị EBAP.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu
2.3.1.1 Dung môi tách chiết DNA a Dung môi SDS 0,5%
0,1ml SDS 5%; 0,2ml 1M Tris pH 8,0; 0,05ml 0,5M EDTA pH 8,0; 0,1ml 2,5M NaCl; 0,55ml nước cất pha tiêm b Dung môi CTAB 4%
CTAB buffer 4%: 0,6g Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB); 3ml 1M Tris pH 8,0; 1,2ml 0,5M EDTA pH 8,0; 16,8ml 2,5M NaCl; 9ml nước cất pha tiêm
2.3.1.2 Khảo sát một số yếu tố của phương pháp tách chiết DNA tổng số a Thu thập và chuẩn bị mẫu
- Mẫu lá được thu hái là lá bánh tẻ (lá không quá non, không quá già), được làm khô bằng silica gel trong túi zip kín ở nhiệt độ phòng (25 o C), bảo quản lâu dài ở -22 o C
- Mẫu lá khô được nghiền thành bột mịn bằng chày cối sứ cùng với nito lỏng, cân khoảng 0,1mg bột lá đã nghiền mịn vào ống eppendorf 2,0ml Riêng với phương pháp SDS thì không cần nghiền mẫu b Các phương pháp tách chiết DNA
(1) Phương pháp 1: phương pháp SDS (PP1)
- Bước 1: Cắt lấy mẩu lá có diện tích khoảng 3x3mm cho vào ống eppendorf 0,2ml, gõ nhẹ cho mẩu lá rơi xuống đáy ống, cho dung dịch SDS buffer vào sao cho mẩu lá chìm hoàn toàn trong dung dịch buffer
- Bước 2: Đưa ống vào máy PCR và ủ ở 96 o C trong 10 phút, lấy ống ra và chuyển toàn bộ dịch vào ống 1,5ml khác
- Bước 3: Thêm 100μl isopropanol vào ống, trộn đều bằng vortex
- Bước 4: Ly tâm ở tốc độ 13rpm trong 20 phút, hút bỏ hoàn toàn dịch, giữ lại phần cắn ở dưới đáy ống Để khô cắn hoàn toàn
- Bước 5: Thêm 50μl CE để hoà tan cắn Bảo quản ở -22 o C
(2) Phương pháp 2: phương pháp CTAB không sử dụng mercaptoethanol (PP2)
- Bước 1: Cân khoảng 20mg bột lá đã nghiền mịn vào ống eppendorf dung tích 2ml
- Bước 2: Thêm 500μl CTAB buffer vào mỗi ống
- Bước 3: Ủ trong bể điều nhiệt ở 65 o C trong 1 giờ, cứ 15 phút lắc đều ống 1 lần Lấy ống ra, thêm 500 μl chloroform, lắc mạnh đến khi tạo dạng nhũ tương trắng như sữa Ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4 o C trong 15 phút
- Bước 4: Hút 300μl dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml khác, chú ý chỉ hút dịch không hút cắn Thêm 300μl isopropanol, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4 o C trong 15phút
- Bước 5: Hút bỏ toàn bộ dịch Thêm 300μl ethanol 70%, ly tâm với tốc độ 13rpm ở 4 o C trong 15 phút Hút bỏ toàn bộ dịch, để tủa khô tự nhiên qua đêm
- Bước 6: Thêm 50μl CE để hoà tan Bảo quản ở -22 o C
(3) Phương pháp 3: phương pháp CTAB (PP3)
- Bước 1: Chuẩn bị các mẫu bột lá đã được nghiền mịn, lấy vào mỗi ống khoảng 20mg bột lá
- Bước 2: Thêm mercaptoethanol vào đệm CTAB với tỷ lệ 60μl mercaptoethanol cho 30ml đệm
- Tiến hành chiết tương tự với các bước 2-6 của PP2
19 (4) Phương pháp 4: phương pháp CTAB kết hợp ủ với enzym RNase sau khi chiết DNA (PP4)
- Tiến hành chuẩn bị mẫu bột lá, đệm và tiến hành tách chiết DNA tương tự các bước ở PP3
- Sau khi có được dung dịch DNA/ CE buffer, thêm vào mỗi ống 5μl RNase Ủ các ống trong bể điều nhiệt ở 37 o C trong 2 giờ, cứ 10 phút lắc đều ống 1 lần Bảo quản ở -22 o C
(5) Phương pháp 5: phương pháp CTAB ủ với enzym RNase trong khi chiết
- Tiến hành chuẩn bị mẫu bột lá và đệm như ở PP3
- Thêm 500μl đệm vào các ống, thêm 5μl RNase vào mỗi ống
- Tiến hành tương tự như các bước 3-6 ở PP2 c Phương pháp điện di
Kết quả tách chiết được tiến hành điện di để kiểm tra nồng độ DNA Tiến hành như sau:
- Chuẩn bị bản gel agarose 1,2%, thêm đệm TAE1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel 0,5-1,0cm
- Trải tấm parafilm lên một mặt phẳng Hút 1μl dung dịch loading dye tạo thành các giọt trên miếng parafilm, số giọt tương ứng với số mẫu
- Hút mỗi mẫu 5μl DNA, hoà trộn với một giọt loading dye vừa tạo rồi tra vào các giếng theo thứ tự
- Chạy điện di với điều kiện 120V, 200mA, 20W trong 30 phút Kết quả điện di được quan sát dưới đèn tử ngoại Đánh giá kết quả tách chiết dựa trên tiêu chí: có quan sát được vạch DNA đậm và rõ nét hay không; có còn tạp RNA hay không
2.3.1.3 Khảo sát một số yếu tố của quy trình tách chiết DNA tổng số
Quá trình tách chiết DNA tổng số được tối ưu hơn bằng cách khảo sát một số yếu tố như khối lượng bột lá sử dụng và lượng enzym RNase thêm vào Để thuận tiện cho quá trình khảo sát, nhóm nghiên cứu lựa chọn 3 mẫu có thể chất lá khác biệt là E_01, E_07 và E_08 để tiến hành khảo sát a Khảo sát khối lượng bột lá
Khảo sát với các lượng bột lá lần lượt là 10mg, 20mg, 30mg và 40mg cho mỗi thí nghiệm Tiến hành nghiền mịn mẫu lá và tách chiết DNA theo PP4 nêu trên, lượng enzym RNase sử dụng cho thí nghiệm trong khảo sát này là 3μl Sau đó tiến hành điện di để kiểm tra DNA sau khi tách chiết Ta sẽ chỉ đánh giá chất lượng của vạch DNA thu được mà không đánh giá hiệu quả loại RNA
20 b Khảo sát lượng enzym RNase
Cố định lượng bột lá sử dụng cho mỗi thí nghiệm là 20mg Tiến hành nghiền mịn mẫu lá và tách chiết DNA theo PP4 nêu trên Lượng RNase sử dụng được khảo sát lần lượt là là 1μl, 2μl, 3μl, 4μl và 5μl Sau đó tiến hành điện di để kiểm tra chất lượng DNA và hiệu quả loại RNA của RNase
2.3.2 Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS
2.3.2.1 Thành phần của một phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 với tổng thể tích phản ứng là 10μl bao gồm: 3,5μl nước cất pha tiêm, 1μl buffer PCR, 1μl mồi ITS1, 1μl mồi ITS4, 1μl dNTPs mix, 0,5μl enzym Taq DNA polymerase và 2μl DNA mẫu
