Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các đích tương ứng.. aureus của tinh dầu Annona glabra - Sàng lọc, nghiên cứu, đánh giá khả năng ức chế sự giải
TỔNG QUAN
Tên khoa học và vị trí phân loại
Cây Bình bát (Annona glabra L.) là một loài cây được phân bố rộng rãi ở nước ta [1], loài cây này rất dễ sống là có khả năng sinh trưởng phát triển tốt
Bình bát thuộc chi Na (Annona L.) Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loại thực vật hạt kín APV IV 2016 (Angiosperm Phylogeny Group), vị trí phân loại của Annona glabra như sau [19]
Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố
Cây gỗ nhỏ, cao 2-5m, vỏ màu xám Lá không có lông, lá hình xoan hay tròn dài, thuôn dài hoặc hình trứng; có 8-9 cặp gân phụ Hoa màu vàng, rộng 2cm; cánh hoa dày, dài 2-3cm, có bớt đỏ ở mặt trong, nhiều nhụy nhỏ Quả dài 7-10 cm, màu vàng xanh, không có gai nạt, nạt trắng; hạt màu nâu đen dài khoảng 1cm
Trái ăn được, khi chín có màu vàng,mùi thơm nhưng vị nhạt Sinh sống tại bờ rạch nơi có nước lợ.[3], [4]
Chi Annona L thuộc họ Annonaceae với khoảng 119 loài [5], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ và 1 số ở vùng nhiệt đới Châu Phi[5], cũng như các nước Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam.[6]
Annona glabra L có nguồn gốc từ Florida (USA), vùng Caribe, Trung và Nam
Châu Mỹ Nó phân bố rộng rãi ở khu vực rừng ngập mặn ở Brazil [7] Nó cũng được tìm thấy ở các bờ hồ và sông, cũng có thể sống trong vùng đầm lầy của rừng ngập mặn, không thể tồn tại ở vùng khô hạn, đất cát.[4]
Thành phần
Thành phần hóa học của Bình bát rất đa dạng về nhóm chất đến từ nhiều bộ phận khác nhau Quả cây chứa nhiều kauranediterpenoid, acetogenin, steroid; thành phần chính của hạt là các alkaloid[8]; lá cây gồm có các hợp chất flavonoid, glycolipid, alkaloid, hợp chất thơm, phenol, đường, steroid, terpen và tinh dầu chứa chủ yếu là mono- và sesquiterpen[6]
Các hợp chất được xác định từ tinh dầu chủ yếu là mono-terpenoid và sesquiterpenoid Theo các bài báo đã tổng hợp thì thành phần chính của tinh dầu của Annona glabra L ở Việt Nam là β-caryophyllen (21,5%), germacren D (17,7%), α- cadinol (5,4%), β-elemen (5,2%), α-phellandren (4,3%) và α-caryophyllen (3,6%) Tinh dầu chiết xuất từ quả của Annona glabra L từ Brazil bao gồm các mono-terpen: α-pinen (11,3-18,5%), limonen (20,0-20,7%), α-phellandren (1,2-21%) và (E)-β-ocimen (15,8- 19,7%).Trong khi đó mẫu từ Cuba chứa myrcen (47,1%), (Z)-β-ocimen (16,3%), limonen (11,2%) và α-pinen (9,5%) chiếm tỷ lệ cao hơn.[6]
Có thể thấy rằng, sesquiterpenoid là hợp chất chiếm ưu thế trong tinh dầu của
Annona glabra L ở Việt Nam; trái ngược với các monoterpenoid được tìm thấy trong tinh dầu từ Brazil và Cuba Chúng ta biết rằng tinh dầu từ lá cây có thành phần khác so với tinh dầu từ các bộ phận khác, cho dù được lấy từ cùng 1 cây.[6]
Năm 2000, Fang Rong Chang và cộng sự đã phân lập được 13 hợp chất alkaloid từ cành và quả Bình bát trong đó bao gồm 1 dioxoaporphin (1), 2 oxoaporphin (2), (3),
5 aporphin (4-8), 1 proaporphin (9), 2 protoberberin (10), (11) và 2 amide (12), (13) [9] Trước đó vài năm, Shoei Sheng Lee cùng với các cộng sự đã tìm được 3 hợp chất akloid (14-16) trong đó có (-)-Anolobine (15) và (-)-Roemeroline (16) là hai chất có tiềm năng ức chế actylcholinesterase với IC50 lần lượt 22,4 và 26,3 àM[10]
Bảng 1 Alkaloid từ cành và quả Bình bát
STT Tên chất CTPT Mw TLTK
1.3.3 Các hợp chất ent-kauran diterpen
Trong cao chiết quả và cành của Bình bát, ngoài các alkaloid thì phần lớn trong cao chứa các terpenoid, cụ thể là các ent-kauran diterpen Các ent-kauran diterpen đặc trưng của loài Bình bát được đặt tên lần lượt là Annonaglabasin A, B, C, D, E , F (17- 22)
Bảng 2 Các hợp chất ent-kauran diterpen trong cành và quả Bình bát
STT Tên chất CTPT Mw TLTK
Các hợp chất Annoglabasin được nghiên cứu và cho là có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư ở người cụ thể trên các dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB[13]
Thành phần hóa học trong cành và quả Bình bát có chứa một hàm lượng nhất định các steroid Các hợp chất này được phân lập bởi Fang Rong Chang và cộng sự năm 2000 bao gồm 5 hợp chất β-Sitosterol (23), Stigmasterol (24), β-sitosteryl-D-glucoside (25), Stigmasteryl-D-glucoside (26) và 6-O-palmitoyl- β -sitosteryl-D-glucoside (27) (bảng 3)[9]
