võ tùng lâm sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng s aureus và ức chế sản sinh nitric oxid từ đẹn ba lá vitex trifolia l sử dụng docking phân tử

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ, động viên từ thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên với tất cả lòng biết ơn và sự kính trọng của mình, em xin gửi lời cảm

ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thanh Tùng, thầy là người đã tận tình chỉ

bảo, hướng dẫn, nhắc nhở cho em từ những ngày đầu tiên cho đến những ngày cuối cùng em thực hiện đề tài này Trong suốt quá trình thực hiện đề tài này, đã có không ít lần thầy phải lo lắng cho em mặc dù thầy cũng có những khó khăn của riêng thầy, một lần nữa em xin phép gửi lời cảm ơn và xin lỗi chân thành nhất tới thầy ạ

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lưu Đàm Ngọc Anh – Bảo tàng thiên

nhiên Việt Nam, cô cũng đã tận tình giúp đỡ, chia sẻ và hướng dẫn em trong suốt quá

trình thực hiện đề tài Nhìn thấy sự nỗ lực, kiên trì và đam mê trong nghiên cứu của hai thầy cô, em lại có thêm động lực để cố gắng hơn trong những điều em đã, đang và sẽ làm

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Đức Vịnh, TS Nguyễn Khắc Tiệp cùng với

DS Dương Quang Quý, các thầy và anh đều đã giúp em rất nhiều, góp phần lớn trong

quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu và các Thầy cô Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè – những người đã luôn ở

bên động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm hoàn thành xong khóa luận

Đặc biệt, xin cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn khóa H1K1 và K75: An, Ánh, Hoàng, Hải

luôn tranh thủ thời gian để hỗ trợ tận tình trong quá trình thực hiện đề tài Tất cả tạo nên một sự ủng hộ về mặt tinh thần rất lớn để em có thể hoàn thành chặng đường học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 2 tháng 6 năm 2024

Sinh viên Võ Tùng Lâm

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

1.4.11.Tác dụng chống sốt rét 9

1.5.Công dụng 10

1.6.Một số bài thuốc dân gian từ Đẹn ba lá (Mạn kinh) 10

1.6.1.Chữa đau nhức đầu, mờ mắt 10

1.6.2.Chữa đau mắt sưng đỏ, có màng che, chảy dử nhiều, quáng mắt 10

1.6.3.Chữa sưng vú giai đoạn đầu 10

1.6.4.Chữa viêm tai giữa 10

1.6.5.Thuốc làm đen tóc 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1.Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 11

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2.Phương tiện nghiên cứu 11

2.1.3.Trang thiết bị nghiên cứu 11

2.2.Nội dung nghiên cứu 12

2.3.Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1.Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Đẹn ba lá 12

2.3.2.Phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng GC-MS 13

2.3.3.Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu Đẹn ba lá bằng phương pháp vi pha loãng 13

2.3.4.Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc 14

2.3.5.Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Đẹn ba lá với các đích tương ứng 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1.Kết quả 18

3.1.1.Kết quả phân tích thành phần tinh dầu 18

3.1.2.Kết quả đánh giá tác dụng kháng S aureus 19

3.1.3.Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc 20

3.1.4.Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá

trên các đích protein của S aureus 20

3.1.5.Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá trên các đích protein ức chế sản sinh Nitric oxid 27

3.2.Bàn luận 32

3.2.1.Kết quả phân tích thành phần tinh dầu 32

3.2.2.Kết quả đánh giá tác dụng kháng S aureus 32

3.2.3.Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc 32

3.2.4.Kết quả nghiên cứu docking phân tử 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ở người

RBC lysis buffer 2X Dung dịch đệm ly giải hồng cầu

và Công nghệ Quốc gia

thiểu

HBSS Hanks' Balanced Salt Solution /Dung dịch muối cân bằng của

Hanks

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid được tìm thấy từ Đẹn ba lá 4

Bảng 1.2 Các labdan diterpenoid mới được tìm thấy từ quả Đẹn ba lá 5

Bảng 1.3 Các labdan diterpenoid alcaloid được tìm thấy từ lá Đẹn ba lá 6

Bảng 1.4 Một số hợp chất triterpenoid và phytosterol từ lá Đẹn ba lá 6

Bảng 3.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng GC-MS 18

Bảng 3.2 Kết quả kháng S aureus của tinh dầu Đẹn ba lá 19

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO của cao chiết Đẹn ba lá trên đại thực bào phúc mạc 20

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn natri nitrite 16Hình 2 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 2W9S lần lượt (A) – Sabinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren 23Hình 3 Tương tác 2D của các hợp chất với các gốc tại vị trí gắn của 2W9S lần lượt (A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren 24Hình 4 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 2W9S lần lượt (A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren 25Hình 5 Tương tác 2D của các hợp chất với các gốc tại vị trí gắn của 2W9S lần lượt (A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren 26Hình 6 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 3E7G lần lượt (A) – Lupeol, (B) – Betulinic acid, (C) – β-sitosterol, (D) – 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on, (E) – Stigmasterol, (F) – Campesterol 30Hình 7 Tương tác 2D của các hợp chất với các gốc tại vị trí gắn của 3E7G lần lượt (A) – Lupeol, (B) – Betulinic acid, (C) – β-sitosterol, (D) – 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on, (E) – Stigmasterol, (F) – Campesterol 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tác dụng sinh học của các loài thực vật hiện đang là vấn đề được nghiên cứu nhiều nhất gần đây trên khắp thế giới bởi sự đa dạng về các loài thực vật cũng như ứng dụng của chúng đến việc điều trị các bệnh lý của con người Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới Theo tài liệu thống kê, Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài có trên thế giới)[44], trong số đó có rất nhiều loài chưa được biết đến, nhiều loài được coi là loài xâm lấn chưa tìm ra được tác dụng thật sự Chính vì thế mà việc nghiên cứu tác dụng sinh học của các loài thực vật luôn là đề tài nóng hổi tại Việt Nam

Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) từ xa xưa đã được biết đến và được sử dụng như một

phương thuốc cổ của ông cha ta nhằm chữa các bệnh như đau đầu, sung vú hay thuốc làm đen tóc Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về Đẹn ba lá và cho thấy đây là loài cây có tiềm năng chứa nhiều đặc tính sinh học quý giá như chống viêm, bảo vệ gan, chống co thắt,…[20]

Qua các thử nghiệm in vitro cho thấy Đẹn ba lá có tác dụng ức chế trên chủng vi sinh vật Stphylococcus areus và ức chế sản sinh nitric oxid Do đó hướng đến việc lựa

chọn đề tài “Sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng S aureus và ức chế sản sinh Nitric

oxid từ Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) sử dụng docking phân tử” và được thực hiện với các

mục tiêu sau:

1 Sàng lọc các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá có tác dụng kháng S aureus

2 Sàng lọc các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá có tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid

3 Sử dụng phương pháp docking phân tử làm sáng tỏ các khả năng tác dụng của các hợp chất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Đẹn ba lá hay Mạn kinh, Quan âm, Từ bi biển, Vạn kim tử, Mác nim (Tày) [3]

có tên khoa học là Vitex trifolia L.[1], [2], [3]

Đẹn ba lá thuộc chi Bình linh (Vitex L.) Trong một số tài liệu cũ, sách báo Việt Nam cũng như quốc tế, chi Vitex L được phân loại vào họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)[2]

Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV 2016 (Angiosperm Phylogeny Group), và các nghiên cứu gần đây trên thế giới vị trí phân loại

của chi Vitex L như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Bộ: Hoa môi (Lamiales)

Họ: Hoa môi (Lamiaceae)

Chi: Bình linh (Vitex L.)

Loài: Vitex trifolia L

1.2 Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Đẹn ba lá là cây nhỏ hay cây bụi, mùi thơm, có thể cao tới 3m [1], [3] Cành non có 4 cạnh, có lông mềm, màu xám nhạt; cành già tròn, nhẵn, màu nâu Lá kép mọc đối, 3 lá chét (lá ở gần ngọn có hoa thường đơn), có loại có 1 lá chét [3], lá chét hình trứng, gốc tròn, đầu tù hoặc hơi nhọn, mép nguyên, mặt trên nhẵn và đen lại khi khô, mặt dưới phủ đầy lông trắng, lá chét giữa lớn hơn , cuống lá dài 1-3cm [1] Cụm hoa là một chùy tận cùng, dài 13-14mm nhiều khi phía dưới có lá, có lông dày[3]; mang nhiều xim mọc đối, mỗi xim có 2-3 hoa màu tím nhạt hoặc lam nhạt; lá bắc nhỏ, hình dài; đài hình chuông, có lông trắng, 5 răng nhỏ đều; tràng hình trụ có lông ở mặt ngoài trừ phần gốc, môi trên có 2 thùy ngắn, môi dưới có 3 thùy, thùy giữa lớn hơn hai thùy bên; nhị 4, thò ra ngoài[1] Quả hình bầu dục có rãnh, đầu hơi dẹt, rộng chừng 6mm, được che kén quá nửa bởi đài phát triển và tồn tại[3] Cây ưa sáng và có thể chịu được hạn, do có hệ thống rễ cọc phát triển cắm sâu xuống đất Cây phân cành nhiều, ra hoa quả đều hàng năm [1] Mùa hoa quả thường vào tháng 5-7, mùa quả thường vào tháng 9-11 [1], [3]

1.2.2 Vị trí phân bố

Chi Vitex L là một trong những chi quan trọng và lớn nhất thuộc họ Lamiaceae

với khoảng 750 loài [29], [37], phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Châu Á, Mỹ Latinh và Châu Phi [29]

Đẹn ba lá có nguồn gốc ở Nam Phi, vùng phân bố từ Madagasca đến Xrilanca, Afghanistan, Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Nhật Bản xuống các nước vùng Đông - Nam Á đến các vùng Bắc Australia và phía động Caledonia [1] Ở Việt Nam, Đẹn ba lá phân bố rải rác khắp các tỉnh vùng núi thấp đến trung du và đôi khi gặp ở cả đồng bằng, loại 1 lá chét rất phổ biến ở dọc các bờ biển tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh [1], [3]

1.3 Thành phần

Trong Đẹn ba lá bao gồm nhiều thành phần hóa học như terpenoid (labdan diterpenoid), phytosterol, flavonoid, acid béo và các hợp chất khác trong đó terpenoid và flavonoid được xác định là các hợp chất chiếm hàm lượng chính[7], [11], [20]

1.3.1 Tinh dầu

Các thành phần được tìm thấy trong tinh dầu Đẹn ba lá chủ yếu là các terpenoid chia thành các nhóm: monoterpen, monoterpenoid, sesquiterpen, sesquiterpenoid, diterpen, diterpenoid và các hợp chất khác [17], [30] Năm 2019, tại Ấn Độ, Thomas đã tìm ra 16 hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá trong đó thành phần chính là caryophyllene (38,36%) và eucalyptol (25,72%) [35] Cũng tại Ấn Độ theo Chadrasekaran và cộng sự thì eucalyptol (16,35%), sabinen (9,44%) và caryophyllen (8,91%) là các thành phần chính của tinh dầu[43] Hay ở Việt Nam tinh dầu Đẹn ba lá chứa các thành phần chính là sabinen (19,4%), eucalyptol (15,7%) và caryophylen (14,5%) [30] Sự khác biệt về thành phần tinh dầu có lẽ đến từ các yếu tố bên trong, bên ngoài và sự tương tác giữa chúng[17]