Bảng 2.3.Thành phần phản ứng PCR sử dụng chỉ thị ITS
Tổng thể tớch phản ứng 10 àl 2.3.2.2 Chương trình chạy PCR
Quá trình khuếch đại được thực hiện trong máy PCR Đầu tiên cần hoạt hoá enzym Taq DNA polymerase trong 5 phút ở nhiệt độ 94 o C Sau đó tiến hành lặp lại 35 chu kì với mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn lần lượt như sau: 94 o C trong 20 giây; 60 o C trong
15 giây; 72 o C trong 50 giây Sau đó duy trì nhiệt độ ở 72 o C trong 15 phút để quá trình kéo dài được hoàn thiện Cuối cùng đưa nhiệt độ của máy PCR về nhiệt độ phòng, kết thúc phản ứng PCR Chất lượng sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose
Bảng 2.4.Chương trình PCR cho mồi ITS Nhiệt độ ( o C) Thời gian Vòng lặp
2.3.2.3 Quy trình điện di trên gel agarose
Các sản phẩm PCR được phối hợp với 2μl loading dye 2X, sau đó được tra vào các giếng trên gel Tiến hành điện di trên gel agarose 1,2% có chứa chất nhuộm màu phát quang RedSafe trong dung môi TAE1X Điều kiện thiết lập máy chạy điện di như sau: 120V, 200mA, 20W, tiến hành chạy trong 30 phút Sau đó nhấc bản gel ra và quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 302nm, DNA sẽ phát sáng dưới ánh sáng UV nhờ liên kết với chất nhuộm Chất lượng sản phẩm PCR được đánh giá bằng cách quan sát vạch điện di xem có sáng, đậm và rõ nét hay không
2.3.2.4 Phương pháp thôi gen theo kit Qiagen
- Cắt lấy đoạn DNA mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml
- Bổ sung buffer Qiagen theo tỷ lệ 3 thể tích Qiagen : 1 thể tích gel (100mg :100μl)
- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn
- Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5
- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ
- Bổ sung 500 μl buffer Qiagen vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13000 rpm trong
1 phút để loại hết agarose dư thừa
- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút
- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5ml sạch
- Để hoà tan DNA, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13000 rpm trong 1 phút, thu lượng DNA tinh sạch
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Khảo sát phương pháp và điều kiện tách chiết DNA
3.1.1 Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA
Từ các mẫu DNA tách chiết theo các phương pháp khác nhau, chọn các mẫu E_03, E_04 và E_08 là các mẫu đại diện để đánh giá hiệu quả tách chiết của các phương pháp Các sản phẩm DNA điện di trên gel agarose 1,2%
Kết quả điện di kiểm tra DNA sau tách chiết bằng 5 phương pháp trong phần phương pháp nghiên cứu được thể hiện trong hình 3.1
Hình 3.1.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA của 5 phương pháp tách chiết
Các phương pháp chiết tách DNA tổng số khác nhau cho chất lượng DNA là khác nhau Phương pháp 1 (PP1) không tách được DNA từ các mẫu Các phương pháp còn lại nhìn chung có tách được DNA, sau khi điện di cho ra vạch gọn, đạt yêu cầu về khả năng tách DNA
Về độ tinh sạch của DNA: PP4 và PP5 có sử dụng enzym RNase để thuỷ phân RNA lẫn vào dịch chiết cho kết quả thuỷ phân ARN tốt PP4 gần như đã loại hoàn toàn RNA PP5 chỉ loại được một phần RNA do nhiệt độ ủ với enzym cao nên làm giảm hiệu suất thuỷ phân PP2 và PP3 không sử dụng enzym thì sản phẩm còn lẫn nhiều RNA
Do vậy, PP4 được lựa chọn để tách chiết toàn bộ các mẫu DNA trong các nghiên cứu tiếp theo
Tiến hành tách chiết DNA bằng PP4 trên toàn bộ mẫu nghiên cứu Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA được thể hiện trong hình 3.2
Hình 3.2.Kết quả điện di kiểm tra nồng độ DNA sau tách chiết theo PP4
Nhận xét : Các băng DNA của 8 mẫu đều gọn và đồng đều, không có tạp chất Điều này chứng tỏ DNA có chất lượng tốt, có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo
3.1.2 Khảo sát điều kiện tách chiết
3.1.2.1 Khảo sát khối lượng bột lá
Tiến hành khảo sát khối lượng bột lá (10mg, 20mg, 30mg, 40mg) của các mẫu E_01, E_07 và E_08 cần cho quá trình tách chiết DNA theo PP4 Kết quả điện di các mẫu khảo sát được thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.3.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát khối lượng để tách DNA
Nhận xét : Tất cả các vạch DNA đều lên đẹp, rõ ràng Với lượng bột lá là 10mg cho vạch DNA đủ đậm, rõ, không lẫn RNA Với lượng bột lá từ 20mg đến 40mg cho vạch DNA rõ, tuy nhiên lượng RNA còn sót lại khá lớn Do đó, lựa chọn lượng bột lá là 10mg để có thể tách được DNA với chất lượng đủ tốt, ít lẫn ARN, tiết kiệm được hoá chất
3.1.2.2 Khảo sát lượng enzym RNase
Tiến hành chiết tách DNA từ các mẫu E_01, E_07 và E_08 bằng phương pháp
4 với lượng enzym RNase khỏc nhau (1àl, 2àl, 3àl, 4àl và 5àl) Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA khi khảo sát lượng enzym RNase được thể hiện ở hình 3.4
Hình 3.4.Kết quả điện di kiểm tra chất lượng DNA các mẫu khảo sát lượng RNase
Nhận xột : Cỏc băng DNA thu được đều rừ ràng Ở cỏc thớ nghiệm sử dụng 5àl enzym, lượng ARN rất ít, hầu như không thấy Ở các thí nghiệm còn lại vẫn thấy xuất hiện ARN, lượng ARN giảm tuyến tớnh từ cỏc ống 1àl đến cỏc ống 4àl Như vậy càng tăng lượng enzym thì lượng ARN được loại đi càng nhiều, khả năng thuỷ phân ARN tốt nhất ở ống chứa 5àl enzym tương ứng với 20mg bột lỏ.
Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS
3.2.1 Kết quả khuếch đại DNA
Sản phẩm PCR được điện di trên agarose 1,2% để kiểm tra Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.5
Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm DNA khuếch đại
L: ladder (thang đo); 1 – 8: đường chạy của các mẫu E_01 – E_08
Nhận xét : Sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1-ITS4 cho kết quả 8 mẫu E_01
– E_08 đều có băng đơn hình với kích thước khoảng 700-800bp Các băng lên vạch gọn, rõ, đều, cho thấy phản ứng PCR đã diễn ra tốt, đoạn trình tự đủ điều kiện để tiến hành tinh sạch và giải trình tự nucleotid vùng ITS
3.2.2 So sánh trình tự DNA ribosom vùng ITS
Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự tại công ty TNHH DNA Sequencing Trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của các mẫu được so sánh với nhau bằng công cụ gióng hàng trình tự MUSCLE của phần mềm MEGA11 Kết quả gióng hàng được trình bày trong phụ lục 4.2
Thông qua quá trình khuếch đại và giải trình tự đối với các mẫu khảo sát, xác định độ dài của trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 trong bảng 3.1
Bảng 3.1.Độ dài các trình tự 8 mẫu Elsholtzia Willd
Ký hiệu đoạn gen khuếch đại
Tổng số Nucleotid giải trình tự
Nhận xét : Số lượng nucleotid của đoạn trình tự ITS trong 8 mẫu nghiên cứu dao động từ 740 đến 756 nucleotid, cho thấy có sự khác biệt trong di truyền giữa các mẫu nghiên cứu Ngoài ra, độ nhiễu của máy giải trình tự có thể khiến một đoạn trình tự đầu và cuối vùng ITS1-5,8S-ITS2 có sự sai khác lớn
Khảo sát thành phần nucleotid thuộc trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của các mẫu nghiên cứu thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.2
27 Bảng 3.2.Thành phần bốn loại nucleotid của 8 mẫu Elsholtzia Willd
STT Ký hiệu đoạn gen
Nhận xét : Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy thành phần T (Thymine), C (Cytosine), A
(Adenine) và G (Guanine) của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt Các mẫu nghiên cứu đều có tỷ lệ % của GC cao hơn AT Mẫu E8-ITS1 có tỷ lệ GC cao nhất (62,4%) và AT thấp nhất (37,6%) Tỷ lệ trung bình của GC là 58,4% và AT là 41,6%
Sau khi sử dụng phần mềm MEGA11 để cắt ghép trình tự của hai đoạn DNA xuôi và ngược, kết quả thu được trình tự đoạn ITS-rDNA của 8 mẫu nghiên cứu Khoảng cách di truyền trong trình tự ITS1-5,8S-ITS2 của 8 mẫu nghiên cứu được tính toán thông qua công cụ Compute pairwise distances của phần mềm MEGA11 và được thống kê ở bảng 3.3 Hệ số tương đồng được tính toán bằng công cụ BLAST và được thống kê ở bảng 3.4
Bảng 3.3.Khoảng cách di truyền giữa 8 mẫu Elsholtzia Willd
Nhận xét : Kết quả phân tích cho thấy các mẫu Kinh giới khá đa dạng về mặt di truyền Hệ số tương đồng dao động từ 84,95% đến 97,02% Khoảng cách di truyền gần nhất là 0,0267 và xa nhất là 0,1633
Bảng 3.4.Hệ số tương đồng của từng cặp mẫu E1-
3.2.3 Xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa các mẫu Elsholtzia nghiên cứu dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2
Sau khi xác định được trình tự nucleotid vùng ITS, tiến hành xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA11 theo phương pháp Maximum likelihood Kết quả phân tích cây phát sinh loài cho thấy 8 mẫu Elsholtzia được phân thành 2 nhóm chính và thể hiện trong hình 3.6
- Nhóm I: gồm các mẫu E_01, E_05, E_02 và E_06
- Nhóm II: gồm các mẫu E_03, E_04, E_07 và E_08
Nhóm I gồm 4 mẫu được chia thành 2 nhóm phụ là:
- Nhóm 1.1: E_01 (Elsholtzia penduliflora) và E_05 (Elsholtzia flava)
- Nhóm 1.2: E_02 (Elsholtzia blanda) và E_06 (Elsholtzia communis)
Nhóm II gồm 4 mẫu được chia thành 2 nhóm phụ là:
29 Hình 3.6.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia dựa trên chỉ thị ITS
Như vậy, kết quả của cây quan hệ phát sinh loài là phù hợp với phân loại định danh loài ban đầu Các mẫu E_04, E_07 và E_08 được xác định là loài E ciliata đều thuộc cùng một nhóm.
Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP
Các mẫu nghiên cứu được khuếch đại bằng PCR với 7 mồi EBAP cho sản phẩm điện di sáng và đủ rõ để đọc ở tất cả các mẫu Sản phẩm PCR của 7 marker EBAP được sắp xếp dựa trên Hierarchical Clustering (phân cấp dữ liệu) Hình 3.8 tổng hợp 7 bộ dữ liệu tương ứng với 7 marker EBAP
Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 7 mồi cho 64 băng, trong đó có 59 băng đa hình, chiếm 92,2%, kích thước các băng từ 200bp đến 1500bp So sánh các mồi sử dụng, có 4/7 mồi có tỷ lệ đa hình tuyệt đối Các mồi xuất hiện băng đơn hình là EBAP4, EBAP8 và EBAP23 Mồi EBAP8 cho 3 băng đơn hình
30 Bảng 3.5.Tỷ lệ băng đa hình của các mồi nghiên cứu
STT Mồi Số băng di truyền
Tỷ lệ băng đa hình
Hình 3.7.Kết quả điện di và phân tích dữ liệu của EBAP4
31 Áp dụng phương pháp phân cấp dữ liệu (Hierarchical Data) cho việc sắp xếp sản phẩm PCR từ các mẫu nghiên cứu, kết quả được thể hiện qua biểu đồ dendrogram trong hình 3.8 hiển thị mối quan hệ phân cấp giữa các nhóm
Cây phân loại được xác định dựa trên sơ đồ Dendrogram hiển thị mối quan hệ phân cấp giữa các nhóm:
Hình 3.8.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia dựa trên chỉ thị EBAP
Kết quả phân tích dựa trên 7 bộ dữ liệu di truyền từ 7 marker EBAP cho thấy sự phân chia của các mẫu Elsholtzia vào 3 nhóm khác nhau, cho thấy có sự khác biệt trong di truyền của các loài này 8 loài Elsholtzia được phân vào 3 nhóm:
- Nhóm I: gồm các mẫu E_04, E_07 và E_08 là các mẫu được xác định là cùng một loài Elsholtzia ciliata Sự khác biệt trong kết quả điện di ba mẫu trên có thể do các mẫu có khác biệt di truyền mức độ dưới loài
- Nhóm II: gồm các mẫu E_01 (Elsholtzia penduliflora) và E_05 (Elsholtzia flava)
- Nhóm III: gồm các mẫu E_02 (Elsholtzia blanda), E_03 (Elsholtzia fruticosa) và E_06 (Elsholtzia communis)
BÀN LUẬN
Về phương pháp và khảo sát điều kiện tách chiết
Nghiên cứu đã khảo sát một số phương pháp tách chiết và đánh giá mức độ phù hợp của phương pháp đối với dược liệu cụ thể là lá Kinh giới, có thể áp dụng cho các dược liệu khác tương tự Trong khảo sát, mức độ phù hợp được đánh giá dựa trên chất lượng, độ sạch và nồng độ của DNA tách chiết được Ngoài sử dụng loại đệm phổ biến như CTAB buffer để tách chiết trong phương pháp 2, 3, 4, 5 thì nghiên cứu còn khảo sát đối với đệm SDS (phương pháp 1) với phương pháp mới dành riêng cho loại dược liệu là lá mềm và mỏng Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này gần như là không có khi không tách được DNA trong cả 3 mẫu Elsholtzia Willd thử nghiệm Kết quả từ khảo sát trong nghiên cứu là chọn ra được phương pháp tách chiết hiệu quả nhất khi tách được DNA sạch, không lẫn tạp chất và đạt nồng độ phù hợp để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo bằng phương pháp đơn giản, không cần trải qua lọc và tinh sạch nhiều bước
Về khảo sát điều kiện tách chiết, ở nghiên cứu này mới chỉ khảo sát hai điều kiện là lượng bột lá ban đầu và lượng enzym RNase thêm vào trong quá trình ủ nhằm đưa ra quy trình tách chiết DNA phù hợp nhất đối với đối tượng nghiên cứu Lượng bột lá phù hợp nhất là khối lượng nhỏ nhất để tách được lượng DNA có chất lượng đủ tốt, tăng tỷ lệ thành công của các phản ứng sau này cũng như tiết kiệm tối đa hoá chất sử dụng.
