BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH TẠO VI KÊNH ĐẾN VẬN CHUYỂN MỘT SỐ DƯỢC CHẤT QUA DA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 202
TỔNG QUAN
Tổng quan về vi kim và ảnh hưởng của da đến hấp thu dược chất từ vi kim
1.1.1 Ảnh hưởng của da đến hấp thu dược chất từ vi kim
Da được coi là cơ quan lớn nhất và phức tạp nhất của cơ thể, chiếm khoảng 15% khối lượng cơ thể và có diện tích từ 1,5 đến 2,0 m 2 Rõ ràng, da đóng vai trò là cơ chế bảo vệ tuyến đầu và cơ chế bảo vệ chính chống lại các yếu tố môi trường bất lợi, bao gồm mất nước, vi sinh vật gây bệnh, các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học [46] Da chủ yếu được tạo thành từ ba lớp Lớp trên là biểu bì, lớp dưới biểu bì là hạ bì, lớp thứ ba và sâu nhất là mô dưới da Lớp biểu bì, lớp ngoài cùng của da, cung cấp hàng rào chống thấm nước và góp phần làm đều màu da, chứa lớp sừng và một số lớp khác Lớp hạ bì được tìm thấy bên dưới lớp biểu bì, chứa mô liên kết, nang lông, mạch máu, mạch bạch huyết và tuyến mồ hôi Các mô dưới da sâu hơn được cấu tạo từ mỡ và mô liên kết
Hình 1.1 Cấu trúc da của con người [46]
1.1.1.2 Ảnh hưởng của da đến hấp thu dược chất
Tốc độ thẩm thấu thuốc qua da phụ thuộc vào đặc điểm của da, trong đó lớp sừng là rào cản chính Lớp sừng có cấu trúc "gạch và vữa" với tế bào sừng hóa và ma trận lipid ngoại bào, tạo thành hàng rào bảo vệ da và hạn chế sự hấp thu thuốc Phương pháp vi kim có thể giúp thuốc xâm nhập qua lớp sừng vào lớp biểu bì mà không gây tổn thương mạch máu và dây thần kinh ở lớp hạ bì.
1.1.2 Giới thiệu về vi kim và hệ trị liệu qua da
1.1.2.1 Giới thiệu về hệ trị liệu qua da
Các hệ trị liệu đưa thuốc qua da đem lại nhiều lợi ích hơn so với đường uống như thuốc không phải trải qua quá trình chuyển hóa qua gan, thuốc không bị phá hủy trong đường tiêu hóa, khả năng giảm tần suất sử dụng thuốc, đơn giản trong việc sử dụng thuốc và dừng thuốc (nếu cần), so với đường tiêm thì giảm và tránh được yêu cầu liên quan đến nhân viên y tế [11], [29] Bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em hay người già, thích sử dụng các hệ trị liệu qua da hơn dạng thuốc thông thường vì việc sử dụng thuốc qua da đơn giản, không gây đau, và tiện dụng hơn [3], [49]
Thông thường, các nhà nghiên cứu báo cáo về cơ chế thẩm thấu thuốc qua da theo ba con đường chính: xuyên qua tế bào, giữa các tế bào, qua các tuyến phụ trên da Đối với con đường xuyên qua tế bào, các thuốc sẽ thấm trực tiếp, xuyên qua lớp lipid kép ở biểu bì của da Đây là đường đưa thuốc qua da tối ưu cho các thuốc có tính thân dầu cao Đối với con đường đi giữa các tế bào, thuốc sẽ di chuyển dọc theo vùng lipid liên tục giữa các tế bào keratin của lớp biểu bì da Các chất thân nước, không tích điện, và có khối lượng phân tử thấp được thấy đi qua da theo con đường giữa các tế bào này [23] Ngoài ra, nang lông và tuyến mồ hôi được gọi chung là các tuyến phụ trên da cũng có thể là các con đường thẩm thấu thuốc hiệu quả, đặc biệt là các thuốc có tính phân cực, tích điện, thân nước và có khối lượng phân tử lớn
