ngọ hoàng an sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng s aureus và ức chế sản sinh nitric oxid từ sài đất ba thùy sphagneticola trilobata l pruski sử dụng docking phân tử

SẢN SINH NITRIC OXID TỪ SÀI ĐẤT BA

THÙY (Sphagneticola trilobata (L.) Pruski.)

SỬ DỤNG DOCKING PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

SẢN SINH NITRIC OXID TỪ SÀI ĐẤT BA

THÙY (Sphagneticola trilobata (L.) Pruski.)

SỬ DỤNG DOCKING PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Thanh Tùng 2 TS.Lưu Đàm Ngọc Anh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành cuốn luận văn này, trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành của mình đến TS Nguyễn Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến

thức, kinh nghiệm cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này.Những nhận xét và đánh giá của Thầy, đặc biệt là những gợi ý về hướng giải quyết vấn đề trong suốt quá trình nghiên cứu, thực sự là những bài học vô cùng quý giá đối với em trong quá trình viết luận văn này

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến TS Lưu Đàm Ngọc Anh chỉ dạy tận tình, truyền

đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành bổ ích cho bản thân em Cô đã tận tình giúp đỡ, chia sẻ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Đức Vịnh , TS Nguyễn Khắc

Tiệp và Dược sĩ Dương Quang Qúy đã tận tình hỗ trợ trong suốt quá trình thực hiện

luận văn này Sự hỗ trợ này không chỉ là về mặt kỹ thuật mà còn là sự khích lệ, động viên tinh thần, giúp em vượt qua những khó khăn và thử thách trong quá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô ở bộ môn Dược liệu, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, góp ý và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu và viết luận văn của mình

Em cũng muốn gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Sự hỗ trợ và cung cấp tài liệu quý báu từ bảo tàng đã đóng góp không nhỏ vào sự hoàn thiện của luận văn này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này Với khả năng nghiên cứu của bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót,em xin kính mong được sự chỉ dẫn và đóng góp của các chuyên gia, các Thầy Cô để đề tài này được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cám ơn !

Hà Nội, ngày 2 tháng 6 năm 2024

Sinh viên Ngọ Hoàng An

4.1 Hoạt tính chống oxy hóa 9

4.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm 10

4.3 Khả năng chống bệnh Leishmania 11

4.4 Hoạt tính phòng và hỗ trợ bệnh tiểu đường 11

4.5 Tác động ức chế hệ thần kinh trung ương 12

4.6 Hoạt tính giảm đau 12

4.7 Các hoạt tính sinh học khác 12

5 Công dụng của S trilobata 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

1.1 Nguyên liệu 14

1.2 Hóa chất,dung môi 14

1.3 Thiết bị,dụng cụ 14

1.4 Phần mền sử dụng 15

1.5 Động vật thí nghiệm 15

1.6 Vi sinh vật nghiên cứu 15

1.7 Địa điểm nghiên cứu 15

1.8 Một vài đích protein được sử dụng 15

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Phương pháp thu tinh dầu,dịch chiết 16

2.2 Phương pháp phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) 17

2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu 18

2.4 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc 18

2.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng S aureus của tinh dầu và khả năng ức chế giải phóng NO của cao chiết sử dụng docking phân tử 20

CHƯƠNG 3 BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ 21

I.KẾT QUẢ 21

1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu 21

2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu S trilobata 22

3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết S trilobata trên đại thực bào phúc mạc của chuột 23

4 Kết quả Docking phân tử 23

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

hợp với phép đo phổ khối

S trilobata Sphagneticola trilobata

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần Sesquiterpenoid và dẫn chất từ cao chiết Sphagneticola trilobata 5

Bảng 2 Thành phần Diterpenoid và dẫn chất từ cao chiết Sphagneticola trilobata 7

Bảng 3 Thành phần Triterpenoid từ cao chiết Sphagneticola trilobata 8

Bảng 4 Các thành phần khác từ cao chiết Sphagneticola trilobata 9

Bảng 5 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu Sphagneticola trilobata bằng GC-MS .21

Bảng 6 Kết quả kháng khuẩn bằng phương pháp MIC của tinh dầu S trilobata 22

Bảng 7 Bảng kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết S trilobata trên đại thực bào phúc mạc ở các nồng độ khác nhau 23

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ,SƠ ĐỒ,ĐỒ THỊ

Hình 1 Hình ảnh Sphagneticola trilobata 3

Hình 2 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit 19

Hình 3 Vị trí gắn các thành phần hóa học chính của tinh dầu từ Sphagneticola trilobata vào các vị trí hoạt động của protein 2S9W của S aureus (Xanh lá : α-phellandren, Xanh lam: limonen ,Đỏ: bicyclosesquiphellandren ,Vàng: bicyclogermacren ,Tím:α-pinen) 26 Hình 3.1 Tương tác 2D của α-phellandren (trái) và limonen (phải) với các gốc trong vị trí

hoạt động của 2W9S 27

Hình 3.2 Tương tác 2D của bicyclosesquiphellandren (trái) và bicyclogermacren (phải) với các gốc trong vị trí hoạt động của 2W9S 27

Hình 3.3 Tương tác 2D của α-pinen với các gốc trong vị trí hoạt động của 2W9S 28

Hình 4 Vị trí gắn các thành phần hóa học chính của tinh dầu từ Sphagneticola trilobata vào các vị trí hoạt động của protein 3SRW của S aureus (Xanh lá : α-phellandren, Xanh lam: limonen ,Đỏ: bicyclosesquiphellandren ,Vàng: bicyclogermacren,Tím:α-pinen) 29 Hình 4.1 Tương tác 2D của α-phellandren (trái) và limonen (phải) với các gốc trong vị trí

hoạt động của 3SRW 30

Hình 4.2 Tương tác 2D của bicyclosesquiphellandren (trái) và bicyclogermacren (phải) với các gốc trong vị trí hoạt động của 3SRW 30