Có thể thấy, mặc dù hàm lượng và thành phần các hợp chất có trong tinh dầu Đẹn ba lá ở các nghiên cứu là khác nhau nhưng tất cả đều cho thấy thành phần chính trong tinh dầu Đẹn ba lá là caryophyllen, sabinen và eucalyptol

1.3.2 Flavonoid

Đẹn ba lá chứa khoảng 57,41 mgQE/g flavonoid trong cao chiết ethanol Trong đó, hàm lượng flavonoid được tính theo microgram quercetin trong 1 mg cao chiết (𝜇gQE/mg)[20] Trên thế giới đã có nhiều hợp chất flavonoid được phân lập từ Đẹn ba

lá và được nghiên cứu nhiều tác dụng sinh học[7] Các hợp chất flavonoid đã được nghiên cứu phổ biến như (Bảng 1.1):

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid được tìm thấy từ Đẹn ba lá

Trong đó, Vitexicarpin (5) là hợp chất được nghiên cứu cho thấy cơ chế hoạt

động dường như là đối kháng không cạnh tranh với Histamin và ổn định màng tế bào

Mast[25] Hợp chất (2) được Qian Wang và cộng sự nghiên cứu cho thấy chúng có tác động lên thần kinh bệnh Alzheimer[33] Sáu hợp chất (3), (4), (5), (6), (7), (8) được

tế bào ung thư động vật có vú[47]

1.3.3 Terpenoid

Không chỉ tinh dầu Đẹn ba lá mà cả quả và lá của cây cũng được nghiên cứu cho thấy chúng là những nguồn dồi dào các terpenoid đặc biệt là ladbdan diterpenoid[20] Đã có tổng cộng 53 dẫn chất labdan diterpenoid khác nhau được mô tả với mức độ phong phú bậc nhất trong số các loài thực vật Và gần đây nhất, các nhà nghiên cứu khoa học đã xác định ra 4 hợp chất labdan diterpenoid mới từ chiết xuất ethanol của quả cây Đẹn ba lá và đặt tên lần lượt là Vitetrolin A, B, C, D (Bảng 1.2) [22]

Năm 2017, Pan Lou cùng cộng sự đã xác định được từ chiết xuất ethanol của lá loài Đẹn ba lá 4 hợp chất labdan diterpenoid alkaloid chứa dị vòng 2-cyano-pyrrol mới và đặt tên lần lượt là Vitepyrroloid A, B, C, D (Bảng 1.3) [32]

Bảng 1.2 Các labdan diterpenoid mới được tìm thấy từ quả Đẹn ba lá

Bảng 1.3 Các labdan diterpenoid alcaloid được tìm thấy từ lá Đẹn ba lá

1.4 Tác dụng sinh học

1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của loài Đẹn ba lá được thử nghiệm bằng cách sử dụng chiết xuất ethanol từ loài cho tiếp xúc với 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) trong 30 phút Kết quả cho ra phạm vi hoạt động chống oxy hóa của Đẹn ba lá nằm trong

do DPPH Kết quả này giúp cho Đẹn ba lá như một phương thuốc truyền thống chữa ngộ độc cá biển[36]

1.4.2 Tác dụng bảo vệ gan

Nghiên cứu cho thấy chiết xuất ethanol của Đẹn ba lá với liều dùng 200mg trên

tổn thương gan ở chuột sau 7 ngày điều trị Quan sát khả năng ở trên được cho là tương đương với tác dụng của một thuốc đạt tiêu chuẩn khác là Silymarin với liều dùng 100mg trên mỗi cân nặng cơ thể cũng trong 7 ngày điều trị Sự tương đồng này thể hiện rõ ở việc làm giảm đáng kể nồng độ của các men gan quan trọng trong huyết thanh, cụ thể như glutamat pyruvat transaminase (SGPT), glutamat oxaloacetat transaminase (SGOT) và phosphat kiềm (ALP) Ngoài ra, sự giảm nồng độ bilirubin toàn phần và 𝛾-glutamyl transpeptidase (GGTP) càng khẳng định thêm tác dụng bảo vệ gan của mẫu[9]

1.4.3 Tác dụng chống co thắt

Trong một nghiên cứu in vivo các chất chuyển hóa có hoạt tính chính trong chiết xuất n-hexane của Đẹn ba lá đã chứng minh rằng chỉ có vitexicarpin(5) mới thể hiện tác dụng trong xét nghiệm co thắt khí quản Đáng chú ý, khả năng này được quan sát thấy

bởi ovalbumin Điều đó cho thấy vitexicarpin(5) có khả năng cản trở tác động của histamine được giải phóng từ các tế bào mast bằng cách ổn định chức năng màng của tế bào mast[14]