Về đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị ITS
Bên cạnh các nghiên cứu phân loại đa dạng di truyền dựa trên so sánh các đặc điểm về hình thái thực vật, trong nghiên cứu di truyền hay định danh cách loài thực vật, công cụ ADN đóng vai trò lớn trong khi có thể cho biết chính xác đoạn gen của sinh vật mà không cần tới toàn bộ đặc điểm hình thái của chúng để xác định loài
Nghiên cứu đã cho ra kết quả đoạn trình tự vùng ITS-rDNA của 8 mẫu Kinh giới thuộc chi Elsholtzia Willd Kích thước vùng ITS dao động từ 740 đến 756bp, kích thước trung bình là 747bp Tỷ lệ %GC của các trình tự dao động từ 55,4% đến 62,4% trung bình là 58,4% So sánh các đoạn trình tự ITS thu được sau khi giải trình tự đoạn ITS-rDNA các mẫu với trình tự trên Genbank thu được độ tương đồng khá cao, cho thấy kết quả giải trình tự là đáng tin cậy và có thể sử dụng để phân tích cây phân loại đa dạng di truyền
Kết quả đọc trình tự thu được cho tín hiệu tốt, các pic có chiều cao đồng đều và tách nhau (Hình 4.1), cho thấy phương pháp giải trình tự này là chính xác và có độ tin cậy cao, có thể sử dụng để xác định trình tự của các mẫu nghiên cứu
33 Hình 4.1.Một phần trình tự Nucleotid của mẫu E_01-ITS1
Việc giải trình tự gen vùng ITS cho phép xác định chính xác trình tự nucleotid của đoạn gen có chiều dài lên tới 500-750 bp, từ đoạn trình tự này có thể so sánh với các trình tự có sẵn trên Genbank hoặc so sánh với các đoạn trình tự khác bằng phần mềm để xác định mối liên quan Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật giải trình tự hai chiều, xác định đồng thời cả trình tự của đoạn DNA sử dụng mồi xuôi và mồi ngược Thông qua cắt ghép đầu cuối có thể cho ra được đoạn trình tự hoàn chỉnh Kỹ thuật giải trình tự gen hai chiều có nhiều ưu điểm hơn so với kỹ thuật giải trình tự gen một chiều là loại bỏ được sai số và nhiễu ở đầu 5’ của đoạn ITS-rDNA thông qua cắt ghép đầu cuối hai đoạn trình tự xuôi và ngược, đồng thời đoạn gen thu được cuối cùng dài hơn do không phải cắt bỏ đi một đoạn nucleotid ở đầu 5’ để giảm sai số, do đó lượng thông tin thu được lớn hơn.
Về đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP
Kỹ thuật Đa hình khuếch đại dựa trên exon (EBAP) là phương pháp khá mới mẻ trong lĩnh vực phân tích đa dạng di truyền, tuy nhiên nó có nhiều ưu điểm và mang lại hiệu quả cao Mồi EBAP sử dụng có chiều dài chỉ 17bp, được thiết kế liên kết với một số vị trí trên exon, là chuỗi giàu GC có chức năng mã hoá trong gen Chỉ thị EBAP sử dụng phản ứng PCR và điện di trên gel đơn giản nhưng có thể xác định được mối liên quan giữa các mẫu nhờ phân tích bộ dữ liệu thu được khi sử dụng các mồi khác nhau
Khi phân tích các cây phân loại thu được từ các mồi đơn, nhận thấy hầu như các kết quả ít có tính lặp do lượng dữ liệu thu được khi khảo sát chỉ với một mồi là rất nhỏ
Hình 4.2.Cây phân loại đa dạng di truyền 8 mẫu Elsholtzia Willd dựa trên chỉ thị
So sánh hai cây phân loại dựa trên hai mồi EBAP 6 (a) và EBAP 8 (b) thấy được có sự khác biệt lớn, ở cây phân loại (a) các mẫu E_02 và E_06, các mẫu E_07 và E_08 có mối quan hệ gần gũi Trong khi đó, ở cây phân loại (b) thấy mẫu E_02 ít có quan hệ với mẫu E_06, mẫu E_07 và E_08 được chia vào 2 nhóm khác nhau Do đó, việc lựa chọn chỉ một loại marker EBAP để phân tích và xây dựng cây phân loại đa dạng di truyền là không có ý nghĩa Để cho ra cây phân loại có ý nghĩa phải tổng hợp từ nhiều bộ dữ liệu của các mồi EBAP khác nhau để cho ra kết quả chung, để tăng độ tin cậy của kết quả cần tăng số lượng mồi EBAP sử dụng
Sau khi thực hiện nghiên cứu với kỹ thuật này, nhận thấy vẫn còn một số hạn chế như chỉ mang giá trị định tính, tức là xác định sự liên quan trong bộ gen của các loài mà không định danh được loài; cần phải khảo sát quy trình PCR nhiều lần mới cho ra được chu trình phù hợp có thể tách được nhiều băng đa hình; kết quả của phương pháp phụ thuộc vào kỹ thuật của người thực hiện và điều kiện tiến hành của phòng thí nghiệm; khi phân tích các băng điện di bằng mắt thường có thể bỏ sót các vạch mờ gây ra sai số, do đó cần thực hiện lặp lại các thí nghiệm và lựa chọn kết quả cho vạch rõ ràng nhất để tiến hành nghiên cứu Tuy nhiên, kỹ thuật EBAP cũng có nhiều ưu điểm vượt trội là thực hiện đơn giản và chi phí không cao, đồng thời có thể phát hiện tính đa hình giữa các cá thể khác loài hoặc trong cùng một loài mà không cần biết trình tự nucleotid của chúng.
So sánh kết quả cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP
Hình 4.3.So sánh cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP
(a) Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS; (b) Cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP
Nhìn chung kết quả cây phân loại thu được sau khi phân tích dữ liệu từ trình tự đoạn ITS-rDNA và dữ liệu từ chỉ thị EBAP có nhiều điểm tương đồng Các mẫu E_01 và E_05; E_02 và E_06; E_04, E_07 và E_08 có quan hệ gần gũi, thuộc cùng một nhóm trong cây quan hệ phát sinh loài Ở cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS (a), E_04 và E_07 có quan hệ gần gũi hơn E_08, trong khi ở cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP (b) E_07 và E_08 có quan hệ gần gũi hơn Mẫu E_03 khi sử dụng chỉ thị ITS-rDNA để xác định quan hệ di truyền nằm cùng nhóm với các mẫu E_04, E_07 và E_08 trong khi sử dụng chỉ thị EBAP để phân tích thì nằm cùng nhóm với mẫu E_02 và E_06 Mức độ tương đồng khi so sánh trình tự của mẫu E_03 so với các mẫu khác khá gần nhau (từ 88,95 - 91,42%) nên có thể do độ nhiễu của phương pháp phân tích làm kết quả bị sai lệch
Năm 2022, Phạm Thị Nga đã tiến hành nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái [1], cho ra cây phân loại như sau:
36 Hình 4.4.Cây phân loại 10 mẫu Kinh giới dựa trên so sánh đặc điểm hình thái
Chú thích : các mẫu sau tương ứng với các mẫu trong nghiên cứu: N3 tương ứng với E_02 (Elsholtzia blanda (Benth.) Benth.); N4 tương ứng với E_04 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N5 tương ứng với E_08 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N6 tương ứng với E_07 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N7 tương ứng với E_06 (Elsholtzia communis (Collett & Hemsl.) Diels.); N8 tương ứng với E_05 (Elsholtzia flava Benth.); N9 tương ứng với E_03 (Elsholtzia fruticosa (D.Don) Rehder); N10 tương ứng với E_01 (Elsholtzia penduliflora W W Smith); các mẫu N1, N2, N3 thuộc cùng một loài Elsholtzia blanda (Benth.) Benth
Dựa trên đặc điểm hình thái, khoá luận trên chia 10 mẫu nghiên cứu thành hai nhóm:
- Nhóm I: gồm 2 mẫu N9 và N10 tương ứng với các mẫu E_03 và E_01
- Nhóm II: gồm 8 mẫu còn lại tương ứng với các mẫu E_02, E_04, E_05, E_06, E_07, E_08
Qua so sánh 3 cây phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và dựa trên chỉ thị DNA, nhận thấy giữa cây phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và cây phân loại dựa trên chỉ thị DNA ít sự tương đồng ở các mẫu khác loài, chỉ có 3 mẫu thuộc cùng 1 loài Elsholtzia ciliata có mối quan hệ gần gũi ở cả 3 cây phân loại phát sinh loài.
