ĐÀM THỊ THU HẰNG góp PHẦN NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật, THÀNH PHẦN HOÁ học và một số tác DỤNG SINH học của nấm LINH CHI (ganoderma lucidum (lyess ex fr ) karst ) ở VIỆT NAM (KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sỹ KHOÁ

B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI _ * rĐ m ^7h i r~Jltíi 'TơcưựỊ, GĨP PHẦN NGHIÊN cứu ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HỐ HỌC • • • VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum (Lyess ex Fr.) Karst.) Ở VIỆT NAM (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997- 2002) Hà Nội, tháng năm 2002 BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI _ * Sinh viên (ĩ)àjrvL & h ị ^7liu Tỉỗầntị GÓP PHẦN NGHIÊN cứu ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HỐ HỌC • • • • VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum (Lyess ex Fr.) Karst.) Ở VIỆT NAM (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997- 2002) Nẹười hướng dẫn: TSKH Trần Văn Thanh TS Nguyễn Viết Thân Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Thời gian thực hiện: 1/2002 - 5/2002 MỜ3 @ c Á M ơ 800.00 B a se lin e E rase Ụ ieu R e-scaĩẽ Zoom C ursor ilEVBir More U r i t e l a b e l s ,on t h e g r a p h _ Hình : Phổ hồng ngoại chất LC2 LC2- HANG FiND PEAKS: Spectrum: LC2 - HANG Region: 4000.00 400.00 Absolute threshold: 87 469 Sensitivity: 50 Peak list: Position: 2926.61 Intensity: Position: 2854 37 Intensitv: Number of sample scans: 32 Number of background scans: 32 Resolution: 4.000 Samplegain: 2.0 Mirror velocity: 0.6329 Aperture: 95.00 55.835 72*915 50 Detector: DTGS TEC 3.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá dịch chiết nấm Linh chi 3.3.1 Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp Blagodorop * Chuẩn bị dịch chiết: Cân xác khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm nước, đun sơi, chiết chia làm lần (lần thứ 1,5 giờ, lần thứ hai 1,0 giờ, lần thứ ba 0,5 giờ) lần 30ml nước Gộp dịch chiết, cô thành cao - nước [1:1], lấy 1,5 ml dịch cao pha thành 100 ml ta dịch chiết cần thử nồng độ 1,5 % * Tiến hành: Trong lọ màu nâu loại, cho hỗn hợp phản ứng gồm: - ml Tween 80 1% - 0,2 ml dung dịch muối sắt II (FeS04) 10' M - 0,2 ml dung dịch acid ascorbic 10’2 M - 0,6 ml dịch chiết thuốc (mẫu đối chứng thay 0,6 ml nước cất) Đậy nút kín, lắc kỹ, ủ nhiệt độ 40°c 48 Lấy 2ml hỗn hợp sau ủ, thêm vào ml dung dịch acid tricloracetic 30%, để yên giờ, sau đem ly tâm phút với tốc độ 4200 vòng/phút Lấy 2ml dịch sau ly tâm, thêm 2ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25%, đun cách thủy 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Đo màu phức tạo thành bước sóng Ả = 532 nm Tính lượng MDA với hệ số tắt = 0,156 nm or'cm 'i Nếu mẫu thử có chất chống oxy hố lượng MDA tạo thành phải mẫu đối chứng (tức mật độ quang mẫu thử phải thấp mẫu đối chứng) Kết thực nghiệm thể bảng 9: 31 B ảng Kết hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp Blagodorop TT M ẫu M ật độ quang (E) MDA (nmol/1) H