TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Sakhan
1.1.1 Tổng quan về thực vật học
Tên khoa học: Piper wallichii (Miq.) Hand.-Hazz (tên khoa học khác là Piper aurantiacum, Piper accrescens, Piper flaviflorum, Piper henryei) [38]
Theo hệ thống phân loại, Sakhan có khóa phân loại như sau [13], [7], [35] : Giới Thực vật (Plantae)
Loài Piper wallichii (Miq.) Hand.-Hazz
1.1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái
Sakhan là cây thân leo lâu năm, phần gốc mọc bò Thân cành mang hoa, thẳng đứng to và nhẵn, có thể cao từ 2 - 4 m Lá Sakhan mọc so le, cuống lá dài từ 3 - 7cm Phiến lá có hình dạng và kích thước khác nhau, đa số hình trứng thuôn, dài Gốc hình tim hơi lệch, đầu lá nhọn, mặt trên và mặt dưới nhẵn Lá có 9 gân Hoa đơn tính, mọc thành từng cụm Cụm hoa đực dài khoảng 5-8 cm, cuống dài 0,5 - 0,8 cm, lá bắc tròn, có 4 nhị Cụm quả dài 2-18 cm, quả hạch hình cầu đường kính 0,3 - 0,6 cm, xếp lỏng lẻo trên trục, khi chính có màu đỏ, cuống quả dài 0,5 - 0,6 cm Ra hoa quả quanh năm [23]
Ghi chú: (1) Lá và thân cây; (2) Hoa đực; (3) Hoa cái; (4) Quả
Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của loài Piper wallichii [22]
1.1.1.3 Đặc điểm phân bố, sinh thái, thu hái và chế biến
Sakhan chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Á gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan và Lào Ở Lào, cây thường mọc phổ biến ở một số tỉnh miền núi phía Bắc như Luangphabang, Xiengkhouang và Xayaboury [39] Sakhan là loại cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc rải rác, đôi khi tạo thành từng đám dưới tán rừng núi ở hai bên bờ khe suối và ven rừng núi đá vôi ẩm [23], [39]
Bộ phận dùng là thân cây, thu hái quanh năm Thân cây rửa sạch, cắt nhỏ có thể sử dụng tươi hoặc phơi khô [23], [39]
1.1.2 Tổng quan về thành phần hóa học
Tính đến năm 2021, đã hơn 60 hợp chất được phân lập từ Piper wallichii bao gồm
18 alcaloid, 28 lignan, 3 flavonoid, 9 phenolic, 4 terpenoid và 15 chất là thành phần khác (steroid, piperolid, arylakanon và phenylpropanoid) Trong đó alcaloid, lignan, tinh dầu là những hợp chất chính và mang lại tác dụng sinh học chính cho cây
Thân và quả của loài Piper wallichii là bộ phận có hàm lượng alcaloid cao hơn bộ phận khác, trong đó hợp chất piperin là alcaloid chính trong cây [14] Alcaloid là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học chính trong chi Hồ tiêu (Piper L.) và được chú ý nghiên cứu nhiều, cho đến nay nhiều nghiên cứu cho thấy loài Piper wallichii có chứa nhiều nhóm hợp chất alcaloid có cấu trúc khác nhau như 1 alcaloid có khung piperidin (piperin (1)), 8 alcaloid có cấu trúc không có dị vòng nitơ (N-isobutyl-deca- trans-2-trans-4-dienamid (2); piperlonguminin (3); pellitorin (4); N-isobutyl-2E,4E- octa-decadienamid (5); guineensin (6); N-trans-feruloyltyramin (7); Paprazin (8)), 9 alcaloid có khung piperolactam (piperolactam A (9); piperolactam B (10); piperolactam
D (11); aristololactam A IIIa (12); aristolactam BII (13); stigmalactam (14); goniothalactam (15)), 1 alcaloid có khung aporphin (piwallidion (16)), 1 alcaloid có khung isoquinolin (cepharadion A (17)) và 1 alcaloid có khung diketopiperazin (neoechinulin A (18)), các hợp chất alcaloid phân lập được đều có những tác dụng sinh học in vitro và cả in vivo [21], [24], [36], [37] Những hợp chất này khá đa dạng về cấu tạo, trong đó, số lượng hợp chất trong công thức cấu tạo có 1 nguyên tử nitơ có 17 hợp chất và có 3 nguyên tử nitơ có 1 hợp chất mà được gặp trong loài Piper wallichii Một sốcác hợp chất alcaloid đã phân lập được được trình bày trong bảng 1.1