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hai yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của thuốc qua da: (i) đặc tính của da và (ii) đặc tính hóa lý của thuốc [5] Về đặc tính hóa lý của thuốc, hệ trị liệu qua da chỉ được ứng dụng hiệu quả giới hạn với các thuốc có khối lượng phân tử nhỏ (100–500 Da), hoạt tính cao, và đặc tính thân dầu trung bình (log P trong khoảng 1,0–3,0) do đặc tính thân dầu và cấu trúc chặt chẽ của lớp biểu bì [10], [20] Từ những hạn chế trên, nhiều phương pháp vật lý được sử dụng để tăng cường hiệu quả thẩm thấu của thuốc qua da, nổi bật là vi kim [47]
1.1.2.2 Giới thiệu về vi kim
Gần đây, vi kim nổi lên như một phương pháp vật lý hiệu quả để đưa thuốc qua da Nhiều nghiên cứu từ các trường đại học, viện nghiên cứu, và công ty trên thế giới đã chứng minh hiệu quả của vi kim [27], [37], [38] Vi kim được định nghĩa là những chiếc kim với kớch thước micron (cú chiều dài từ 25 đến 2000 àm) cú thể xuyờn và đi qua các lớp da một cách có kiểm soát để tạo ra các kênh nhỏ trong da, cho phép thuốc thẩm thấu qua da một cách dễ dàng hơn [66] Khái niệm kim với kích thước micron lần đầu xuất hiện trên bằng sáng chế của tác giả Gerstel và Place vào năm 1976 Sau đó bằng sáng chế về vi kim rỗng sử dụng trong việc đưa thuốc qua da được đăng ký vào năm 1996 Vi kim đặc tạo vi kênh làm từ silicon lần đầu được sử dụng để đưa calcein qua da vào năm 1998 Trong năm 2000, các nhà nghiên cứu phát triển vi kim rỗng để tiêm dung dịch thuốc vào da Vi kim bao lần đầu được bào chế vào năm 2004 để tăng sự thẩm thấu của desmopressin qua da Sau đó, vào năm 2006, vi kim hòa tan chứa thuốc được sản xuất để đưa bovine serum albumin và calcein qua da Cuối cùng, vi kim nở được phát triển vào năm 2012 để đưa thuốc phân tử nhỏ và lớn qua da một cách hiệu quả Đã có nhiều bài báo tổng hợp về các khía cạnh khác nhau của vi kim như quá trình sản xuất [19], [62], thiết kế [59], ứng dụng trong việc đưa thuốc, mức độ an toàn [48], các nghiên cứu lâm sàng [19], mô phỏng trên máy tính [64],…
❖ Một số ưu và nhược điểm chung của của vi kim Ưu điểm của vi kim:
So với đường tiêm: Vi kim không chỉ giúp giải quyết các vấn đề gặp phải với kim tiêm truyền thống như vết thương do kim tiêm, chứng sợ kim tiêm, rác thải kim loại và lây nhiễm các bệnh qua đường máu mà còn đem lại hiệu quả giảm liều và đáp ứng miễn dịch mạnh (vắc xin) Ngoài ra, việc sử dụng vi kim không yêu cầu sự giúp đỡ hay can thiệp của nhân viên y tế, từ đó cho phép bệnh nhân tự sử dụng tại nhà [46]
So với thuốc dùng qua đường uống: Dù đường uống rất thuận tiện nhưng hiệu quả phân phối thuốc bị hạn chế do tác dụng chuyển hóa bước một qua gan, vi kim đã giúp cải thiện sinh khả dụng của thuốc bằng cách bỏ qua quá trình chuyển hóa qua gan, và tránh sự phân hủy thuốc bởi enzyme ở hệ tiêu hóa [46]
So với các liệu pháp qua da thông thường, microneedling có khả năng đưa các loại thuốc với bất kỳ kích thước hay khối lượng phân tử nào vào trong da Các vết thương hở tạm thời phục hồi do microneedling gây ra giúp giảm thiểu nguy cơ kích ứng và nhiễm trùng da Có thể điều chỉnh độ dài đầu kim và độ sâu của đường dẫn thuốc để đưa thuốc vào các lớp da mục tiêu Bằng cách thay đổi kích thước, kiểu dáng hoặc vật liệu của đầu kim, có thể tùy chỉnh liệu pháp điều trị theo nhóm đối tượng bệnh nhân cụ thể [46].