1.4.4 Tác dụng chống viêm

Đặc tính chống viêm của chiết xuất lá từ Đẹn ba lá đã được phân tích thông qua các nghiên cứu trên động vật Kết quả cho thấy chiết xuất được dùng ở liều 200mg trên mỗi cân nặng cơ thể cho ra tác dụng chống viêm phụ thuộc vào liều lượng Ở liều lượng này, cả chiết xuất nước và ethanol đều cho thấy tác dụng đáng kể (p < 0,0001) chống lại phản ứng viêm cấp tính với mức giảm tương ứng là 46,91% và 60,49% Mặc dù các giá trị này thấp hơn so với giá trị tiêu chuẩn (70,27%) đối với chứng phù tai do xylen gây

ra, nhưng chiết xuất ethanol đã ức chế tình trạng phù nề đáng kể vào giờ thứ 3 (43%) đối với chứng phù chân do carrageenan gây ra Tác dụng này nhất quán ở cả chứng phù chân do carrageenan và chứng phù tai do xylene gây ra ở chuột, nhấn mạnh tiềm năng của Đẹn ba lá như một chất chống viêm hiệu quả[24]

1.4.5 Tác dụng chống ung thư và độc tính

Nghiên cứu khảo sát hoạt tính ức chế của Đẹn ba lá với tế bào ung thư vú (T47D) với nồng độ 25 𝜇g/mL và ủ trong 24 giờ, cho thấy kết quả hoạt tính đáng kể là 88,7% Trong đó, epirubicin và doxorubicin được sử dụng làm chứng dương và DMSO là chứng âm[26]

Độc tính lên tế bào của các bộ phận trên mặt đất loài Đẹn ba lá đã được đánh giá trong một nghiên cứu in vivo sử dụng ba dung môi chiết xuất khác nhau là: methanol, ethyl acetate và chloroform thông qua phương pháp xét nghiệm trên tôm ngâm nước mặn Kết quả chỉ ra rằng chiết xuất methanol có hoạt tính gây độc tế bào cao nhất, với

tính tế bào ít nhất trong số ba loại, với giá trị LC50 là 180 mg/mL, với potassium dichromate làm chứng dương[12]

1.4.6 Tác dụng chống mất trí nhớ

Trong mô hình thử nghiệm tránh né thụ động và mô hình mê cung chữ T, chiết xuất nước từ lá Đẹn ba lá đã chứng minh hoạt tính chống mất trí nhớ (p < 0,01) một cách đáng kể Mẫu thử cho ra thời gian trốn thoát ngắn hơn đáng kể (12 giây) so với nhóm đối chứng (29 giây) và cho thấy phần trăm thời gian tối đa dành để thăm dò góc phần tư là 60,75% Kết quả này cao gần gấp đôi so với nhóm đối chứng, cho thấy khả năng duy trì trí nhớ được cải thiện[8]

1.4.7 Tác dụng diệt côn trùng

Đẹn ba lá đã được chứng minh rằng có khả năng đuổi muỗi hiệu quả với liều lượng nhỏ nhất định Năm 2008, Tandon và cộng sự đã so sánh tinh dầu của Đẹn ba lá

(Vitex trifolia L.) với Trinh nữ Châu Âu (Vitex agnus-castus L.) và nhận thấy rằng mặc

dù tinh dầu của Trinh nữ Châu Âu kém hiệu quả hơn Đẹn ba lá, cả hai tinh dầu đều làm tăng thời gian ấu trùng, tỷ lệ tử vong của ấu trùng, thời gian nhộng và biến dạng trưởng thành, đồng thời làm giảm sự xuất hiện, khả năng sinh sản và khả năng sinh sản của trứng khi trưởng thành[40]

1.4.8 Tác dụng kháng khuẩn

Nghiên cứu cho thấy Đẹn ba lá có tác dụng kháng khuẩn, khả năng này có thể đến từ Vitrifolin A – một terpenoid[45] Vitrifolin A được cho là đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng cường đặc tính kháng khuẩn của chiết xuất Nó có khả năng liên kết với bề mặt của các hạt nano, do đó dẫn đến việc phân phối các chất chống vi khuẩn hiệu quả hơn và có mục tiêu hơn Cơ chế này cho phép vitrifolin A tác động mạnh hơn đến vi sinh vật, góp phần tăng cường tác dụng tổng thể của chiết xuất lá chống lại nhiều loại mầm bệnh[23]

1.4.9 Tác dụng kháng virus

Đẹn ba lá đã được xác nhận tác dụng đáng kể kháng virus Molluscum contagiosum và Herpes simplex với nồng độ hiệu quả lần lượt là khoảng 0,25 𝜇g/mL và 0,5 𝜇g/mL Điều quan trọng là tác dụng kháng virus này đạt được mà không gây ra độc tính nào đáng chú ý Những phát hiện này nổi bật tiềm năng của Đẹn ba lá như một nguồn tự nhiên đầy hứa hẹn để phát triển các tác nhân chống vi rút an toàn và hiệu quả Việc nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất có hoạt tính sinh học cụ thể và cơ chế hoạt động của chúng, cũng như các ứng dụng rộng hơn trong môi trường lâm sàng, sẽ nâng cao hiểu biết của chúng ta về tiềm năng điều trị của Đẹn ba lá trong các biện pháp chống vi-rút[41]

1.4.10 Tác dụng chống HIV

Trong một nghiên cứu về tác động của chiết xuất nước và ethanol 80% từ 20 cây thuốc của Thái Lan đối với hoạt động phiên mã ngược của HIV loại 1, kết quả cho thấy chiết xuất nước của Đẹn ba lá (phần trên mặt đất) có tỷ lệ ức chế rất tốt (% IR) cao hơn 90% ở nồng độ 200 𝜇g/mL trong 1 giờ ủ Lấy Doxorubicin hydrochlorid làm chứng dương, mẫu đã ức chế hoạt động phiên mã ngược của HIV-1 ở mức 1 mM đến 98,3% Phát hiện này cho thấy rằng những chiết xuất cụ thể của Đẹn ba lá có tiềm năng mạnh mẽ như là ứng cử viên cho các nghiên cứu sâu hơn về việc phát triển các liệu pháp chống HIV[46]

