hà thị ngọc ánh sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng s aureus và ức chế sản sinh nitric oxid từ lá bình bát annona glabra l sử dụng docking phân tử

Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các đích tương ứng.. aureus của tinh dầu Annona glabra - Sàng lọc, nghiên cứu, đánh giá khả năng ức chế sự giải

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thanh Tùng – Giảng viên tại Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội và TS Lưu Đàm Ngọc Anh đang công tác tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình

giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các giảng viên thuộc Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền Trường đại học Dược Hà Nội; các cán bộ làm việc tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả quý thầy cô trong Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, trang bị rất nhiều kiến thức quý báu cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường Đây là hành trang to lớn cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp và cả tương lai sau khi ra trường

Em xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới thầy Tùng, thầy Vịnh, thầy Tiệp, cô Ngọc Anh và anh Quý đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp em có thể hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2024

Sinh viên

Hà Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠNMỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNH

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 9

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 9

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 9

2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Bình bát 10

2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu Bình bát bằng GC-MS 10

2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu Bình bát bằng phương pháp vi pha loãng 11

2.3.4 Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Bình bát trên đại thực bào phúc mạc 12

2.3.5 Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các đích tương ứng 14

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu 15

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật 17

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc của chuột 17

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Alkaloid từ cành và quả Bình bát 3

Bảng 2 Các hợp chất ent-kauran diterpen trong cành và quả Bình bát 4

Bảng 3 Các steroid trong cành và quả Bình bát 5

Bảng 4 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu A.glabra bằng GC-MS 15

Bảng 5 Kết quả kháng khuẩn của A.glabra bằng phương pháp MIC 17

Bảng 6 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết A glabra trên đại thực bào phúc mạc chuột tại các nồng độ khác nhau 17

Bảng 7 Kết quả chứng dương (L-NAME) 17

Bảng 8 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các thành phần tinh dầu với các đích protein của S Aureus 18

Bảng 9 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các thành phần cao chiết A glabra L với đích protein của iNOS 24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn natri nitrite 13

Hình 2 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 2w9s 20

Hình 3 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 2w9s 20

Hình 4 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 2w9s 21

Hình 5 Tương tác 2D của β-Guaiene với 2w9s 21

Hình 6 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 3srw 22

Hình 7 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 3srw 22

Hình 8 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 3srw 23

Hình 9 Tương tác 2D của β-Guaiene với 3srw 23

Hình 10 Vị trí gắn 3D của Rutin với 3e7g 25

Hình 11 Tương tác 2D của Rutin với 3e7g 25

Hình 12 Vị trí gắn 3D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g 26

Hình 13 Tương tác 2D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g 26

Hình 14 Vị trí gắn 3D của Nicotiflorine với 3e7g 27

Hình 15 Tương tác 2D của Nicotiflorine với 3e7g 28

Hình 16 Vị trí gắn 3D của β-sitosteryl-D-glucoside với 3e7g 29

Hình 17 Tương tác 2D của β-sitosteryl-D-glucoside với 3e7g 29

Hình 18 Vị trí gắn 3D của Stigmasteryl-D-glucoside với 3e7g 30

Hình 19 Tương tác 2D của Stigmasteryl-D-glucoside với 3e7g 30

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

S.aureus Staphylococcus aureus

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong bối cảnh gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh, việc tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ và an toàn là một nhu cầu cấp bách

Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất, gây ra

nhiều bệnh nhiễm trùng từ nhẹ đến nghiêm trọng, bao gồm viêm da, viêm phổi, và nhiễm trùng máu Sự xuất hiện của các chủng S aureus kháng methicillin (MRSA) đã làm gia tăng đáng kể nguy cơ lây nhiễm và tỷ lệ tử vong liên quan đến các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra

Lá của cây Bình bát (Annona glabra L.) đã được sử dụng trong y học dân gian ở

nhiều nền văn hóa khác nhau để điều trị các bệnh lý khác nhau như nhiễm trùng và viêm