Bảng 3 Các steroid trong cành và quả Bình bát
STT Tên chất CTPT Mw TLTK
Tác dụng sinh học
Bệnh Leishmania chủ yếu do ký sinh trùng đơn bào thuộc chi Leishmania gây ra và là một trong những bệnh nhiệt đới bị lãng quên (Neglected tropical diseases – NTDs), đặc trưng bởi sự hình thành các vết loét trên da
Alkaloid là chất có hoạt tính chống leishmania ở loài Bình bát Trong số các alkaloid được phân lập từ các loài, các hợp chất đã được chứng minh có hoạt tính chống Leishmania là coronaridine, O-methylarmepavine, 18-methoxycoronaridine và liriodenine Ngoài ra, acetogenins corosolone và anonacinone cũng có triển vọng như chất diệt leishmania[14]
1.4.2 Tác dụng chống ung thư
Các acetogenin annonaceous từ họ annonaceae là nguồn rất quan trọng cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai Các phần acetogenin có trong lá Bình bát được phát hiện bằng thuốc thử Kedde và chúng được phân lập thông qua sắc ký cột Nó từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền như một chất chống ung thư[15]
Cao chiết Ethanol của lá Bình bát cho thấy sự hiện diện của annoglacin A và B, và nó ngăn chặn sự tăng sinh của ung thư biểu mô tuyến tụy và các dòng tế bào vú ở người, đồng thời nó có hoạt tính chống ung thư rõ rệt hơn adriamycin[15]
Các nghiên cứu thực hiện trên cao chiết methanol của hạt Bình bát dựa trên thử nghiệm sinh học đã phân lập được các thành phần annonin I, squamocin-C và squamocin-D Trong số đó, annonin I có hoạt tính cao hơn chống lại ung thư biểu mô phổi A-549 và ung thư biểu mô tuyến vú[15]
Viêm là phản ứng bình thường và tức thời của mô sống đối với bất kỳ loại chấn thương nào Nếu quá trình viêm xảy ra lặp đi lặp lại hoặc liên tục sẽ dẫn đến một số bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh viêm ruột, hen suyễn, bệnh vẩy nến, xơ vữa động mạch và một số bệnh ung thư Tình trạng viêm, chủ yếu được hình thành qua enzym trung gian là phospholipase A2 (SPLA2S) có tác dụng điều chỉnh con đường axit arachidonic qua đó các chất trung gian gây viêm được giải phóng
Cây Bình bát cho thấy sự hiện diện của một số hợp chất có hoạt tính sinh học, như alkaloid, flavonoid, tannin, steroid, terpenoid, glycoside, phenol và những hợp chất này có thể tạo ra các đặc tính y học khác nhau của nó Cơ chế hoạt động chống viêm của cao chiết axeton của lá Bình bát được đánh giá dựa trên khả năng ức chế SPLA2S Dịch chiết cho thấy vùng ức chế tốt Tác dụng hiệp đồng của các hợp chất có trong cao chiết của lá Bình bát có thể là nguyên nhân ức chế enzyme SPLA2 ở mức độ lớn hơn[8]
Trong nghiên cứu trước đây, Bình bát đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn chọn lọc như Bacillus cereus (Gram+), Pseudomonas aeruginosa (Gram-) và Shigella flexneri (Gram-) Những hoạt tính này được so sánh với kháng sinh tiêu chuẩn, cụ thể là kháng sinh phổ rộng như ampicillin và penicillin Việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tuân theo kỹ thuật truyền thống là đĩa khuếch tán trên môi trường thạch Sau đó, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng phương pháp pha loãng Ampicillin và penicillin tiêu chuẩn có giá trị MIC dao động trong
7 khoảng từ 0,244 mg/mL đến 0,488 mg/mL Kết quả cho thấy cao chiết Bình bát thể hiện hiệu quả kháng khuẩn vượt trội so với kháng sinh thông thường[16]
Flavonoid trong Bình bát rất hữu ích trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do
P aeruginosa gây ra Cao chiết từ quả của cây cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng chú ý chống lại một số vi khuẩn được thử nghiệm, bao gồm Escherichia coli (Gram-), Staphylococcus aureus (Gram+), Aspergillus niger và Candida albicans Hơn nữa, nó cung cấp bằng chứng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các chất chiết xuất được thử nghiệm có thể là do sự cộng tác giữa các thành phần chính và phụ của chúng Những chất chiết xuất này có thể được coi là một liệu pháp hiệu quả để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau Do đó, quả Bình bát có thể được sử dụng như một nguồn thuốc kháng khuẩn tự nhiên rất tốt[16]
