Tổng quan về andrographolid
Nguồn gốc và cấu trúc hóa học
Andrographolid là diterpen lacton có hoạt tính sinh học chính được phân lập từ cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Wall ex Nees, thuộc họ Ô rô Acanthaceae)
Lá cây chứa một lượng lớn andrographolid (0,054 – 4,686%), một lượng nhỏ andrographolid cũng có trong thân, ngọn hoa và rễ [23]
Cấu trúc phân tử của andrographolid được thể hiện qua hình 1.1
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của ADG
Tên khoa học: (3E,4S)-3-[2-[(1R,4aS,5R,6R,8aS)-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)- 5,8a-dimethyl-2-methyliden-3,4,4a,6,7,8-hexahydro-1H-naphthalen-1-yl]ethyliden]-4- hydroxyoxolan-2-on [98]
Công thức phân tử: C20H30O5, khối lượng phân tử: 350,45 g/mol [23]
- Cảm quan: bột kết tinh trắng hoặc tinh thể hình kim, không màu, không mùi, vị đắng [99]
- Nhiệt độ nóng chảy của ADG là 229 – 232 0 C [23]
- Độ tan: ADG tan ít trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol, pyridin, acid acetic và aceton
- Độ ổn định: do có cấu trúc este nội phân tử, ADG dễ bị thuỷ phân, mở vòng và đồng phân hoá trong dung dịch nước Ở nhiệt độ thấp, độ ổn định của ADG tăng lên ADG kém ổn định nhất trong môi trường kiềm, ở pH càng cao, ADG càng kém ổn định Ngoài ra, ADG có thể bị thuỷ phân chậm trong điều kiện acid mạnh, còn bền vững trong môi trường trung tính và acid yếu [99]
Tác dụng dược lý của andrographolid
Andrographolid có nhiều tính chất sinh học như hạ đường huyết [61], [100], chống dị ứng, chống kết tập tiểu cầu [7], [58], bảo vệ gan [87] và chống HIV [45], nhưng nổi bật lên là khả năng chống oxy hóa [90], chống viêm và điều hòa miễn dịch [74]
ADG có khả năng chống oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp ADG có thể ngăn ngừa sự hình thành gốc tự do bằng cách bảo vệ ty thể hoặc bằng cách ức chế các enzyme sản xuất chất oxy hóa cụ thể Nó cũng có thể kích hoạt các chất chống oxy hóa có enzyme hoặc không enzyme, chủ yếu thông qua việc kích hoạt đường truyền tín hiệu Nrf2 [30] ADG làm giảm đáng kể tình trạng viêm do histamin, dimethyl benzen và adrenalin gây ra Andrographolid chống được tình trạng viêm do nó ức chế sản xuất NO và iNOS Andrographolid cũng có tác dụng ức chế sản xuất IL-2 và tăng sinh tế bào T trong phản ứng tế bào lympho hỗn hợp và ức chế sự trưởng thành của tế bào đuôi gai và trình diện kháng nguyên [43] Đặc tính điều hòa miễn dịch của ADG cũng là một đặc tính nổi trội, đang được quan tâm trong thời gian gần đây Một vài nghiên cứu gần đây chỉ ra ADG đã tăng cường các đặc tính dung nạp của các tế bào đuôi gai chưa trưởng thành (DC) trong bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm (EAE) bằng cách ức chế hoạt hóa NF-ĸB ở tế bào đuôi gai ở chuột Ngoài ra, một vài báo cáo khác còn chỉ ra ADG còn làm tăng sinh tế bào lympho ở máu ngoại vi ở người, đồng thời cũng làm tăng sản xuất các cytokin chính [43] Đặc điểm hấp thu của andrographolid
Mặc dù andrographolid có rất nhiều tác dụng sinh học, có tiềm năng nghiên cứu và phát triển thành dạng thuốc mới nhưng việc sử dụng ADG trong điều trị còn rất nhiều hạn chế do sinh khả dụng đường uống của ADG còn thấp (chỉ 2,67%) [102] Điều này do ADG có cấu trúc diterpenlacton, cản trở khả năng hòa tan trong nước, do đó không đạt nồng độ thuốc tối ưu tại vị trí hấp thu chính của ADG – hồi tràng và hỗng tràng, giảm khả năng hấp thu của thuốc vào vòng tuần hoàn chung [56], [79]