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng A glabra có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính

sinh học, bao gồm các alkaloid, flavonoid, và các loại hợp chất phenolic khác Tuy

nhiên, việc xác định và sàng lọc các hợp chất cụ thể có khả năng kháng S aureus và ức

chế sự giải phóng nitric oxide (NO) vẫn còn nhiều thách thức và chưa được nghiên cứu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm sàng lọc và xác định các hợp chất từ lá Bình bát (A glabra) có khả năng kháng S aureus và ức chế sự giải phóng nitric oxide, mục tiêu của nghiên cứu

bao gồm: - Xác định các hợp chất tiềm năng có khả năng kháng S aureus của tinh dầu

Annona glabra - Sàng lọc, nghiên cứu, đánh giá khả năng ức chế sự giải phóng nitric oxide của

các hợp chất trong cao chiết Các nghiên cứu invitro được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kháng S.aureus và ức chế giải phóng NO,sau đó làm sáng tỏ hơn bằng cách sử dụng phương pháp docking phân tử -một phương pháp tính toán mạnh mẽ, cho phép mô phỏng và dự đoán cách thức các hợp chất nhỏ (ligand) tương tác với các đích protein (receptor) trong cơ thể

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Cây Bình bát (Annona glabra L.) là một loài cây được phân bố rộng rãi ở nước

ta [1], loài cây này rất dễ sống là có khả năng sinh trưởng phát triển tốt

Bình bát thuộc chi Na (Annona L.) Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh

chủng loại thực vật hạt kín APV IV 2016 (Angiosperm Phylogeny Group), vị trí phân

loại của Annona glabra như sau [19]

Trái ăn được, khi chín có màu vàng,mùi thơm nhưng vị nhạt Sinh sống tại bờ rạch nơi có nước lợ.[3], [4]

1.2.2 Vị trí phân bố

Chi Annona L thuộc họ Annonaceae với khoảng 119 loài [5], phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới Châu Mỹ và 1 số ở vùng nhiệt đới Châu Phi[5], cũng như các nước Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam.[6]

Annona glabra L có nguồn gốc từ Florida (USA), vùng Caribe, Trung và Nam

Châu Mỹ Nó phân bố rộng rãi ở khu vực rừng ngập mặn ở Brazil [7] Nó cũng được tìm thấy ở các bờ hồ và sông, cũng có thể sống trong vùng đầm lầy của rừng ngập mặn, không thể tồn tại ở vùng khô hạn, đất cát.[4]

1.3 Thành phần

Thành phần hóa học của Bình bát rất đa dạng về nhóm chất đến từ nhiều bộ phận khác nhau Quả cây chứa nhiều kauranediterpenoid, acetogenin, steroid; thành phần chính của hạt là các alkaloid[8]; lá cây gồm có các hợp chất flavonoid, glycolipid, alkaloid, hợp chất thơm, phenol, đường, steroid, terpen và tinh dầu chứa chủ yếu là mono- và sesquiterpen[6]

1.3.1 Tinh dầu

Các hợp chất được xác định từ tinh dầu chủ yếu là mono-terpenoid và sesquiterpenoid Theo các bài báo đã tổng hợp thì thành phần chính của tinh dầu của Annona glabra L ở Việt Nam là β-caryophyllen (21,5%), germacren D (17,7%), α-cadinol (5,4%), β-elemen (5,2%), α-phellandren (4,3%) và α-caryophyllen (3,6%) Tinh dầu chiết xuất từ quả của Annona glabra L từ Brazil bao gồm các mono-terpen: α-pinen (11,3-18,5%), limonen (20,0-20,7%), α-phellandren (1,2-21%) và (E)-β-ocimen (15,8-19,7%).Trong khi đó mẫu từ Cuba chứa myrcen (47,1%), (Z)-β-ocimen (16,3%), limonen (11,2%) và α-pinen (9,5%) chiếm tỷ lệ cao hơn.[6]

Có thể thấy rằng, sesquiterpenoid là hợp chất chiếm ưu thế trong tinh dầu của

Annona glabra L ở Việt Nam; trái ngược với các monoterpenoid được tìm thấy trong

tinh dầu từ Brazil và Cuba Chúng ta biết rằng tinh dầu từ lá cây có thành phần khác so với tinh dầu từ các bộ phận khác, cho dù được lấy từ cùng 1 cây.[6]