Vết thương do bỏng là vết thương do tai nạn phổ biến nhất Vết bỏng không chỉ làm biến dạng làn da mà còn có thể gây hậu quả nặng nề cho chức năng cơ thể Toàn bộ quá trình chữa lành vết thương là một quá trình năng động và phức tạp bao gồm một chuỗi các sự kiện được sắp xếp để khôi phục tính toàn vẹn của mô bị tổn thương
Nghiên cứu cho thấy màng alginate tẩm chiết xuất từ lá Bình bát có tác dụng chữa lành vết thương và cũng tăng cường tốc độ co lại của vết thương Người ta tin rằng các chất hóa thực vật (Phytochemical) có trong chiết xuất lá đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình chữa bệnh Việc sử dụng băng có chứa Bình bát sẽ thúc đẩy quá trình lành vết bỏng, bằng chứng là thời gian lành vết thương giảm và vết thương co lại nhanh hơn Có thể nói lá của loài Bình bát có đặc tính chữa lành vết thương[17]
1.4.6 Tác dụng diệt côn trùng
Trong các nghiên cứu kiểm soát muỗi gần đây, được biết chi Annona có đặc tính diệt côn trùng mạnh Theo báo cáo, Annona crassiflora cho thấy hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti Annona squamosa thể hiện hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti và Culex quinquefasciatus Chiết xuất hạt Annona muricata cho thấy hoạt tính diệt côn trùng đối với Ae aegypti
Cao chiết ethanol vỏ thân của Bình bát có tác dụng diệt ấu trùng Ae aegypti Cao chiết nước của lá cây cho thấy đặc tính diệt côn trùng trên Ae aegypti và Ae albopictus (lần lượt là 5,94 mg/L và 5,00 mg/L) Công thức nano bạc của Bình bát cho thấy hiệu quả diệt ấu trùng được nâng cao trên Ae aegypti và Ae albopictus (LC50 = 2,51 mg/L và 2,43 mg/L tương ứng)[6]
1.4.7 Tác dụng chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các hợp chất làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa và kéo dài tuổi thọ của vật chất có thể oxy hóa Các chất oxy hóa đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa khác nhau và không thể thiếu đối với đời sống hiếu khí và các chức năng trao đổi chất Chúng có khả năng phản ứng cao, thời gian bán hủy rất ngắn và có hoạt tính gây tổn hại đối với các đại phân tử như protein, lipid và DNA
Cao chiết Bình bát cho thấy tác dụng chống oxy hóa vừa phải Chất chuẩn được sử dụng là quercetin, một hợp chất thuộc nhóm flavonoid phổ biến nhất và nổi bật nhờ khả năng chống oxy hóa tuyệt vời Kết quả cho thấy các cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất là ethyl axetat và metanol từ vỏ thân trong và metanol từ hạt, tương ứng với các chất có chứa hợp chất phenolic[18]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (thân, lá, quả) của loài Annona glabra
L (Bình bát) được thu hái tại tọa độ 20 o 14.454'N; 106 o 30,874'E Vườn Quốc gia Xuân Thủy, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định
Hóa chất và dung môi dùng cho nghiên cứu gồm có
- Dùng trong thu lấy tinh dầu và cao chiết: Nước cất, methanol
- Dùng trong đánh giá tác dụng kháng S.aureus: Tween 80 4%, Chủng vi sinh vật thí nghiệm: Vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia
- Dùng trong đánh giá ức chế sản sinh NO:
+ Thioglycollate được cung cấp bởi BD (Franklin Lakes, NJ., USA)
+ LPS và L-NAME được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) + Thuốc thử Griess được mua từ Promega (Madison, WI, USA)
+ Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech (Aidenbach, Germany)
+ Dung dịch đệm ly giải hồng cầu (RBC lysis buffer 2X) được mua từ Bio Basic Inc (Markham, Canada)
+ Thuốc thử MTT được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA) + DMSO được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)
2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc có mỏ, bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Việt Nam, lọ đụng mẫu, ống falcon, bình cầu cổ nhám, đĩa petri, đĩa 96 giếng vô trùng, đũa thủy tinh,…
- Cân phân tích AND GR-200
- Cân kỹ thuật Sartorius TE412
- Bể siêu âm Daihan Scientific
- Hệ thống sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS model: Trace 1310_ITQ900 thế hệ ISQ/Hãng Thermo Scientific/Mỹ
- Máy cất quay chân không RE301A
- Máy ly tâm lạnh để bàn Model: Rotanda – 460RC
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss
Nội dung nghiên cứu
- Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Bình bát
- Phân tích thành tinh dầu Bình bát bằng phương pháp sắc kí kết nối khối phổ (GC- MS)
- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) của tinh dầu và cao chiết Bình bát
- Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của tinh dầu và cao chiết Bình bát
- Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các đích tương ứng.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thu tinh dầu và cao chiết methanol từ Bình bát
Cân một lượng khoảng 900g dược liệu đã làm sạch, cắt nhỏ đến kích thước 3- 10mm Sau đó các mẫu đã cắt nhỏ được cất kéo hơi nước sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam V Tinh dầu được cất trong 2 giờ đến khi thể tích tinh dầu không đổi Tinh dầu thu được được bảo quản trong lọ kín, làm khan bằng Na2SO4 khan và bảo quản ở nhiệt độ -5 0 C trong bóng tối
Dược liệu được phơi khô hoặc sấy khô bằng tủ sấy, sau đó được xay nhỏ thành bột Cân khoảng 1g bột dược liệu khô ở trên cho vào ống Falcon 50ml cùng với 20ml methanol (99% v/v) Siêu âm ở 50 0 C trong vòng 15 phút Ly tâm với tốc độ 3500rpm trong 5 phút sau đó gạn lấy phần dịch trong Bã dược liệu còn lại được hòa tan tiếp trong 20ml methanol (99% v/v), lặp lại quy trình trên thêm 2 lần Gộp lấy dịch trong của cả 3 lần sau đó cô quay với áp suất giảm tại 40 0 C Để bay hơi tự nhiên phần dung môi còn lại ở nhiệt độ phòng trong tủ hút
2.3.2 Phân tích thành phần tinh dầu Bình bát bằng GC-MS
Phân tích thành phần hóa học tinh dầu được thực hiện bằng thiết bị sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC-MS) Thermo Scientific Trace 1310 ghép nối với detector ITQ
900 (Thermo, bẫy ion) Cột phõn tớch TG-5MS, kớch thước 30m x 0,25àm x 0,25mm với khí mang là Heli Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 260 0 C Nhiệt độ Detector là 240 0 C
11 Chương trình nhiệt độ 60 0 C (2 phút), tăng 4 0 C/phút đến 220 0 C, giữ ở nhiệt độ này trong
Việc xác định các thành phần được thực hiện trên cơ sở của các chỉ số RI (Retention Indices), xác định với các đồng đẳng n-alkan (C8-C20), trong cùng một điều kiện sắc ký Đồng thời so sánh với phổ khối lượng tìm kiếm trong thư viện NIST 17, Willey 8 và cơ sở dữ liệu Adam 2017 Tỷ lệ % các thành phần trong tinh dầu được tính toán dựa trên diện tích peak sắc ký và không sử dụng yếu tố điều chỉnh[2], [20]
RTx: Thời gian lưu của chất phân tích
RTn: Thời gian lưu của ankan liền trước pic của chất phân tích
RTn+1: Thời gian lưu của ankan liền sau pic của chất phân tích n: Số nguyên tử carbon của ankan liền trước pic của chất phân tích
2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) của tinh dầu
Bình bát bằng phương pháp vi pha loãng
Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC) của tinh dầu được xác định bằng phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa 96 giếng chủng S aureus (Gram+) theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa kỳ[2], [20]
Tinh dầu được pha trong nước có bổ sung Tween 80 4% Nồng độ tinh dầu ban đầu tính là 1, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ làm việc trong môi trường phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng (1:1) trên đĩa 96 giếng, từ các giếng ở cột 1 lần lượt xuống đến các giếng ở cột 10, để thu được dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân Nồng độ MIC được biểu diễn dưới dạng 1/pha loãng hoặc theo nồng độ (%) Ví dụ 1/1024 tức là MIC ở nồng độ tinh dầu đó pha loãng 1024 lần, tương đương nồng độ khoảng 0,1% hoặc 1ml/L
Hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x10 6 vi khuẩn/ml được bổ sung vào các giếng trong đĩa (trừ các giếng ở cột 12, vai trò chứng âm) Các đĩa được nắp kín, ủ ở 37 0 C trong 20 giờ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật Tất cả các thử nghiệm được thực hiện độc lập ít nhất 2 lần[2], [20]
2.3.4 Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid của cao chiết Bình bát trên đại thực bào phúc mạc
Cao chiết dược liệu được hòa tan trong DMSO với nồng độ gốc 50 mg/mL và bảo quản ở -20 0 C Khi cần ủ với tế bào, cao chiết được pha loãng trông môi trường nuôi cấy đến các nồng độ thích hợp Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10-12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 30 g, khỏe mạnh do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do