Hình 1.2 Một số nhóm thế trên alcaloid
Bảng 1.1 Một số cấu trúc alcaloid đáng chú ý trong Piper wallichii [20], [23], [35]
Khung hợp chất Tên hợp chất R 1 R 2 R 3 R 4
Piperolactam A H OH OCH3 H Piperolactam B OCH3 OCH3 OH H Aristolactam BII H OCH3 OCH3 H Goniothalactam H OCH3 OCH3 OH
Khung không có dị vòng nitrơ
Hiện tại đã phân lập được 28 lignan bao gồm các nhóm tetrahydrofuran, furofuran, aryltetralin, neolignan và lignamid Lignan cũng là một trong những hợp chất chính của
Piper wallichii và gần đây, nhiều nhà nghiên cứu đã đề nghị nên đưa nhóm hợp chất lignan trở thành một trong những chỉ tiêu chất lượng của các loài trong chi Piper L [11] Cấu trúc các lignan phân lập được từ chi Piper L thường được tạo nên bởi 2 đơn vị phenylpropan có cấu tạo C6-C3 và liên kết với nhau ở vị trí cacbon β - β’ của chuỗi bên Cấu tạo của nhóm hợp chất lignan khá đa dạng, giữa các chất có sự khác nhau về loại, số lượng và vị trí nhóm thế ở hai nhân thơm Nhóm thế ở nhân thơm thường gặp gồm: OH, OCH3, OCH2O hoặc các phân tử đường Bên cạnh đó, sự kết hợp giữa hai chuỗi bên của hai đơn vị cấu tạo nên hợp chất lignan cũng khá phong phú và tạo thành các dạng mạch thẳng, vòng cyclobutan, một hoặc hai dị vòng tetrahydrofuran…[11] Tetrahydrofuran :
Các nhà khoa học đã phân lập được 4 tetrahydrofuran lignan từ thân Piper wallichii bao gồm: galbelgin (19) [8], prestegan B (20), (–)-olivil (21) và neoolivil (22)
Trong nghiên cứu của Shi với cộng sự (2015) đã phân lập được 9 hợp chất furofuran lignan từ loài Piper wallichii bao gồm: syringaresinol (23), medioresinol (24), epipinoresinol (25), 3',5'-dimethoxybiphenyl-3,4'-diol (26), lirioresinol A (27), pinoresinol (28), prinsepiol (29), epilyoniresinol (30) và isolariciresinol (31) [32] Aryltetralin :
2 hợp chất lignan có khung aryltetralin đã được phân lập và được xác định cấu trúc từ thân của loài cây này đó là hợp chất (+)-lyonisid (32), isolariciresinol (33) và (-) -nudiposid (34) [32]
Neolignan được tạo nên bởi 2 đơn vị phenylpropan có cấu tạo C6-C3 giống như lignan nhưng được cầu nối với nhau không phải tại vị trí cacbon β - β’ Neolignin được báo cáo có trong lá và thân của loài Piper wallichii bao gồm kadsurenon (35), denudatin
B (36), hancinon D (37), (+)-licarin A (38), wallichinin (39), hancinon C (40), hancinon
B (41), (+)-burchellin (42), piperwalliol A (43), rosalaevin B (44), 9- hydroxyeriobofuran (45) và evofolin B (46) [8], [12], [31], [32]
Bảng 1.2 Một số cấu trúc lignan đáng chú ý trong Piper wallichii
Khung hợp chất Tên hợp chất R 1 R 2 R 3 R 4
Galbelgin CH3 CH3 CH3 CH3
Neoolivil H CH3 CH2OH CH2OH
Prestegan B OH OH OCH3 OCH3
Epilyoniresinol OH OH OCH3 OCH3
Ngoài ra, nhà nghiên cứu Wang và cộng sự (2014) đã phân lập một số hợp chất thuộc nhóm lignanamid từ bộ phận thân của loài Piper wallichii bao gồm: dicarboxamid (47), hancamid A (48), hancamid B (49) [20] Lignanamid là một nhóm hợp chất rất hiếm gặp, là hợp chất vừa có cấu trúc lignan vừa có cấu trúc alcaloid (có liên kết ít nhất một monomer với nhóm amid) Tính đến năm 2020, đã phân lập được khoảng 86