1.3.2 Các hợp chất alkaloid

Năm 2000, Fang Rong Chang và cộng sự đã phân lập được 13 hợp chất alkaloid từ cành và quả Bình bát trong đó bao gồm 1 dioxoaporphin (1), 2 oxoaporphin (2), (3), 5 aporphin (4-8), 1 proaporphin (9), 2 protoberberin (10), (11) và 2 amide (12), (13) [9] Trước đó vài năm, Shoei Sheng Lee cùng với các cộng sự đã tìm được 3 hợp chất akloid (14-16) trong đó có (-)-Anolobine (15) và (-)-Roemeroline (16) là hai chất có tiềm năng

1.3.3 Các hợp chất ent-kauran diterpen

Trong cao chiết quả và cành của Bình bát, ngoài các alkaloid thì phần lớn trong cao chứa các terpenoid, cụ thể là các ent-kauran diterpen Các ent-kauran diterpen đặc trưng của loài Bình bát được đặt tên lần lượt là Annonaglabasin A, B, C, D, E , F (17-22)

Bảng 2 Các hợp chất ent-kauran diterpen trong cành và quả Bình bát

1.3.4 Các hợp chất steroid

Thành phần hóa học trong cành và quả Bình bát có chứa một hàm lượng nhất định các steroid Các hợp chất này được phân lập bởi Fang Rong Chang và cộng sự năm 2000 bao gồm 5 hợp chất β-Sitosterol (23), Stigmasterol (24), β-sitosteryl-D-glucoside (25), Stigmasteryl-D-glucoside (26) và 6-O-palmitoyl- β -sitosteryl-D-glucoside (27) (bảng 3)[9]

Bảng 3 Các steroid trong cành và quả Bình bát

Alkaloid là chất có hoạt tính chống leishmania ở loài Bình bát Trong số các alkaloid được phân lập từ các loài, các hợp chất đã được chứng minh có hoạt tính chống Leishmania là coronaridine, O-methylarmepavine, 18-methoxycoronaridine và liriodenine Ngoài ra, acetogenins corosolone và anonacinone cũng có triển vọng như chất diệt leishmania[14]

1.4.2 Tác dụng chống ung thư

Các acetogenin annonaceous từ họ annonaceae là nguồn rất quan trọng cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai Các phần acetogenin có trong lá Bình bát được phát hiện bằng thuốc thử Kedde và chúng được phân lập thông qua sắc ký cột Nó từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền như một chất chống ung thư[15]

Cao chiết Ethanol của lá Bình bát cho thấy sự hiện diện của annoglacin A và B, và nó ngăn chặn sự tăng sinh của ung thư biểu mô tuyến tụy và các dòng tế bào vú ở người, đồng thời nó có hoạt tính chống ung thư rõ rệt hơn adriamycin[15]

Các nghiên cứu thực hiện trên cao chiết methanol của hạt Bình bát dựa trên thử nghiệm sinh học đã phân lập được các thành phần annonin I, squamocin-C và squamocin-D Trong số đó, annonin I có hoạt tính cao hơn chống lại ung thư biểu mô phổi A-549 và ung thư biểu mô tuyến vú[15]

1.4.3 Tác dụng kháng viêm

Viêm là phản ứng bình thường và tức thời của mô sống đối với bất kỳ loại chấn thương nào Nếu quá trình viêm xảy ra lặp đi lặp lại hoặc liên tục sẽ dẫn đến một số bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh viêm ruột, hen suyễn, bệnh vẩy nến, xơ vữa động mạch và một số bệnh ung thư Tình trạng viêm, chủ yếu được hình thành qua enzym trung gian là phospholipase A2 (SPLA2S) có tác dụng điều chỉnh con đường axit arachidonic qua đó các chất trung gian gây viêm được giải phóng

Cây Bình bát cho thấy sự hiện diện của một số hợp chất có hoạt tính sinh học, như alkaloid, flavonoid, tannin, steroid, terpenoid, glycoside, phenol và những hợp chất này có thể tạo ra các đặc tính y học khác nhau của nó Cơ chế hoạt động chống viêm của cao chiết axeton của lá Bình bát được đánh giá dựa trên khả năng ức chế SPLA2S Dịch chiết cho thấy vùng ức chế tốt Tác dụng hiệp đồng của các hợp chất có trong cao chiết của lá Bình bát có thể là nguyên nhân ức chế enzyme SPLA2 ở mức độ lớn hơn[8]