Phân lập và nuôi cấy đại thực bào sơ cấp phúc mạc chuột nhắt Để huy động đại thực bào phúc mạc, chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 mL dung dịch thioglycollat 4% Sau 3 ngày, chuột nhắt được giết bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng sử dụng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 mL dung dịch muối cân bằng (HBSS) vào khoang phúc mạc của chuột, sau đó lắc rửa và thu hồi hỗn dịch tế bào vào một ống tube 50 mL trong đá Tiêm HBSS được lặp lại 3 lần và dịch rửa được gom, ly tâm để thu pellet tế bào Tế bào hồng cầu được loại bỏ bằng cách ủ tế bào trong dung dịch ly giải hồng cầu trong 5 phút Sau đó, tế bào được rửa bằng dung dịch PBS sinh lý trước khi được hỗn dịch trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS và 1% penicillin/Streptomycin Đo giải phóng Nitric oxide (NO)
Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào
Sau khi phân lập, tế bào được cấy trong một đĩa nuôi cấy 96 giếng (Corning) thành trong ở mật độ 1×10 5 tế bào/giếng trong môi trường đầy đủ Sau khi ủ 1 giờ trong tủ nuôi cấy, loại bỏ môi trường và rửa tế bào 3 lần với dung dịch PBS để loại bỏ các tế bào không kết dính Sau đó, môi trường mới được thêm và tế bào được tiếp tục ủ qua đêm Vào ngày tiếp theo, tế bào được ủ với môi trường chứa các chất thử ở nồng độ thích hợp trong 2 giờ, sau đó tiếp tục ủ với môi trường chứa LPS 100 ng/mL thêm 24
13 giờ nữa Mụi trường trong mỗi giếng (50 àL) được hỳt chuyển sang một đĩa 96 giếng mới Sau đú, thờm 50 àL dung dịch sulfanilamid và ủ ở nhiệt độ phũng, trong búng tối trong 5 phỳt trước khi thờm 50 àL N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid tới hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 535 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)
Nồng độ NO trong mỗi mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit Tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO của mẫu thử được tính theo công thức:
CLPS: Nồng độ NO của tế bào được xử lý với LPS đơn độc
Cthu: Nồng độ NO của tế bào được xử lý với LPS kết hợp mẫu thử
Hình 1 Đường chuẩn định lượng NO được xây dựng với chất chuẩn natri nitrite
Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Graphpad 8.0.2 sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến
2.3.5 Nghiên cứu docking các thành phần trong tinh dầu và cao chiết Bình bát với các đích tương ứng
Phương pháp docking phân tử được sử dụng để phân tích sự phù hợp và tương tác thuận lợi giữa các hợp chất hoạt động và vị trí liên kết với các đích, chứng minh khả năng tác dụng ức chế của tinh dầu và cao chiết Bình bát đối với S aureus và sự sản sinh Nitric oxid Các đích protein của S Aureus bao gồm Dihydrofolate reductase (PDB: 2W9S, 3SRW), Tyrosyl-tRNA synthetase (PDB: 1JIJ), Dehydrosqualene synthase (PDB: 2ZCQ) và của ức chế sản sinh NO Nitric oxid synthase (PDB: 3E7G) là các đích sử dụng trong phương pháp được tải xuống từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (Protein Data Bank) (https://www.rcsb.org/) Sau đó, các cấu trúc này được chuẩn bị bằng phần mềm MOE (Molecular Operating Environment) bằng cách loại bỏ nước và các phân tử nhỏ, thêm proton, xác định các túi liên kết và thiết lập trường lực Amber99
Các phối tử được sử dụng trong mô hình docking phân tử là các hợp chất hóa học được tìm thấy trong tinh dầu và các hợp chất được tổng quan có trong cao chiết Bình bát Các phối tử được chuẩn bị bằng phần mềm MOE, tối ưu năng lượng với điện tích cục bộ AM1-BCC Mô hình docking phân tử được chạy với 100 cấu hình và 10 cấu hình tốt nhất thể hiện trạng thái năng lượng thấp sẽ được báo cáo Các tương tác trong 10 cấu hình này sau đó được hiển thị và phân tích chi tiết bằng phần mềm Discovery Studio
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả phân tích thành phần tinh dầu
Bằng phương pháp sắc kí khí kết nối khối phổ, có tổng cộng 53 hợp chất đã được xác định trong tinh dầu của Annona glabra L Trong đó, thành phần β-Caryophyllen (26,45%) và β-Guaiene (24,16%) là 2 hợp chất chiếm tỉ lệ phần trăm theo diện tích pic cao nhất trong các tinh dầu thể hiện giá trị hàm lượng của chúng trong tinh dầu Ngoài ra còn có 1 số hợp chất chiếm hàm lượng tương đối trong tinh dầu như α-Pinene (3,13%), β-Myrcene (5,38%), α-Phellandrene (7,28%), Limonene (3,4%), β-trans-Ocimene (5,72%), Alloaromadendrene (2,9%)