1.4.11 Tác dụng chống sốt rét

Trong một cuộc điều tra thông tin để thu thập kiến thức về thực vật có liên quan đến bệnh sốt rét và các triệu chứng liên quan, tiềm năng chống sốt rét từ 70 loài thực vật, đại diện cho 62 chi và 34 họ Kết quả nhấn mạnh Solanaceae là họ có tiềm năng nhất với 7 loài cho thấy đặc tính chống sốt rét đầy hứa hẹn Ngoài ra còn có các kết quả

khác đáng chú ý xuất hiện ở họ Lamiaceae, đặc biệt là Ngũ trảo (Vitex negundo L.) và Đẹn ba lá (Vitex trifolia L.) được xác định là thuốc chống sốt rét tham khảo từ tài liệu

vùng Thung lũng Soon ở Pakistan Những phát hiện này cho thấy tiềm năng nghiên cứu đặc tính chống sốt rét của chúng[5]

1.5 Công dụng

Theo tài liệu cổ, quả cây Đẹn ba lá (Mạn kinh tử) vị cay, đắng, tính hơi hàn, vào 3 kinh can, phế và bàng quang Có tác dụng tán phong nhiệt Dùng chữa đầu nhức, mắt hoa, mắt đau Hiện nay, Mạn kinh tử là một vị thuốc có tác dụng chữa cảm mạo, sốt, nhức đầu, nhức bên thái dương, đau nhức trong mắt, mặt mũi tối tăm; còn có tác dụng giảm đau[1] Mạn kinh tử tán nhỏ cho vào kho thóc gạo hoặc tủ quần áo để khử côn trùng[1], [3]

1.6 Một số bài thuốc dân gian từ Đẹn ba lá (Mạn kinh)

1.6.1 Chữa đau nhức đầu, mờ mắt

Mạn kinh 10g, cam cúc hoa 8g, tế tân 3g, xuyên khung 4g, cam thảo 4g, bạch chỉ 3g Nước 600ml, sắc còn 200ml, chia làm 3 lần uống trong ngày[1]

ngày trở lên Ngày uống 2 lần, mỗi lần 10-15ml[1], [3]

1.6.2 Chữa đau mắt sưng đỏ, có màng che, chảy dử nhiều, quáng mắt

Mạn kinh, hạt muồng (sao), hạt đuôi mang, hạt mã đề, hạt ích mẫu Các vị lượng bằng nhau, tán bột làm viên uống với nước chè, hoặc dùng mỗi vị 12g, sắc nước uống[1]

1.6.3 Chữa sưng vú giai đoạn đầu

Mạn kinh sao giòn tán nhỏ, mỗi lần dùng 4g hòa với rượu, gạn lấy rượu uống, còn bã đắp lên vú[3], [1]

1.6.4 Chữa viêm tai giữa

Mạn kinh, hoàng liên ô rô mỗi vị 15g, thương nhĩ tử 9g Sắc uống trong ngày[1]

1.6.5 Thuốc làm đen tóc

Mạn kinh, mỡ gấu, 2 vị lượng bằng nhau, trộn với giấm thanh, bôi vào tóc[1], [3]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (thân, lá, quả) của loài Vitex trifolia L (Đẹn ba lá) được thu hái tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam

được lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số tiêu bản là QTBY - XT16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Hóa chất và dung môi dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Dược điển Việt Nam V gồm có:

- Dùng trong thu lấy tinh dầu và cao chiết: Nước cất, methanol

- Dùng trong đánh giá tác dụng kháng S.aureus: Tween 80 4%, Chủng vi sinh vật thí nghiệm: Vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus 33591 được cung cấp bởi

Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia - Dùng trong đánh giá ức chế sản sinh NO:

+ Thioglycollate được cung cấp bởi BD (Franklin Lakes, NJ., USA) + LPS và L-NAME được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) + Thuốc thử Griess được mua từ Promega (Madison, WI, USA)

+ Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech (Aidenbach, Germany)

+ Dung dịch đệm ly giải hồng cầu (RBC lysis buffer 2X) được mua từ Bio Basic Inc (Markham, Canada)

+ Thuốc thử MTT được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA) + DMSO được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc có mỏ, bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Việt Nam, lọ đụng mẫu, ống falcon, bình cầu cổ nhám, đĩa petri, đĩa 96 giếng vô trùng, đũa thủy tinh,…

- Cân phân tích AND GR-200 - Cân kỹ thuật Sartorius TE412 - Tủ sấy Memmert (Đức) - Bếp cách thủy Memmert

- Bể siêu âm Daihan Scientific - Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS model: Trace 1310_ITQ900 thế

hệ ISQ/Hãng Thermo Scientific/Mỹ - Máy cất quay chân không RE301A - Máy ly tâm lạnh để bàn Model: Rotanda – 460RC - Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Đẹn ba lá - Phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng phương pháp sắc kí khí kết nối khối

phổ (GC-MS)

- Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu Đẹn

ba lá bằng phương pháp vi pha loãng - Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại

thực bào phúc mạc - Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Đẹn ba lá với các