1.4.4 Tác dụng kháng khuẩn

Trong nghiên cứu trước đây, Bình bát đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng

khuẩn trên các chủng vi khuẩn chọn lọc như Bacillus cereus (Gram+), Pseudomonas

aeruginosa (Gram-) và Shigella flexneri (Gram-) Những hoạt tính này được so sánh với

kháng sinh tiêu chuẩn, cụ thể là kháng sinh phổ rộng như ampicillin và penicillin Việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tuân theo kỹ thuật truyền thống là đĩa khuếch tán trên môi trường thạch Sau đó, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng phương pháp pha loãng Ampicillin và penicillin tiêu chuẩn có giá trị MIC dao động trong

khoảng từ 0,244 mg/mL đến 0,488 mg/mL Kết quả cho thấy cao chiết Bình bát thể hiện hiệu quả kháng khuẩn vượt trội so với kháng sinh thông thường[16]

Flavonoid trong Bình bát rất hữu ích trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do P aeruginosa gây ra Cao chiết từ quả của cây cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng chú ý chống lại một số vi khuẩn được thử nghiệm, bao gồm Escherichia coli (Gram-), Staphylococcus aureus (Gram+), Aspergillus niger và Candida albicans Hơn nữa, nó cung cấp bằng chứng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các chất chiết xuất được thử nghiệm có thể là do sự cộng tác giữa các thành phần chính và phụ của chúng Những chất chiết xuất này có thể được coi là một liệu pháp hiệu quả để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau Do đó, quả Bình bát có thể được sử dụng như một nguồn thuốc kháng khuẩn tự nhiên rất tốt[16]

1.4.5 Tác dụng chữa bỏng

Vết thương do bỏng là vết thương do tai nạn phổ biến nhất Vết bỏng không chỉ làm biến dạng làn da mà còn có thể gây hậu quả nặng nề cho chức năng cơ thể Toàn bộ quá trình chữa lành vết thương là một quá trình năng động và phức tạp bao gồm một chuỗi các sự kiện được sắp xếp để khôi phục tính toàn vẹn của mô bị tổn thương

Nghiên cứu cho thấy màng alginate tẩm chiết xuất từ lá Bình bát có tác dụng chữa lành vết thương và cũng tăng cường tốc độ co lại của vết thương Người ta tin rằng các chất hóa thực vật (Phytochemical) có trong chiết xuất lá đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình chữa bệnh Việc sử dụng băng có chứa Bình bát sẽ thúc đẩy quá trình lành vết bỏng, bằng chứng là thời gian lành vết thương giảm và vết thương co lại nhanh hơn Có thể nói lá của loài Bình bát có đặc tính chữa lành vết thương[17]

1.4.6 Tác dụng diệt côn trùng

Trong các nghiên cứu kiểm soát muỗi gần đây, được biết chi Annona có đặc tính diệt côn trùng mạnh Theo báo cáo, Annona crassiflora cho thấy hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti Annona squamosa thể hiện hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti và Culex quinquefasciatus Chiết xuất hạt Annona muricata cho thấy hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti

Cao chiết ethanol vỏ thân của Bình bát có tác dụng diệt ấu trùng Ae aegypti Cao chiết nước của lá cây cho thấy đặc tính diệt côn trùng trên Ae aegypti và Ae albopictus (lần lượt là 5,94 mg/L và 5,00 mg/L) Công thức nano bạc của Bình bát cho thấy hiệu quả diệt ấu trùng được nâng cao trên Ae aegypti và Ae albopictus (LC50 = 2,51 mg/L và 2,43 mg/L tương ứng)[6]

1.4.7 Tác dụng chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các hợp chất làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa và kéo dài tuổi thọ của vật chất có thể oxy hóa Các chất oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa khác nhau và không thể thiếu đối với đời sống hiếu khí và các chức năng trao đổi chất Chúng có khả năng phản ứng cao, thời gian bán hủy rất ngắn và có hoạt tính gây tổn hại đối với các đại phân tử như protein, lipid và DNA