Chi tiết về thành phần ở bảng sau:
Bảng 4 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu A.glabra bằng phương pháp GC-MS
STT RT RI RI thư viện Tên hợp chất CTPT
Ghi chú : RT: Thời gian lưu
RI: Chỉ số lưu giữ tính toán trên cột RT-5MS
RI thư viện: Chỉ số lưu giữ tra cứu trên thư viện
Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật
Kết quả kháng khuẩn bằng phương pháp vi pha loãng của tinh dầu A glabra như sau
Bảng 5 Kết quả kháng khuẩn của A glabra bằng phương pháp MIC
Chủng vi sinh vật S Aureus E.coli Nấm Candida
Ghi chú: MIC là nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật
MBC là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc của chuột
Bảng 6 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết A.glabra trên đại thực bào phúc mạc chuột tại các nồng độ khác nhau
95% CI của IC50 (àg/mL) 1,483 ± 4,829
Bảng 7 Kết quả chứng dương (L-NAME) Nồng độ chứng dương
Kết quả docking
3.4.1 Kết quả phương pháp docking phân tử của tinh dầu A.glabra trên các đích protein của S Aureus
Bảng 8 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các thành phần tinh dầu với các đích protein của S Aureus
STT TÊN HỢP CHẤT ĐÍCH PROTEIN
Các hợp chất trong tinh dầu A.glabra đa phần đều có khả năng liên kết tương đối mạnh với 2 phân tử mục tiêu (giá trị năng lượng nằm trong khoảng từ -9,3 đến -5,5 đối với 2w9s và -9,5 đến -5,3 đối với 3srw) Trong đó các chất có khả năng liên kết mạnh nổi bật như: Hanphyllin, Abietadine, GA9Me, α-cadinol, β-caryophyllen, β-Guaiene nhưng ở đây chúng ta chỉ bàn về liên kết giữa β-caryophyllen và β-Guaiene với đích protein 2w9s, 3srw bởi phần trăm hàm lượng của 2 chất này trong tinh dầu A.glabra là lớn nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả kháng S.aureus của tinh dầu
• Vị trí gắn các thành phần hóa học của tinh dầu A.glabra vào protein 2w9s
Hình 2 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 2w9s
Hình 3 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 2w9s
Tương tác Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid LEU28, ILE31, ALA7, ILE5, LEU20, ILE50
Tương tác Pi-Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid PHE92 β-Guaiene
21 Hình 4 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 2w9s
Hình 5 Tương tác 2D của β-Guaiene với 2w9s
Tương tác Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid ILE50, LEU20, ILE14, ILE5, VAL6, ALA7, ILE31
Tương tác Pi-Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid PHE92
• Vị trí gắn các thành phần hóa học của tinh dầu A.glabra vào protein 3srw
Hình 6 Vị trí gắn 3D của β-caryophyllen với 3srw
Hình 7 Tương tác 2D của β-caryophyllen với 3srw
Tương tác Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid ILE15, LEU21,VAL32, LEU6, ILE51
Tương tác Pi-Alkyl giữa β-caryophyllen với aminoacid PHE99, PHE93
Hình 8 Vị trí gắn 3D của β-Guaiene với 3srw
Hình 9 Tương tác 2D của β-Guaiene với 3srw
24 Tương tác Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid LEU6, ALA8, VAL32, LEU21, LEU29, LEU55, ILE51
Tương tác Pi-Alkyl giữa β-Guaiene với aminoacid PHE93
3.4.2 Kết quả phương pháp docking phân tử của cao chiết Annona glabra trên các đích protein ức chế giải phóng khí NO
Bảng 9 Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính toán thông qua mô phỏng lắp ghép của các thành phần cao chiết A.glabra L với đích protein của iNOS
STT Tên Hợp Chất Năng lượng lk(kcal/mol)
22 Chất đối chiếu (Chất ức chế đồng kết tinh) -6.2
• Vị trí gắn các thành phần hóa học của cao chiết A.glabra vào protein 3e7g
25 Hình 10 Vị trí gắn 3D của Rutin với 3e7g
Hình 11 Tương tác 2D của Rutin với 3e7g
Rutin tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau:
Liên kết Pi-Alkyl: với aminoacid CYS200, VAL352, PHE369, TYR489
Liên kết C-H: với aminoacid GLU377
26 Liên kết Hydro: với aminoacid ARG199, TYR491
Liên kết Alkyl: với aminoacid ALA197, MET355
Hình 12 Vị trí gắn 3D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g
Hình 13 Tương tác 2D của Kaempferol 7-neohesperidoside với 3e7g
27 Kaempferol 7-neohesperidoside tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau: Liên kết chồng Pi-Pi: với aminoacid PHE369
Liên kết Pi-Alkyl: với aminoacid ALA197, CYS200