đích tương ứng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Đẹn ba lá

Tinh dầu

Dược liệu tươi sau khi thu hái sẽ được làm sạch Cân một lượng khoảng 1kg cành mang lá của dược liệu đã làm sạch sau đó cắt nhỏ (khoảng 5-10mm) sau đó được cất kéo hơi nước sử dụng thiết bị chưng cất clevenger theo Dược điển Việt Nam V Đun

dầu không thay đổi Tinh dầu thu được có màu vàng đậm, nhẹ hơn nước nên sẽ nổi lên

Cao chiết methanol

Dược liệu thu hái đem phơi khô hoặc sấy khô bằng tủ sấy, sau đó được xay nhỏ thành bột dược liệu khô Cân khoảng 1g bột dược liệu khô ở trên cho vào ống Falcon

với tốc độ 3500rpm trong 5 phút sau đó gạn lấy phần dịch trong Bã dược liệu còn lại được hòa tan tiếp trong 20ml methanol (99% v/v), lặp lại quy trình trên thêm 2 lần Gộp

lấy dịch trong của cả 3 lần sau đó cô quay với áp suất giảm tại 400C Để bay hơi tự nhiên phần dung môi còn lại ở nhiệt độ phòng trong tủ hút

2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng GC-MS

Sắc kí khí kết hợp khối phổ GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy) bao gồm thiết bị sắc kí khí kết nối với detector khối phổ Mẫu sau khi tách trên cột phân tích của thiết bị sắc kí sẽ được detector khối phổ nhận biết Hiện nay phương pháp này được áp dụng phổ biến với mục đích định tính dựa vào thời gian lưu hay định lượng dựa vào diện tích và chiều cao pic, đối tượng là các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu

Hệ thống sắc kí khí GC-MS gồm thiết bị Thermo Scientific Trace 1310 ghép nối với detector ITQ 900 (Thermo, bẫy ion) Cột phân tích TG-5MS, kích thước 30m x 0,25µm x 0,25mm với khí mang là Heli

Tiến hành

240oC Chương trình nhiệt độ 60oC (2 phút), tăng 4oC/phút đến 220oC, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút

- Tiến hành phân tích: Xác định các thành phần trong tinh dầu dựa trên nguyên lý so sánh về độ trùng lặp về khối phổ của các chất có trong thư viện Thêm vào đó, giá trị RI được so sánh với các dữ liệu trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố Giá trị RI được tính theo thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các ankan trong dãy đồng đẳng C9 – C20 tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký

- Công thức tính RI:

Trong đó:

n: Số nguyên tử carbon của ankan liền trước pic của chất phân tích

2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu

Đẹn ba lá bằng phương pháp vi pha loãng

Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của tinh dầu được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa 96 giếng với chủng

Staphylococcus aureus (Gram+) theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét

nghiệm Hoa Kỳ.[19]

Tinh dầu được pha trong nước có bổ sung Tween 80 4% Nồng độ tinh dầu ban đầu tính là 1, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong môi trường phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân Nồng độ MIC được biểu diễn dưới dạng 1/pha loãng hoặc theo nồng độ (%) Ví dụ 1/1024 tức là MIC ở nồng độ tinh dầu đó pha loãng 1024 lần, tương đương nồng độ khoảng 0,1% hoặc 1ml/L

giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật Tất cả các thử nghiệm được thực hiện độc lập ít nhất 2 lần

2.3.4 Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá trên đại

thực bào phúc mạc

Chuẩn bị chất thử

Cao chiết dược liệu được hòa tan trong DMSO với nồng độ gốc 50 mg/mL và

cấy đến các nồng độ thích hợp

Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10-12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 30 g,

khỏe mạnh do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

Phân lập và nuôi cấy đại thực bào sơ cấp phúc mạc chuột nhắt

Để huy động đại thực bào phúc mạc, chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 mL dung dịch thioglycollat 4% Sau 3 ngày, chuột nhắt được giết bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng sử dụng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 mL dung dịch muối cân bằng (HBSS) vào khoang phúc mạc của chuột, sau đó lắc rửa và thu hồi hỗn dịch tế bào vào một ống tube 50 mL trong đá Tiêm HBSS được lặp lại 3 lần và dịch rửa được gom, ly tâm để

thu pellet tế bào Tế bào hồng cầu được loại bỏ bằng cách ủ tế bào trong dung dịch ly giải hồng cầu trong 5 phút Sau đó, tế bào được rửa bằng dung dịch PBS sinh lý trước khi được hỗn dịch trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS và 1% penicillin/Streptomycin

Đo giải phóng Nitric oxide (NO)

Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào

Sau khi phân lập, tế bào được cấy trong một đĩa nuôi cấy 96 giếng (Corning)

tủ nuôi cấy, loại bỏ môi trường và rửa tế bào 3 lần với dung dịch PBS để loại bỏ các tế bào không kết dính Sau đó, môi trường mới được thêm và tế bào được tiếp tục ủ qua đêm Vào ngày tiếp theo, tế bào được ủ với môi trường chứa các chất thử ở nồng độ thích hợp trong 2 giờ, sau đó tiếp tục ủ với môi trường chứa LPS 100 ng/mL thêm 24 giờ nữa Môi trường trong mỗi giếng (50 µL) được hút chuyển sang một đĩa 96 giếng mới Sau đó, thêm 50 µL dung dịch sulfanilamid và ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối trong 5 phút trước khi thêm 50 µL N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid tới hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 535 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

Nồng độ NO trong mỗi mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit Tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO của mẫu thử được tính theo công thức:

𝐼% = (𝐶𝐿𝑃𝑆 − 𝐶𝑡ℎ𝑢) × 100

𝐶𝐿𝑃𝑆 Trong đó:

Hình 1 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn natri nitrite

Xử lý số liệu

hồi quy phi tuyến

2.3.5 Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Đẹn ba lá với

- Tyrosyl-tRNA synthetase (PDB: 1JIJ): Tyrosyl-tRNA synthetase xúc tác cho sự

gắn tyrosine vào đầu 3’ của tRNATyr, giải phóng AMP, pyrophosphate và tyrosyl-tRNA dưới dạng sản phẩm Vì enzym này đóng vai trò trung tâm trong quá trình tổng hợp protein nên nó đã thu hút được sự chú ý như một mục tiêu tiềm năng để phát triển các chất chống vi trùng mới.[48]

L Dihydrofolate reductase (PDB: 2W9S, 3SRW): Dihydrofolate reductase

(DHFR) là enzym xúc tác cho sự hình thành tetrahydrofolate (THF) bằng cách khử dihydrofolate (DHF) với sự có mặt của nicotinamide adenine dinucleotide phospha (NADPH)[16], [27] Ngoài ra, nó có vai trò lớn trong việc tổng hợp thimydylate, purin và một số chất chuyển hóa quan trọng khác Do đso DHFR là enzym cần thiết cho sự tăng sinh tế bào, ức chế DHFR dẫn đến phá hủy nhóm THF nội bào ngăn cản quá trình sinh tổng hợp RNA, DNA, thymidine và protein[34]

- Dehydrosqualene synthase (PDB: 2ZCQ): Dehydrosqualene synthase tham gia

vào quá trình tổng hợp staphyloxanthin (sắc tố màu vàng sáng thuộc nhóm carotenoid) là yếu tố độc lực của S.aureus[10] Staphyloxanthin mang đặc tính kháng oxi hóa, do đó có tác dụng giúp vi khuẩn Staphylococcus aureus chống lại các tác nhân oxi hóa có khả năng phá hủy và giết chết vi khuẩn[4]

Nitric oxide

- Nitric oxide synthase (PDB: 3E7G): Nitric oxide synthase (NOS) tham gia vào

quá trình tổng hợp NO, một tín hiệu giãn mạch và dẫn truyền thần kinh ở nồng độ thấp và là chất độc tế bào phòng thủ ở nồng độ cao hơn Các chất ức chế NOS được sử dụng để điều trị viêm, viêm khớp, đột quỵ, sốc nhiễm trùng và ung thư[20]

được chuẩn bị bằng phần mềm MOE (Molecular Operating Environment) bao gồm bổ sung hydro, tối ưu hóa cấu trúc, tạo túi bằng công cụ Site Finder và gán trường lực bằng Amber99

Các hợp chất hóa học được tìm thấy trong tinh dầu và các hợp chất được tổng quan có trong cao chiết Đẹn ba lá được lấy ra dưới dạng cấu trúc 3D từ

Chemdraw, được chuẩn bị bằng phần mềm MOE và được tối giản năng lượng bằng điện tích cục bộ AM1-BCC

Việc docking phân tử được thực hiện bằng cách đặt các phối tử đã chuẩn bị ở trên vào các hốc phân tử của các mục tiêu Phối tử được lắp ghép với 100 cấu hình khác nhau (tọa độ, tư thế) và 10 cấu hình tốt nhất thể hiện trạng thái năng lượng thấp nhất sẽ được báo cáo Các tương tác trong số 10 cấu hình sau đó được trực quan hóa và phân tích chi tiết bằng phần mềm Discovery Studio 2021

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả

3.1.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu

Tổng cộng 49 hợp chất đã được xác định trong tinh dầu lá của loài Đẹn ba lá sử dụng phương pháp sắc kí kết nối khối phổ (Bảng 3.1) Trong các thành phần được xác định, caryophyllen (66,25%) là hợp chất chiếm tỷ lệ cao nhất có trong tinh dầu, tiếp đến là sabinen (10,58%), ngoài ra còn có các hợp chất khác như alloaromadendren (2,04%), rimuen (1,95%), isophyllocladen (1,79%), terpinen-4-ol (1,65%), isoaromadendren epoxid (1,46%), 𝛽-pinen (1,01%) chiếm tỷ lệ phần trăm theo diện tích peak đáng chú ý (>1%)

Bảng 3.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu Đẹn ba lá bằng GC-MS

(9-3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng S aureus

Tác dụng kháng Tụ cầu vàng (S aureus) được đánh giá qua nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của loài Đẹn ba lá được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả kháng S aureus của tinh dầu Đẹn ba lá

S aureus

3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá

trên đại thực bào phúc mạc

Tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Đẹn ba lá đánh giá thông qua định lượng chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào và được

ở bảng 3.3 so sánh với dữ liệu chất chứng dương (bảng 3.4) Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO của cao chiết Đẹn ba lá trên

3.1.4 Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong tinh dầu Đẹn ba lá trên

các đích protein của S aureus

Kết quả docking 49 hợp chất được xác định trong tinh dầu Đẹn ba lá thông qua phương pháp GC-MS được thể hiện bằng các giá trị năng lượng liên kết với 4 đích

protein của S.aureus (1JIJ, 2W9S, 2ZCQ, 3SRW) (Bảng 3.5) và được so sánh với các

chất đối chiếu (chất ức chế đồng kết tinh) trên các đích tương ứng (Bảng 3.6) Bảng 3.5 Giá trị năng lượng liên kết (kcal/mol) của các hợp chất trong tinh dầu Đẹn

ba lá trên các đích protein của S.aureus

- 2ZCQ: BPH-652 (C16H16K3O7PS)