Hình 4 3 Tương tác 2D của α-pinen với các gốc trong vị trí hoạt động của 3SRW 31

Hình 5 Vị trí gắn các thành phần hóa học chính của tinh dầu từ Sphagneticola trilobata vào các vị trí hoạt động của protein 4DXD của S aureus (Xanh lá : α-phellandren, Xanh lam: limonen ,Đỏ: bicyclosesquiphellandren ,Vàng: bicyclogermacren,Tím:α-pinen) 32 Hình 5.1 Tương tác 2D của α-phellandren (trái) và limonen (phải) với các gốc trong vị trí

hoạt động của 4DXD 33

Hình 5.2 Tương tác 2D của bicyclosesquiphellandren (trái) và bicyclogermacren (phải) với các gốc trong vị trí hoạt động của 4DXD 33

Hình 5.3 Tương tác 2D của α-pinen với các gốc trong vị trí hoạt động của 4DXD 34

Hình 6 Tương tác 2D và 3D của Wedetrilid A với các gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 36

Hình 7 Tương tác 2D và 3D của Wedetrilid E với các gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 36

Hình 8 Tương tác 2D và 3D của 15α-(Angeloyloxy)-9β-hydroxy-ent-kaur-16-en-19-oic

acid với các gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 37

Hình 9 Tương tác 2D và 3D của

3α-Cinnamoyloxy-9β,17-dihydroxy-ent-kaur15-en-19-oic acid với các gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 37

Hình 10 Tương tác 2D và 3D của 3α-angeloyloxy-16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid

với các gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 38

Hình 11 Tương tác 2D và 3D của 3α-(Cinnamoyloxy)-ent-kaur-16-en-19-oic acid với các

gốc acid amin trong vị trí hoạt động của 3E7G 38

Sài đất ba thùy (Sphagneticola trilobata) là một dược liệu tiềm năng trong y học cổ

truyền với nhiều hoạt tính sinh học như gây độc tế bào, bảo vệ gan, hạ sốt, giảm đau, diệt

khuẩn,chống oxy hóa, hạ đường huyết và điều trị hen suyễn.Nhiều thử nghiệm in vitro cho thấy tinh dầu từ cây này có hiệu quả kháng S aureus và cao chiết có khả năng ức chế

giải phóng NO Nhằm khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên dược liệu phong phú của Việt Nam và hướng tới việc tìm kiếm các giải pháp y học mới, đặc biệt là trong bối cảnh các bệnh

nhiễm trùng và viêm nhiễm do S aureus ngày càng gia tăng, đề tài “ Sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng S aureus và ức chế sản sinh Nitric oxid từ Sài đất ba thùy (Sphagneticola trilobata (L.) Pruski.) sử dụng docking phân tử ” đã được thực hiện với

các mục tiêu sau:

1 Sàng lọc các hợp chất từ cây Sài đất ba thùy có hoạt tính kháng S aureus và

ức chế sản xuất NO 2 Hiểu rõ cơ chế tác động của các hợp chất với các đích protein bằng phương

pháp docking phân tử Kết quả nghiên cứu dự kiến cung cấp thông tin về tiềm năng điều trị của các hợp chất từ Sài đất ba thùy đối với các bệnh liên quan đến vi khuẩn và viêm, mở ra cơ hội phát triển các phương pháp điều trị mới dựa trên dược liệu tự nhiên

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Sài đất ba thùy hay còn được gọi là Sài đất kiểng, Cúc xuyến chi và có tên khoa

học: Sphagneticola trilobata (L.) Pruski., tên đồng nghĩa là Wedelia trilobata (L.)

Hitchc.,thuộc họ Cúc( Asteraceae)[5], [28]

Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV

2016 ,vị trí phân loại của chi Sphagneticola như sau :

Lá: đơn, mọc đối, dày, dài khoảng 4 - 9 cm, rộng 2 - 5 cm, có răng cưa ở 2 bên thùy lá, có lông cứng và thô ở cả hai mặt lá Hình thuôn bầu dục, nhọn đầu Hệ gân lá cong hình cung và lông chim.[68], [34]

Cụm hoa: hình đầu, mọc từ nách lá, mang hoa không đều ở vòng ngoài đơn, mọc ở nách lá, màu vàng tươi, nhiều cánh thành tầng, cuống hoa dài 3 - 10 cm, tổng bao có dạng chuông hoặc bán cầu, đầu hoa thường có khoảng 8 - 13 hoa tia, cánh dài 6 - 15mm, đĩa tràng hoa dài 4 - 5 mm Ra hoa quanh năm Quả bế có nốt sần.[64]

3

Hình 1 Hình ảnh Sphagneticola trilobata

2.2 Vị trí phân bố

Sphagneticola trilobata (L.) Pruski có nguồn gốc Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và

được tìm thấy rộng rãi ở Bangladesh, Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Campuchia, Miến Điện, phát triển mạnh mẽ trong các thung lũng, các vùng trồng trọt, rừng tự nhiên, rừng trồng, đồng cỏ, vùng ven biển và các khu vực thành thị.[31]

S trilobata được liệt kê trong “ Danh sách 100 loài xâm lấn tồi tệ nhất thế giới ”

của IUCN [35] Nó được người dân trồng như một vật trang trí hoặc lớp phủ mặt đất được trồng trong vườn Nó nhanh chóng tạo thành một lớp phủ mặt đất dày đặc, chen chúc và ngăn cản các loài thực vật khác tái sinh Nó là một loại cỏ dại độc hại ở đất nông nghiệp, ven đường, những nơi rác thải đô thị và những nơi khác Nó cũng mọc dọc theo suối, kênh rạch Nó có mặt phổ biến và rộng rãi như là một loài xâm lấn trên Quần đảo Thái Bình Dương, Hồng Kông, Nam Phi, Úc, Indonesia và Sri Lanka.[58]

3 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam ,S trilobata chủ yếu được trồng và canh tác như một cây phủ đất và

cây cảnh trong các thành phố, công viên và nhà ở Lá hoặc các bộ phận trên mặt đất của cây này được sử dụng trong y học cổ truyền ở Caribe và Trung Mỹ để chữa đau lưng, thấp khớp, đau khớp, và để điều trị sốt và sốt rét ở Việt Nam[51]

terpenoid, saponin [7], flavonoid, phenolid, tanin và tinh dầu [7] ,stigmasterol và các

glucosid của stigmasterol, β-sitosterol và các dẫn xuất este của axit oleanolic [7], [41]