Liên kết Pi-Sulfur: với aminoacid CYS200
Liên kết C-H: với aminoacid CYS200, ASN370, PRO350, GLY371
Liên kết Hydro: với aminoacid CYS200, GLY202
Liên kết Alkyl: với aminoacid PRO350, VAL352
Hình 14 Vị trí gắn 3D của Nicotiflorine với 3e7g
28 Hình 15 Tương tác 2D của Nicotiflorine với 3e7g
Nicotiflorine tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau:
Liên kết Pi-Pi: với aminoacid TRP194, PHE369
Liên kết Pi-Alkyl: với aminoacid ALA197, CYS200, TYR373
Liên kết Pi-Sulfur: với aminoacid CYS200
Liên kết Amid-Pi: với aminoacid ARG199
Liên kết Hydro: với aminoacid ILE201, TRP372, GLU377, TYR373, ASN370 Liên hết C-H: với aminoacid GLU377
Liên kết Alkyl: với aminoacid PRO350 β-sitosteryl-D-glucoside
29 Hình 16 Vị trí gắn 3D của β-sitosteryl-D-glucoside với 3e7g
Hình 17 Tương tác 2D của β-sitosteryl-D-glucoside với 3e7g β-sitosteryl-D-glucoside tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau:
30 Liên kết Hydro: với aminoacid TYR373, GLU377, ASP382
Liên kết C-H: với aminoacid ASP382, GLU377
Liên kết Alkyl: với aminoacid PRO350, CYS200, ALA197
Liên kết Pi-Alkyl: với aminoacid PHE369, TRP194, TYR489
Hình 18 Vị trí gắn 3D của Stigmasteryl-D-glucoside với 3e7g
Hình 19 Tương tác 2D của Stigmasteryl-D-glucoside với 3e7g
31 Stigmasteryl-D-glucosidE tạo với đích protein 3e7g các loại tương tác sau: Liên kết Hydro: với aminoacid GLU377, TYR347, TYR373, ASP382
Liên kết Alkyl: với aminoacid ARG381
Liên kết Pi-alkyl: với aminoacid TRP463, PHE369, TRP194
Liên kết Pi-Sigma: với aminoacid TRP194
1 Kết quả phân tích thành phần tinh dầu
Bằng phương pháp sắc kí khí kết nối khối phổ, có tổng cộng 53 hợp chất đã được xác định trong tinh dầu của bình bát Trong đó các hợp chất có hàm lượng cao ở trong cây bao gồm α-Pinen (3,13%), β-Myrcen (5,38%), α-Phellandren (7,28%), Limonen (3,44%), β-trans-Ocimen (5,72%), β-Caryophyllen
(26,45%), β-Guaien (24,16%) Trong đó β-Caryophyllen và β-Guaien chiếm tỉ lệ cao nhất trong tinh dầu
2 Kết quả đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu
Sau khi thử tác dụng của tinh dầu lên 3 chủng vi sinh vật, ta thấy tinh dầu A.glabra thể hiện tác dụng kháng vi sinh vật trên S Aureus Đặc tính kháng vi sinh vật của tinh dầu này có thể có liên quan đến hàm lượng của các hợp chất monoterpenoid, sesquiterpenoid MIC bằng MBC cho thấy tinh dầu A.glabra không chỉ ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn mà còn có khả năng tiêu diệt chúng
3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của cao chiết dược liệu trên đại thực bào phúc mạc của chuột
Giỏ trị IC50 của cao chiết là 3,202 àg/mL Khoảng tin cậy 95% (1,483 – 4,829 àg/mL) tương đối hẹp, chứng tỏ tớnh ổn định và độ tin cậy cao của giỏ trị IC50 Điều này chỉ ra rằng A.glabra có khả năng ức chế sự tổng hợp và giải phóng NO từ các đại thực bào ở nồng độ thấp, hạn chế nguy cơ gây độc cho tế bào khi sử dụng làm thuốc điều trị
- Docking tinh dầu trên các đích protein của S.aureus
Các hợp chất trong tinh dầu A.glabra đa phần đều có khả năng liên kết tương đối mạnh với 2 phân tử mục tiêu (giá trị năng lượng nằm trong khoảng từ -9,3 đến -5,5 đối với 2w9s và -9,5 đến -5,3 đối với 3srw) Trong đó các chất có khả năng liên kết mạnh nổi bật như: Hanphyllin, Abietadine, GA9Me, α-cadinol, β-
32 caryophyllen, β-Guaiene nhưng ở đây chúng ta chỉ bàn về liên kết giữa β- caryophyllen và β-Guaiene với đích protein 2w9s, 3srw bởi phần trăm hàm lượng của 2 chất này trong tinh dầu A.glabra là lớn nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả kháng S.aureus của tinh dầu
Các liên kết chủ yếu giữa các aminoacid trên các đích protein với β-caryophyllen và β-Guaiene chủ yếu là Alkyl và Pi-Alkyl
- Docking các thành phần được tổng quan của cao chiết trên các đích protein của iNOS
Có tất cả 22 hợp chất trong cây Annona glabra L được tổng quan và mang đi docking với đích protein 3e7g của iNOS Tương tác của các chất Rutin (-9,3 kcal/mol), Kaempferol 7-neohesperidoside (-9,5 kcal/mol), Nicotiflorine (-10,1 kcal/mol), β-sitosteryl-D-glucoside (-10,6 kcal/mol), Stigmasteryl-D-glucoside (-9,9 kcal/mol) là mạnh nhất và mạnh hơn rất đáng kể so với chất đối chiếu (-6,2 kcal/mol) Điều này thể hiện khả năng ức chế giải phóng NO của cao chiết A.glabra là rất đáng mong đợi Ở 22 hợp chất trên thì có rất nhiều loại tương tác khác nhau đối với các aminoacid của protein, điều này cũng lý giải vì sao năng lượng liên kết của các hợp chất trong cao chiết nhỏ hơn rất nhiều so với năng lượng liên kết của các hợp chất trong tinh dầu