a) và EBAP 8 (b)
So sánh hai cây phân loại dựa trên hai mồi EBAP 6 (a) và EBAP 8 (b) thấy được có sự khác biệt lớn, ở cây phân loại (a) các mẫu E_02 và E_06, các mẫu E_07 và E_08 có mối quan hệ gần gũi Trong khi đó, ở cây phân loại (b) thấy mẫu E_02 ít có quan hệ với mẫu E_06, mẫu E_07 và E_08 được chia vào 2 nhóm khác nhau Do đó, việc lựa chọn chỉ một loại marker EBAP để phân tích và xây dựng cây phân loại đa dạng di truyền là không có ý nghĩa Để cho ra cây phân loại có ý nghĩa phải tổng hợp từ nhiều bộ dữ liệu của các mồi EBAP khác nhau để cho ra kết quả chung, để tăng độ tin cậy của kết quả cần tăng số lượng mồi EBAP sử dụng
Sau khi thực hiện nghiên cứu với kỹ thuật này, nhận thấy vẫn còn một số hạn chế như chỉ mang giá trị định tính, tức là xác định sự liên quan trong bộ gen của các loài mà không định danh được loài; cần phải khảo sát quy trình PCR nhiều lần mới cho ra được chu trình phù hợp có thể tách được nhiều băng đa hình; kết quả của phương pháp phụ thuộc vào kỹ thuật của người thực hiện và điều kiện tiến hành của phòng thí nghiệm; khi phân tích các băng điện di bằng mắt thường có thể bỏ sót các vạch mờ gây ra sai số, do đó cần thực hiện lặp lại các thí nghiệm và lựa chọn kết quả cho vạch rõ ràng nhất để tiến hành nghiên cứu Tuy nhiên, kỹ thuật EBAP cũng có nhiều ưu điểm vượt trội là thực hiện đơn giản và chi phí không cao, đồng thời có thể phát hiện tính đa hình giữa các cá thể khác loài hoặc trong cùng một loài mà không cần biết trình tự nucleotid của chúng
35 4.4 So sánh kết quả cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP
Hình 4.3.So sánh cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và chỉ thị EBAP
(a) Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS; (b) Cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP
Nhìn chung kết quả cây phân loại thu được sau khi phân tích dữ liệu từ trình tự đoạn ITS-rDNA và dữ liệu từ chỉ thị EBAP có nhiều điểm tương đồng Các mẫu E_01 và E_05; E_02 và E_06; E_04, E_07 và E_08 có quan hệ gần gũi, thuộc cùng một nhóm trong cây quan hệ phát sinh loài Ở cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS (a), E_04 và E_07 có quan hệ gần gũi hơn E_08, trong khi ở cây phân loại dựa trên chỉ thị EBAP (b) E_07 và E_08 có quan hệ gần gũi hơn Mẫu E_03 khi sử dụng chỉ thị ITS-rDNA để xác định quan hệ di truyền nằm cùng nhóm với các mẫu E_04, E_07 và E_08 trong khi sử dụng chỉ thị EBAP để phân tích thì nằm cùng nhóm với mẫu E_02 và E_06 Mức độ tương đồng khi so sánh trình tự của mẫu E_03 so với các mẫu khác khá gần nhau (từ 88,95 - 91,42%) nên có thể do độ nhiễu của phương pháp phân tích làm kết quả bị sai lệch
Năm 2022, Phạm Thị Nga đã tiến hành nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Elsholtzia Willd ở Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái [1], cho ra cây phân loại như sau:
36 Hình 4.4.Cây phân loại 10 mẫu Kinh giới dựa trên so sánh đặc điểm hình thái
Chú thích : các mẫu sau tương ứng với các mẫu trong nghiên cứu: N3 tương ứng với E_02 (Elsholtzia blanda (Benth.) Benth.); N4 tương ứng với E_04 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N5 tương ứng với E_08 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N6 tương ứng với E_07 (Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyland.); N7 tương ứng với E_06 (Elsholtzia communis (Collett & Hemsl.) Diels.); N8 tương ứng với E_05 (Elsholtzia flava Benth.); N9 tương ứng với E_03 (Elsholtzia fruticosa (D.Don) Rehder); N10 tương ứng với E_01 (Elsholtzia penduliflora W W Smith); các mẫu N1, N2, N3 thuộc cùng một loài Elsholtzia blanda (Benth.) Benth
Dựa trên đặc điểm hình thái, khoá luận trên chia 10 mẫu nghiên cứu thành hai nhóm:
- Nhóm I: gồm 2 mẫu N9 và N10 tương ứng với các mẫu E_03 và E_01
- Nhóm II: gồm 8 mẫu còn lại tương ứng với các mẫu E_02, E_04, E_05, E_06, E_07, E_08
Qua so sánh 3 cây phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và dựa trên chỉ thị DNA, nhận thấy giữa cây phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và cây phân loại dựa trên chỉ thị DNA ít sự tương đồng ở các mẫu khác loài, chỉ có 3 mẫu thuộc cùng 1 loài Elsholtzia ciliata có mối quan hệ gần gũi ở cả 3 cây phân loại phát sinh loài
37 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
- Đã khảo sát và xây dựng phương pháp tối ưu để tách chiết DNA cho 8 mẫu
Elsholtzia với các điều kiện cơ bản như sau: phương pháp tách chiết sử dụng CTAB buffer có bổ sung mercaptoethanol, sau đó ủ với RNase sau khi đã tách chiết DNA; lượng bột lỏ sử dụng là 10mg và lượng RNase sử dụng là 2,5àl tương ứng với 10mg bột lá
- Về chỉ thị phân tử ITS: Đã xây dựng cây phân loại dựa trên đoạn trình tự ITS- rDNA của 8 mẫu thuộc chi Elsholtzia Willd., trong đó có 3 mẫu là thuộc cùng một loài
Elsholtzia ciliata Kết quả cho thấy 8 mẫu nghiên cứu thuộc 2 nhóm, nhóm I gồm các mẫu E_03, E_04, E_07 và E_08; nhóm II gồm các mẫu còn lại Trình tự ITS-rDNA của
8 mẫu cho thấy khoảng cách di truyền gần nhất là 0,0267 và xa nhất là 0,1633
- Về chỉ thị phân tử EBAP: Đã xây dựng được cây phân loại dựa trên chỉ thị phân tử EBAP với 7 marker EBAP được khảo sát, 8 mẫu nghiên cứu được chia làm 3 nhóm, nhóm I gồm các mẫu E_02, E_03 và E_06; nhóm II gồm các mẫu E_01 và E_05, các mẫu còn lại thuộc nhóm III
- Thu thập thêm các mẫu thuộc các loài còn lại thuộc chi Elsholtzia Willd ở
Việt Nam không nằm trong danh sách mẫu nghiên cứu, đồng thời tiến hành trên nhiều mẫu khác nhau để tăng độ tin cậy cho nghiên cứu
- Thử trên nhiều EBAP marker hơn, tổng hợp và xây dựng cây phân loại để thu được kết quả có độ tin cậy cao hơn
DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phạm Thị Nga (2022), Nghiên cứu đa dạng đặc điểm thực vật một số loài chi
Elsholtzia Willd ở miền Bắc Việt Nam, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội
2 Bùi Thị Kim Oanh (2023), Phân tích sự đa dạng di truyền giữa các giống Actiso trồng tại Việt Nam (Cynara cardunculus var Scolymus) dựa trên chỉ thị phân tử và chỉ thị hoá học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh
3 Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thị Kim Oanh, và cs (2013), Nghiên cứu tầm soát, khuếch đại và giải trình tự vùng gene tạo hương AAT của Lan Vanda,
Trường Đại học Dân lập Văn Lang, Khoa Công nghệ sinh học, TP Hồ Chí Minh