Việc sử dụng nguyên liệu an toàn, tương thích sinh học và tự phân hủy giúp hạn chế tối đa nguy cơ xảy ra phản ứng viêm và các vấn đề an toàn về sinh học Bên cạnh đó, sự kết hợp giữa vi kim với các phương pháp vật lý khác mang lại hiệu quả cộng hưởng, làm gia tăng hiệu quả đưa thuốc qua da.
Một số nhược điểm của vi kim đã được ghi nhận:
Vi kim chỉ có thể vận chuyển một lượng thuốc rất hạn chế Hơn nữa, tính đàn hồi của da làm giảm độ đâm sâu của vi kim Các đặc tính của da (độ dày, độ ẩm, tính đàn hồi) gây khó khăn cho việc đạt được một độ sâu của vi kênh nhất quán và có tính lặp lại Ngoài ra, hiện tại còn thiếu các quy định hướng dẫn, thực hành sản xuất tốt, và hệ thống kiểm soát tiêu chuẩn chất lượng cho quy mô sản xuất lớn Sự thiếu hụt vốn đầu tư từ các công ty dược cũng tạo thành một trở ngại đáng kể cho việc phát triển các sản phẩm vi kim [46]
❖ Phân loại vi kim: Hiện nay có năm loại vi kim được sử dụng trong việc đưa thuốc qua da gồm: vi kim đặc tạo vi kênh, vi kim rỗng, vi kim bao, vi kim hòa tan, và vi kim nở (hình 1.2)
Hình 1.2 Quá trình vận chuyển thuốc qua da bằng vi kim: (a) Vi kim đặc cải thiện sự thẩm thấu của thuốc qua da bằng cách tạo ra các vi kênh thân nước tạm thời trên da (b) Thuốc được bao lên bề mặt của vi kim và tan nhanh khi được đưa vào trong da (c)
Vi kim rỗng đâm xuyên vào da, cho phép tiêm dung dịch thuốc vào trong da (d) Sau khi được đưa vào trong da, vi kim hòa tan tan ra trong da và giải phóng thuốc vào trong các lớp da (e) Vi kim nở hấp thụ chất lỏng trong da và nở ra [7]
Vi kim đặc tạo vi kênh
Vi kim đặc tạo vi kênh thường được sử dụng theo quy trình hai bước khi đưa thuốc qua da Trước tiên vi kim đặc được ấn vào da, sau khi rút ra sẽ hình thành các vi kênh tạm thời trên da Sau đó, một công thức bôi da chứa thuốc (gel, kem, mỡ…) hay miếng dán được đưa lên khu vực có các vi kênh để vận chuyển thuốc vào da [43], [44], [45]
Giới thiệu về một số dược chất được ứng dụng trong vi kim dùng qua da
1.2.1 Một số dược chất được ứng dụng phương pháp đưa thuốc qua da bằng cách tạo vi kênh
Việc đưa thuốc vào da để gây ra tác dụng cục bộ hoặc toàn thân là vô cùng khó khăn do đặc tính rào cản cao của lớp sừng Bằng cách vượt qua hàng rào lớp sừng, vi kim đã được chứng minh là làm tăng đáng kể số lượng hợp chất vận chuyển qua da, bao gồm các loại thuốc có khối lượng phân tử thấp, thuốc trị liệu sinh học, vắc xin và các vật liệu khác
❖ Thuốc có khối lượng phân tử thấp: Hầu hết các nghiên cứu về việc cung cấp thuốc khối lượng phân tử thấp đều nhấn mạnh đến việc tạo vi kênh trước bằng vi kim đặc để tăng tính thấm của da Điều này là do liều lượng của hầu hết các loại thuốc chỉ định toàn thân đều quá lớn để có thể phủ lên hoặc gói gọn trong các vi kim khác Có thể cung cấp liều lượng lớn hơn bằng cách tạo vi kênh trên da bằng vi kim và sau đó bôi thuốc trong thời gian dài để thuốc khuếch tán qua các vi kênh [33]
❖ Thuốc sinh học trị liệu: Các chế phẩm sinh học, chẳng hạn như peptid, protein, ADN và ARN, là những phân tử lớn không thể dễ dàng sử dụng bằng đường uống hoặc thẩm thấu qua da và do đó, thông thường hầu như chỉ được tiêm bằng đường tiêm dưới da Vận chuyển thuốc bằng vi kim được hình dung như một giải pháp thay thế cho việc tiêm dưới da, ít đau hơn, an toàn hơn và đơn giản hơn để bệnh nhân tự thực hiện [33] Điển hình là insulin, một trong những nghiên cứu đầu tiên, vi kim đặc tạo vi kênh được ấn vào da chuột mắc bệnh tiểu đường trước khi bôi dung dịch insulin tại chỗ, điều này làm tăng đáng kể lượng insulin cung cấp và giảm mức đường huyết [40]