Cao chiết Bình bát cho thấy tác dụng chống oxy hóa vừa phải Chất chuẩn được sử dụng là quercetin, một hợp chất thuộc nhóm flavonoid phổ biến nhất và nổi bật nhờ khả năng chống oxy hóa tuyệt vời Kết quả cho thấy các cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất là ethyl axetat và metanol từ vỏ thân trong và metanol từ hạt, tương ứng với các chất có chứa hợp chất phenolic[18]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (thân, lá, quả) của loài Annona glabra

Thủy, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Hóa chất và dung môi dùng cho nghiên cứu gồm có - Dùng trong thu lấy tinh dầu và cao chiết: Nước cất, methanol

- Dùng trong đánh giá tác dụng kháng S.aureus: Tween 80 4%, Chủng vi sinh vật thí nghiệm: Vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus được cung cấp bởi Viện

Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia - Dùng trong đánh giá ức chế sản sinh NO:

+ Thioglycollate được cung cấp bởi BD (Franklin Lakes, NJ., USA) + LPS và L-NAME được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) + Thuốc thử Griess được mua từ Promega (Madison, WI, USA)

+ Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech (Aidenbach, Germany)

+ Dung dịch đệm ly giải hồng cầu (RBC lysis buffer 2X) được mua từ Bio Basic Inc (Markham, Canada)

+ Thuốc thử MTT được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA) + DMSO được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc có mỏ, bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Việt Nam, lọ đụng mẫu, ống falcon, bình cầu cổ nhám, đĩa petri, đĩa 96 giếng vô trùng, đũa thủy tinh,…

- Cân phân tích AND GR-200 - Cân kỹ thuật Sartorius TE412 - Tủ sấy Memmert (Đức) - Bếp cách thủy Memmert - Bể siêu âm Daihan Scientific - Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS model: Trace 1310_ITQ900 thế

hệ ISQ/Hãng Thermo Scientific/Mỹ

- Máy cất quay chân không RE301A - Máy ly tâm lạnh để bàn Model: Rotanda – 460RC - Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Bình bát - Phân tích thành tinh dầu Bình bát bằng phương pháp sắc kí kết nối khối phổ (GC-

MS)

- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) của tinh dầu và cao chiết

Bình bát - Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của tinh dầu và cao chiết Bình bát - Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các

đích tương ứng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Bình bát

Tinh dầu

Cân một lượng khoảng 900g dược liệu đã làm sạch, cắt nhỏ đến kích thước 10mm Sau đó các mẫu đã cắt nhỏ được cất kéo hơi nước sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam V Tinh dầu được cất trong 2 giờ đến khi thể tích tinh

Cao chiết methanol

Dược liệu được phơi khô hoặc sấy khô bằng tủ sấy, sau đó được xay nhỏ thành bột Cân khoảng 1g bột dược liệu khô ở trên cho vào ống Falcon 50ml cùng với 20ml

trong 5 phút sau đó gạn lấy phần dịch trong Bã dược liệu còn lại được hòa tan tiếp trong 20ml methanol (99% v/v), lặp lại quy trình trên thêm 2 lần Gộp lấy dịch trong của cả 3

lại ở nhiệt độ phòng trong tủ hút

2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu Bình bát bằng GC-MS

Phân tích thành phần hóa học tinh dầu được thực hiện bằng thiết bị sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC-MS) Thermo Scientific Trace 1310 ghép nối với detector ITQ 900 (Thermo, bẫy ion) Cột phân tích TG-5MS, kích thước 30m x 0,25µm x 0,25mm

Chương trình nhiệt độ 600C (2 phút), tăng 40C/phút đến 2200C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút[2], [20]

Việc xác định các thành phần được thực hiện trên cơ sở của các chỉ số RI (Retention Indices), xác định với các đồng đẳng n-alkan (C8-C20), trong cùng một điều kiện sắc ký Đồng thời so sánh với phổ khối lượng tìm kiếm trong thư viện NIST 17, Willey 8 và cơ sở dữ liệu Adam 2017 Tỷ lệ % các thành phần trong tinh dầu được tính toán dựa trên diện tích peak sắc ký và không sử dụng yếu tố điều chỉnh[2], [20]

Công thức tính RI:

Trong đó:

n: Số nguyên tử carbon của ankan liền trước pic của chất phân tích

2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu

Bình bát bằng phương pháp vi pha loãng

Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của tinh dầu được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa 96 giếng chủng S aureus (Gram+) theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ[2], [20]

Tinh dầu được pha trong nước có bổ sung Tween 80 4% Nồng độ tinh dầu ban đầu tính là 1, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong môi trường phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân Nồng độ MIC được biểu diễn dưới dạng 1/pha loãng hoặc theo nồng độ (%) Ví dụ 1/1024 tức là MIC ở nồng độ tinh dầu đó pha loãng 1024 lần, tương đương nồng độ khoảng 0,1% hoặc 1ml/L

trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật Tất cả các thử nghiệm được thực hiện độc lập ít nhất 2 lần[2], [20]

2.3.4 Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Bình bát trên đại

thực bào phúc mạc

Chuẩn bị chất thử

Cao chiết dược liệu được hòa tan trong DMSO với nồng độ gốc 50 mg/mL và

cấy đến các nồng độ thích hợp

Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10-12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 30 g,

khỏe mạnh do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

Phân lập và nuôi cấy đại thực bào sơ cấp phúc mạc chuột nhắt

Để huy động đại thực bào phúc mạc, chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 mL dung dịch thioglycollat 4% Sau 3 ngày, chuột nhắt được giết bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng sử dụng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 mL dung dịch muối cân bằng (HBSS) vào khoang phúc mạc của chuột, sau đó lắc rửa và thu hồi hỗn dịch tế bào vào một ống tube 50 mL trong đá Tiêm HBSS được lặp lại 3 lần và dịch rửa được gom, ly tâm để thu pellet tế bào Tế bào hồng cầu được loại bỏ bằng cách ủ tế bào trong dung dịch ly giải hồng cầu trong 5 phút Sau đó, tế bào được rửa bằng dung dịch PBS sinh lý trước khi được hỗn dịch trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS và 1% penicillin/Streptomycin

Đo giải phóng Nitric oxide (NO)

Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào

Sau khi phân lập, tế bào được cấy trong một đĩa nuôi cấy 96 giếng (Corning)

tủ nuôi cấy, loại bỏ môi trường và rửa tế bào 3 lần với dung dịch PBS để loại bỏ các tế bào không kết dính Sau đó, môi trường mới được thêm và tế bào được tiếp tục ủ qua đêm Vào ngày tiếp theo, tế bào được ủ với môi trường chứa các chất thử ở nồng độ thích hợp trong 2 giờ, sau đó tiếp tục ủ với môi trường chứa LPS 100 ng/mL thêm 24

giờ nữa Môi trường trong mỗi giếng (50 µL) được hút chuyển sang một đĩa 96 giếng mới Sau đó, thêm 50 µL dung dịch sulfanilamid và ủ ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối trong 5 phút trước khi thêm 50 µL N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid tới hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 535 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

Nồng độ NO trong mỗi mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit Tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO của mẫu thử được tính theo công thức:

𝐶𝐿𝑃𝑆 Trong đó:

Hình 1 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn natri

nitrite

Xử lý số liệu

hồi quy phi tuyến

2.3.5 Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với

các đích tương ứng

Phương pháp docking phân tử được sử dụng để phân tích sự phù hợp và tương tác thuận lợi giữa các hợp chất hoạt động và vị trí liên kết với các đích, chứng minh khả năng tác dụng ức chế của tinh dầu và cao chiết Bình bát đối với S aureus và sự sản sinh Nitric oxid Các đích protein của S Aureus bao gồm Dihydrofolate reductase (PDB: 2W9S, 3SRW), Tyrosyl-tRNA synthetase (PDB: 1JIJ), Dehydrosqualene synthase (PDB: 2ZCQ) và của ức chế sản sinh NO Nitric oxid synthase (PDB: 3E7G) là các đích sử dụng trong phương pháp được tải xuống từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (Protein Data

MOE (Molecular Operating Environment) bằng cách loại bỏ nước và các phân tử nhỏ, thêm proton, xác định các túi liên kết và thiết lập trường lực Amber99