4 Huỳnh Thị Trúc Phương, Hồ Viết Thế (2021), "Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS trong định danh và xác định mối quan hệ di truyền một số loài lan thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium)", Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, 21(4), tr 31-38
5 Vũ Xuân Phương, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (2000), Thực vật chí
Việt Nam: Họ Bạc hà - Lamiaceae Lindl (Họ Hoa môi - Labiatae Juss.), NXB
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 225-237
6 Vũ Anh Tài, Nguyễn Nghĩa Thìn (2014), "Kết quả điều tra và thống kê các loài thực vật bị đe doạ ở tỉnh Hà Giang, Việt Nam ", Tạp chí Sinh học, 36(3), tr 323-
7 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội, tr 141-147
8 Đậu Bá Thìn, Phạm Hồng Ban, và cs (2013), "Tính đa dạng hệ thực vật bậc cao có mạch ở khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, Thanh Hoá ", Tạp chí Sinh học, 35(3), tr 293-300
9 Atkinson Maurice R., Deutscher Murray P., et al (1969), "Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid XXXIV Termination of chain growth by a 2',3'- dideoxyribonucleotide", Biochemistry, 8(12), pp 4897-4904
10 Baldwin Bruce G., Sanderson Michael J., et al (1995), "The its Region of
Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny", Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2), pp 247-277
11 Bongcheewin B, Chantaranothai P, et al (2015), "Elsholtzia (Lamiaceae) in
Thailand", Naturalis Biodiversity Center, 59(3), pp 209-214
12 Bou G, Cervero G, et al (2000), "PCR-based DNA fingerprinting (REP-PCR,
AP-PCR) and pulsed-field gel electrophoresis characterization of a nosocomial outbreak caused by imipenem-and meropenem-resistant Acinetobacter baumannii", Clinical Microbiology and Infection, 6(12), pp 635-643
13 Chen Shuqi, Chen Jixin, et al (2022), "Elsholtzia: A genus with antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory advantages", Journal of Ethnopharmacology,
14 Dai Peng, Yang Yanfeng, et al (2022), "A dPCR-NIPT assay for detections of trisomies 21, 18 and 13 in a single-tube reaction-could it replace serum biochemical tests as a primary maternal plasma screening tool", Journal of Translational Medicine, 20(1), p 269
15 Feitosa Yara Barros, Cruz-Magalhães Valter, et al (2019), "Characterization of genetic diversity on tropical Trichoderma germplasm by sequencing of rRNA internal transcribed spacers", BioMed Central Research Notes, 12(1), p 663
16 Fredricks David N, Relman David A (1999), "Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases", Clinical Infectious Diseases,
17 Green M R., Sambrook J (2018), "The Basic Polymerase Chain Reaction
(PCR)", Cold Spring Harbor Protocols, 2018(5), pp 338-345
18 Guarro Josep, Gené Josepa, et al (1999), "Developments in Fungal Taxonomy",
19 Guo Zhiqin, Liu Zizhen, et al (2012), "Elsholtzia: phytochemistry and biological activities", Chemistry Central Journal, 6(1), p 147
20 Gibson Joel F, Kelso Scott, et al (2011), "Diptera-specific polymerase chain reaction amplification primers of use in molecular phylogenetic research",
Annals of the Entomological Society of America, 104(5), pp 976-997
21 Hoang Thanh Son, Min Dao-Zhang, et al (2020), "First record of Elsholtzia kachinensis (Lamiaceae: Nepetoideae) for the Flora of Vietnam", Phytotaxa,
22 Hoang Thi Binh (2022), "The antimicrobial activity and chemical composition of Elsholtzia blanda (Benth.) Benth essential oils in Lam Dong Province, Viet Nam", Journal of Innovation and Sustainable Development, 14(3), pp 72-77
23 Korovaeva I., Popova N (2020), "Kary Mullis - bright name in the history of science", Annals of Mechnikov's Institute, 0(3), pp 72-74
24 Li G., Quiros C F (2001), "Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica", Theoretical and Applied Genetics, 103(2), pp
25 Li Xiwen Ian C Hedge (1994), Flora of China, pp 248-257
26 Ling Haiyun, Lou Yijia (2005), "Total flavones from Elsholtzia blanda reduce infarct size during acute myocardial ischemia by inhibiting myocardial apoptosis in rats", Journal of Ethnopharmacology, 101(1-3), pp 169-175
27 Liston Aaron, Robinson William A., et al (1996), "Length Variation in the
Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Region of Non-Flowering Seed Plants", Systematic Botany, 21(2), pp 109-120
28 Liu Ai-Lin, Lee Simon M.Y., et al (2007), "Elsholtzia: Review of traditional uses chemistry and pharmacology", Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, pp 73-78
29 Liu Ai-Lin, Liu Bo, et al (2008), "Anti-influenza virus activities of flavonoids from the medicinal plant Elsholtzia rugulosa", Planta Medical, 74(08), pp 847-
30 Lo Y.M.D (2008), Clinical Applications of PCR, Humana Press, pp 3-9
31 Lorenz T C (2012), "Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies", JoVE Journal, (63), p e3998
32 Maggini Fabio, Marrocco Roberto, et al (1998), "Lengths and nucleotide sequences of the internal spacers of nuclear ribosomal DNA in gymnosperms and pteridophytes", Plant Systematics and Evolution, 213(3), pp 199-205
33 Mathela Chandra S, Padalia Rajendra C, et al (2009), "Chemical diversity in
Himalayan Elsholtzia species", Chemistry & Biodiversity, 6(12), pp 2217-2226
34 Maxam A M., Gilbert W (1977), "A new method for sequencing DNA",
Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(2), pp 560-564
35 Mingke Wang, Jin Cai, et al (2023), "PCR Techniques and Their Clinical
Applications", Polymerase Chain Reaction, Ph D Murat Aycan,Prof Mustafa
Yildiz, IntechOpen, Rijeka, pp Ch 32
36 Nguanchoo Varangrat, Srisanga Prachaya, et al (2014), "Food plants in Hmong cuisine in Northern Thailand", Thai Journal of Botany, 6(2), pp 131-145
37 Pudziuvelyte Lauryna, Liaudanskas Mindaugas, et al (2020), "Elsholtzia ciliata
(Thunb.) Hyl extracts from different plant parts: Phenolic composition, antioxidant, and anti-inflammatory activities", Molecules, 25(5), p 1153
38 Rahman Md Tahminur, Uddin Muhammed Salah, et al (2013), "Polymerase chain reaction (PCR): a short review", Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1), pp 30-36
39 Sanger F., Nicklen S., et al (1977), "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), pp 5463-
40 Schoch C L., Seifert K A., et al (2012), "Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi", Proc Natl
41 Shi XF, He FJ, et al (1994), "Study on chemical constituents of essential oil from
Elsholtzia ciliate (Thunb.) Hyland", Gansu Med, 13, pp 152-153
42 Sun Zeng-Peng, Zhao Yue, et al (2022), "Systematic placement of Elsholtzia griffithii (Nepetoideae, Lamiaceae), a new record from China", Phytotaxa,
43 Szymanski Maciej, Barciszewska Miroslawa Z, et al (2002), "5S ribosomal RNA database", Nucleic Acids Research, 30(1), pp 176-178
44 Taberlet Pierre, Griffin Sally, et al (1996), "Reliable Genotyping of Samples with Very Low DNA Quantities Using PCR", Nucleic Acids Research, 24(16), pp 3189-3194
45 Takhtajan A (2009), Flowering Plants, Springer Netherlands, p 573
46 Tan Mei, Bai Yue, et al (2021), "Early genetic screening uncovered a high prevalence of thalassemia among 18 309 neonates in Guizhou, China", Clinical genetics, 99(5), pp 704-712
47 Tkadlec J, Peckova M, et al (2019), "The use of broad-range bacterial PCR in the diagnosis of infectious diseases: a prospective cohort study", Clinical Microbiology and Infection, 25(6), pp 747-752
48 Tu Xiong-De, Zhao Zhuang, et al (2023), "Comparative Analysis of Plastomes in Elsholtzieae: Phylogenetic Relationships and Potential Molecular Markers",
International Journal of Molecular Sciences, 24(20), p 15263
49 Wang Fulin, Liu Xue, et al (2022), "Elsholtzia ciliata (Thunb.) hyland: a review of phytochemistry and pharmacology", Molecules, 27(19), p 6411
50 Xiong Faqian, Liu Jing, et al (2022), "Exon based amplified polymorphism
(EBAP): A novel and universal molecular marker for plants", Electronic Journal of Biotechnology, 56, pp 65-74
DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 DANH MỤC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 2 HÌNH ẢNH TIÊU BẢN CÂY KHÔ CỦA 8 MẪU Elsholtzia Willd
PHỤ LỤC 3 HÌNH ẢNH PHIẾU GIÁM ĐỊNH VÀ GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ
PHỤ LỤC 4 PHẦN ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS
Phụ lục 4.1 Trình tự nucleotid đoạn ITS-rDNA của 8 mẫu Kinh giới thuộc chi Elsholtzia Willd
Phụ lục 4.2 Gióng hàng đoạn trình tự ITS-rDNA của 8 mẫu Kinh giới thuộc chi
PHỤ LỤC 5 PHẦN ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN CHỈ THỊ EBAP
Phụ lục 5.1 Khoảng cách giữa các nhóm trong phân tích đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị EBAP
Phụ lục 5.2 Kết quả điện di và phân tích đặc điểm di truyền của 8 mẫu Kinh giới
Elsholtzia Willd dựa trên chỉ thị EBAP
PHỤ LỤC 1 DANH MỤC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
Tên khoa học Tên địa phương Số hiệu tiêu bản Nơi thu mẫu
Chùa dù/Kinh giới rủ
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
Kinh giới hoa vàng HNIP/18675/22
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
Kinh giới Đồng Văn HNIP/18674/22
Xã Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang
Xã Chàng Sơn, huyện Thạch Thất, thành phố
Xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai
PHỤ LỤC 2 HÌNH ẢNH TIÊU BẢN CÂY KHÔ CỦA 8 MẪU Elsholtzia Willd
Tiêu bản cây khô mẫu E_01 Tiêu bản cây khô mẫu E_02
Tiêu bản cây khô mẫu E_03 Tiêu bản cây khô mẫu E_04
Tiêu bản cây khô mẫu E_05
Tiêu bản cây khô mẫu E_07 Tiêu bản cây khô mẫu E_08
PHỤ LỤC 3 HÌNH ẢNH PHIẾU GIÁM ĐỊNH VÀ GIẤY
CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN
PHỤ LỤC 3.1 HÌNH ẢNH PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
Phụ lục: Bảng danh sách các mẫu (Kèm theo phiếu giám định số 07/2022, ngày 16 tháng 6 năm 2022)
Ký hiệu mẫu trong nghiên cứu
Tên khoa học Tên địa phương
Chàng Sơn, Thạch Thất, Hà Nội
PHỤ LỤC 3.2 HÌNH ẢNH GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN
Phụ lục: Bảng danh sách các mẫu trong nghiên cứu
Ký hiệu mẫu trong nghiên cứu
Ký hiệu mẫu trong giấy chứng nhận mã số tiêu bản
Tên khoa học Tên địa phương
Chùa dù/Kinh giới rủ
(D.Don) Rehder* Kê cốt sài
(Thunb.) HylDNA Kinh giới dại
(Thunb.) HylDNA Kinh giới trồng
(Thunb.) HylDNA Nhàn châu mia
PHỤ LỤC 4 ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS
PHỤ LỤC 4.1 TRÌNH TỰ NUCLEOTID ĐOẠN ITS-rDNA CỦA 8 MẪU KINH GIỚI THUỘC CHI Elsholtzia Willd
Mẫu E_01 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 756
TTTTTATTCACCTTTTTGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGC GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCAAAGCAGACCGCGAACACGTGTTTAACATCATCGGG CACGGCGTGGGGGCAACCCCCTGTCGTGATACCGCTCCTGCCGGCGCGCGCCCTCGGGCG TTGCGTCGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCATGCGCCAAGGAAAACTAAATGAAGC GTCCGCCTCCTGCATCCCGTTCGCGGGGTGTGCGGGGGGAGTGGGCGTCTATCGAATGTC ACAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATG CGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCG CCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCT CCCCGCTCTAAGCGCTCGTGAGGGGGGGTGGATACTGGCCTCCCGTGCGCCTCGGCATGC GGCTGGCCCAAATGCGATCCCTCGGCGACTCGTGTCACGACCAGTGGTGGTTGAATTGCT CAATCTCGCGTCTTGTCGTGCTACCGTGTCGTCGGTGTGGGCATCGAATAACGACCCAAC TGCGTCGGTGCGTTGTCGCGCTGCGCTTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACC CGCTGAGTTTAAGCATATCAAAAAGGGGGGGAAAAA
Mẫu E_02 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 749
TTTTTTTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGA AGGATCATTGTCGAAACCTGCAAAAGTAGACCGCGAACATGTGTTTAACATCATCAGGCG CGGCGCGGGGGAAACTCCCGTCGCGTCCTGCCCCTGCCGGTGTACGCTCTCGGGCGCTGC ATCGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACGAAATTTAGCATCC GCCCTCCGCATCCCGTTCGCGGGGCGTGCGGGGGAGCGGCTGTCTATCGAACGTCATAAC GACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATA CTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGA AGCCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCTCCCCG CCCTCAGTGCTCGTGAGTGGGGTGGATATTGGCCTCCCGTGCGCTTCAGCGTGCGGCTGG CCCAAATGTGATCCCTCGGCGACTCGCATCGCGACTAGTGGTGGTTGAACAGCTCAATCT CGCGTCGTGTCGTGTGTTGCGTTGTTGTCCGCGCGGGCATCGGATGCAAACCCAACGGTG GCGGTGCTCGCACCGCGCCTTCGACCGCGACCCCATGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGT TTAAGCATATCATAAAGCGGGGGGGAAAA
Mẫu E_03 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 749
TTCTTATCATTTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGA AGGATCATTGTCGAAACCTGCAAAGCAGACCGCGAACACGTGTTTAACATCATCGGGCGC GGCGTGGAGGCAACTCCCGCTGTGTCCCGCCCCCGCCGGTGCTCGCTCTTGAGTGATGCA TCGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCAAGCGCCAAGGAAAACTAAATTTAGCGTCTC CCTCCGCATCCCGTTCGCGGGGCGTGCGGGGGTGTTGACGTCTAACGAATGTCATAACGA CTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACT TGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAG CCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCTCCCCGCGC TATGCGCTTGTGAGTGGGGCGGATATTGGCCTCCCGTTCGCCTCGGCGTGCGGCTGGCCC AAATGCGATCCCTCGGCGACTCGCGTCGCGACAAGTGGTGGTTGATAGCTCAATCTCGCG TCTCGTCGCGTGCCGCGTCGTCGTCCGTATGGGCATCGGATAAAGACCCAGCGGTTTCGG TGCCTCATCGCACCGTGCCTACGACCGCGACCCCATGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGT TTAAGCATATCATAGAGGGGGGGGAAAAA
Mẫu E_04 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 740
TTTTTCTTTATCAATTTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCT GCGGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCAAAGCAGACCGCGAACACGTGTTTAACTTCATCG GGCTCGGAGTGAGGCAACTCTCGCCGTGTCCCGTCCCCGCCGGTGCTTGCTCTCGGGCAA AGCATTGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCAAGCGCCAAGGAAAACTGAATTTAGTG TCTCCCCCTGCATCCCGTCCGCGGGTCGTGCGGGGGTGTTGATGTCTAACGAATGTCGTA ACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGA TACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC GAAGCCGTCAGGTTGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCTCCCT GCACTCTGTGCTGGTGGGTGGGGCGGATATTGGCTTCTTGTACGCTTCGGTGTGCGGTTG GCCCAAATACGATCCCTCGGCGACTCACGTCGTGACTTGTGGTGGTTGAATATCTCAATC TCGCGTCTCGTCGTGCCGTCGTCCGTATGCATCGATAAAAGACCCAATGGTTTTGGTGCC TCGCACCGTGCCTACGACCGCGACCCCATGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCA TATCATAGAAGGGGGAAAAA
Mẫu E_05 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 755
TTTTTCTTATCATTTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGC GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCAAGGCAGACCGCGAACACGTGTTTAACATCATCGGG CACGGCGTGGGGGCAACCCCCTGTCGTGATACCGCTCCTGCCGGCGCGCGCCCTCGGGCG TTGCGTCGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCACGCGCCAAGGAAAACTAAATGAAGC GTCCGCCTCCTGCATCCCGTTCGCGGGGTGTGCGGGGGGAGTGGGCGTCTATCGAATGTC ATAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATG CGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCG CCCGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCCT CCCCGCTCTGAGCGCTCGCGAGGGGGGTGGATATTGGCCTCCCGTGCGCCTCGGCATGCG GCTGGCCCAAATGCGATCCCTCGGCGACTCATGTCACGACCAGTGGTGGTTGAATAGCTC AATCTCGCGTCTTGTCGTGCTGCTGTGTCGTCGGTACGGGCATCGAATAACGACCCAACT GCGTCGGTGCGCTATCGCACTGCGCTTTCGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACCC GCTGAGTTTAAGCATATCATAAAAGGGGGGAGAAA
Mẫu E_06 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 744
CTCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAA GGATCATTGTCGAAACCTGCAAAGCAGACCGTGAACACGTTTTTAACATCATTGGGCGCG GTGCGGGGGAAACTCCTGCCGTGTCCAATCCTCGCCGGTGTGTGCTTTCGGGCACGCATT GTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCATGCGCCAAGGAAAACGAAATTTAGCATCTGCC CTTTGCATCCCGTTCGCGGTGTATGCGGGGGATTGGATGTCTATCGAATGTCATAACGAC TCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTT GGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAAGC CGTCAGGCTGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCCTCTCTGCCCT AAGTGCAAGTGAGTGGGGCGGATATTGGCCTCCCGTGCACCTTGGTGCGCGGCTGGCCCA AATTTGATCCCTCGGCGACTCGCATCGCGACTAGTGGTGGTTGAATAGCTCAATCTCGCA TCATGTCGTGTGCAGCGTTGTTCTCCGTATGGGCATCGGATGCAAACCCAATGGTTGCGG TGCTCGCACTGCGCCTTCGACCGCGACCCCATGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAA GCATATCAATAAGCCGGAGGAAAA
Mẫu E_07 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 742
TTCTTATCATTTAGAGAGAAGGAAGGAAGTTCGTAACAGAGGTTTTCCGTAGGTGAATCT GCGGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCAAAGCAGACCGCGAACACGTGTTTAACTTCATCG GGCTCGGAGTGAGGCAACTCTCTCCGTGTCCCGTCCCCGTCGGTGCTTGCTCTCGGGCAA AGCATTGTGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCAAGCGCCAAGGAAAACTGAATTTAGTG TCTCCCCCTGCATCCCGTCCGCGGGTCGTGCGGGGGTGTTGATGTCTAATGAATGTCGTA ACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGA TACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC GAAGCCGTCAGGTTGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATTGCGTCGCCCCCTCCCT GCACTCTGTGCTTGTGGGTGGGGCGGATATTGGCCTCCTGTACGCTTCGGTGTGCGGTTG GCCCAAATACGATCCCTCGGCGACTCACGTCGTGACTTGTGGTGGTTGAATATCTCAATC TCGCGTCTCGTCGTGCCGTTGTCCGTGTGCATCGATAAAAGACCCAATGGTTTTGGTGCC TCGCACCGTGCCTACGACTGCGACCCCATGTCAGGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCA TATCAAAAAGGGGGGGGAAAAA
Mẫu E_08 Tổng số Nucleotid sau khi ghép trình tự hai đầu: 741
TCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG GATCATTGTCGAAACCTGCAAGGCAGACCGAGAACACGTTCCCAACTGCAACGGGCGCGG CGTGGGGCGACCCTCGCCGTGTCCCGCCCCCGCCGGTGCCCGCTCTCGGGCGACGCATCG TGCGGGCTAACGAACCCCGGCGCGGCATGCGCCAAGGAAAACTGAGTTTAGCGTCTCCCT CCGCATCCCGTCCGCGGGTCGTGCGGGGGCGTCGGCGTCTAACGAATGTCACAACGACTC TCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGG TGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCG TCAGGCTGAGGGCACGTCTGCATGGGCGTCACGCATCGCGTCGCCCCACTCCCCGCCCTA GGCGCTCGTGAGTGGGGCGGATAATGGCCCCCCGTGCGCCCAGGCGTGCGGCCGGCCCAA ACACGATCCCTCGGCGACTCGCGTCGCGACCAGTGGTGGTTGATTATCTCAATCTCGCGT CTCGTCGCGCCGTGCCTTCGTCCGTCGGATTCGCTTCACGACCCAACGGCTTCGGCGCCT CACGCCGTGCCCACGACCGCGACCCCATGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCAT ATCATAAAACGGGAAGGAAAA
PHỤ LỤC 4.2 GIÓNG HÀNG ĐOẠN TRÌNH TỰ ITS-rDNA CỦA 8 MẪU KINH GIỚI THUỘC CHI Elsholtzia Willd
PHỤ LỤC 5 ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN CHỈ THỊ EBAP
PHỤ LỤC 5.1 KHOẢNG CÁCH GIỮA CÁC NHÓM TRONG PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN DỰA TRÊN CHỈ THỊ EBAP
PHỤ LỤC 5.2 KẾT QUẢ ĐIỆN DI VÀ PHÂN TÍCH DỮ LIỆU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN
Hình 1 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 4 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
Hình 2 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 6 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
Hình 3 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 8 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
Hình 4 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 17 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
Hình 5 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 18 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
Hình 6 Kết quả đặc điểm di truyền dựa trên EBAP 22 marker a Kết quả điện di; b Kết quả phân tích; c Cây phân loại; d Độ tương đồng các nhóm