4

3.1 Tinh dầu

Thành phần tinh dầu của lá, thân và hoa của Sài đất ba thùy cũng đã được phân tích bằng GC/MS và xác định có chứa hàm lượng cao sesquiterpen (25,5-86,4%), monoterpen (22,9-72,3%) và một tỷ lệ thấp các sesquiterpen có oxy (0,0-7,4%) Bên cạnh đó, thành phần trong tinh dầu dễ bay hơi cũng đã được xác định có chứa germacren D

(11,9-35,8%), α-pinen (7,3-23,8%), E-caryophyllen (4,6-19,0%), bicyclogermacren (6,0- 17,0%), α-humulen (4,0-11,6%), limonen (1,8-15,1%) và α-phellandren (1,4-28,5%) [41], camphen, 10-nor-calamenen-10-on và γ-amorphen [50]

3.2 Thành phần Sesquiterpenoid và dẫn chất

Năm 2013 Li và cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất eudesmanolid từ loài

Sphagneticola trilobata trong đó có 5 hợp chất mới wedelolid C-F và wedetrilid A [82]

Năm 2020, L Sun và cộng sự tiếp tục phân lập từ hoa của loài S trilobata các hợp chất eudesmanolid mới: 1α,6α,9β-trihydroxy-4,10α-dimethy-l5α,7α,8α-eudesm-3-en-

8,12-olid (11), isovaleryloxyprostat (12), 1β-acetoxy-4α-hydroxy-6β-isobutyryloxy-15α-methyl-9β-tiglinoyloxyprostatolid (13), 1β-acetoxy-4α-hydroxy-6β-isobutyryloxy-9α-

1α-acetoxy-4α-hydroxy-6α-isobutyryloxy-15α-methyl-9β-tiglinoyloxyprostatolid (14), 1α,4α,9β-trihydroxy-6β-isobutyryloxyprostatolid (15), 1α,9β-diacetoxy-4β-hydroxy-6α-methacryloxy-11β-methylprostatolid (16) [36]

Một số eudesmanolid này đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng vi rút đối với vi rút khảm thuốc lá (TMV) bằng phương pháp nửa lá và đĩa lá thông thường cùng với phân tích Western blot Tất cả các hợp chất được thử nghiệm ở nồng độ 10 μg/mL đều cho thấy Hoạt động kháng virus mạnh ở cây thuốc lá với tỷ lệ ức chế từ 46,7% đến 76,5%, cao hơn đáng kể so với đối chứng dương là Ningnanmycin (13,5%).[62]

6

3.3 Thành phần Diterpenoid và dẫn chất

Tổng quan nghiên cứu về hóa học các loài thuộc chi Sphagneticola cho thấy sự có

mặt của kauren diterpen, trong đó các dẫn xuất ent-kauran được tìm thấy ở hầu hết các

loài thuộc chi Sphagneticola với rất nhiều hợp chất mới có cấu trúc thú vị được công bố

[48], [78]

Ở nước ta, năm 2006, tác giả Nguyễn Thanh Hoàng và cộng sự đã phân lập từ lá

Sphagneticola trilobata (L.) Pruski được hợp chất 3α-(tigloyloxy)-ent-kaur-16-en-19-oic

acid (25) [47]

Đến năm 2015, Hui và cộng sự đã phân lập được 7 hợp chất ent-kauran khác từ S

trilobata , trong đó có 2 hợp chất là 16α,17,19-trihydroxy-18-nor-ent-kauran-4β-ol (36) và 17-chloro-16β-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid (37), những hợp chất này thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn ở mức trung bình với các giá trị MIC từ 3,13 tới 12,5 μg/mL trên chủng

vi khuẩn Gram (-) (Shigella dysenteriae) và Gram (+) (Staphylococcus aureus) [27]

Năm 2016, Li và cộng sự đã phân lập từ S trilobata 26 hợp chất ent-kauran

diterpenoid, trong đó có các hợp chất mới (38-42, 47) với hoạt tính thú vị [71] Các hợp

chất này đã được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại Pseudomonas aeruginosa , Staphyloccocus aureus, Monilia albicans và Escherichia coli bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch [70] Các hợp chất 39, 41, 47, 30 cho thấy tác dụng yếu chống lại M

albicans (vùng ức chế > 10 mm ở liều 1 mg/mL)

Năm 2020, hợp chất 3α-angeloyloxy-ent-kaur-16-en-19-oic acid (48) được J.Xu và

cộng sự phát hiện từ loài S trilobata [33]

8

Các hợp chất ent-kaur-16-en-19- oic acid (31)[83] ,

3a-cinnamoyloxy-ent-kaur-16-en19-oic acid (27) [83] đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn in vitro chống lại

ba loại vi khuẩn Gram(+) [Staphyloccocus aureus, Bacillus cereus, và Curtobacter flaccumfaciens ] và ba loại vi khuẩn Gram(-) [Escherichia coli , Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium ] bằng cách sử dụng phương pháp vi pha loãng [32] ,kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể đối với S aureus và S dysenteriae, đặc biệt là hợp

chất 27 và 31 có giá trị MIC dao động từ 3,125 đến 6,25 mg/mL, tương đương với hợp

chất đối chứng kháng sinh (MIC 3,125 mg/mL) Ngoài ra ,chúng còn thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn rõ rệt chống lại Bacillus Cereus với MIC 12,5–25 mg/mL 3.4 Thành phần Triterpenoid

Ở Việt Nam, năm 2006, tác giả Nguyễn Thanh Hoàng và cộng sự đã phân lập từ lá

của loài S trilobata được 2 hợp chất Friedelan-3β-ol (51) và β-amyrin acetat (52)[47]

Friedelan-3β-ol (51)có hoạt tính mạnh nhất chống lại các vi khuẩn và nấm chọn

lọc, cụ thể là S aureus , Klebsiella Pneumoniae và Aspergillus flavus Ngoài ra, β-amyrin

acetat(52) cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại Penicillium Chrysogenum [12]