Các phối tử được sử dụng trong mô hình docking phân tử là các hợp chất hóa học được tìm thấy trong tinh dầu và các hợp chất được tổng quan có trong cao chiết Bình bát Các phối tử được chuẩn bị bằng phần mềm MOE, tối ưu năng lượng với điện tích cục bộ AM1-BCC Mô hình docking phân tử được chạy với 100 cấu hình và 10 cấu hình tốt nhất thể hiện trạng thái năng lượng thấp sẽ được báo cáo Các tương tác trong 10 cấu hình này sau đó được hiển thị và phân tích chi tiết bằng phần mềm Discovery Studio 2021

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KẾT QUẢ 3.1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu

Bằng phương pháp sắc kí khí kết nối khối phổ, có tổng cộng 53 hợp chất đã được xác định trong tinh dầu của Annona glabra L Trong đó, thành phần β-Caryophyllen (26,45%) và β-Guaiene (24,16%) là 2 hợp chất chiếm tỉ lệ phần trăm theo diện tích pic cao nhất trong các tinh dầu thể hiện giá trị hàm lượng của chúng trong tinh dầu Ngoài ra còn có 1 số hợp chất chiếm hàm lượng tương đối trong tinh dầu như α-Pinene (3,13%), β-Myrcene (5,38%), α-Phellandrene (7,28%), Limonene (3,4%), β-trans-Ocimene (5,72%), Alloaromadendrene (2,9%)

Chi tiết về thành phần ở bảng sau:

Bảng 4 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu A.glabra bằng phương pháp GC-MS

Diện tích pic%

Ghi chú: RT: Thời gian lưu

RI: Chỉ số lưu giữ tính toán trên cột RT-5MS RI thư viện: Chỉ số lưu giữ tra cứu trên thư viện

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật

Ghi chú: MIC là nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật

MBC là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc của chuột

Bảng 6 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết A.glabra trên đại thực

bào phúc mạc chuột tại các nồng độ khác nhau

0,473-0,765

3.4 Kết quả docking

3.4.1 Kết quả phương pháp docking phân tử của tinh dầu A.glabra trên các đích

protein của S Aureus

Bảng 8 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các

thành phần tinh dầu với các đích protein của S Aureus

• Vị trí gắn các thành phần hóa học của tinh dầu A.glabra vào protein 2w9s

β-caryophyllen

Hình 2 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 2w9s

Hình 3 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 2w9s Tương tác Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid LEU28, ILE31, ALA7, ILE5, LEU20, ILE50

Tương tác Pi-Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid PHE92

β-Guaiene

Hình 4 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 2w9s

Hình 5 Tương tác 2D của β-Guaiene với 2w9s Tương tác Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid ILE50, LEU20, ILE14, ILE5, VAL6, ALA7, ILE31

Tương tác Pi-Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid PHE92 • Vị trí gắn các thành phần hóa học của tinh dầu A.glabra vào protein 3srw

β-caryophyllen

Hình 6 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 3srw

Hình 7 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 3srw Tương tác Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid ILE15, LEU21,VAL32, LEU6, ILE51

Tương tác Pi-Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid PHE99, PHE93

β-Guaiene

Hình 8 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 3srw

Hình 9 Tương tác 2D của β-Guaiene với 3srw

Tương tác Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid LEU6, ALA8, VAL32, LEU21, LEU29, LEU55, ILE51

Tương tác Pi-Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid PHE93

3.4.2 Kết quả phương pháp docking phân tử của cao chiết Annona glabra trên các

đích protein ức chế giải phóng khí NO

Bảng 9 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các

thành phần cao chiết A.glabra L với đích protein của iNOS

• Vị trí gắn các thành phần hóa học của cao chiết A.glabra vào protein 3e7g

Rutin

Hình 10 Vị trí gắn 3D của Rutin với 3e7g

Hình 11 Tương tác 2D của Rutin với 3e7g Rutin tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau:

Liên kết Pi-Alkyl: với aminoacid CYS200, VAL352, PHE369, TYR489 Liên kết C-H: với aminoacid GLU377

Liên kết Hydro: với aminoacid ARG199, TYR491 Liên kết Alkyl: với aminoacid ALA197, MET355

Kaempferol 7-neohesperidoside

Hình 12 Vị trí gắn 3D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g

Hình 13 Tương tác 2D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g