Mặt khác, dưới tác dụng của enzym liên hợp sulfat, ADG bị chuyển hoá thành 14- deoxy-12-sulfoandrographolid tồn tại ở dạng ion hoá cũng làm giảm hấp thu Khi xuống tới các vùng hỗng tràng-hồi tràng, ADG vẫn có khả năng thấm vào tế bào biểu mô ruột, nhưng bị bơm ngược trở lại lòng ruột bởi các kênh vận chuyển như P-gp và Bcrp [102] Độ tan tương đối thấp của ADG [25] cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sinh khả dụng Mặt khác, cấu trúc vòng lacton trong ADG có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh hoặc các enzym thuỷ phân lacton (bản chất là các esterase) [98], như vậy môi trường dịch vị với pH acid và enzym thuỷ phân có thể là yếu tố bất lợi đối với độ ổn định của ADG Tuy nhiên, nghiên cứu của Ye và cộng sự cho thấy môi trường dịch
4 vị ít ảnh hưởng tới ADG và đây có lẽ không phải là nguyên nhân dẫn tới sinh khả dụng thấp của hoạt chất này [102]
Một số nghiên cứu cải thiện sinh khả dụng của andrographolid
Một số nghiên cứu về cải thiện sinh khả dụng của andrographolid được trình bày ở Bảng 1.1 Có thể thấy công nghệ nano đang ngày càng thể hiện nhiều tiềm năng trong việc cải thiện độ tan, tốc độ hoà tan và sinh khả dụng cho hợp chất kém tan như andrographolid, khắc phục được những nhược điểm của hoạt chất này như đã trình bày ở phần trên
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về cải thiện sinh khả dụng của andrographolid
STT Tên nghiên cứu Kết quả đạt được TLTK
Hệ nano tự nhũ hoá
(SNEDDS) mới của andrographolid từ
Andrographis paniculata: Đánh giá các đặc tính in vitro và in vivo
Công thức SNEDDS tối ưu sử dụng pha dầu, chất diện hoạt và đồng diện hoạt là Capryol-90, Tween
20 và PEG 400 theo tỷ lệ 20:70:10 và 20:60:20 cho thấy khả năng cải thiện đáng kể về độ hoà tan so với ADG nguyên liệu, kết quả đánh giá sinh khả dụng in vivo trên thỏ của công thức tối ưu cho thấy AUC tăng 1,2 lần, Cmax tăng 1,26 lần và Tmax giảm 1,72 lần so với bột nguyên liệu
Bào chế nano nhũ tương nhằm cải thiện sinh khả dụng đường uống và hoạt tính chống viêm của
Nhũ tương nano chứa andrographolid (ADG-NE) có sinh khả dụng vượt trội (SKD tương đối 594,3%) so với hỗn dịch ADG, hơn nữa, chỉ số loét (ulcer index) và điểm tổn thương mô học của chuột bị loét ruột bởi indomethacin giảm có ý nghĩa khi được điều trị trước với ADG-NE
PLGA nạp ADG: tối ưu hoá, đánh giá đặc tính và tương quan in vitro - in vivo
Vi cầu PLGA nạp andrographolid được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi, cho khả năng giải phóng kéo dài lên đến 9 ngày, tuân theo động học Korsmeyer-Peppa, đồng thời duy trì nồng độ ADG tương đối cao trong huyết tương trong suốt một tuần chỉ với một liều tiêm bắp duy nhất
Tổng quan về các phương pháp che vị
Các phương pháp che vị trong dược phẩm ngày nay
Vị giác là khả năng phát hiện ra mùi vị của hợp chất như thuốc, thực phẩm Vị của thuốc chính là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em và người già Điều này càng trở nên quan trọng hơn nữa vì đa số thuốc hiện nay được sử dụng theo đường uống Các phương pháp khác nhau như tạo phức, tạo màng bao, tạo hạt, hấp phụ, sử dụng tiền chất, bổ sung hương liệu và chất làm ngọt, sử dụng nhựa trao đổi ion được sử dụng để che giấu mùi vị khó chịu của thuốc Tuy nhiên, không có phương pháp chung nào để che vị Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm và những ứng dụng cụ thể