❖ Vắc xin: Theo nhiều nghiên cứu đã được báo cáo, việc xử lý da bằng vi kim đặc để tạo vi kênh đã được sử dụng để tiêm vắc xin giải độc tố bạch hầu được bổ sung độc tố dịch tả, tạo ra phản ứng miễn dịch tương tự so với tiêm dưới da [17], [18]
1.2.2 Một số dược chất được sử dụng trong nghiên cứu:
Các dược chất dùng qua da thường có đặc điểm là có khối lượng phân tử nhỏ hơn
500 Da và có giá trị log P 1-3 Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành thiết kế mô hình gồm 3 DC với sự khác nhau về khối lượng phân tử (từ nhỏ đến lớn) và log P để đánh giá đươc vai trò của vi kênh trong vận chuyển thuốc qua da Đặc điểm của các được chất được lựa chọn được thể hiện trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Một số DC được khảo sát trong nghiên cứu này
Dược chất Berberin clorid DC A Salmon calcitonin
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng [34] Nhiệt độ nóng chảy của BER là 191 – 192°C [1]
Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi
Bột màu trắng hoặc gần như trắng [15] Độ tan
Dạng muối clorid tan trong nước nóng, tan trong nước theo tỉ lệ 1/400, khó tan trong ethanol, tan trong methanol, rất khó tan trong cloroform, không tan trong ether [34]
1g tan trong khoảng 35 ml nước, 7ml nước sôi, 81 ethanol, 26ml ethanol ở 60°C, không tan trong ether, khó tan trong cloroform
Tan vô hạn trong nước [15]
Dữ liệu ở bảng 1.1 cho thấy log P < 1 của berberin clorid thể hiện tính thân lipid kém Đối với calcitonin, DC có khối lượng phân tử rất lớn (> 500 Da), tan rất tốt trong nước, thân lipid kém, log P < 1 Cả hai dược chất này thể hiện rất rõ là khả năng xuyên thấm qua da kém Ngược lại, DC A cho thấy khả năng xuyên thấm qua da tốt hơn nhiều, tuy khối lượng phân tử lớn hơn 500 Da
❖ Vài nét về salmon calcitonin (Calcitonin cá hồi)
Calcitonin, là một polypeptide tuần hoàn gồm 32 acid amin, được tìm thấy ở lợn và người, thậm chí ở tuyến cuối cánh của chim và cá Trong đó, calcitonin cá hồi (sCT) được ưu tiên sử dụng vì hiệu lực cao hơn so với các nguồn khác [58]
Hình 1.5 Công thức hóa học của Salmon calcitonin
L-cysteinyl-L-seryl-L-asparagyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-cysteinyl-L-valyl- L-leucyl-glycyl-L-lysyl-L-leucyl-L-seryl-L-glutaminyl-L-alphaglutamyl-L-leucyl-L- histidyl -L-lysyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-threonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-arginyl-L- threonyl-L-asparagyl-L-threonyl-glycyl-L-seryl-glycyl-L-threonyl-L-prolinamide (1-
• Tác dụng dược lý và chỉ định
Tác dụng dược lý: Calcitonin ức chế quá trình hấp thụ xương bởi các tế bào tái tạo xương (osteoclasts) và thúc đẩy quá trình hình thành xương Điều này dẫn tới sự tăng lượng xương và giảm nồng độ canxi trong máu Thuốc này cũng thúc đẩy sự bài tiết của các ion như canxi, natri, magie và kali trong thận bằng cách giảm quá trình tái hấp thụ ống thận [41]
Chỉ định: Hiện nay, FDA đã phê duyệt sử dụng calcitonin để kiểm soát bệnh loãng xương sau mãn kinh, bệnh xương Paget và tăng canxi máu [41]
• Một số dạng bào chế trên thị trường
Thuốc tiêm đem lại ưu điểm về chi phí thấp, liều lượng chính xác và tỷ lệ hấp thu cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của hình thức thuốc này là gây buồn nôn, đỏ mặt do nồng độ trong máu tăng nhanh Ngoài ra, tiêm bắp còn tiềm ẩn nguy cơ nhiễm trùng tại chỗ tiêm, đau do kim tiêm và giảm sự tuân thủ của bệnh nhân.