8 lignanamid từ 26 loài thực vật và được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đang quan tâm nghiên cứu [29]
Bảng 1.3 Một số cấu trúc lignamid đáng chú ý trong Piper wallichii
Một số hợp chất khác cũng được phân lập từ Piper wallichii như flavonoid ((-)- epicatechin (50); (-)-taxifolin (51)), các triterpenoid (2-oxo-3b,19a,23-trihydroxyl-12- en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester (52); arjunoglucosid II (53); 2a,3b,19a- trihydroxyl-12-en-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranosid (54); nigaichigosid F1(55)), sterol (Sitosterol (56)), phenolic (piperwalliosid A (57); piperwalliosid B (58); piperwalliosid C (59); piperwalliosid D (60); ) [18]
1.1.3.1 Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase
Nghiên cứu của Wang P và cộng sự cho thấy cao chiết MeOH của thân loài Piper wallichii thể hiện hoạt tớnh ức chế AChE in vitro với giỏ trị IC50 là 28,57 àg/mL [36] Trong một nghiên cứu khác, tác giả Zhao G và cộng sự đã xác định được cao chiết EtOH 96% của thõn loài Piper wallichii ức chế AChE với IC50 là 12,27 àg/mL [20] Trong nghiên cứu Feng D và cộng sự đã đánh giá tác dụng cao chiết EtOH 96% từ thân của Piper wallichii trên tốc độ thoái hóa thần kinh trong giai đoạn đầu mắc
Alzheimer trên loài giun Caenorhabditis elegan in vivo, kết quả cho thấy cao chiết EtOH thể hiện tác dụng chống Alzheimer bằng cách cải thiện tốc độ bơm và làm chậm tốc độ thoái hóa thần kinh [38]
Những công bố về hoạt tính ức chế AChE in vitro và tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo của các chất phân lập được từ Piper wallichii còn khá hạn chế trước đây chủ yếu đề cập đến tác dụng này của piperin, piperin có tác dụng ức chế AChE ở hồi hải mã và tác dụng cải thiện trí nhớ trên động vật thực nghiệm thông qua thử nghiệm với mô hình mê lộ nước Morris Những năm gần đây, có nghiên cứu phân lập được 15 hợp chất từ
Hancamid A OCH3 OH OH Hancamid B OCH3 OH OCH3
9 dịch chiết MeOH của bộ phần thân Piper wallichii bằng phương pháp phân lập ngẫu nhiên và đã đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro, kết quả đánh giá cho thấy chỉ có một số hợp chất như dicarboxamid, goniothalactam và aristololactam A IIIa thể hiện tác dụng ức chế trên AChE, nhưng có tác dụng yếu[13], [36]
1.1.3.2 Tác dụng sinh học khác
Ngoài những họat tính sinh học trên, Piper wallichii cũng đã được chứng minh có tác dụng kháng virus sốt xuất huyết, tác dụng kháng ung thư, kháng viêm,
Các phương pháp chiết xuất phân lập
1.2.1 Các phương pháp chiết xuất
Các phương pháp chiết xuất dược liệu như chiết lạnh, chiết nóng, đun hồi lưu, chiết siêu âm…với dung môi như EtOH, MeOH, nước, … [8], [24], [32] Đối với dược liệu Sakhan lần đầu tiên, Han G Q và cộng sự (1989) đã chiết xuất dược liệu này bằng MeOH với phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng [12] Những công trình gần đây được các tác giả thực hiện chiết xuất bằng EtOH có nồng độ khác nhau, có hoặc không có sử dụng nhiệt độ Nhìn chung các nghiên cứu trước đây chiết xuất Piper wallichii bằng những dung môi thông dụng, đa năng, dễ bay hơi như MeOH, EtOH độ cồn khác
10 nhau với phương pháp chiết xuất đơn giản như chiết ở nhiệt độ phòng, chiết nóng hay đun hồi lưu, … (Bảng 1.4.)