Bảng 3 Thành phần Triterpenoid từ cao chiết Sphagneticola trilobata

3.5 Các thành phần khác

Có nhiều loại polyacetylen được biết đến là có nguồn gốc từ thực vật, Thiophen

acethylen(53) là một thành phần có trong Sài đất ba thùy[48][22]

Hai dẫn xuất acid caffeic mới là p-hydroxyphenyl caffeat (54) và methyl methoxy-dihydrocaffeoyl)-5-caffeoyl quinat (55), được phân lập từ toàn bộ cây

3-(7-Sphagneticola trilobata, cùng với bốn chất đã biết, Neochlorogen acid metyl este (57),

Metyl 4,5-di-O-caffeoyl quinat (58), Metyl 3,5-di-Ocaffeoyl quinat (59) và Chlorogenic

acid methyl ester (56) Các hợp chất 54,55,58 và 59 thể hiện hoạt tính ức chế

9

Ngoài ra còn có các hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Sphagneticola này:

5-hydroxymethylfurfuran (63), axit vanillic (60), 5,4' - dihydroxy-7-methoxyflavon (62), 3,4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavon (64), metyl caffeat (61) [72]

Bảng 4 Các thành phần khác từ cao chiết Sphagneticola trilobata

Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học từ Sphagneticola trilobata rất phong

phú và đa dạng Trong đó, các hợp chất được công bố nhiều là các hợp chất thuộc khung sesquiterpen và các hợp chất diterpenoid dạng khung ent-kauren với cấu trúc hóa học khá độc đáo

4 Tác dụng sinh học

4.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Loài S trilobata đã được nghiên cứu chi tiết từ dịch chiết bằng nhiều loại dung

môi khác nhau như nước, methanol, trên các bộ phận khác nhau của cây như lá, thân, hoa

10

hoặc toàn cây và sử dụng nhiều phương pháp đánh giá khác nhau gồm có 1,1 picryl-hydrazyl (DPPH) và acid 2,2'-azino-bis 3-thylbenzthiazolin-6- sulphonic (ABTS), phương pháp đánh giá năng lực khử sắt (FRAP).[18],[45]

diphenyl-2-Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Govindappa đã đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa

của dịch chiết từ các bộ phận hoa, thân và lá của cây S trilobata bằng phương pháp

DPPH và FRAP [45]

Kết quả của phương pháp DPPH cho thấy dịch chiết nước từ lá của cây sài đất ba thùy có hoạt tính bắt gốc tự do cao hơn so với dịch chiết từ thân và hoa Ở nồng độ 0,1 mg/ml, hoạt tính trung hòa gốc tự do của cao chiết nước từ hoa, thân và lá tươi lần lượt đạt 55,41, 82,64 và 86,17% (acid ascorbic là 98% và BHT là 97,8% ở cùng mức nồng độ 0,1mg/ml)[45]

Ngoài ra, kết quả của phương pháp FRAP cho thấy khả năng khử sắt của dịch chiết nước thì nằm trong khoảng từ 773,32 đến 16230,21 µm Fe(II)/mg Trong đó, giá trị năng lực khử sắt trung bình của các dịch chiết nước từ lá tươi là 1623,21 ± 0,06; hoa tươi là 1611,26 ± 0,06; và dịch chiết lá khô là 1432,64 ± 0,08; và hoa khô là 1368,57 ± 0,09µm

Fe(II)/mg Sphagneticola trilobata cũng có khả năng khử phức hợp TPRZ-Fe (III) thành

TPTZ-Fe (II) Các giá trị FRAP đối với dịch chiết nước của lá và thân thấp hơn đáng kể so với acid ascorbic nhưng cao hơn so với BHT [45]

Cùng năm, Jayakumar cũng công bố một nghiên cứu tương tự bằng phương pháp DPPH Nhóm của Jayakumar đã thay thế dịch chiết nước bằng dịch chiết metanol Kết quả là thân và hoa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất là 92,44 và 99,12% Hoạt tính chống oxy hóa của hoa cao hơn Lascorbic acid ở mọi nồng độ (400, 600 và 800 µg/ml) [18]

Nhìn chung tổng hợp từ các kết quả nghiên cứu đều cho thấy dịch chiết từ

Sphagneticola trilobata có tiềm năng chống oxi hóa, mức độ mạnh yếu phụ thuộc nhiều

vào dung môi sử dụng tách chiết và bộ phận cây dùng để tách chiết

4.2 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm

Các hợp chất khác như 3α-(angeloyloxy)-ent-kaur-16-en-19-oic acid (61) có khả

Các nghiên cứu khác trong năm 2012 cho biết các hợp chất diterpenoid từ Sài đất

ba thùy có khả năng kháng Pseudomonas solanacearum (Smith) (một loại vi rút gây héo

11

rũ ở cà chua) thông qua con đường tín hiệu JA ở cây thuốc lá [37] Ngoài ra từ cao chiết

của S trilobata còn cho thấy tác dụng chống ký sinh trùng, kháng khuẩn, kháng nấm,

kháng viêm [61], [66], [40]

Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu thu được từ lá cây Sài đất ba thùy đã được

chứng tỏ có khả năng kháng lại Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa [63]

Govindappa và cộng sự cũng đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn,kháng viêm của dịch chiết nước từ SDBT [45].Các hợp chất eudesmanolid phân lập từ tất cả các phần của cây SDBT có thể đề kháng với virus khảm thuốc lá[82]

4.3 Khả năng chống bệnh Leishmania

Acid kaurenic (ent-kaur-16-in-19-oic), được phân lập từ cây S trilobata của Venezuela đã được đánh giá trên Leishmania (V.) braziliensis cả in vivo và in vitro Hợp

lượt là 0,25 và 0,78 μg/ml trong 24 giờ Ngoài ra, kích thước tổn thương da ở chuột Balb/c giảm 70% mà không có tác dụng độc hại rõ ràng Kết quả chỉ ra rằng hợp chất này

có tác dụng diệt khuẩn mạnh đối với L (V.) braziliensis [60] 4.4 Hoạt tính phòng và hỗ trợ bệnh tiểu đường