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
- Xác định được các hợp chất từ cây Bình bát (Annona glabra L.), một số hợp chất được xác định là có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với S aureus như: Hanphyllin, Abietadiene, GA9Me, α-cadinol, β-caryophyllen, β-Guaiene
- Qua quá trình sàng lọc, nghiên cứu về các hợp chất trong cao chiết lá Bình bát (Annona glabra L.) xác định được một số hợp chất thể hiện khả năng ức chế sản sinh NO rất tốt như: Rutin, Kaempferol 7-neohesperidoside, Nicotiflorine, Stigmasteryl-D-glucoside, β-sitosteryl-D-glucoside Điều này có thể trở thành giải pháp trong việc kiểm soát quá trình sản sinh NO trong cơ thể một cách chủ động Đề xuất
- Tiếp tục sàng lọc 1 số tác dụng sinh học khác và nghiên cứu insilico các hợp chất có trong cây Annona glabra L để tìm kiếm những hoạt chất có tiềm năng
- Phân lập các hợp chất có tiềm năng kể trên để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng
[1] Đỗ Tất Lợi (1962), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Việt
[2] N T Tùng (2024), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng vi sinh vật in vitro của tinh dầu từ thân rễ và lá của loài sa nhân vỏ đỏ (Wurfbainia villosa (Lour.) Škornick & AD Poulsen) định hướng điều trị nhiễm khuẩn.Tạp chí Y học
[3] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, NXB Trẻ, Việt Nam
[4] L E D’Elia Oliveira, C M Dutok-Sánchez, R Balieiro Monteiro, and F A de Medeiros (2022), “Aplicaỗóo de Annona glabra L (Annonaceae) na ỏrea da saỳde, composiỗóo quớmica e atividade biolúgica,” Revista Amazonia Investiga, pp 224–
[5] A C de Q Pinto (2005), Annona species International Centre for Underutilised Crops, University of Southampton
[6] T D Thang, D N Dai, T M Hoi, and I A Ogunwande (2013), “Study on the volatile oil contents of Annona glabra L., Annona squamosa L., Annona muricata
L and Annona reticulata L., from Vietnam,” Nat Prod Res, , pp 1232–1236
[7] S de S L Galvão (2016), “Annona glabra Flavonoids Act As Antimicrobials by Binding to Pseudomonas aeruginosa Cell Walls,” Front Microbiol
[8] R Sinchana, T T Mani, T Pavithra, and L Shiju (2024), “A REVIEW ON A MIRACLE PLANT ANNONA GLABRA LINN,” International Journal of Pharmacognosy, pp 65–77
[9] F Chang, C Chen, T Hsieh, C Cho, and Y Wu (2000), “Chemical Constituents from Annona Glabra III,” Journal of the Chinese Chemical Society, pp 913–920
[10] S.-S Lee, D.-Y Wu, S.-F Tsai, and C.-K Chen (2015), “Anti-Acetylcholinesterase Alkaloids from Annona glabra Leaf,” Nat Prod Commun [11] F.-R Chang, P.-Y Yang, J.-Y Lin, K.-H Lee, and Y.-C Wu (1988), “Bioactive Kaurane Diterpenoids from Annona glabra,” J Nat Prod, pp 437–439
[12] C.-Y Chen, F.-R Chang, C.-P Cho, and Y.-C Wu (2000), “ent -Kaurane Diterpenoids from Annona glabra,” J Nat Prod, pp 1000–1003
[13] H Le Tuan Anh (2014), “ent -Kaurane Diterpenes from Annona glabra and Their Cytotoxic Activities,” Nat Prod Commun
[14] D L Araújo (2021), “Evaluation of the anti-Leishmania mechanisms of Annona glabra L (Annonaceae): A brief review,” Research, Society and Development
[15] A R Amala Dev and S M Joseph (2021), “Anticancer potential of Annona genus: A detailed review,” Journal of the Indian Chemical Society
[16] Dr S K Sivagnanam, M Ram, and M Ram Krishna Rao (2016), “In vitro inhibitory effects of Annona glabra on selected human pathogens,” J Chem Pharm
[17] H Son (2013), “Preparation and Evaluation of Annona glabra L Leaf Extract Contained Alginate Film for Burn Healing,” European J Med Plants, pp 485–
[18] S Panchawat, K Rathore, and S Sisodia (2010), “A review on herbal antioxidants,” Int J Pharmtech Res, pp 232–239
[19] L W CHATROU (2012., “A new subfamilial and tribal classification of the pantropical flowering plant family Annonaceae informed by molecular phylogenetics,” Botanical Journal of the Linnean Society, pp 5–40
[20] Clinical and Laboratory Standards Institute (2018), M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing.