Xịt mũi: Tránh được những hạn chế của đường tiêm nhưng khi sử dụng ở dạng xịt mũi thì sinh khả dụng rất thấp và gây kích ứng niêm mạc mũi cùng các tác dụng phụ như viêm mũi, chảy nước mũi và viêm mũi dị ứng
Do đó, việc sử dụng sCT qua da được nghiên cứu và phát triển để thay thế cho dạng tiêm và xịt mũi [13] Tuy nhiên, lớp sừng, lớp ngoài cùng của da tạo ra rào cản lớn cho việc thẩm thấu thuốc, đường dùng này chỉ phù hợp với các thuốc có độ thân dầu vừa phải, khối lượng phân tử thấp, và hoạt tính cao [51] Vì calcitonin là phân tử thân nước và có khối lượng phân tử lớn, thuốc này sẽ khó thấm vào da một cách thụ động Việc ứng dụng quá trình tạo vi kênh trong nghiên cứu hệ đưa calcitonin qua da là đề tài đang rất được quan tâm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Bảng 2.1 Các nguyên liệu dùng trong thực nghiệm
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Salmon Calcitonin BCN peptides TCCS
2 Berberin clorid Việt Nam DĐVN V
3 Dược chất A Việt Nam DĐVN V
4 ACN Merck – Đức Dùng cho HPLC
8 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc TKHH
9 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TKHH
10 Natri clorid Việt Nam DĐVN
11 Methanol Merck – Đức Dùng cho HPLC
13 Acid phosphoric 85% Merck – Đức Dùng cho HPLC
14 Acic citric monohydrat Việt Nam DĐVN V
15 Natri citrat Việt Nam DĐVN V
16 Nước cất Việt Nam TCCS
17 Nước tinh khiết Việt Nam TCCS
18 TFA Mỹ Dùng cho HPLC
20 Vi kim đặc Dr Pen ™ Ultima A1-W với đầu 36, 12 kim USA
Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong thực nghiệm
STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Máy khuấy từ IKA Labortechnik Đức
2 Cân phân tích Mettler Toledo ME204E Thụy Sỹ
3 Cân kỹ thuật Sartorius Đức
4 Máy ly tâm lạnh HEMLEE Labortechnik GmbH
5 Máy đo pH Metler Telodo FE 20 Kit Trung Quốc
6 Tủ lạnh sâu Unicryo Mỹ
8 Hệ thống HPLC – DAD Shimadzu LC – 40D XR Nhật Bản
9 Kính hiển vi quang học Nikon eclipse Ci-L Nhật Bản
10 Cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 àm) Nhật Bản
11 Máy thử giải phóng qua màng Hanson Research Ấn Độ
12 Máy siêu âm WiseClean WUC–A06H Hàn Quốc
13 Máy đo độ mất nước qua da Dermalab Combo Cortex Technology
14 Các thiết bị thí nghiệm khác (cốc có mỏ, pipet, bình định mức…)
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xác định một số đặc điểm của vi kênh tạo ra
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tạo vi kênh đến vận chuyển của một số dược chất qua da
2.2.3 Bước đầu bào chế công thức kết hợp với quá trình tạo vi kênh nhằm tăng cường hiệu quả hệ vận chuyển calcitonin qua da
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu các đặc tính của vi kim đặc tạo vi kênh
2.3.1.1 Xác định hình thái của vi kim đặc tạo vi kênh
Quan sát hình dạng và chụp lại hình ảnh vi kim bằng kính hiển vi quang học Nikon eclipse Ci-L (Nhật Bản)
2.3.1.2 Xác định tính đồng nhất cơ học của vi kim Để đánh giá khả năng đâm xuyên qua da của vi kim, chúng tôi đã sử dụng parafilm làm mô hình để mô phỏng da người Parafilm đã được đề xuất như một mô hình mô phỏng các đặc tính cơ học của da lợn, có đặc tính rào cản tương tự như da người [2] Độ dày trung bình của một lớp parafilm là 0,11 ± 0,00 mm (n=4), các lớp parafilm được xếp chồng lên nhau (số lớp parafilm tùy thuộc vào chiều dài kim và độ dày mỗi lớp parafilm), sau đó, ấn vi kim lên với thông số phù hợp (chiều dài kim, số kim, thời gian) [43] Tiếp đến, nhấc vi kim ra và chụp lại hình ảnh vi kênh trên các lớp parafilm Tiến hành xác định diện tích trung bình của 10 vi kênh được chọn ngẫu nhiên ở lớp parafilm đầu tiên bằng phần mềm ImageJ Từ độ lệch chuẩn tối thiểu của diện tích bề mặt trung bình sẽ chứng minh tính đồng nhất cơ học của vi kim Hơn nữa, số lượng vi kênh xuất hiện trong lớp parafilm cuối cùng chỉ ra tính đồng nhất của chiều dài kim [43]