T C O (%) Mẫu chứng 0,121 4,659 Mẫu thử 0,050 1,925 58,68 Mẫu thử 0,049 1,887 59,50 Mẫu thử 0,053 2,041 56,19 Mẫu thử 0,051 1,964 57,85 Mẫu thử 0,047 1,810 61,15 Trung bình 58,67 ± 2,29 Với lượng MDA tính theo cơng thức: x= Trong đó: F 3 = 3%5 E 0,156 X: Lượng MDA (đơn vị nmol/1) E: Mật độ quang mẫu đo 4: Thể tích mẫu đo quang (ml) 3: Thể tích tồn phần mẫu phân tích (ml) 2: Thể tích dịch để xác định MDA (ml) 0,156: Hệ số tắt mol (nmol ' cm '];i) Hoạt độ chống oxy hố tính theo cơng thức: HCTO = Xc Xc Trong đó: X t X 100 HTCO: Hoạt độ chống oxy hoá x c Lượng MDA mẫu chứng x t : Lượng MDA mẫu thử 32 Trong thí nghiệm nồng độ chất thử dùng là: (0,6ml X 0,015 g/ml) : ml = 0,003 g/ml = mg/ml Nhán xét: Nấm Linh chi trồng Việt Nam với hàm lượng mg dược liệu ỉ ml hỗn hợp phân tích có khả ức chế q trình peroxyd hố acid béo chưa no (Tween 80) với hoạt tính chống oxy hố 58,67 ± 2,29 % (so với mẫu đối chứng) 3.3.2 Nghiên cứu tác dụng chơng oxy hố bảo vệ tê bào gan theo phương pháp Jawiga Robak Misno Tanaka * Chuẩn bị dịch chiết cần thử: Từ cao - nước [1:1] phần [3.3.1] ta pha dung dịch cần thử với nồng độ 3g dược liệu 100 ml nước cất (3%) * Chuẩn bị thuốc thử: - Dung dịch acid Thiobabituric: 160 mg/20ml - Dung dịch Tricloacetic: 40 mg/lOOml - Dung dịch KC1: U2g/\ - Dung dịch acid ascobic: 0,4325 g/1 - Dung dịch muối sắt II (FeS04): 0,0165 g/1 * Chuẩn bị dung dịch đồng thể gan chuột: - Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, mổ lấy gan Nghiền lạnh với dung dịch KC1 máy nghiền đồng thể theo tỷ lệ 400 mg gan/ 9,6 ml KC1, thu dung dịch đồng thể gan chuột * Cách tiến hành: - Chuẩn bị giá ống nghiệm ml, đánh số thứ tự cho vào ống dung dịch theo thứ tự bảng 10: 33 Bảng 10: Trình tự cho dung dịch vào ống nghiệm Ống Ống Mẫu Dịch đồng thể (ml) thử Ống thử Ống thử Ống thử4 Ống thử 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Dung dịch thử (ml) 0,0 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 Muối sắt II 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 Acid ascobic (ml) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 Dung dịch KC1 (ml) 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,0 - FeS04(ml) Sau buộc kín ống nghiệm, ủ nhiệt độ 37° c 30 phút, lấy ra, thêm vào ống ml dung dịch acid tricloacetic 40% Để yên giờ, tiếp đem ly tâm phút với tốc độ 3000 vòng/ phút Lấy ml dịch sau ly tâm thêm vào ỉ ml dung dịch acid thiobabituric 0.80 %, đun cách thuỷ 20 phút để nguội đến nhiệt độ phòng Đo màu phức tạo thành bước sóng X = 532 nm Tính lượng MDA thơng qua mật độ quang với hệ số tắt = 0,156 nmol' 1cnv'l Kết thực nghiệm thể bảng 11: Bảng 11: Kết hoạt độ chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan (invitro) TT Mẫu Thể tích (mi) Nồng độ MDA HTCO (mg/ml) Mật độ quang (E) (nmol/1) Mẫu chứng 0,00 0,0 0,353 11,9 (%) 0,0 Mẫu thử 0,10 0,91 0,309 9,79 12,51 Mẫu thử 0,20 1,82 0,224 7,10 36,55 Mẫu thử 0,30 2,73 0,195 6,18 44,77 Mẫu thử 0,40 3,64 0,129 4.09 63,45 Mẫu thử 0,50 4,55 0,095 3,10 73,10 34 Lượng MDA