1.2.2 Các phương pháp phân lập, tinh chế
Sau khi chiết xuất dược liệu thu được cao toàn phần, tiếp theo tiến hành các phương pháp phân lập tinh chế đã được sử dụng như chiết lỏng - lỏng, sắc ký cột cổ điển, sắc ký cột pha đảo, sắc ký với pha tĩnh là hạt sephadex LH-20, HPLC điều chế… để thu được các phân đoạn tinh sạch hơn [32] Đối với dược liệu Sakhan chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là xu hướng thực hiện phân lập các hợp chất trong dược liệu Sakhan được nhiều tác giả thực hiện trong nghiên cứu của mình Các dung môi như ester dầu hỏa, dichloromethan, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol,
MeOH và nước được sử dụng trong phương pháp chiết lỏng - lỏng Sau đó các dịch chiết này được cô đặc thành cao và được lựa chọn để thực hiện các phương pháp tinh chế khác Các cao phân đoạn này được tinh chế qua sắc ký cột pha thuận với một số dung môi như CH3Cl – MeOH, CH2Cl2 – MeOH, ester dầu hỏa – aceton, n-hexan – EtOAc,
CH2Cl2 – aceton hoặc sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi như MeOH - nước, aceton - nước… Đặc biệt Wei A và cộng sự (2011) đã tiến hành sàng lọc các phân đoạn dựa trên tác dụng kháng tế bào u của các cao phân đoạn để tiếp tục tinh chế trên sắc ký cột [37] Năm 2015, Yan và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC điều chế đã thu được 24 hợp chất tinh khiết [32] Năm 2021, Chalini N và cộng sự đã phân lập được một số hợp chất mới chưa từng được công bố trước đây là piperwalliol A, piperwalliosid A-D, Piwalkanon, Piwallidion bằng phương pháp HPLC điều chế [24]
1.2.3 Các phương pháp đánh giá hợp chất phân lập được
1.2.3.1 Đánh giá độ tinh khiết hợp chất phân lập được
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng : hợp chất phân lập được đánh giá trên bản sắc ký lớp mỏng khai triển bằng 3 hệ dung môi pha động có độ phân cực khác nhau, phát hiện các vết bằng đèn UV, sử dụng thuốc thử chung hay thuốc thử đặc hiệu
Kiểm tra bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): hợp chất phân lập được đánh giá trên HPLC phân tích bằng chương trình sắc ký phù hợp
1.2.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập
Dùng các kỹ thuật phổ nghiệm như IR, UV, MS, NMR để xác định cấu trúc hóa học phẳng và không gian trong một số trường hợp đã được các tác giả sử dụng để xác định cấu trúc các chất phân lập được.
Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ cây Sakhan Piper wallichii
STT Năm Tác giả Nội dung Đối tượng Tóm tắt phương pháp chiết xuất, phân lập
1 1989 Yan Ni Shi và cộng sự [12]
Bột của phần trên mặt đất loài Piper wallichii
Chiết bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, dịch chiết MeOH cô thành cao, sau đó chiết phân bố với các dung môi và cất thu hồi dung môi thu được cao CH2Cl2 và cao EtOAc Cao EtOAc được tách và tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH được 5 phân đoạn, phân đoạn 4 được tiếp tục phân lập tiếp trên sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi MeOH : nước thu được
Bột của phần trên mặt đất loài Piper wallichii (4kg)
Chiết 3 lần với EtOH 96% bằng phương pháp chiết siêu âm, cô cạn thành cao, sau đó cao được phân tán với nước, chiết lỏng - lỏng với dung môi n-hexan,
EtOAc, n-butanol, cất thu hồi dung môi thu được các cao phân đoạn Cao
EtOAc 20g được tiến hành sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CHCl3 : MeOH thu được 10 phân đoạn, phân đoạn 7 được phân lập qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi MeOH : nước, phân lập được các hợp chất tinh khiết và xác định cấu trúc bằng phương pháp UV, IR, ESI-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR thu được hợp chất (19), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41) và (42)
Bột thân loài Piper wallichii