Dịch chiết nước của S trilobata có tác dụng làm giảm đường huyết ở chuột bị tiểu

đường do Streptozotocin gây ra Ở thí nghiệm này, những con chuột bạch đực được gây kích thích tăng đường huyết bằng Streptozotocin với liều (45 mg/kg), sau đó được điều trị

bằng cách cho uống với S trilobata liều (50 mg/kg) Thử nghiệm cho thấy, chuột đã giảm nồng độ glucose trong máu và cân nặng được cải thiện Đồng thời, S trilobata cũng làm

giảm các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi hóa lipid phản ứng với acid thiobarbituric quan sát thấy ở gan, thận, tinh hoàn cũng như triglyceride huyết thanh cao, giảm men gan (ALT và AST) ở chuột bị bệnh tiểu đường [29]

Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Buddhakala và cộng sự khi nghiên cứu về độc

tính và hoạt tính chống đái tháo đường của dịch chiết ethanolic từ hoa của S trilobata trên

chuột cho biết dịch chiết ethanolic từ hoa của loài này không độc và chuột bị bệnh tiểu

đường được cho uống dịch chiết ethanolic từ hoa S trilobata ở liều 250 mg/kg cho thấy

lượng đường trong máu và triglycerid giảm đáng kể so với những con chuột đối chứng [43]

12

4.5 Tác động ức chế hệ thần kinh trung ương

Dịch chiết chloroform, ethyl acetat và dịch chiết methanol từ lá của S trilobata (30

mg/kg) kết hợp với sử dụng pentobarbiton được tiến hành thử nghiệm dựa trên đánh giá thời gian ngủ và hoạt động di chuyển ở chuột [23]

Năm 2019, M.A.F Islam và cộng sự tiếp tục nghiên cứu hoạt tính từ cao chiết

ethanolic của S trilobata về tác dụng chống tiêu chảy và hệ thần kinh trung ương Kết quả cho thấy cao chiết từ S trilobata có tác dụng chống tiêu chảy và trầm cảm thần kinh

trung ương giảm đáng kể [39]

4.6 Hoạt tính giảm đau

Nghiên cứu so sánh trên chuột về hoạt tính giảm đau của dịch chiết ethanolic của

S trilobata , Stylosanthes biflora và Eclipta alba được đánh giá bằng phương pháp gây đau quặn do acid acetic gây ra Người ta phát hiện ra rằng dịch chiết S trilobata cho thấy

khả năng ngăn chặn phản ứng đau quằn quại phụ thuộc vào liều lượng Liều 500 mg/kg

dịch chiết S trilobata và aspirin (500 mg/kg) ngăn chặn phản ứng gây đau quằn quại lần

lượt là 49,17% và 68,68% [69] Acid kaurenoic (10 mg/kg) thu được từ Sài đất ba thùy ức chế sự hấp thụ giống như là tác dụng gây ra bởi phenyl-p-benzoquinon, tá dược Freund hoàn chỉnh (CFA) và Formalin Acid kaurenoic (1-10 mg/kg po) cũng ức chế chứng tăng cảm giác đau cơ học cấp tính do carrageenin và PGE2 gây ra, mãn tính do CFA gây ra [65]

4.7 Các hoạt tính sinh học khác

Hoạt tính làm lành vết thuơng được khảo sát trên hợp chất 63 phân lập từ lá Sài đất ba thùy Hợp chất này có tác dụng chữa lành vết thương là do khả năng kháng khuẩn, kích thích tăng trưởng nguyên bào sợi và bảo vệ các tế bào thương tích gây ra bởi peroxid Các ent-kaura-9(11),16-dien-19-oic acid (0,08-2,5 g/ml) đã làm tăng sự sống sót của tế bào nguyên bào sợi L929 từ 97-117% và bảo vệ tế bào nguyên bào sợi L929 chống lại sự mất cân bằng oxy hóa gây ra bởi hydrogen peroxid (80-94%) [40]

Các báo cáo dược lý cho thấy loại cây này có tác dụng chống oxy hóa, giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn, chữa lành vết thương, diệt ấu trùng, co tử cung, chống ung thư, bảo vệ gan và điều trị bệnh tiểu đường, đau bụng kinh và các vấn đề sinh sản ở phụ nữ Sài đất ba thùy dường như có tiềm năng lớn để nghiên cứu chuyên sâu về các hoạt động sinh học khác nhau, đặc biệt là tác dụng của chúng đối với tình trạng viêm, nhiễm khuẩn và hệ thống sinh sản

13

5 Công dụng của S trilobata

Các bộ phận trên mặt đất của cây này được sử dụng trong y học cổ truyền ở Caribe và Trung Mỹ để chống viêm phế quản, cảm lạnh, đau bụng, đau bụng kinh[56] và thậm chí là thuốc tăng cường khả năng sinh sản [21]

Trong y học dân gian, nó được sử dụng để điều trị đau lưng, chuột rút, thấp khớp, vết thương cứng đầu, vết loét và sưng tấy cũng như đau khớp Người da đỏ Miskito ở miền đông Nicaragua sử dụng lá để điều trị rối loạn chức năng thận, cảm lạnh, vết thương do cá đuối gai độc, rắn cắn, thanh lọc và vô kinh [11], [30] Coe và Anderson (1996) báo cáo rằng quả, lá và thân được sử dụng trong quá trình sinh nở và điều trị vết cắn, vết đốt, sốt và nhiễm trùng [21]

S trilobata được sử dụng ở Hồng Kông để thay thế cho W chinensis, một loại

thuốc cổ truyền Trung Quốc dùng để điều trị cảm lạnh thông thường, viêm gan, khó tiêu và nhiễm trùng [80] Ở Trinidad và Tobago, được sử dụng cho các vấn đề sinh sản, vô kinh, đau bụng kinh [15] Nó còn sử dụng để điều trị sốt và sốt rét ở Việt Nam [52]

Các báo cáo chưa được công bố chỉ ra rằng dịch chiết nước của cây đã được sử dụng tại địa phương và theo kinh nghiệm ở miền Nam Brazil trong việc kiểm soát bệnh tiểu đường Trên thực tế, nó được gọi phổ biến là insulina do đặc tính trị đái tháo đường được quan sát thấy của nó [52] Hoa và phần lá của cây được phụ nữ sử dụng với mục đích vô kinh, sinh con, sẩy thai và làm sạch nhau thai sau khi sinh [67], [10] Tổng quan tài liệu cho thấy rằng toàn bộ cây tươi được sử dụng làm hoạt động diệt động vật thân mềm, hoạt động kháng khuẩn và chống vi khuẩn[67]

Y học cổ truyền Suriname dùng thân, lá và hoa đun sôi trong nước để chữa bệnh viêm gan, khó tiêu do gan chậm chạp, phân trắng, tiểu buốt và ngừng tiểu và nhiễm trùng Thân và lá tươi luộc dùng để tắm cho những người bị đau lưng, chuột rút, thấp khớp hoặc sưng tấy Ở Nam Mỹ ,nó dùng để chữa đau khớp do viêm khớp, lá và thân tươi được nghiền nát, trải trên một miếng vải rồi bôi lên vùng da đó, quấn chặt bằng một lớp áo ấm Loài Sài đất ba thùy được sử dụng ở Thái Lan để trị đau đầu và sốt [10]

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1 Nguyên liệu

Mẫu Sài đất ba thùy(S trilobata ) được thu ở Vườn quốc gia Xuân Thủy thuộc

huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định, được đối chiếu với tài liệu tham khảo để xác định đúng dược liệu Mẫu tinh dầu và cao chiết được chuẩn bị theo các bước như sau:

+ Tinh dầu: Thu tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo quy định của Dược Điển Việt Nam V [1].Việc chưng cất được thực hiện đến khi thể tích tinh dầu không đổi

+ Cao chiết: Dùng phương pháp chiết siêu âm với dung môi methanol

+ Dữ liệu nghiên cứu docking phân tử: Toàn bộ thành phần của tinh dầu S trilobata

được xác định bằng GC-MS,một phần các hợp chất trong cao chiết methanol của

Sài đất ba thùy được tổng quan từ tài liệu tham khảo(Chi tiết trong Bảng 10),Dữ

liệu các đích protein được lấy từ cơ sở dữ liệu protein RCSB ( //www.rcsb.org/ )

1.2 Hóa chất,dung môi

- Thioglycollat được cung cấp bởi BD (Franklin Lakes, NJ., USA) - LPS và L-NAME được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) - Thuốc thử Griess được mua từ Promega (Madison, WI, USA)

- Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech

(Aidenbach, Germany) - Dung dịch đệm ly giải hồng cầu (RBC lysis buffer 2X) được mua từ Bio Basic Inc

(Markham, Canada) - Thuốc thử MTT được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA) - DMSO được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)

15

- Tủ sấy Memmert (Đức) - Bếp cách thủy WNB 29 - Máy ly tâm lạnh để bàn Rotanda-460RC - Bể rửa siêu âm SH 100

- Cân điện tử SC600 - Tủ Hút

- Bộ dụng cụ Định lượng tinh dầu theo DĐVN V - Máy sắc ký khí - khối phổ GCMSn Trace 1310_ITQ900 Thế hệ ISQ/Hãng Thermo

Scientific/Mỹ - Hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

1.4 Phần mền sử dụng

- Phần mềm Graphpad 8.0.2 - Phần mềm MOE 2015 - Phần mềm Discovery Studio 2021

1.5 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10-12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 30 g, khỏe

mạnh do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

1.6 Vi sinh vật nghiên cứu

- Staphylococcus aureus 33591 - Escherichia coli

- Candida Albicans

1.7 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Dược liệu,Khoa Dược liệu-Dược học cổ truyền,Trường Đại Học Dược Hà Nội

- Bảo Tàng Thiên Nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

1.8 Một vài đích protein được sử dụng

Dihydrofolat reductase (ID PDB: 3SRW,2W9S) chịu trách nhiệm tạo điều kiện

thuận lợi cho việc chuyển ion hydrid từ Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphat

16

(NADPH) sang 7,8-dihydrofolat (DHF), dẫn đến sự hình thành sản phẩm cuối cùng 5,6 ,7,8-tetrahydrofolat (THF) DHFR đóng vai trò then chốt trong con đường tổng hợp THF, vì nó không thể thiếu để duy trì nguồn dự trữ nội bào của THF và các dẫn xuất của nó Việc ức chế enzym này sẽ làm dừng quá trình tổng hợp DNA và phân chia tế bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào [16], [79]

Protein phân chia tế bào, FtsZ, (ID:4DXD) đã được xác định là mục tiêu kháng

khuẩn tiềm năng mới chống lại tụ cầu vàng đa kháng thuốc (MDR) và tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) ,nó còn được gọi là "Z-ring-forming protein", là một protein quan trọng trong việc phân chia tế bào ở vi khuẩn và một số sinh vật tương tự vi khuẩn FtsZ được biết đến như một homolog của tubulin, một protein chính trong việc hình thành cấu trúc microtubule trong tế bào eukaryotic Cấu trúc của FtsZ thường bao gồm hai domain chính: domain N-terminal và domain C-terminal, được nối với nhau thông qua một vùng linker FtsZ tự tổ chức thành các sợi đa sắc tố và sau đó tự tạo thành một vòng xung quanh trung tâm của tế bào, gọi là Z-ring Z-ring chính là một bước quan trọng trong quá trình phân chia tế bào ở vi khuẩn Công việc chính của FtsZ là hình thành và duy trì cấu trúc của Z-ring, một cấu trúc hoạt động như máy chia tế bào và dẫn đến việc chia tế bào Quá trình này là bước quyết định trong chu kỳ tế bào và được kiểm soát bởi một số protein và tác nhân khác Trong quá trình phân chia tế bào, FtsZ tương tác với nhiều protein khác nhau để hình thành và duy trì Z-ring, bao gồm cả các enzym khác và các protein cấu trúc Bất kỳ thay đổi hoặc rối loạn nào trong quá trình này đều có thể dẫn đến các vấn đề về phân chia tế bào và sinh sản của vi khuẩn.[19], [25]

Protein (ID:3E7G), đại diện cho Phosphodiesterase 4D (PDE4D), PDE4D là enzym

phá vỡ cyclic AMP (cAMP) thành AMP, làm giảm mức cAMP nội bào, cAMP là một phân tử tín hiệu quan trọng điều hòa nhiều quá trình sinh học, bao gồm phản ứng miễn dịch và viêm[73], [38].iNOS được điều chỉnh bởi các tín hiệu cAMP,sự thay đổi trong mức cAMP có thể ảnh hưởng đến biểu hiện và hoạt động của iNOS[76] PDE4D, bằng cách giảm cAMP, có thể dẫn đến tăng biểu hiện iNOS làm tăng sản xuất NO, gây ra việc tăng phản ứng viêm.Từ cơ sở đó,các chất ức chế PDE4D có thể được sử dụng để điều trị các bệnh viêm mạn tính như hen suyễn bằng cách tăng nồng độ cAMP, từ đó có thể giảm hoạt động của iNOS và NO [9]

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu tinh dầu,dịch chiết

2.1.1 Tinh dầu

17

+ Lấy khoảng 1kg mẫu dược liệu khô đem cắt nhỏ(5-10 mm),thêm nước vừa đủ,thực hiện chưng cất hồi lưu lôi cuốn hơi nước.Do tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn 1,vì vậy không cho xylen vào ống hứng chia độ

+ Tinh dầu được cất trong 2h Cất 3 lần, rồi gộp toàn bộ lượng tinh dầu vào ống vial

hợp với phép đo phổ khối (GC-MS).[1]

2.1.2 Cao chiết

Mẫu thực vật sau khi thu về được rửa sạch bằng nước, để ráo Sau đó đem phơi dưới

thước 1-3mm Bỏ vào túi buột kín và bảo quản nơi khô ráo

Cân lấy khoảng 3g bột,chia đều vào 6 ống Falcon,mỗi ống thêm 20ml Methanol rồi

3500 vòng/phút trong 5 phút , gạn phần dịch lọc phía trên,lọc thô bằng vải xô và lọc tinh với giấy lọc Whatman để lấy dịch chiết lần 1 Tiếp tục thực hiện chiết lần 2 và 3 với các điều kiện tương tự Gom dịch chiết lần 1, 2 và 3 đem cô quay dưới áp suất giảm (100mbar,

Việc xác định các thành phần được thực hiện trên cơ sở của các chỉ số RI (Retention

Đồng thời so sánh với phổ khối lượng tìm kiếm trong thư viện NIST 17, Willey 8, dữ liệu Adam 2017 [53].Tỷ lệ % các thành phần trong tinh dầu được tính toán dựa trên diện tích pic sắc ký và không sử dụng yếu tố điều chỉnh

18

2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu

Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của tinh dầu được xác định bằng

phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa 96 giếng với 3 chủng S aureus (Gram+), E coli (Gram-) và C albicans (vi nấm) theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn

lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ (Clinical & Laboratory Standards Institute – CLSI) [75], [55] Tinh dầu được pha trong nước có bổ sung 4% Tween 80 Nồng độ tinh dầu ban đầu tính là 1, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong môi trường phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân Nồng độ MIC được biểu diễn dưới dạng 1/pha loãng hoặc theo nồng độ (%) Ví dụ 1/1024 tức là MIC ở nồng độ tinh dầu đó pha loãng 1024 lần, tương đương nồng độ khoảng 0,1% hoặc 1ml/L Hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x106 vi khuẩn/ml và 104 vi nấm/ml được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được

thấy sự phát triển của vi sinh vật Tất cả các thử nghiệm được thực hiện độc lập ít nhất 2 lần

2.4 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc

2.4.1 Phân lập và nuôi cấy đại thực bào sơ cấp phúc mạc chuột nhắt

Để huy động đại thực bào phúc mạc, chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 mL dung dịch thioglycollat 4% Sau 3 ngày, chuột nhắt được giết bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng sử dụng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 mL dung dịch muối cân bằng (HBSS) vào khoang phúc mạc của chuột, sau đó lắc rửa và thu hồi hỗn dịch tế bào vào một ống tube 50 mL trong đá Tiêm HBSS được lặp lại 3 lần và dịch rửa được gom, ly tâm để thu pellet tế bào Tế bào hồng cầu được loại bỏ bằng cách ủ tế bào trong dung dịch ly giải hồng cầu trong 5 phút Sau đó, tế bào được rửa bằng dung dịch PBS sinh lý trước khi được hỗn dịch trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS và 1% penicillin/Streptomycin

2.4.2 Đo giải phóng Nitric oxid (NO)

Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào

19

Sau khi phân lập, tế bào được cấy trong một đĩa nuôi cấy 96 giếng (Corning) thành

cấy, loại bỏ môi trường và rửa tế bào 3 lần với dung dịch PBS để loại bỏ các tế bào không kết dính Sau đó, môi trường mới được thêm và tế bào được tiếp tục ủ qua đêm Vào ngày tiếp theo, tế bào được ủ với môi trường chứa các chất thử ở nồng độ thích hợp trong 2 giờ, sau đó tiếp tục ủ với môi trường chứa LPS 100 ng/mL thêm 24 giờ nữa Môi trường trong mỗi giếng (50 µL) được hút chuyển sang một đĩa 96 giếng mới Sau đó, thêm 50 µL dung dịch sulfanilamid và ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối trong 5 phút trước khi thêm 50 µL N-1-napthylethylendiamin dihydrochlorid tới hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 535 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

Nồng độ NO trong mỗi mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit Tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO của mẫu thử được tính theo công thức: I% = (CLPS - Cthử)×100/CLPS, trong đó CLPS và Cthử lần lượt là nồng độ NO của tế bào được xử lý với LPS đơn độc và LPS kết hợp với mẫu thử