tạo thành tính dựa vào mật độ quang theo cơng thức: Trong X : Lượng MDA (đơn vị nmol/1) E : Mật độ quang mẫu đo : Thể tích mẫu đo quang (ml) 3,3: Thể tích tồn phần mẫu phân tích (ml) : Thể tích dịch để xác định MDA (ml) 0,156: Hệ số tắt mol (n m o l'1 cm '1^) Hoạt độ chống oxy hố (HTCO) tính theo cơng thức phần [3.3.1] Lượng MDA tạo thành hoạt độ chống oxy hoá dịch chiết nấm Linh chi thể biểu đồ biểu đồ Biểu đồ : Lượng MDA tạo thành Biểu đồ : Hoạt độ chống oxy hoá Hoạt độ’ » chống oxy hoá Lượng MDA tạo thành MDA 15 HTCO 11.19 9.79 10 Mẫ.u thử MO MI M2 M3 M4 M5 MO MI M2 M3 M4 M5 Nhân xét: Từ kết bảng biểu đồ cho thấy lượng MDA mẫu thử giảm rõ rệt nồng độ chất mẫu thử tăng Điều cho thấy dịch chiết nấm Linh chi trồng Việt Nam có chứa chất chống oxy hố với hoạt tính chống oxy hố cao (73,10 % với nồng độ4,55mg dược liệu m í hỗn hợp nghiên cứu) 36 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 4.1.Kết luận: *Sau thời gian nghiên cứu thu số kết sau: 4.1.1 Về đặc điểm thực vật: - Đã phân tích đặc điểm hình thái cấu trúc nấm Linh chi trồng Việt Nam Đã tiến hành so sánh thấy nấm Linh chi trồng Việt Nam có khác đặc điểm hình thái so với nấm Linh chi hoang dại, Trung Quốc, Hàn Quốc cấu trúc bào tử đảm khơng thấy có khác biệt rõ rệt 4.1.2 Vê thành phần hoá học - Bằng phản ứng định tính sơ xác định nấm có số nhóm chất: Saponin, Sterol, Flavonoid, Acid amin, Polysaccharid, Alcaloid - Xây dựng sơ đồ chiết xuất hợp chất nấm Linh chi - Đã chiết xuất, phân lập chất LC1 LC2 tinh khiết từ nấm Linh chi 4.1.3 Vê tác đụng sinh học Đã chứng minh dịch chiết nấm Linh chi trồng Việt Nam có chứa hoạt chất có tác dụng chống oxy hố Linh chi với nồng độ mg dược liệu mỉ hỗn hợp nghiên cứu có khả ức chế q trình peroxyd hố lipid Tween 80 với hoạt tính chống oxy hố 58,67 ± 2,29%, cịn dịch đồng thể gan chuột 52,29% Điều cho thấy thực nghiệm tiến hành hai chất khác cho kết khả quan 37 4.2 Đê xuất Với kết thu nhận thấy: Nấm Linh chi Việt Nam cần tiếp tục nghiên cứu sâu mặt thực vật, hoá học tác dụng sinh học, để sớm thức đưa Linh chi vào danh mục thuốc nước, góp phần khẳng định vị trí loại dược liệu quý 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Văn Chuyên - Bài giảng Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội (Tr 124-144) Bài giảng Dược liệu tập 1, 2, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Anh Dũng - Góp phần vào nghiên cứu thành tố hố học Ganoderma lucidum, Tạp chí Dược học số 2/1996 (Tr 14-16) Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu - Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc Lê Trần Đức - Cây thuốc Việt Nam; NXB Nơng nghiệp/1997 (Tr 831833) Trương Thị Hồ, Trương Hương Lan - Nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi; International workshop on biology, Hanoi Vietnam 2-5, July 2001 (Tr 175-181) Trần Văn Mão, Phạm Quang Thu - Linh chi loại nấm chữa nhiều bệnh, Tạp chí Lâm nghiệp (Tr 20 -21) Đàm Nhận - Nghiên cứu thành phần loài số đặc điểm sinh học họ Linh chi (Ganodermataceae Donk) Việt Nam, Luận án PTS Khoa học Sinh học, 1996 Đàm Nhận, Trịnh Tam Kiệt - Khả phân lập nuôi cấy khiết số lồi họ nấm Ganodermataceae Donk, Tạp chí Dược học số 1/1995 (Tr 7-9) 39 10 Đàm Nhận, Lê Xuân Thám - Nghiên cứu tương đồng tính trạng hình thái hố sinh đại diện chi Ganoderma Karsten, Tạp chí Dược học ứng dụng số 4/1999 (Tr 10 - 13) 11 Đàm Nhận, Lê Xuân Thám - Đặc điểm tiến hoá cấu trúc bào tử đảm nấm Linh chi, Tạp chí Dược học số 5/1995 (T - 8) 12 Lê Xuân Thám - Nấm Linh chi dược liệu quý Việt Nam - Khảo cứu kết hợp với phương pháp phóng xạ hạt nhân - NXB Mũi Cà Mau, 1996 13 Lê Xuân Thám - Nghiên cứu đặc điểm sinh học q trình hấp thu khống nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst kỹ thuật hạt nhân - Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, 1996 14 Lê Xuân Thám - Giả thuyết tiến hố hình thái phát sinh chủng loại họ Linh chi, Tạp chí Dược học số 10/1996 15 Lê Xuân Thám, Jean Mars Moncalvo - Hệ thống tiến hoá nấm Linh chi Ganodermataceae sở phân tích cấu trúc ADN bào tử đảm, Tạp chí Sinh học tháng 12/1999 16 Phạm Quang Thu - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Lim Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst vùng Đông Bắc Việt Nam Luận án Phó Tiến sĩ Nơng nghiệp, 1994 17 Phạm Quang Thu - Giá trị Dược liệu cải thiện chất lượng nuôi trồng nhân tạo nấm Linh chi Việt Nam, Thông tin Khoa học kỹ thuật Lâm nghiệp số 5/2001 18 Cổ Đức Trọng - Tìm hiểu ảnh hưởng cường độ ánh sáng lên tăng trưởng thể Linh chi - Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học, 1996 19 Thực tập Dược liệu (phần vi học hoá học) - Trường Đại học Dược Hà Nội 40 20 Thực tập Thực vật - Trường ĐH Dược Hà Nội 21 Nguyễn Quang Thường, Nguyễn Thị Bích, Nguyễn Gia Chẩn, Đỗ Ngọc Sơn - Thăm dị hoạt tính chống oxy Linh chi, Tạp chí Dược học số 8/1996 (Tr 18-21) 22.Kawagishi - From mycelia of the íungus Ganoderma lucỉdum, Phytochemistry, Vol 40, No (Tr 7-10) 23 Klyotaka Kyoama - Antinociceptic components of Ganoderma ỉucid Planta medica 63/1997 (Tr 224-227) 24 Raymond Chang - Eữective dose of Ganoderma in humans, 5th International mycological congress Vancouver, Auguts 14-21, 1994( Tr.117 - 121) 25 Yang Qing Yao - The effect of Ganoderma lucidum extract againt fatigue and endurance in the absence oxygen, 5* International mycological congress Vancouver, August 14 -21,1994 (Tr 101-104) 41 ... tiến hành nghiên cứu nấm Linh chi trồng Việt Nam vói số nội dung sau: Nghiên cứu đặc điểm thực vật Nghiên cứu thành phần hoá học Thử tác dụng chống oxy hoá nấm Linh chi trồng Việt Nam Phần I TỔNG... ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI _ * Sinh viên (ĩ)àjrvL & h ị ^7liu Tỉỗầntị GÓP PHẦN NGHIÊN cứu ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HỐ HỌC • • • • VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum. .. 1.3 Thành phần hoá học nấm Linh chi Trong Tây Âu, nhà khoa học sâu vào nghiên cứu hệ thống học, điều tra đặc điểm sinh học nấm Linh chi nước châu Á, nhà khoa học lại dẫn đầu nghiên cứu thành phần