Hình 2 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 2W9S lần lượt (A) – Sabinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren

Hình 3 Tương tác 2D của các hợp chất với các gốc tại vị trí gắn của 2W9S lần lượt

(A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren

Hình 4 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 2W9S lần lượt (A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren

Hình 5 Tương tác 2D của các hợp chất với các gốc tại vị trí gắn của 2W9S lần lượt

(A) – Sanbinen, (B) – Caryophyllen, (C) – Alloaromadendren

Nhận xét:

So sánh giá trị năng lượng của các chất có trong tinh dầu Đẹn ba lá với các chất ức chế đồng kết tinh tương ứng, giá trị càng nhỏ đồng nghĩa với việc khả năng liên kết của hợp chất với đích protein càng bền chặt hay khả năng ức chế càng lớn

Dữ liệu cho thấy tại 2 đích 1JIJ và 2ZCQ, không có hợp chất nào trong tinh dầu Đẹn ba lá cho ra giá trị năng lượng thấp hơn so với các chất ức chế đồng kết tinh tương ứng (Bảng 3.5-3.6) Ngược lại tại đích 2W9S thì có 47 hợp chất thỏa mãn điều kiện trên

ngoại trừ 2 hợp chất (5) 1-Octen-3-ol và (6) 3-Octanone Và tại đích 2ZCQ thì tất cả các

hợp chất thuộc nhóm sesquiterpen, sesquiterpenoid, diterpen, diterpenoid (23-49) đều

có giá trị năng lượng thấp hơn so với chất ức chế đồng kết tinh

Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Đẹn ba lá chống lại S.aureus đã được chứng minh một phần thông qua thử nghiệm in vitro (Mục 3.2) Do đó, việc sử dụng phương

pháp docking phân tử nhằm làm sáng tỏ thêm khả năng này với mục đích thể hiện sự

tương tác của 3 thành phần chính (≥2%) là (3) sabinen, (26) caryophyllen và (27)

alloaromadendren trên các đích 2W9S (Hình 2-3) và 3SRW (Hình 4-5) Năng lượng liên kết giữa các phối tử và vị trí hoạt động tương đối thấp (Bảng 3.5) cho thấy khả năng ức chế enzym tiềm tàng của các hợp chất

Tại đích protein 2W9S, sabinen thể hiện tương tác alkyl và pi-alkyl tại các vị trí hoạt động Ile5, Ala7, Ile31, Ile50, Phe92; caryophyllen chiếm vị trí hoạt động bằng cách liên kết với các gốc acid amin Ile5, Ala7, Leu20, Leu28, Ile31, Ile50, Phe92 cũng bằng các tương tác alkyl, pi-alkyl còn alloaromadendren ngoài các tương tác tương tự với các gốc Ile5, Val6, Ala7, Ile14, Leu20, Ile31, Ile50, Phe92 thì hợp chất còn có thêm tương tác pi-sigma với Phe92

Đối với mục tiêu 3SRW, sabinen thể hiện tương các tương tác yếu với các vị trí hoạt động Val7, Ala8, Ile15, Leu21, Leu29, Val32, Phe99 trong khi caryophyllen và alloaromadendren lại cho thấy khả năng tương tác cực kì tốt tại các gốc Leu6, Val7, Ala8, Ile15, Leu21, Val32, Ile51, Phe93, Phe99 với giá trị năng lượng liên kết xấp xỉ -7,0 kcal/mol

3.1.5 Kết quả nghiên cứu docking phân tử các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá

trên các đích protein ức chế sản sinh Nitric oxide

Các hợp chất trong cao chiết Đẹn ba lá được sử dụng trong phương pháp docking bao gồm các hợp chất được tổng quan từ các nghiên cứu trong nước và trên thế giới, các thành phần chính có trong cao chiết Các hợp chất được tính toán giá trị năng lượng liên kết (kcal/mol) đối với đích 3E7G và so sánh với chất ức chế đồng kết tinh trên cùng đích tác dụng (AR-C95791).(Bảng 3.7)

Bảng 3.7 Giá trị năng lượng liên kết (kcal/mol) của các hợp chất được tổng quan trong cao chiết

Đẹn ba lá và chất ức chế đồng kết tinh trên các đích protein ức chế sản sinh NO

Lupeol 11,015 kcal/mol), Betulinic acid 10,473 kcal/mol), β-sitosterol 11,545 kcal/mol), 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on (-10,527 kcal/mol), Stigmasterol (-10,260 kcal/mol), Campesterol (-10,542 kcal/mol) là 6 hợp chất có giá trị năng lượng thấp nhất, tương ứng với khả năng liên kết mạnh nhất Nguyên nhân là do các hợp chất này có các tương tác mạnh mẽ với các vị trí hoạt động của đích như liên kết hydro với

(-Trp372, Tyr489 của Lupeol, Betulinic acid, β-sitoster, 6β-hydroxystigmast-4-en-3-on; tương tác pi-sigma với Trp372 của Stigmasterol; tương tác alkyl và pi-alkyl với Trp194, Ala197, Arg199, Cys200, Ile201, Pro350, Val352, Met355, Phe369, Trp372, Met374, Met434, Trp463 (Hình 6-7)

Hình 6 Vị trí và tư thế của hợp chất gắn vào các trung tâm hoạt động của protein 3E7G lần lượt (A) – Lupeol, (B) – Betulinic acid, (C) – β-sitosterol, (D) – 6β-

hydroxystigmast-4-en-3-on, (E) – Stigmasterol, (F) – Campesterol