2.3.2 Nghiên cứu các đặc tính của vi kênh được tạo ra từ vi kim
2.3.2.1 Xác định chiều sâu của vi kênh tạo ra trên mô hình parafilm
Thực hiện tương tự 2.3.1.2, chiều sâu của vi kênh được xác định bằng công thức:
L: chiều sâu của vi kênh (mm) n: số lớp parafilm kim xuyên qua
M: bề dày trung bình của một lớp parafilm (mm)
2.3.2.2 Xác định đặc tính của vi kênh tạo ra trên mô hình da tai lợn a) Da tai lợn được loại bỏ lông, các mẫu da sau đó được đặt phẳng trên một tấm xốp và vị trí mong muốn được kéo căng bằng các ngón tay trước khi đưa vi kim vào để khắc phục tính chất đàn hồi vốn có của da, điều này có thể cản trở sự xâm nhập thành công của vi kim và cũng sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ sâu mà vi kim có thể đạt tới trong da Thuốc nhuộm xanh methylen 1% sau đó được nhuộm lên vị trí vi kênh tạo ra trong
Sau khi ủ tế bào gốc trong 1 phút, vùng da được làm sạch bằng cồn và bông Tiếp đó, chụp ảnh để xác định số lượng vi kênh hình thành trên da tai lợn Sử dụng phần mềm ImageJ, khoảng cách giữa các vi kênh và mật độ số vi kênh trên 1 cm2 được xác định từ hình ảnh thu được.
2.3.2.3 Xác định khả năng xâm lấn tế bào của vi kim
Một mảnh da tai lợn nhỏ (1×1 cm 2 ) được chèn vi kim, nhuộm bằng dung dịch xanh metylen 1%, được làm sạch bằng bông và gạc tẩm cồn sau 1 phút và để đông lạnh ở nhiệt độ tối ưu (-80°C) [45] Sau đó, dùng dao cắt dọc miếng da theo chiều dọc các vi kênh để làm thành tiêu bản và đem soi dưới kính hiển vi quang học
2.3.2.4 Xác định chiều sâu của vi kênh trên da lợn
Từ hình ảnh thu được ở 2.3.2.3, tiến hành đo chiều sâu các vi kênh bằng phần mềm ImageJ (n=4)
2.3.2.5 Phương pháp đánh giá tính toàn vẹn của da thông qua đo lượng nước mất qua da
Tính toàn vẹn và độ ẩm của da tai lợn trước và sau khi xử lý bằng vi kim được đánh giá nhanh chóng và không xâm lấn bằng phép đo giá trị mất nước qua da (TEWL) với thiết bị Dermalab Combo (thiết bị hoạt động theo nguyên lý đo sự mất nước qua da bằng cách so sánh độ ẩm của không khí xung quanh và không khí ngay trên bề mặt da) Đầu tiên, đầu dò được giữ trên mẫu da không được xử lý bằng vi kim trong 13 giây và ghi lại giá trị TEWL (n=4) hiển thị trên màn hình Tiếp theo, vị trí da đó được xử lý bằng vi kim và tiến hành xác định chỉ số TEWL [30], [45]
Hình 2.1 Hình ảnh mô phỏng nguyên lý đo độ mất nước qua da bằng thiết bị
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tạo vi kênh đến vận chuyển một số dược chất qua da
2.3.3.1 Phương pháp định lượng dược chất a) Định lượng sCT
Theo tài liệu tham khảo [12], khảo sát sơ bộ với điều kiện thực nghiệm, lựa chọn phương pháp định lượng sCT trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký:
• Cột sắc ký: InertSustain C18 250 x 4,6 mm, kớch thước hạt nhồi 5 àm
• Pha động: H2O : ACN (65:35, tt/tt), chứa 0,1% (tt/tt) trifluoroacetic acid
• Tốc độ dòng: 1 ml/phút
• Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl
• Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg nguyên liệu sCT, cho vào bình định mức 10 ml Thêm khoảng 7 ml đệm citrat pH 3,5, lắc kỹ trong 10 phút, cho tan hết Bổ sung đệm citrat pH 3,5 vừa đủ thể tích, lắc đều Từ chuẩn gốc này (nồng độ chớnh xỏc khoảng 1000 àg/ml), pha loóng bằng pha động thành cỏc dung dịch chuẩn cú nồng độ 5; 10; 20; 40; 80; 100 àg/ml, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc kớch thước lỗ lọc 0,45 àm Dịch lọc được tiờm sắc ký để xỏc định nồng độ sCT trong dung dịch chuẩn
• Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g dạng bào chế vào bình định mức 10 ml Thêm khoảng 3 ml pha động, lắc kỹ, đậy nắp và siêu âm trong 10 phút Bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động Tiếp tục pha loãng bằng pha động đến dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tớnh Lọc qua màng lọc 0,45 àm, thu được mẫu thử b) Định lượng DC A
Khảo sát sơ bộ với điều kiện thực nghiệm, lựa chọn phương pháp định lượng DC
A trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký:
• Cột sắc ký: InertSustain C18 250 x 4,6 mm, kớch thước hạt nhồi 5 àm
• Pha động: MeOH : KH2PO4 0,01M pH 2,5 (73:27, tt/tt),
• Tốc độ dòng: 1 ml/phút
• Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl
• Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg nguyên liệu A, cho vào bình định mức
25 ml Thêm khoảng 10 ml EtOH 50%, lắc kỹ, đậy nắp và siêu âm trong 10 phút cho tan hết Bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động, lắc đều Từ chuẩn gốc này (nồng độ chớnh xỏc khoảng 1000 àg/ml), pha loóng bằng pha động thành cỏc dung dịch chuẩn cú nồng độ 5; 10; 50; 100; 150; 200 àg/ml, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc kớch thước lỗ lọc 0,45 àm Dịch lọc được tiờm sắc ký để xỏc định nồng độ A trong dung dịch chuẩn
• Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g dạng bào chế DC A vào bình định mức 10 ml Thêm khoảng 3 ml EtOH 50%, lắc kỹ, đậy nắp và siêu âm trong 10 phút Bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động Tiếp tục pha loãng bằng pha động đến dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tớnh Lọc qua màng lọc 0,45 àm thu được dung dịch mẫu thử c) Định lượng berberin clorid
Qua tham khảo Dược điển Việt Nam V [1] và khảo sát sơ bộ với điều kiện sắc ký thực tế, lựa chọn phương pháp định lượng BER bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
• Cột sắc ký: Cột InertSustain C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, GL Sciences, NhậtBản)
• Detector UV ở bước sóng 345 nm
• Pha động: 3,4 g Kali dihydrophosphat và 1,7 g natri lauryl sulfat trong 1000 mL hỗn hợp Acetonitril – Nước (1:1)
• Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút
• Mẫu BER nguyên liệu (mẫu chuẩn)
Cân chính xác khoảng 10,0 mg BER nguyên liệu vào bình định mức 50 ml, thêm
20 ml methanol, siêu âm cho tan hết, bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động Từ dung dịch chuẩn này, pha loãng bằng pha động thành các dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 2,0 đến 100,0 μg/ml, lọc dung dịch qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm
Cân chính xác khoảng 0,1 g dạng bào chế BER vào bình định mức 10 ml, thêm 3 ml methanol, siêu âm trong 20 phút Làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng, bổ sung pha động vừa đủ, lắc đều Từ nồng độ này, pha loãng đến nồng độ trong khoảng tuyến tính (từ 2,0 đến 100,0 μg/ml) bằng pha động Lọc dung dịch qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm
2.3.3.2 Phương pháp bào chế Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình tạo vi kênh đến vận chuyển một số DC qua da, tiến hành bào chế các công thức dung dịch với 3 dược chất có thành phần như bảng 2.3
Bảng 2.3 Công thức khảo sát ảnh hưởng của quá trình tạo vi kênh đến vận chuyển một số DC qua da
*Chú thích: đơn vị: % (kl/kl)
- Cân các thành phần có trong bảng 2.3
- Phối hợp DC vào nước tinh khiết hoặc đệm citrat pH 3,5
- Thêm tween 80 vào dung dịch bên trên (với H1, trước khi thêm tween 80 thì bổ sung trehalose với khối lượng như trên bảng)
2.3.3.3 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua da
Lượng dược chất giải phóng qua da và lưu trữ trong da sau 24 giờ được đánh giá trên da lưng chuột nhắt Thiết kế thí nghiệm nhằm so sánh khả năng giải phóng dược chất qua da và lưu trữ trong da sau 24 giờ giữa các nhóm: Nhóm đối chứng (nhóm không tạo vi kênh trên da bằng vi kim), nhóm tạo vi kênh trên da bằng vi kim
Qua tài liệu tham khảo [43], [45], lượng DC thấm qua màng được tiến hành ở các điều kiện cụ thể: Điều kiện thử:
Thiết bị: Hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả khảo sát phương pháp định lượng DC
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ như đã mô tả ở mục 2.3.3.1 Tiến hành định lượng dãy dung dịch chuẩn trên bằng phương pháp HPLC Kết quả được trình bày trong hình 3.1 và 3.2
Hệ số hồi quy tuyến tính thu được R 2 đều lớn hơn 0,999 chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Do đó, phương pháp HPLC theo những điều kiện trên được sử dụng để định lượng DC trong các mẫu thử.
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về vi kim đặc đến quá trình tạo vi kênh
3.2.1 Lựa chọn các biến đầu ra
Nhận thấy chiều sâu của vi kênh và số lượng vi kênh tạo ra có thể ảnh hưởng đến khả năng giải phóng DC qua da nên lựa chọn 2 biến đầu ra gồm: độ sâu vi kênh trên parafilm (Y1) và số vi kênh tạo ra trên da lợn (Y2) (bảng 3.1)
Bảng 3.1 Biến đầu ra được lựa chọn
STT Biến đầu ra Ký hiệu Đơn vị
1 Chiều sâu của vi kênh trên parafilm Y1 mm
2 Số vi kênh tạo ra trên da tai lợn Y2 Vi kênh y = 28321x - 80856 R² = 0.9998
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tích pic và nồng độ sCT
3.2.2 Các biến đầu vào và khoảng biến thiên
Nhận thấy chiều sâu của vi kênh và số lượng vi kênh tạo ra có thể bị ảnh hưởng bởi các biến đầu vào bao gồm chiều dài kim (X1), thời gian tác dụng (X2), số lượng kim (X3) Tiến hành khảo sát các biến đầu vào và các khoảng biến thiên tương ứng được thể hiện trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Các biến đầu vào và khoảng biến thiên
STT Biến đầu vào Ký hiệu Đơn vị Khoảng biến thiên
Sử dụng phần mềm JMP Pro 17.0 đề xuất thiết kế 20 thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm theo quy trình mô tả ở mục 2.3.2.1 và 2.3.2.2a thu được kết quả như bảng 3.3
Bảng 3.3 Thiết kế thí nghiệm và giá trị của biến đầu ra
Biến đầu vào Biến đầu ra
3.2.4 Phân tích ảnh hưởng của biến đầu vào tới các biến đầu ra
Sau khi tiến hành thí nghiệm và phân tích kết quả, xây dựng được các phương trình hồi quy mô tả mối quan hệ giữa từng biến đầu ra và 3 biến đầu vào Kết quả đánh giá các phương trình hồi quy được tóm tắt ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả các phương trình hồi quy thu được
Biến đầu ra Y1 (chiều sâu vi kênh trên parafilm)
Y2 (số lượng vi kênh trên da tai lợn) p-mô hình