Chiết hồi lưu bằng MeOH ở nhiệt độ 85 O C, loại bỏ dung môi thành cao, sau đó chiết lỏng - lỏng với dung môi n-hexan, EtOAc, n-butanol Sau đó tác giả đã tiến hành sàng lọc tác dụng gây độc tế bào HK-2 của các phân đoạn, kết quả cho thấy phân đoạn EtOAc có tác dụng tốt nhất nên tiếp tục phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột pha thuận hệ dung môi n-hexan : EtOAc được 8 phân đoạn, phân đoạn 8 được tiến hành trên HPLC điều chế với hệ dung môi MeOH : nước thu được hợp chất (9), (10), (11), (12), (13), (14) và (15) và các hợp chất cũng đã được đánh giá tác dụng gây độc tế bào HK-2
Bột thân loài Piper wallichii (18kg)
Chiết hồi lưu (3 lần x 6L) với dung môi nước (mỗi lần 1h) Chiết phân bố với dung môi ester dầu hỏa, EtOAc, n-butanol Phân đoạn EtOAc phân lập quả sắc ký cột rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3 : MeOH, thu được 37 phân đoạn Từ phân đoạn 21-30 tiếp tục phân lập trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi ester dầu hỏa : EtOAc (9:1 đến 1:1 v/v) thu được hợp chất (47), (48) và (49)
5 2015 Yan Ni Shi và cộng sự [32]
Bột của phần trên mặt đất loài Piper wallichii (19kg)
Chiết bằng MeOH ở nhiệt độ 60 o C, cất thu hồi dung môi thu được cao toàn phần, sau đó cao được hòa tan với nước, chiết lỏng - lỏng với EtOAc, dịch EtOAc cô thành cao, cho chạy qua cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi CHCl3–MeOH (99:1 đến 5:1 v/v) thu được 8 phân đoạn (A-H), phân đoạn E chạy qua sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH : nước (2:1 v/v) thu được 8 phân đoạn và hợp chất (20), (26), và phân đoạn 3 sử dụng HPLC điều chế với hệ dung môi acetonitrile : nước thu được hợp chất hợp chất (22) và (23) phân đoạn F chạy qua sắc ký cột diaion HP-20 với hệ dung môi MeOH : nước thu được 13 phân đoạn, phân đoạn 8 chạy qua sắc ký cột diaion HP-20 với dung môi MeOH phân lập được hợp chất (21), phân đoạn 9 sử dụng HPLC điều chế với hệ dung môi acetonitrile : nước thu được hợp chất hợp chất (24), (25), (27), (28), (29), (30) và (31)
6 2015 Yan Ni Shi và cộng sự [31]
Bột thân loài Piper wallichii (1,4kg)
Ngâm chiết với EtOH 70% ở nhiệt độ phòng, sau đó chiết phân đoạn với dung môi n-hexan, EtOAc, n-butanol từ phân đoạn EtOAc tiến hành sắc ký cột rửa giải bằng dung môi CH2Cl2 : MeOH thu được 10 phân đoạn Phân đoạn 2, phân đoạn 3 và Phân đoạn 7 được tinh chế trên silica gel rửa giải bằng ester dầu hỏa : aceton thu được các hợp chất (18), (42), (44), (45), (46), (50), (51)
Bột thân loài Piper wallichii (1,4kg)
Bột thân của Piper wallichii được chiết (3 lần x 10L) lần lượt với các dung môi n-hexan, EtOAC, MeOH ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dung môi Cao n-hexan
13 6,8g được chạy qua sắc ký cột rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : EtOAc
(95:5 đến 70:30 v/v) được 9 phân đoạn Phân đoạn 4 cho chạy qua sắc ký cột nhanh với hệ dung môi n-hexan : aceton (95:5) thu được các hợp chất (1), (3) và (6) Cao EtOAC 14,8g chạy qua sắc ký cột rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan, EtOAc và MeOH thu được 14 phân đoạn, phân đoạn 5 chạy qua sắc ký cột Sephadex LH-20 dùng MeOH để rửa giải thu được hợp chất (4) Phân đoạn
8 phân lập quả sắc ký cột pha thuận, hệ dung môi n-hexan : aceton (95:5 đến 50:50 v/v) thu được hợp chất (2), (5), (7), (8)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu là thân cây Sakhan thu hái vào thời điểm tháng 12 năm
2023 tại tỉnh Luangprabang – CHDCND Lào Mẫu nghiên cứu được Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Piper wallichii (Miq.) Hand - Hazz., họ Hồ tiêu (Piperaceae) Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng tiêu bản thực vật – Viện Dược liệu (Số hiệu DV-070524) Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi sấy ở 55 o C đến độ ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện nghiên cứu (BM Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường ĐH Dược HN)
Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu và phiếu giám định tên khoa học [1]
❖ Hoá chất, dung môi thí nghiệm
Hoá chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có :
- Hóa chất nghiên cứu thành phần hóa học : aceton, ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), n-butanol, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), acid sulfuric, chloroform, amoniac, nước cất, …
- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol
- Hóa chất nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học: Acetylcholinesterase loại EC 3.1.1.7 (AChE), acetylthiocholin iodid (ATCI), acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
15 (DTNB), Dimethyl sulfoxid (DMSO), tris base và galantamin hydrobromid chuẩn (TCI Japan); …
❖ Trang thiết bị nghiên cứu
- Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 àm, Merck), pha đảo RP18 (30 - 50 àm, Merck)
- Sắc ký cột dựng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 àm (Merck), sephadex LH-20
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam (VAST)
- Phổ khối lượng phun mù điện tử đo trên máy AGILENT 1260 series single
- Máy đọc ELISA Molecular Devices Mỹ
- Mỏy cụ quay 5 L và 20 L của BĩCHI, Thụy Sĩ
- Bình cầu đáy tròn các loại (50 - 2000 mL)
- Các dụng cụ thủy tinh: bình nón 250 mL, cốc có mỏ, ống nghiệm thủy tinh, phễu thủy tinh, phiến 96 giếng, Micropipet các cỡ, máy ủ phiến 96 giếng
- Chiết xuất cao toàn phần, các cao phân đoạn và phân lập các hợp chất thực hiện tại
Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu - Dược học cổ truyền, Đại học Dược Hà Nội
- Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được tại phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau :
- Mục tiêu 1 : Chiết xuất, phân lập 1-2 hợp chất từ thân cây Sakhan theo định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
- Mục tiêu 2 : Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các hợp chất phân lập được
Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn
Thân được tách riêng khỏi các phần dược liệu khác, sẽ được cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ 55 o C để đạt độ ẩm 100 àg/mL)
Nhận thấy trong 4 cao phân đoạn, chỉ có cao ethyl acetat thể hiện tác dụng ức chế acetylcholinesterase in vitro mạnh nhất và tìm hiểu sâu hơn về tác dụng ức chế acetylcholinesterase đối với cao phân đoạn, theo tác giả José M và cộng sự cho rằng các loại thực vật có chứa các hợp chất như alcaloid, coumarin, flavonoid, lignan, tinh dầu, terpenoid, carotenoid, stilben, quinon, xanthon có khả năng ức chế acetylcholinesterase Khi so sánh với kết quả định tính bảng 3.2, trong khóa luận cho thấy trong cao ethyl acetat có các nhóm hợp chất alcaloid, coumarin, flavonoid, terpenoid, carotenoid, nên cao phân đoạn này có tác dụng ức chế acetylcholinesterase rất tốt và mạnh hơn so với so với cao phân đoạn khác Và như vậy, không có các nhóm hợp chất nêu trên nên có thể là nguyên nhân dẫn đến tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của các cao phân đoạn còn lại yếu hoặc không có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase
Từ phân đoạn ethyl acetat đã phân lập được hợp chất (-)-isolariciresinol-4-O-β- D-glucopyranosid (PB1) và pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid (PB2) và đã được đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase in vitro, cho thấy cả 02 hợp chất đều biểu hiện tác dụng ức chế acetylcholinesterase in vitro với giá trị IC50 lần lượt là 51,08 àg/mL; 55,75 àg/mL Để giải thớch cơ chế tỏc dụng khúa luận đó đưa vào một số giả thiết về liên quan cấu trúc tác dụng ức chế acetylcholinesterase (SAR) có thể giải thích như sau: