nguyễn thu hiền nghiên cứu đặc điểm thực vật đa dạng di truyền và xác định hàm lượng aldehyd cinnamic và coumarin trong lá và vỏ thân một số mẫu quế trồng ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ALDEHYD CINNAMIC VÀ COUMARIN TRONG LÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG ALDEHYD CINNAMIC VÀ COUMARIN

TRONG LÁ VÀ VỎ THÂN MỘT SỐ MẪU QUẾ

TRỒNG Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG ALDEHYD CINNAMIC VÀ COUMARIN

TRONG LÁ VÀ VỎ THÂN MỘT SỐ MẪU QUẾ

TRỒNG Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DL- DHCT

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Trần Văn Ơn 2 PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI- 2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thiện luận văn thạc sĩ tại Trường Đại học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình của thầy cô, sự giúp đỡ của anh chị, các bạn, các em và gia đình

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS TS Trần Văn Ơn và PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh người thầy, người cô đã

trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận Thầy cô đã chỉ dạy cho tôi về cách tư duy, xử lý vấn đề, hướng dẫn tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu và cho tôi những lời khuyên giá trị

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến nhóm nghiên cứu Khoa Hóa phân tích

và kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, ThS Bùi Thị Lan Phương và sinh viên Lê Bảo Trâm Đã hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá

trình làm thực nghiệm và xử lý kết quả nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn đến TS Trần Duy Cường, Nguyễn Trường Khoa cùng các nghiên cứu viên, kỹ thuật viên tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện di truyền nông

nghiệp, đã hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi, những kiến thức kinh nghiệm thực tế trong

thực nghiệm nghiên cứu ADN Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi còn nhận được sự chỉ bảo

tận tình của các thầy cô tại Bộ môn Thực Vật.: ThS Nghiêm Đức Trọng, ThS Phạm

Thị Linh Giang, ThS Lê Thiên Kim, đã giải đáp thắc mắc của tôi trong quá trình thực nghiệm, cũng như các em Lê Thị Diễm, Bùi Thị Kim Oanh, Trần Ngọc Ánh, Đào Việt Quốc đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin cảm ơn Ban giám Hiệu cùng các đồng nghiệp trong Khoa Y Dược – Trường Đại học Tân Trào, đã tạo mọi điều kiện thận lợi cho tôi hoàn thành khóa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, các bạn cao học CH27 đã giúp đỡ em có được nhiều kỹ năng, kiến thức mới trong quá trình học

Lời sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi, đã luôn tạo điều kiện, ủng hộ, động viên, đặc biệt chồng và con luôn ở bên tạo động lực cho tôi hoàn thành khóa học

Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thu Hiền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

C cassia Cinnamomum cassiaC verum Cinnamomum verum

C loureirii Cinnamomum loureirii

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide bp Base pair (cặp base nitơ)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid Tris HCl- pH Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride TAE Tris – acetat - EDTA

TE Tris - EDTA Rnase A Ribonuclease A dNTPs deoxynucleotide triphosphates buffer QG QIAgen Genomic Buffer (công thức độc quyền được phát triển bởi

QIAgen) EtOH Ethanol RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) NaCl Natri clorua

GC-MS Sắc ký khí khối phổ HPLC High Performance Thin Layer Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) HPTLC High-Performance Thin-Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao) IR Infrared (tia hồng ngoại) LOD Limit of detection (giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng)

Chữ viết tắt Viết đầy đủ

MeOH Methanol

NaCl Natri clorua

PCR Relative Standard Deviation (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PVP Poly (vinyl pyrrolidone)

RAPD Random Amplified polymorphic DNA ISSR Inter-Simple Sequence Repeat (Lặp lại trình tự đơn giản xen kẽ)

RSD Relative standard deviation (Giá trị độ lệch chuẩn tương đối) S/N Phương pháp và tỷ lệ đáp ứng

AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội Hóa học Nông

nghiệp Chính thức) CM Coumarin

CAL Cinamandehyd

1.1.3.2 Coumarin (chromen – 2 – on) 8

1.1.3.3 Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học trong quế 8

1.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 10

1.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm di truyền 10

1.2.1.1 Đặc điểm cơ bản của trình tự barcode 10

1.2.1.2 Trình tự hai gen trnL (UAA)-trnF(GAA) 11

1.1.1.3 Ứng dụng của các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài Cinnamomum 12

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 14

1.2.2.1 Phương pháp định lượng sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.2.2.2 Một số chỉ tiêu kiểm tra chất lượng dược liệu 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Thiết bị, hóa chất 17

2.2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 17

2.2.1.1 Phân tích hình thái 17

2.2.1.2 Nghiên cứu hóa học 18

2.2.1.3 Phân tích đa dạng di truyền 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 19

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái 19

2.3.1.2 Giám định tên khoa học 20

2.3.1.3 Phân loại các mẫu nghiên cứu dựa trên đặc điểm thực vật 20

2.3.2 Phân tích DNA 23

2.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số 23

2.3.2.2 Thành phần của một phản ứng PCR 23

2.3.2.3 Chương trình chạy PCR 24

2.3.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 24

2.3.2.5 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 25

2.3.2.6 Giải trình tự 25

2.3.3 Định lượng coumarin và aldehyd cinnamic trong lá quế và vỏ thân quế 25

2.3.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng thành phần hóa học trong lá quế 25

2.3.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 27

2.3.3.3 Ứng dụng phương pháp định lượng mẫu lá quế và vỏ quế 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 33

3.1 Đặc điểm hình thái 33

3.1.1 Đặc điểm hình thái chung 33

3.1.2 Đặc điểm hình thái phân biệt giữa các mẫu 37

3.1.2 Phân loại các mẫu Quế trồng dựa trên đặc điểm thực vật 39

3.1.2 Tên khoa học của các mẫu Quế trồng ở Việt Nam 41

3.2 Đặc điểm di truyền các mẫu quế 42

3.2.1 Tách chiết DNA 42

3.2.2 Kết quả khuếch đại DNA (PCR) 42

3.2.3 Xác định trình tự ribosom vùng TrnL/TrnF 43

3.2.4 So sánh trình tự DNA ribosom vùng TrnL/TrnF 44

3.3.5 Xây dựng cây phân loại 48

3.3 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng HPLC 49

3.3.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu lá quế 49

3.2.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 58

3.3.3 Kết quả định lượng mẫu lá quế và vỏ Quế 59

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 63

4.1 Về phương pháp thu mẫu nghiên cứu 63

4.2 Đặc điểm hình thái và tên khoa học 63

4.3 Đặc điểm di truyền đoạn trình tự trnL/ trnF của các mẫu Quế 69

4.3 Nghiên cứu hóa học 71

4.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 71

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Danh mục các mẫu quế nghiên cứu 16

Bảng 2 2 Danh sách cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2 3 Các đặc điểm hình thái được mô tả của các mẫu Quế 19

Bảng 2 4 Bảng biến số dùng phân loại các mẫu Quế dựa trên đặc điểm hình thái cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản 21

Bảng 2 5 Thành phần phản ứng PCR 23

Bảng 2 6 Chu trình chạy PCR 24

Bảng 2 7 Bảng quy trình xử lý mẫu lá 26

Bảng 2 8 Chương trình pha động 27

Bảng 3.1 Đặc điểm phân biệt trong mẫu nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Kết quả phân tích cây phân loại 40

Bảng 3.3 Trình tự các nucleotid 43

Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng Coumarin trong quy trình xử lý mẫu lá Quế 49

Bảng 3.6 Kết quả hàm lượng aldehyd cinnamic trong các quy trình xử lý 49

mẫu lá Quế 49

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra tính tương thích của hệ thống phương pháp định lượng Coumarin và Aldehyd cinnamic trong lá quế 51

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của coumarin và aldehyd cinnamic 54

Bảng 3.9 Kết quả độ thu hồi coumarin 55

Bảng 3.10 Kết quả độ thu hồi cinnamaldehyd 56

Bảng 3.11 Kết quả định lượng phép thử độ độ lặp lại coumarin và aldehyd cinnamic 56

Bảng 3.12 Bảng kết quả thẩm định độ chính xác trung gian (thử –KNV 2) 57

Bảng 3.13 Kết quả độ chính xác trung gian của 2 kiểm nghiệm viên 58

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát LOD và LOQ 58

Bảng 3.15 Kết quả định lượng coumarin và aldehyd cinnamic của 18 mẫu lá quế 59

và vỏ quế 59

Bảng 4.1 So sánh các đặc điểm hình thái các mẫu nghiên cứu và mô tả loài Cinnamomum loureirii và Cinnamomum zeylanicum 64

Bảng 4.2 So sánh các đặc điểm hình thái các mẫu nghiên cứu và mô tả loài

Cinnamomum cassia của Thực vật chí Việt Nam và Thực vật chí Trung Quốc 65

Bảng 4.3 Độ tương đồng trên ngân hàng Genbank 70

DANH MỤC BẢNG HÌNH

Hình 1 1 Công thức cấu tạo 7

Hình 1 2 Sơ đồ mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự trnL- F 11

Hình 1 3 Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu quế tại Thanh Hóa bằng kỹ thuật RADP – PCR 13

Hình 3.8 Cây phân loại 18 mẫu Quế trồng dựa trên đặc điểm thực vật 40

Hình 3.9 DNA tổng số của 18 mẫu Quế 42

Hình 3.10 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại 43

Hình 3.11 Kết quả so sánh trình tự nucleotit với 18 mẫu quế nghiên cứu 47

Hình 3.12 Cây phân loại của 18 mẫu quế dựa trên so sánh trình tự TrnL/TrnF 48

Hình 3.13 Phổ UV của coumarin mẫu chuẩn và mẫu thử 52

Hình 3.14 Phổ UV của aldehyd cinnamic 52

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử và dung môi pha mẫu 53

Hình 3.16 Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc 55

Hình 3.17 Biểu đồ hàm lượng aldehyd cinnamic lá và vỏ 60

Hình 3.18 Biểu đồ hàm lượng coumarin lá và vỏ 61

Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu TVO22-19 mẫu lá và mẫu vỏ 62

Hình 4.1 Cinnamomum cassia (L.) J Presl trong Thực vật chí Việt Nam 69

Hình 4.2 Hàm lượng coumarin và aldehyd cinnamic trong lá quế 73

Hình 4.3 Hàm lượng coumarin và aldehyd cinnamic trong vỏ quế 74

ĐẶT VẤN ĐỀ

Quế là một loại dược liệu quý được sử dụng từ hàng ngàn năm về trước trong các nền Y học cổ truyền ở Việt Nam, Trung Quốc…, để trị phong thấp, bong gân, viêm phế quản, ăn không tiêu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn kinh nguyệt, cảm lạnh,… [1], [2] Nó cũng là một loại gia vị truyền thống, được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới; phụ gia cho các ngành công nghiệp, nguyên liệu sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm, lấy gỗ, chất bảo quản thực phẩm, thuốc trừ sâu, trừ nấm có nguồn gốc thực vật [3], [4]

Năm 2021, Việt Nam là quốc gia dẫn đầu trên thế giới về diện tích trồng Quế và xuất khẩu với giá trị trên 200 triệu USD [5] Việc phát triển mạnh trồng Quế trong khoảng 20 năm gần đây do việc thay đổi mô hình trồng, từ trồng thưa sang trồng mật độ cao và cắt tỉa để chưng cất tinh dầu cành con và lá, từ đó nâng cao thu nhập từ trồng quế cũng như có thu nhập ngay từ năm thứ tư sau khi trồng Việc phát triển mạnh mẽ này đặt ra nhiều thách thức cho sự phát triển bền vững và chất lượng các sản phẩm từ cây quế ở Việt Nam [6] Sự phát triển ồ ạt trong giai đoạn gần đây đã khiến cho các vùng trồng quế có sự xáo trộn về thành phần loài, gây giảm chất lượng đầu ra của một số vùng trồng quế bản địa như Thanh Hóa, Trà My

Trong bối cảnh như vậy, các nghiên cứu trên đối tượng cây Quế ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào mô tả đặc điểm hình thái, phân bố, đặc điểm sinh lý, sinh thái, giá trị sử dụng Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để nhận biết nguồn gen, xác định dòng/giống, nghiên cứu phát sinh loài và phân tích đa dạng di truyền mới được thực hiện theo từng địa phương và ít có liên hệ với thành phần hoạt chất trong cây Bởi vậy việc sử dụng kết hợp các mồi ở vùng DNA lục lạp để phân tích định danh loài [7], và định lượng thành phần hóa học trong lá Quế và vỏ Quế, trong đó quan trọng nhất là

hàm lượng aldehyd cinnamic - thành phần có tác dụng sinh học và coumarin - thành

phần gây ảnh hưởng đến chức năng gan [8] Các nghiên cứu này cũng giúp đánh giá lại tình hình phân bố thực tế các loài Quế, cung cấp dữ liệu cho chọn giống, xây dựng vùng trồng, sản xuất các sản phẩm chất lượng, truy xuất được nguồn gốc rõ ràng, từ đó góp phần đưa Quế trở thành dược liệu thế mạnh và đa giá trị của Việt Nam

Xuất phát từ thực tế nêu trên, đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đa dạng

di truyền và xác định hàm lượng aldehyd cinnamic và coumarin trong lá và vỏ

thân một số mẫu Quế trồng ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Phân tích đặc điểm thực vật và đa dạng di truyền của một số mẫu Quế trồng ở Việt Nam

2 Xác định hàm lượng aldehyd cinnamic và coumarin trong lá và vỏ thân một

số mẫu Quế trồng ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Quế

1.1.1 Về thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Các loài mang tên Quế tại Việt Nam thuộc chi Cinnamomum Schaeffer Tên tiếng Việt là chi Quế hay chi Long Não Đây là một chi lớn, có giá trị kinh tế cao trong

họ Lauraceae (Long Não) [9]

Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009)

[5], chi Cinnamomum được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân Lớp Ngọc Lan (Magnoliidae)

Bộ Long Não (Laurales)

Họ Long Não (Lauraceae)

Chi Quế (Cinnamomum) Chi Cinnamomum có khoảng 250 loài, trong đó Trung Quốc có 49 loài, Ấn Độ

có 15 loài

Ở Việt Nam năm 1991, chi Cinnamomum đã được nhà thực vật Việt Nam là

Phạm Hoàng Hộ đã mô tả 40 loài, đến năm 2003 thêm 3 loài, nâng tổng số lên 43 loài và có hình vẽ minh họa [6] Nhà thực vật Nguyễn Kim Đào năm 1994 đã thống kê được 42 loài [10], năm 2003 thống kê được thêm 2 loài và một thứ, nâng tổng số loài thống kê được lên 44 loài và 1 thứ [11]

Đến năm 2016, “Nghiên cứu phân loại chi Long Não (Cinnamomum Schaeff.) tại Việt Nam” đã đưa ra Khóa tra cho 22 loài trong chi Cinnamomum ở

Việt Nam, góp phần vào việc nghiên cứu phân loại thực vật Việt Nam nói chung và chi này nói riêng [11]

Năm 2017, Thực Vật chí Việt Nam – tập 20 Họ Long Não được xuất bản Hiện nay, đây là cuốn sách cung cấp đầy đủ nhất về khóa phân loại, mô tả cho các loài

thuộc chi Cinnamomum tại Việt Nam Bao gồm 49 loài và 2 thứ Tuy nhiên, vẫn còn

12 loài chưa đầy đủ thông tin [10]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật chi cinnamomum

Thực vật chí Trung Quốc [12] và Thực vật chí Việt Nam [10], có cùng những

quan điểm về đặc điểm thực vật chi Cinnamomum như sau:

Cây gỗ thường xanh hoặc cây bụi Vỏ, cành và lá cây thường có mùi thơm Chồi có hoặc không có dạng vảy, nếu có vảy, các vảy có thể nhìn rõ hoặc không rõ lắm, được xếp chồng lên nhau Lá mọc so le, so le hai hàng hay mọc đối, đôi lúc mọc tập trung ở ngọn, dày và cứng, có ba gân chính xuất phát từ gốc lá Cụm hoa dạng chùm ở nách lá, gần ngọn, hoặc ngọn, gồm (1–)3 cụm xim, mỗi cụm xim chứa từ 3 hoa trở lên Hoa vàng hoặc trắng, kích thước từ nhỏ đến vừa, hoa lưỡng tính Đài hàn liền ngắn, hình chén, hoặc hình chuông, tràng hoa 6 gần đều, rụng hoàn toàn khi hoa nở hoặc một phần trên cùng,cùng rụng sau khi hoa nở, hiếm khi toàn bộ hoa hoặc một số phần của nó không rụng Nhị hữu thụ 9 (hiếm khi nhiều hay ít hơn), xếp thành 3 vòng; bao phấn 4 ô (hiếm khi 2); 2 vòng ngoài bao phấn hướng vào trong, không tuyến; vòng nhị thứ 3 bao phấn hướng ra ngoài, có 2 tuyến; vòng thứ 4 có 3 nhị lép, hình mũi mác hoặc hình tim, có chân Bầu có độ dài bằng vòi nhụy, núm nhụy có hình đầu, hoặc đĩa, đôi khi được chia thành 3 thùy Quả mọng được bao bọc bởi cốc (đấu) ở phần dưới quả, cốc có thể có hình chuông hay hình ly, có mép cắt ngang hình chữ nhật, hoặc lượn sóng, răng cưa không đều hoặc đôi khi phần đỉnh có thể chia thành 6 phần tương tự nhau [10], [11]

1.1.1.3 Phân bố

Chi Cinnamomum gồm khoảng 250 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới Châu Á, Châu Đại Dương và Nam Mỹ [4], [10], [12]

Tại Việt Nam, trong số 49 loài đã được xác định trong chi Cinnamomum, có 27

loài mang tên “Quế”, phân bố ở các vùng rừng núi trong cả nước[1], [6], [10], [13]

Phần lớn các tài liệu trong nước đến nay cho rằng Việt Nam có 3 loài Quế, bao gồm [13], [14]

1) Cinnamomum cassia (Quế Trung Quốc, Quế đơn, Quế bì), phân bố chủ yếu ở

Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ

2) Cinnamomum loureirii (Quế Thanh), phân bố chủ yếu ở vùng Đông Trường

Sơn, tập trung nhiều ở vùng Bắc Trung Bộ từ Thanh Hóa đến Quảng Ngãi

3) Cinnamomum zeylanicum (Quế Quan, Quế Sri Lanka), phân bố ở cực Nam

Trung Bộ nước ta

1.1.1.4 Đặc điểm sinh thái

Quế là một loài cây nhiệt đới thích hợp ở các vùng ẩm, mưa nhiều, lượng mưa lớn hơn 2000 mm/năm, ưa đất sét pha cát, dễ thoát nước, đất sâu trên 1m, ẩm, mát, phát triển trên các loại đá macma chua (phiến thạch mica, phiến thạch sét…) Quế phát triển không tốt trên đất phù sa quá xốp Trên đất đá vôi chua, mặn, ngập nước hoặc đã bị đá ong hoá không trồng quế được [10],[12]

Quế là cây nhiệt đới ẩm, cây gỗ ưa sáng, tuy nhiên giai đoạn cây nhỏ cần phải được che bóng Ở giai đoạn trưởng thành 3 - 4 năm cây cần được tạo điều kiện đầy đủ về ánh sáng để cây sinh trưởng và phát triển tốt, hàm lượng và chất lượng tinh dầu cao [10]

Cây có bộ rễ phát triển rất mạnh, ăn sâu và lan rộng trong đất nên cây có khả năng sinh trưởng và phát triển rất mạnh Cây trồng từ giai đoạn gieo ươm đến 3,5 tuổi có thể đạt chiều cao khoảng 2,2 - 2,7 m Cây ở giai đoạn 9 năm tuổi có chiều cao đạt khoảng 6,5 - 7,2 m và đường kính thân trung bình 20 - 21cm Đặc biệt, cây Quế có khả năng tái sinh bằng chồi gốc rất mạnh Vì thế sau khi thu cây lấy vỏ, người ta có thể tiếp tục chăm sóc chồi gốc để chồi gốc phát triển thanh cây và tiếp tục thu hoạch [10]

1.1.2 Đa dạng di truyền

Năm 2007 Govinden và cộng sự nghiên cứu mã vạch DNA của cây quế bản địa Thành phần tinh dầu của lá và vùng đệm phiên mã nội bộ không mã hóa (ITS2), bằng cách khuếch đại PCR và giải trình tự DNA để đánh giá việc sử dụng vùng đó trong

ứng dụng mã vạch DNA C osmophloeum Kaneh Cây phát sinh chủng loại được xây

dựng bằng phương pháp phân cụm UPGMA Kết quả cho thấy trình tự nucleotide một phần ITS2 của cả 7 chủng địa lý là giống hệt nhau [15]

Năm 2009 Pushpa và cộng sự; đánh giá mối liên quan di truyền giữa các loài

Cinnamomum ở Sri Lanka, có 9 loài Cinnamomum Sử dụng phương pháp phân loại

dựa hình thái, sinh lý, sinh hóa và thành phần tinh dầu, sử dụng kết hợp kỹ thuật phân tử để xác định chính xác Kết quả so sánh trình tự nucleotide của các vùng cpDNA và

ITS rDNA ở 8 loài Cinnamomum, phát hiện sự khác biệt về trình tự ở trnL intron,

trnL-trnF IGS, trnT-trnL IGS, trnH-psbA IGS và ITS rDNA Điều này cho thấy vùng cpDNA ít biến đổi, nhưng vẫn có giá trị trong phân loại di truyền Vùng ITS rDNA

hiệu quả hơn trong việc xác định loài Cinnamomum [16]

Năm 2010 tác giả Miss Jittra Jansote đã đánh giá đa dạng di truyền quần thể Quế ở miền Nam Thái Lan, dựa trên 73 mẫu giống Quế thuộc 17 loài (8 loài đã biết và 9 loài chưa xác định), phân tích đặc điểm hình thái; thân, lá, hoa, quả, sử dụng 10 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền Phân tích dữ liệu bằng phần mềm NTSYS version 2.1 Kết quả thu được 8 băng DNA, 75 băng đa hình (chiếm 96,15%), hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,397 đến 0,987, trung bình 0,641 Có 73 mẫu giống

Quế được chia thành 5 nhóm; C porrectum và C ilicioides có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất (hệ số tương đồng di truyền trung bình cao nhất: 0,843) C.porrectum và

C mollisimum có mối quan hệ di truyền xa nhất (hệ số tương đồng di truyền trung

bình thấp nhất 0,522) Tác giả kết luận quần thể quế ở miền Nam Thái Lan có đa dạng

di truyền cao, phân tích hình thái và RAPD có thể phân biệt các loài Quế C porrectum và C ilicioides có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất C.porrectum và C mollisimum

có mối quan hệ di truyền xa nhất [17]

Năm 2011, Sandigawad và cộng sự đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 8

loài thuộc chi Cinnamomum ở Nam Ấn Độ sử dụng 40 marker RAPD, để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 8 loài Cinnamomum Kết quả thu được Chỉ thị RAPD hiệu quả trong việc phân loại và nghiên cứu phát sinh loài ở các loài Cinnamomum [18]

phần có hoạt tính sinh học với sự xuất hiện của 16 hợp chất Ngoài ra trong cây còn có

24 hợp chất thuộc nhóm glycosid, 26 hợp chất nhóm lignan, 9 hợp chất nhóm lacton

và các hợp chất khác [19], [20]

Quế là loài cây có chứa tinh dầu các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, hàm lượng tinh dầu Quế trong vỏ Quế khá cao (2,7 - 3,11 %), ở lá và cành non thấp hơn [21], [22] Tinh dầu từ vỏ có màu vàng nâu nhạt, sánh, vị cay, thơm, ngọt, nóng, nặng hơn nước, với 41 hợp chất dễ bay hơi Chất chiếm thành phần cao nhất trong tinh dầu

quế là aldehyd cinnamic với hàm lượng dao động 60-80 % [23]

Hình 1 1 Công thức cấu tạo

a Aldehyd cinnamic; b Coumarin (chromen-2-on)

1.1.3.1 Aldehyd cinnamic

Tên IUPAC: (E)-3-Phenylprop-2-enal

Công thức phân tử: C9H8O (M = 132,15 g/mol) (Hình 1.3 a)

Tên khác: Cinnamaldehyd, trans-cinnamaldehyd, aldehyd cinnamic

Tính chất: • Dầu màu vàng, ít tan trong nước (1,42mg/ml ở 25°C), hòa tan trong cloroform, ether, không hòa tan trong dầu hỏa

• Nhiệt độ nóng chảy: −7,5°C, nhiệt độ sôi 253°C, tỷ trọng 1,048 - 1,052 g/ml ở 25°C, áp suất hóa hơi 0,005 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ 1,6195

• Bước sóng hấp phụ cực đại: 291 nm [24]

Aldehyd cinnamic là một phenylpropanoid, đây là thành phần chính trong C

cassia, trong tinh dầu aldehyd cinnamic có nồng độ khoảng 90% Định lượng bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao

Aldehyd cinnamic được sử dụng trong hương liệu làm kẹo cao su, đồ uống,

kem, kẹo và cũng được sử dụng trong nước hoa Aldehyd cinnamic có khả năng khử

trùng, có tác dụng đuổi muỗi rất hiệu quả [25] Ngoài ra, còn có đặc tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm [26], [27]

1.1.3.2 Coumarin (chromen – 2 – on)

Tên IUPAC: 2H-coumarin Tên gọi khác: Rattex, coumarinic anhydrid,

2H-1-benzopyran-2-on…

Công thức phân tử: C9H6O2 (Hình 1.3 b) Khối lượng phân tử: 146,14 g/mol Tính chất:

• Tinh thể không màu hoặc màu trắng, mùi thơm dễ chịu, có mùi hoa Quế • Nhiệt độ nóng chảy: 71°C

• Độ tan trong nước: 0,19 g/100 mL ở 20 °C, hòa tan trong ethanol, rất tan trong ether và chlorofor

• Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [28]

Coumarin và dẫn xuất có hoạt tính sinh học như chống đông máu, kháng khuẩn,

kháng virus chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế enzym Liều cao

coumarin được phát hiện là có nguy cơ gây độc cho gan, tuy nhiên có thể giúp giảm

nguy cơ gây ung thư và bệnh lý về thần kinh và tim mạch [29]

Cơ quan an toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) và Viện Đánh giá rủi ro Liên

Bang Đức (BfR) đã thiết lập lượng coumarin có thể chấp nhận được hàng ngày (TDI) là 0,1 mg/kg [30] Theo quy định Châu Âu, mức tối đa của coumarin tự nhiên có trong

hương liệu được đặt trong khoảng 5-50 mg/kg (tương đương 0,5 - 5%) [31]

1.1.3.3 Các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học trong quế

Năm 2011, Rind và cộng sự đã áp dựng phương pháp đo quang phổ để định

lượng aldehyd cinnamic trong vỏ Quế, dầu Quế và chế phẩm Thông qua phản ứng của nhóm aldehydaldehyd với - aminonaphthalen tạo thành dẫn xuất có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 376 nm Cách tiến hành sử dụng phương pháp ngân bột

vỏ Quế với ethanol trong 24 giờ Kết quả định lượng aldehyd cinnamic trong vỏ Quế

là 0,40 – 0,57 %, dầu quế là 0,44 - 46,00 % và chế phẩm thương phẩm là 0,003 – 0,34 % Phương pháp này có ưu điểm đơn giản và nhanh chóng nhưng cũng có những hạn

chế độ chính xác của phương pháp có thể bị ảnh hưởng chất nhiễu trong mẫu và cần có thiết bị máy đo quang phổ[32]

Năm 2013, Yan-qun Li và các công sự đã định lượng để xác định thành phần

hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp GC-MS và FT-IR của 3 loài Quế C verum, C

cassia và C loureirii Tiến hành chiết xuất tinh dầu từ vỏ 3 loài quế bằng phương pháp

chưng cất hơi nước sau đó tiến hành phân tích bằng GC-MS để xác định và định lượng các hợp chất dễ bay hơi, cuối cùng phân tích bằng FT-IR để xác định cấu trúc của các hợp chất Kết quả cho thấy cả 3 loài Quế đều chứa hợp chất dễ bay hơi, bao gồm

aldehyd, rượu, este và terpen Trong đó C loureirii có hàm lượng tinh dầu cao nhất (3,08 %) trong đó tỷ lệ trans- cinnamaldehyd cao nhất (81,97 %) C verum chứa một lượng đáng kể eugenol, C cassia chứa nhiều guaien hơn so với 2 loài còn lại Nhận

thấy có sự khác biệt đáng kể về thành phần và hàm lượng hoạt chất dễ bay hơi giữa 3 loài Quế [33]

Năm 2014, Bizuneh Adinew đã xác định và định lượng được 6 thành phần trong

đó 2-propenal và 3-phenyl chiếm phần lớn (87,013 %) trong khi aldehyd cinnamic chiếm 0,236 %, eugenol chiếm 9,317 %, trong tinh dầu vỏ Quế trồng ở vùng Tây Nam

Ethiopia Sử dụng phương pháp GC-MS và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR để xác định cấu trúc nghiên cứu đã cung cấp thông tin quan trọng về thành phần hóa học độc đáo của tinh dầu vỏ quế [34]

Năm 2016 Pei-Yi Chen và nhóm nghiên cứu đã định lượng được 8 thành phần

gồm coumarin, aldehyd cinnamic, cinnamyl alcohol, acid cinnamic,

2-hydroxycinnamaldehyd, acid 2- hydroxycinnamic, 2-methoxycinnamaldehyd and methoxycinnamaldehyd Trong số các thành phần này thì 4 – methoxycinnamaldehyd

4-cho thấy sự thay đổi lớn nhất ở 3 bộ phận của cây và cinnamyl alcohol, coumarin và

aldehyd cinnamic cũng có sự khác nhau Sử dụng phương pháp LCqTOF-MS để phân

tích thành phần hoá học trong cành Quế, vỏ Quế [35]

Năm 2019, Ying Liang và cộng sự đã xác định được 11 chất với hàm lượng

aldehyd cinnamic trong quế nhận thấy có sự thay đổi tùy theo loài và phương pháp

chiết xuất Các hợp chất hóa học được phân tích bằng dịch chiết và xác định bằng MS và HPLC-MS Điều kiện phân tích gồm pha tĩnh là cột Polaris C18 (250 × 4,6

GC-mm), pha động là dung môi acid formic 0,1 % trong nước và dung môi acid formic 0,1 % trong MeOH Tốc độ dòng 1 ml/phút Nghiên cứu [36]

Al-Zehouri J.J (2017) Sử dụng quy trình HPLC xử lý đơn giản khả năng chiết

hiệu quả và độ nhạy cao Phương pháp phân tích định lượng đồng thời coumarin và

aldehyd cinnamic trong các mẫu Quế từ các vùng khác nhau Sử dụng cột C18, mục

tiêu đạt được trong vòng 4 phút, với độ lặp lại tốt và độ tuyến tính đã được chứng

minh trong khoảng 0,013–1 mg/L, đối với coumarin 0,5–40 mg/L aldehyd cinnamic [37]

1.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm di truyền

1.2.1.1 Đặc điểm cơ bản của trình tự barcode

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn [38], [39] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, công nghệ giải trình tự và phân tích dữ liệu sinh học, đoạn DNA mã hóa đã trở thành công cụ thiết yếu cho các nhà phân loại học Nó cho phép họ nhận biết và quản lý được toàn bộ hệ sinh thái rộng lớn và nhiều biến đổi [40] bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR Một đoạn DNA được mã hóa, đơn giản nhất là một đoạn trình tự gen ngắn được tách ra từ hệ gen của một loài được sử dụng để nhận dạng loài đó [40] Đoạn trình tự đáp ứng 3 tiêu chuẩn thứ 1 tính đặc hiệu chứa thông tin di truyền của loài; thứ 2 chứa những vị trí thích hợp để gắn các cặp mồi PCR dễ dàng và cuối cùng độ dài thích hợp để thuận tiện tách chiết DNA Bên cạnh 3 tiêu chuẩn thì ý kiến của nhà khoa học nói đoạn trình tự phải có chất lượng tốt [41], ứng dụng này được thực hiện đầu tiên trên động vật [38] Sau đó, qua hàng loạt các nghiên cứu sàng lọc trên hệ gen thực vật,3

vùng gen trong plastid (rbcL, matK và trnH-psbA) và 1 vùng gen trong nhân (ITS) là

những đoạn DNA tiêu chuẩn để lựa chọn trong hầu hết các nhận diện các loài thực vật và nấm [41]

Trong nhiều năm gần đây, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân

loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [42]

Hình 1 2 Sơ đồ mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự trnL- F

1.2.1.2 Trình tự hai gen trnL (UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (GAA), là một phần của DNA lục lạp, nằm giữa hai

gen mã hóa cho tARN (transfer RNA) có tên là trnL (UAA) và trnF (GAA) DNA lục lạp là DNA riêng biệt nằm trong các bào quan lục lạp của tế bào thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp

Vai trò Locus trnL (UAA) - trnF (GAA) đóng vai trò quan trọng trong Quá

trình quang hợp: Gen trnL (UAA) mã hóa cho tARN leucine, tham gia vào quá trình

tổng hợp protein cần thiết cho quang hợp Nghiên cứu hệ thống học thực vật: Locus

trnL - trnF được sử dụng như một "mã vạch" (barcode) DNA để phân biệt và xác định loài thực vật do cấu trúc đặc biệt với sự xen kẽ giữa vùng biến đổi và vùng bảo thủ

Từ Quang Tân [43] là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên

cứu hệ thống học thực vật Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotid ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại

các đoạn gen ở vùng biến đổi Trong nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên

được sử dụng làm vùng DNA barcode, đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận

rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một

barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [16]

1.1.1.3 Ứng dụng của các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR trong nghiên

cứu đa dạng di truyền loài Cinnamomum

Trong nghiên cứu đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 8 loài thuộc chi

Cinnamomum ở Nam Ấn Độ các mẫu được lấy từ tự nhiên ở phía Tây Ghats của

Karnataka, Tamil Nadu và Kerala Theo phương pháp CTAB có cải tiến thu được 40 mồi RAPD thành công trong việc phân loại và nghiên cứu phát sinh loài ở các loài

thuộc chi Cinnamomum thu được 111 băng DNA trong đó có 98% băng đa hình Kích

thước băng nhân lên được cao nhất là 4200bp và thấp nhất là 100bp, hệ số tương đồng

di truyền dao động từ 0,17 (giữa C.zeylanicum và C.travancoricum) đến 0,81 (giữa

C.macrocarpum và C.travancoricum) Dựa vào sơ đồ hình cây chia thành 2 nhóm

Nhóm A gồm C malabatrum, C sulphuratum, C macrocarpum, C travancoricum, C

wightii, C nicolsonianum và C walaiwarense Nhóm B chỉ có loài C.zeylanicum [47]

Năm 2009, Pushpa và cộng sự, sử dụng phương pháp phân tích trình tự DNA

để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài quế (Cinnamomum) ở Sri Lanka nhận

thấy vùng ITS đa dạng nhất với với 7 vị trí đa hình được tìm thấy trong số 9 loài Quế Băng phân tích trình tự nucleotide của các vùng cpDNA khác nhau và một vùng ITS của rDNA Các vùng cpDNA được nghiên cứu là các đoạn mã gen giữa trnL-trnF, trnT-trnL, trnH-psbA và intron trnL Trong số sử dụng 14 mồi; vùng trnL lục lạp 6 mồi 3 cặp cho trnL intron và trnL-trnF IGS liền kề (c/d, e/f và a/b), trnH-psbA spacer 2 mồi (trnH và psbA), vùng ITS có 2 mồi ITS4 và ITS5A [16]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Kuen – Yin Ho và cộng sự đã điều tra mối quan

hệ tiến hóa giữa các loài Cinnamomum Họ đã sử dụng kết hợp ba cách tiếp cận khác

nhau; Phân tích hình thái lá, phân tích ISSR, phân tích ITS, để phân tích sự đa dạng di

truyền và mối quan hệ họ hàng giữa 12 loài Cinnamomum ở Đài Loan, 7 đoạn mồi

được lựa chọn ISSR đã được sử dụng để phân tích sự đa dạng di truyền trong các quần

thể Cinnamomum camphora, ITS đã được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài của các loài Cinnamomum ở Đài Loan Kết quả phương pháp ISSR là một phương pháp

hiệu quả để phân tích sự đa dạng di truyền trong các quần thể ITS là một phương pháp hiệu quả để xây dựng cây phát sinh loài xác định các loài lai [44]

Năm 2015, Khuất Hữu Trung và cộng sự đánh giá đa dạng di truyền của quế Thanh bằng chỉ thị RAPD – PCR gồm 22 mồi ngẫu nhiên đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 32 mẫu giống quế Thanh Hóa Kết quả phân tích PCR nhân lên được 3,137 băng bao gồm 126 loại băng với kích cỡ khác nhau Trong đó 61 băng đa hình (chiếm 48,41%) và 65 băng đơn hình (chiếm 51,59%) Số băng nhân lên dao động từ 3 đến 11 loại băng, trung bình 5,8 băng/mồi Hệ số tương đồng của 32 mẫu dao động 0,67 đến 0,97 Dựa vào hệ số tương đồng chia 32 mẫu giống nghiên cứu thành 6 nhóm lớn Kết quả nghiên cứu cũng xác định được 2 băng cá biệt ở 2 mồi có thể làm marker

nhận dạng chính xác 2 nguồn gen khác nhau Mồi OPN20 và UBC 728 có thể phân

biệt mẫu giống tương ứng là TT02 vã XC24 [14]

Hình 1 3 Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu quế tại Thanh Hóa bằng kỹ thuật

RADP – PCR

Như vậy, các kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu như RAPD, ISSR và ITS đã được sử dụng thành công để phân biệt các loài Quế khác nhau, đánh giá đa dạng di truyền trong quần thể và xác định mối quan hệ họ hàng

Nghiên cứu lựa chọn phân tích so sánh trình tự nucleotide các đoạn trnL-trnF

nhằm so sánh với các trình tự nucleotid, có độ lặp lại kết quả cao hơn các kỹ thuật của RAPD hay ISSR Mặt khác, có thể so sánh kết quả các đoạn trình tự với các đoạn trình

tự của loài cinnamomun đã được công bố bởi các nghiên cứu khác trên trên GenBank

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

1.2.2.1 Phương pháp định lượng sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trần Ngọc Phan (2023) đã định lượng đồng thời coumarin, acid cinnamic,

aldehyd cinnamic trong vỏ Quế bằng phương pháp HPLC dựa trên Dược điển Mỹ

[45] Điều kiện sắc ký tham khảo Dược điển Mỹ với mục tiêu có thể áp dụng cho mọi phòng thí nghiệm [45] với quy trình như sau: Sử dụng cột C18 (25 cm × 4,6 mm; 5 µm); nhiệt độ cột 25oC; tốc độ dòng 1 ml/phút; dung môi pha mẫu: MeOH-H2O (7:3); bước sóng phát hiện 280nm; pha động acid phosphoric 0,05% - ACN với chương trình gradient Thẩm định theo phương pháp ICH [46] Kết quả cho thấy các píc tách tốt, chân píc gọn, cân xứng rõ ràng Phương pháp này đã được dùng để đánh giá sơ bộ hàm

lượng coumarin và aldehyd cinnamic trong 102 mẫu ở 8 tỉnh khác nhau: coumarin giao động trong khoảng 0,06-2,58%, aldehyd cinnamic giao động khoảng 0,98-9,83% [47]

1.2.2.2 Một số chỉ tiêu kiểm tra chất lượng dược liệu

Dược điển Việt Nam

Dược điển Việt Nam V, phần dược liệu đã đưa ra một số chỉ tiêu để kiểm tra chất lượng dược liệu: mô tả, vi phẫu, soi bột, tạp chất, phương pháp định tính, định lượng hàm lượng tinh dầu [48]

Dược điển Mỹ

Dược điển Mỹ USP 2022 [49] định lượng procyanidin B2 , coumarin, 2-

hydroxycinnamaldehyd, acid cinnamic, aldehyd cinnamic, and 2-

methoxycinnamaldehyd trong vỏ quế Cinnamomum cassia bằng HPLC với cột tách L1

(2,1 mm x 10 cm; 1,5 µm), pha động gồm dung dịch acid formic 0,1% và ACN chạy chế độ gradient, phát hiện ở bước sóng 280 nm Mẫu thử được chiết với hỗn hợp MeOH: nước (7:3) siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng Yêu cầu hàm lượng tổng các

phenylpropanoid ≥ 3,2 %, aldehyd cinnamic ≥ 3,0% và procyanidin B2 ≥ 0,03 % tính

theo chế phẩm khô kiệt

Dược điển Trung Quốc

Dược điển Trung Quốc 2015 [50] chuyên luận Cinnamomi Cortex đã đưa ra phương pháp định lượng aldehyd cinnamic Chương trình chạy đẳng dòng với điều

kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động: ACN: nước (35:75); phát hiện ở bước sóng UV 290nm Mẫu thử được chiết siêu âm bằng MeOH Yêu cầu tinh dầu >

1,2%, aldehyd cinnamic ≥ 1,5%

Dược điển Hồng Kông

Dược điển Hồng Kông trong chuyên luận Cinnamomi Cortex đã đưa ra chỉ tiêu

định tính, định lượng hoạt chất trong vỏ thân của cây Quế [51] Cụ thể, phương pháp

chọn 2 chất đối chiếu là aldehyd cinnamic và acid cinnamic với điều kiện sắc ký như

sau: Cột ODS (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động: ACN: 0,5 % acid acetic, rửa giải gradient; phát hiện ở bước sóng UV 290 nm Mẫu thử được chiết siêu âm bằng ethanol

70 % Yêu cầu hàm lượng tinh dầu > 1,2%, tổng aldehyd cinnamic và acid cinnamic

phải không nhỏ hơn 1,7 % tính theo chế phẩm khô kiệt

Như vậy, để có thể bước đầu đánh giá chất lượng dược liệu Quế tại Việt Nam,

đề tài đã tiến hành định lượng hai chất coumarin và aldehyd cinnamic từ những vùng

trồng khác nhau Từ đó có những đề xuất phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng vào chọn giống vùng trồng Quế tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 18 mẫu Quế trưởng thành có tuổi từ 10-15 tuổi được thu hái ở các vùng trồng trong cả nước thuộc 4 vùng sinh thái Đông Bắc (Quảng Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên); Tây Bắc (Yên Bái, Lào Cai, Hòa Bình); Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa); Duyên hải miền Trung (Quảng Nam) Các mẫu được thu 03 lần vào các thời điểm: Lá và quả được thu vào mùa bóc vỏ quế từ tháng 8-9; Cành mang hoa được thu vào mùa hoa từ tháng 6-7 và Quả được thu vào dịp tháng 3 Các mẫu nghiên cứu cây được ghi lại tọa độ địa lý để truy suất khi cần thiết Thông tin các mẫu được trình bày (Bảng 2.1)

Lá, vỏ để định lượng thành phần coumarin, aldehyd cinnamic được phơi trong

bóng râm đến độ ẩm nhỏ hơn 14% DĐVN V, sau đó được bảo quản trong túi PE hạt silicagel kín, để nơi khô ráo

Tiêu bản của các mẫu nghiên cứu được lưu trữ tại phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) Mã số tiêu bản của các mẫu được đính kèm ở Phụ lục 1 và ảnh tiêu bản được đính kèm ở (Phụ lục 2)

Bảng 2 1 Danh mục các mẫu quế nghiên cứu

Đông Bắc

1 TVO22-18 Xã Hoành Mô, huyện Bình Liêu, Quảng Ninh 21°35'14,59"Bắc;

107°29'46,85"Đông 2 TVO22-19 Xã Hoành Mô, huyện Bình Liêu, Quảng Ninh 21°33'27,34"Bắc;

107°29'57,96"Đông 3 TVO22-17 Xã Hoành Mô, huyện Bình Liêu, Quảng Ninh 21°33'27,34"Bắc;

107°29'57,96"Đông 4 TVO22-28 Xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên 21°53'38,79"Bắc;

105°45'0,62"Đông 5 TVO23-35 Xã Đại Sảo, huyện Chợ Đồn, Bắc Kạn 22° 7'10,73"Bắc;

105°37'37,97"Đông 6 TVO23-36 Xã Đại Sảo, huyện Chợ Đồn, Bắc Kạn 22° 4'55.72"Bắc;

105°37'56.26"Đông

Tây Bắc

STT Mã Địa điểm thu mẫu Tọa độ địa lý

7 TVO22-14 Xã Cao Sơn, huyện Đà Bắc, Hòa Bình 20°49’9,04”Bắc;

105° 9’32,15”Đông 8 TVO22-

31 Xã Trung Thành, huyện Đà Bắc, Hòa Bình

20°52’8,60”Bắc; 105° 5’46,73”Đông 9 TVO22-13 Xã Cao Sơn, huyện Đà Bắc, Hòa Bình 20°49’9,77”Bắc;

105° 9’31,50”Đông 10 TVO22-15 Xã Cao Sơn, huyện Đà Bắc, Hòa Bình 20°49’56,43”Bắc;

105° 9’6,23”Đông 11 TVO22-29 Xã Trung Thành, huyện Đà Bắc, Hòa Bình 20°52’21,59”Bắc;

105° 7’35,90”Đông 12 TVO22-8 Xã Sơn Hà, huyện Bảo Thắng, Lào Cai 22°18’55,56”Bắc;

104°10’23,12”Đông 13 TVO23-43 Xã Nậm Đét, huyện Bắc Hà, Lào Cai 22°24'48,66"Bắc;

104°17'21,23"Đông 14 TVO23-44 Xã Nậm Đét, huyện Bắc Hà, Lào Cai 22°24'50,08"Bắc;

104°17'20,81"Đông 15 TVO22-11 Xã Đại Sơn, huyệnVăn Yên, Yên Bái 21°50'25,03"Bắc;

104°36'42,58"Đông

16 TVO22-20 Xã Luận Thành, huyện Thường Xuân, Thanh Hóa 19°47'22,51"Bắc;

105°23'58,81"Đông 17 TVO22-21 Xã Xuân Liên, huyện Thường Xuân, Thanh Hóa 19°52'38,01"Bắc;

105°17'51,53"Đông

Duyên hải miền Trung

18 TVO22-23 Xã Trà Mai, huyện Nam Trà My, Quảng Nam 15°10'47,74"Bắc;

108° 7'46,28"Đông

2.2 Thiết bị, hóa chất 2.2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.2.1.1 Phân tích hình thái

Các dụng cụ tại Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, gồm: - Kính lúp soi nổi Labomed Luxeo-4Z (Mỹ); máy ảnh kỹ thuật số Sony 𝛼-6000 (Nhật Bản); kính hiển vi Labomed CxL (Mỹ)

- Tủ sấy Memmert 30-1060 (Đức)

- Các dụng cụ khác: Thước kẻ 15-30 cm; giấy kẻ ô ly; tấm vải nhung đen, bộ dụng cụ phân tích hoa, dao lam

2.2.1.2 Nghiên cứu hóa học

Các thiết bị, dụng cụ tại Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia, gồm: - Hệ thống HPLC-DAD Shimadzu LC-40D XR (Nhật Bản) trang bị hệ thống bơm gradient áp suất thấp 4 kênh dung môi và detector PDA, phần mềm Labsolution

- Cột sắc ký phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) (GL Sciences, Nhật Bản)

- Cân phân tích Mettler Toledo GF-244A, độ chính xác 0,0001g (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105, độ chính xác 0,01 mg (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm DAIHAN WUC - A22H (Daihan, Hàn Quốc) - Máy ly tâm HERMILE Z306 (Hermile, Đức)

- Tủ sấy MEMMERT ULM-500 (Memmert, Đức) - Tủ lạnh Haier HYC 940 (Haier, Trung Quốc) - Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25ml, 50 ml, 100 ml, cốc có mỏ, ống đong 1000, 250, 25 ml của Class A, Isolab (Đức); vial (Waters, Mỹ)

- Micropipet 100-1000 µl Nichipet (Nhật Bản) - Ống ly tâm 15 ml

- Giấy lọc

2.2.1.3 Phân tích đa dạng di truyền

Thiết bị, dụng cụ tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, gồm: - Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu -23oC (Biomedical Freezer – Sanyo) - Dụng cụ tách chiết: Máy nghiền mẫu tốc độ cao, máy ly tâm Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -30oC, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml và 2 ml), bể ổn nhiệt Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA

- Máy PCR: Eppendorf mastercycler pro S, máy soi chụp ảnh gen UVP

Gel-docIt, máy điện di Consort EV 222

2.2.2 Hóa chất

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric 85 % (Merck), - Chất chuẩn:

Aldehyd cinnamic 98% (C9H8O) hàm lượng 98%, (Hãng: Ark Pharm, CAS No: 14371-10-9, Lot No: BRL645, MW: 132,16)

Coumarin 99,99% (K4MC6MLG-25g, CAS 91-64-5, MW:14,14) Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymerazase, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, chloroform, isoamyalcohol, Ribonuclease A, Agarose, mồi lục lạp

Bảng 2 2 Danh sách cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Sử dụng phương pháp mô tả phân tích để mô tả các cơ quan dinh dưỡng (lá) và cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt) Các đặc điểm được mô tả được trình bày ở Bảng 2.3) Sự khác biệt của các mẫu được mô tả bằng phương pháp mô tả chẩn đoán [52]

Bảng 2 3 Các đặc điểm hình thái được mô tả của các mẫu Quế

1 Lá trưởng

thành

Cách mọc

Cuống lá: chiều dài cuống lá, đường kính cuống lá, bề mặt

cuống lá, màu sắc cuống lá

Phiến lá: hình dạng phiến lá, chiều dài, chiều rộng phiến lá, chỉ

số phiến lá, hình dạng gốc lá, hình dạng ngọn lá

Gân lá: màu sắc gân chính, kiểu gân phụ, kiểu gân mép, chiều

dài gân chính trước chia nhánh Mầu lá non

STT Bộ phận Đặc điểm mô tả

Chiều dài cụm hoa, chiều dài trung bình phân nhánh đầu tiên từ trục cụm hoa, tỉ số chiều dài trung bình phân nhánh đầu tiên từ trục cụm hoa/chiều dài cụm hoa

Chiều dài cuống hoa, chiều dài hoa

Bao hoa: Hình dạng, mép, ngọn, chiều dài, chiều rộng, mặt

Bao phấn: Hình dạng, chiều dài, chiều rộng, tỉ số độ dài bao

phấn/độ dài chỉ nhị, hướng của bao phấn vòng 1, hướng của bao phấn vòng 2, hướng của bao phấn vòng 3

Tuyến: Vị trí trên chỉ nhị vòng 3, hình dạng, chiều dài

6 Bộ nhuỵ Bầu: Hình dạng, chiều dài, chiều rộng, bề mặt

Vòi nhuỵ: Chiều dài, chiều rộng, bề mặt Núm nhuỵ: Hình dạng, chiều dài, chiều rộng, màu sắc, bề mặt

7 Cụm quả chín

Độ dài cuống cụm quả phân nhánh lần đầu, đường kính cuống cụm quả phân nhánh lần đầu

Quả chín: Cuống quả: Chiều dài cuống quả, đường kính, màu sắc, bề mặt Đấu quả: Chiều dài, đường kính, màu sắc, mặt cắt của đấu, rìa

đấu, chiều rộng vòng rìa đấu, gờ trên đấu 8 Hạt Hình dạng, chiều dài, chiều rộng

2.3.1.2 Giám định tên khoa học

Tên khoa học được giám định bằng phương pháp so sánh hình thái của các mẫu nghiên cứu với các bản mô tả trong Thực vật chí Việt Nam; Thực vật chí Trung Quốc, và mẫu tiêu bản chuẩn (type) tại phòng tiêu bản Paris (online) do ThS Nghiêm Đức Trọng - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội thực hiện

2.3.1.3 Phân loại các mẫu nghiên cứu dựa trên đặc điểm thực vật

Xác định biến số: Dựa trên các đặc điểm hình thái thực vật của các mẫu nghiên cứu đã được mô tả, lựa chọn các đặc điểm có sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu và

không thay đổi trên cùng 1 mẫu Tổng cộng có 19 biến số đã được xác định (Bảng 2.4

Phụ lục 4) Đặc điểm hình thái cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản của các mẫu (các biến số) được mã hóa và lập thành ma trận, sau đó nhập vào phần mềm SPSS và được phân loại dựa trên phép phân cụm (Cluster analysis), mối quan hệ giữa các mẫu nghiên cứu được xây dựng dựa trên khoảng cách Euclidean

Bảng 2 4 Bảng biến số dùng phân loại các mẫu Quế dựa trên đặc điểm hình thái

cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản

Đặc điểm hình thái lá trưởng thành năm đầu thuộc cành mang hoa

1 Mầu sắc mặt dưới lá ML Định tính 1= Xanh nhạt

2= Đỏ tím 2 Chiều dài cuống CDC Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0)

3 Hình dạng phiến lá HDLA Định tính

1 = Bầu dục 2 = Mác thuôn dài 3 = Elip

4= Hẹp dài/hình mác

4 Chiều dài lá/chiều

x (x là số nguyên dương khác 0)

5 Trung bình chiều dài cuống/ chiều dài lá TBDCUONGLA Định lượng

x (x là số nguyên dương khác 0)

1= Nêm hoặc tù 2= Nhọn hoặc tù 3= Tròn

4= Nêm

1= Tù 2= Rộng đầu 3= Nhọn 4= Tù hoặc nhọn 8 Chiều dài gân chính DAIGAN Định lượng x (x là số nguyên dương

TT Đặc điểm Mã Loại biến Giá trị biến

trước khi chia gân bên (mm)

khác 0)

Đặc điểm hình thái cụm hoa

9 Chiều dài cụm hoa

khác 0)

10 Chiều dài trung bình phân nhánh đầu tiên từ trục cụm hoa (cm)

DAICH1 Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0)

11 Dài cụm hoa/dài

x (x là số nguyên dương khác 0)

Đặc điểm hình thái bộ nhị

12 Vị trí tuyến trên chỉ

1 = 1/3 trên của chỉ nhị 2 = 1/2 của chỉ nhị 3= 1/3 dưới của chỉ nhị 13 Rộng của chỉ nhị/

rộng bao phấn, TLRCHINHIRBP Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0) 14 Rộng bao phấn/ dài

của bao phấn TLDAIRONGBP Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0) 15 Chỉ nhị/ bao phấn TLCHINHIBP Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0)

Đặc điểm hình thái bộ nhuỵ

16 Chiều dài bầu/ chiều

x (x là số nguyên dương khác 0)

17 Dài bầu/dài vòi nhụy CSDBVOINHUY Định lượng x (x là số nguyên dương

khác 0) 18 Hình dáng núm nhụy HDANGNN Định lượng 1= Bằng

2= Vát chéo

Đặc điểm hình thái cụm quả chín

19 Hình dáng rìa đấu RIADAU Định tính 1 = Rách

2 = Không rách

TT Đặc điểm Mã Loại biến Giá trị biến

3 = Uốn lượn, rách ít

2.3.2 Phân tích DNA

2.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách CTAB có cải tiến của của Asif and Cannon (2005) để tiến hành tách chiết ADN từ 18 mẫu nghiên cứu [53]

Công thức pha CTAB Buffer : CTAB (4%), NaCl 2,5M, Tris base pH 8, EDTA

pH8 0,5M, H2O

Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 500l CTAB bufferr Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút Bổ sung chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4C

Hút dung dịch nổi phía trên chuyển sang ống eppendoft 1,5ml mới sau đó bổ sung isopropanol đã làm lạnh theo tỷ lệ 1:1 về thể tích để thu tủa DNA Để ở -20C trong 1 giờ

Ly tâm thu tủa 11000 vòng/phút trong 20 phút ở 4C Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE và kiểm tra chất lượng DNA thu được bằng điện di 5µl DNA/mẫu trên gel agarose 1%, sử dụng thuốc nhuộm Redsafe

2.3.2.2 Thành phần của một phản ứng PCR

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở (Bảng 2.5)

Bảng 2 5 Thành phần phản ứng PCR

1 Nước cất hai lần khử ion 8,5

2.3.2.3 Chương trình chạy PCR

Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau (Bảng 2.6)

2.3.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45-50C bổ sung 2,5l thuốc nhuộm Redsafe, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm

Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4l loading dye và tra vào các giếng trên gel

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn Đặt 130V

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ liên kết với chất nhuộm Redsafe

2.3.2.5 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

1 Cắt lấy đoạn DNA mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml

2 Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG: 1 thể tích gel (100mg ~100μl) 3 Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn 4 Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5

5 Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút

6 Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa

7 Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút

8 Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch 9 Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 - 8.5) vào giữa màng của cột

QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng DNA tinh sạch

2.3.2.6 Giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty TNHH DNA Sequecing – Việt Nam Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI

2.3.3 Định lượng coumarin và aldehyd cinnamic trong lá quế và vỏ thân quế

2.3.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng thành phần hóa học trong lá quế

a) Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu lá quế

Tham khảo điều kiện xử lý mẫu lá trong Dược điển Hồng Kông [51], Dược điển Trung Quốc [50], Dược điển Mỹ [49] Tiến hành khảo sát lượng dung môi chiết, số lần chiết, thời gian chiết trên mẫu TVO22-19, quy trình được trình bày trong (Bảng 2.7)

Bảng 2 7 Bảng quy trình xử lý mẫu lá Quy trình 1 Quy trình 2 Quy trình 3 Quy trình 4 Giống nhau Cân 0,5g mẫu lá quế, cho vào bình định mức 25ml, thêm dung môi

methanol : Nước với các tỉ lệ: 1-9, 3-7, 5-5, 7-3, 9-1

Khác nhau

Lắc nhẹ nhàng <10 phút Siêu âm lạnh 30 phút Để nguội Thêm dung môi chiết đến vạch, lắc đều

Lắc nhẹ nhàng <10 phút Siêu âm lạnh 30 phút Để nghỉ 30 phút Sau đó lại siêu âm lạnh 30 phút Để nguội

Lắc bằng máy lắc bập bênh 1-2h Siêu âm nhiệt độ thường 30 phút Để nghỉ 30 phút Sau đó lại siêu âm lần 2 30 phút

Lắc bằng máy lắc bập bênh 8h Siêu âm nhiệt độ thường 30 phút Để nghỉ 30 phút Sau đó lại siêu âm lần 2 30 phút

b) Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn (1): Cân chính xác khoảng 175 mg Coumarin chuẩn vào bình

định mức 50ml, thêm methanol, siêu âm 30 phút đến tan hoàn toàn, bổ sung methanol đến vạch thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 3,5 mg/ml

Dung dịch chuẩn (2): Cân chính xác khoảng 127 mg aldehyd cinnamic chuẩn

vào bình định mức 25 ml, thêm MeOH, siêu âm 30 phút đến tan hoàn toàn, bổ sung MeOH đến vạch nồng độ chính xác khoảng 5,08 mg/ml

Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 1,5 ml dung chuẩn (1) và 1,5 ml dung dịch

chuẩn (2) vào bình định mức 25 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, trộn đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm (chuẩn hỗn hợp)

Dung dịch thử: Lấy khoảng 10 g lá quế, nghiền mịn, rây qua rây 250 Cân chính

xác khoảng 0,50 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml Mẫu được khảo sát theo quy trình chiết mẫu đã khảo sát (phụ lục 6.1) Thêm khoảng 20 ml dung môi Methanol- Nước tỉ lệ 9-1 theo quy trình khảo sát (phụ lục 6.2) Lắc nhẹ nhàng, siêu âm lạnh 30 phút Để nghỉ 30 phút, sau đó lại siêu âm lạnh 30 phút, để nguội Thêm dung môi chiết đến vạch, lắc đều Lấy khoảng 10ml dung dịch vào ống ly tâm và ly tâm 4000

vòng/phút trong 5 phút Dịch trong phía trên được lọc qua màng lọc 0,45 µm được

dung dịch tiêm sắc ký

c) Điều kiện sắc ký

Cột sắc ký: C18 (4,6 mm x 25 cm; 5 µm) Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút

Bước sóng phát hiện 280 nm Thể tích tiêm mẫu 10 µl Nhiệt độ cột 25 oC, Pha động: Kênh A: acid phosphoric 0,05%, Kênh B: acetonitril

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Độ đúng

Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn định lượng (LOQ)

a) Độ phù hợp hệ thống

Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp Ghi lại

thời gian lưu và diện tích píc, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi, độ phân giải của từng chất trong từng lần tiêm sắc ký

Dung dịch chuẩn đơn coumarin: Hút 1,5ml dung dịch chuẩn (1) vào bình

định mức 25 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, trộn đều Lọc qua màng lọc 0.45 µl

Dung dịch chuẩn đơn aldehyd cinnamic: Hút 1,5 ml dung dịch chuẩn (2) vào

bình định mức 25 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, trộn đều Lọc qua màng lọc 0,45 µl

Dung dịch chuẩn: Hút 1,5 ml dung chuẩn (1) và 1,5 ml dung dịch chuẩn (2) vào

bình định mức 25 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, trộn đều Lọc qua màng lọc 0,45 µl (chuẩn hỗn hợp)

Dung dịch thử: Lấy khoảng 10 g lá quế, nghiền mịn, rây qua rây 250 Cân chính

xác khoảng 0,50 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml Thêm khoảng 20 ml dung môi methanol - nước tỉ lệ 9-1, lắc nhẹ nhàng, siêu âm lạnh 30 phút, để nghỉ 30 phút, sau đó lại siêu âm lạnh 30 phút, để nguội, thêm dung môi chiết đến vạch, lắc đều Lấy khoảng 10ml dung dịch vào ống ly tâm và ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút Dịch trong phía trên được lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch tiêm sắc ký

Dung môi pha mẫu: MeOH – Nước: tỷ lệ 9 – 1

Tiến hành tiêm sắc ký dung dịch chuẩn đơn, dung dịch chuẩn hỗn hợp, mẫu thử và dung môi pha mẫu

Phổ UV tại đỉnh píc chất phân tích của mẫu thử và mẫu chuẩn tương đồng

c) Độ tuyến tính

Pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp coumarin, aldehyd cinnamic có nồng độ

trong khoảng nồng độ khảo sát của các chất phân tích rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Thiết lập phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ tương ứng Từ đó tính hệ số tương quan r và độ đúng tính lại từ đường chuẩn hoặc độ chệch (bias)

+ Yêu cầu: Hệ số tương quan r ≥ 0, 995 và độ đúng tính lại từ đường chuẩn

Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD

Yêu cầu: RSD ≤ 2,0%

Độ chính xác trung gian

Độ chính xác trung gian được đánh giá dựa trên độ lệch của 12 mẫu thử được phân tích riêng biệt ở 02 ngày khác nhau trên cùng một mẫu thử Mỗi KNV thực hiện 6 lần mẫu thử Các kết quả phải khác nhau không có ý nghĩa thống kê (sử dụng test F)

Dùng chuẩn F – Fisher với độ tin cậy φ = 95 % Tính toán Ftn (F thực nghiệm) và so sánh với Flt (F lý thuyết)

𝐹𝑡𝑛 = 𝑆1

2

𝑆2 2 > 1 Trong đó: 𝑆12, 𝑆2 2 là các phương sai kết của của 2 kiểm nghiệm viên Quy ước 𝑆12 > 𝑆2 2