Hình 2 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit

2.4.3 Xử lý số liệu

hồi quy phi tuyến

20

2.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng S aureus của tinh dầu và khả năng ức

chế giải phóng NO của cao chiết sử dụng docking phân tử

Cấu trúc tinh thể của Dihydrofolat reductase của S aureus (ID: 2S9W), Protein phân chia tế bào của S aureus (ID:4DXD), Dihydrofolat reductase của S aureus (ID:3SRW),

Enzym tổng hợp oxid nitric (NOS) (ID:3E7G) đã được lấy từ cơ sở dữ liệu protein RCSB

( //www.rcsb.org/ ) Sử dụng phần mềm MOE 2015 để chuẩn bị cấu trúc protein và phối tử Áp dụng trường lực AMBER99 cho tất cả các cấu trúc protein được khảo sát Toàn bộ các

hợp chất có trong tinh dầu và 23 hợp chất trong cao chiết của S trilobata được chọn để

ghép Tất cả các phối tử và hợp chất đối chiếu đã được điều chế và tối ưu hóa năng lượng bằng cách sử dụng MOE 2015 Trường lực AM1-BCC được áp dụng cho tất cả các phối tử đã điều chế

Các hợp chất được gắn vào vị trí hoạt động của protein sử dụng phần mềm MOE 2015 Ái lực liên kết của chúng được đánh giá dựa trên sự tương tác với các acid amin trong túi và năng lượng của phức hợp neo Sử dụng phần mềm Discovery Studio 2021 để trực quan hóa các tương tác ligand -protein và xử lý kết quả lắp ghép

21

CHƯƠNG 3 BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ I.KẾT QUẢ

1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu

Tổng cộng 43 hợp chất đã được xác định trong tinh dầu của S trilobata sử dụng

phương pháp sắc ký khí kết nối khối phổ(GC-MS) Trong các thành phần được xác định,

α-pinen (37,65%) và α-phellandren(22,62%) là 2 hợp chất chiếm tỉ lệ phần trăm tính theo

diện tích pic cao nhất trong tinh dầu,ngoài ra còn có các thành phần khác như bicyclosesquiphellandren(3,79%),bicyclogermacren(7,1%),camphen(1,39%),p-cymen

(2,28%), limonen (6,77%),β-ylangen(2,11%)(Bảng 5)

Bảng 5 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu Sphagneticola trilobata bằng GC-MS

2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu S trilobata

Từ bảng 6, có thể thấy tinh dầu S trilobata thể hiện tác dụng kháng vi sinh vật trên

S aureus(MIC=0,4%).Trong khi đó lại không có tác dụng trên E.coli và C.albicans

Bảng 6 Kết quả kháng khuẩn bằng phương pháp MIC của tinh dầu S trilobata

23

Ngoài ra , thực hiện xác định MBC của tinh dầu Sài đất ba thùy trên S.aureus thu

được giá trị là 0,4%

3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết S trilobata trên đại

thực bào phúc mạc của chuột

Tác dụng ức chế sản sinh NO của cao chiết được trình bày trong bảng 7 được so sánh với chứng dương (Bảng 8)

Bảng 7 Bảng kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết S trilobata

trên đại thực bào phúc mạc ở các nồng độ khác nhau

4 Kết quả Docking phân tử

4.1 Kết quả phương pháp Docking phân tử của tinh dầu S trilobata trên các đích protein của S aureus

Giá trị năng lượng liên kết (kcal/mol) của các thành phần tinh dầu với các đích

protein của S aureus được đưa ra trong bảng 9

24

Bảng 9 Bảng năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép

của các thành phần tinh dầu với các đích protein của S aureus

26

Hình 3 Vị trí gắn các thành phần hóa học chính của tinh dầu từ S trilobata vào các vị trí

hoạt động của protein 2S9W của S aureus (Xanh lá : α-phellandren, Xanh lam: limonen

,Đỏ: bicyclosesquiphellandren ,Vàng: bicyclogermacren ,Tím:α-pinen)

27

.

Hình 3.1 Tương tác 2D của α-phellandren (trái) và limonen (phải) với các gốc trong vị trí

hoạt động của 2W9S

Hình 3.2 Tương tác 2D của bicyclosesquiphellandren (trái) và bicyclogermacren (phải)

với các gốc trong vị trí hoạt động của 2W9S

28

Hình 3.3 Tương tác 2D của α-pinen với các gốc trong vị trí hoạt động của 2W9S

29

Hình 4 Vị trí gắn các thành phần hóa học chính của tinh dầu từ S trilobata vào các vị trí

hoạt động của protein 3SRW của S aureus (Xanh lá : α-phellandren, Xanh lam: limonen

,Đỏ: bicyclosesquiphellandren ,Vàng: bicyclogermacren,Tím:α-pinen)

30

Hình 4.1 Tương tác 2D của α-phellandren (trái) và limonen (phải) với các gốc trong vị trí

hoạt động của 3SRW

Hình 4.2 Tương tác 2D của bicyclosesquiphellandren (trái) và bicyclogermacren (phải)

với các gốc trong vị trí hoạt động của 3SRW

31

Hình 4 3 Tương tác 2D của α-pinen với các gốc trong vị trí hoạt động của 3SRW

Theo năng lượng liên kết của các phối tử với vị trí hoạt động trong bảng 9,các hợp

chất trong tinh dầu thể hiện năng lượng liên kết tương đối mạnh với 2 mục tiêu phân tử(giá trị năng lượng trung bình khoảng -9,0 đến -5,0 kcal/mol).Trong 5 hợp chất có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu, 2 hợp chất bicyclosesquiphellandren , bicyclogermacren có năng

lượng liên kết cao nhất.Ngoài ra, α-pinen , α-phellandren , limonen cũng có khả năng liên

kết mạnh càng minh chứng cho tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Các tương tác chính bao gồm các tương tác pi-alkyl như Ala7, Leu20, Ile14, Ile5, Ile31 , Phe92 (2S9W) và Ala8,

Leu21, Phe93, Val32, Ile51 (3SRW).(Hình 3-4)