Tạo màng bao là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến và hiệu quả được sử dụng trong công nghệ che giấu vị giác [13], [19], [82] Lớp màng bao hoạt động như một rào cản vật lý xung quanh dược chất, từ đó giảm thiểu sự tương tác giữa dược chất và vị giác để các hạt được nuốt mà không cảm nhận được mùi vị trong miệng Các hạt thuốc được bào chế dưới nhiều dạng bào chế khác nhau Polyme hiện nay được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màng bao Polyme không hòa tan ở pH > 5,9 và hòa tan ở pH acid sẽ được sử dụng để che vị đắng Trong khoang miệng, polyme có thể ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình hòa tan thuốc, do đó che giấu mùi vị [97]
1.2.1.2 Thêm các chất tạo ngọt
Các chất tạo ngọt thường được sử dụng kết hợp với các phương pháp che vị khác Chúng được sử dụng điều vị của dược chất Dựa trên nguồn gốc, các chất tạo ngọt được chia thành các chất tạo ngọt tự nhiên và tổng hợp Các chất tạo ngọt tổng hợp có khả năng che vị tốt hơn rất nhiều so với chất có nguồn gốc từ tự nhiên
Gần đây, chất tạo ngọt và hương liệu đã được sử dụng thành công để cải thiện độ ngon miệng của các hợp chất đắng trong công thức giải phóng nhanh Pioglitazon là một thuốc trị đái tháo đường tuýp 2 có vị khó chịu điển hình, nên để che vị, Matsui và cộng sự đã điều chế viên nén phân tán trong miệng pioglitazon bằng cách trộn pioglitazon với cả natri clorid và aspartam, sau đó trộn hỗn hợp với các tá dược khác để tạo thành viên nén [60]
1.2.1.3 Sử dụng các chất ức chế vị giác
Các chất ức chế vị giác và/hoặc chất chặn vị giác đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm Việc ngăn chặn hiệu quả các thụ thể vị giác có thể được thực hiện bằng cách chiếm giữ các vị trí liên kết với thụ thể hoặc cạnh tranh trong chính các kênh đó Trong số các loại lipoprotein khác nhau, các lipoprotein bao gồm acid phosphatidic
6 (PA) và lactoglobulin (LG) có hiệu quả nhất trong việc ức chế vị đắng [47] Những lipoprotein này đã được chứng minh là có khả năng ngăn chặn một cách an toàn và có thể đảo ngược phản ứng của dây thần kinh lưỡi hầu của ếch đối với các chất đắng bằng cách liên kết với vùng kỵ nước của màng thụ thể [48] Chúng cũng đã được chứng minh là chất ức chế vị giác hiệu quả của các loại thuốc cơ bản và kỵ nước như quinin, papaverin, denatortium, caffein, propranolol và theophyllin – những thuốc được biết đến với vị đắng mạnh
Do đó, các chất ức chế vị giác dường như ít nhiều có tác dụng đặc hiệu đối với một số dược chất trong khi cùng một dược chất có thể có một số chất ức chế vị giác Các phân tử khác nhau có thể có cơ chế ức chế liên kết tương tự với các thụ thể vị giác
1.2.1.4 Che vị bằng cách sử dụng các biến đổi về hóa học Để che giấu vị đắng, người ta sử dụng một số phương pháp biến đổi về mặt hóa học cho các dược chất như là tạo phức, tạo phức nhựa trao đổi ion Chất tạo phức có khả năng che giấu vị đắng của thuốc bằng cách giảm độ hòa tan trong miệng khi nuốt vào hoặc giảm số lượng hạt thuốc tiếp xúc với vị giác, do đó làm giảm cảm nhận về vị đắng [13] Phương pháp này phù hợp nhất với những thuốc có liều thấp Cyclodextrin là tác nhân tạo phức được sử dụng rộng rãi nhất do khả năng hình thành các phức bao gồm nhiều phân tử khác nhau mà không có liên kết cộng hóa trị [54], [86] Ibuprofen là một ví dụ điển hình của một phân tử có đặc tính hóa lý và mùi vị có thể được cải thiện bằng cách hình thành các phức hợp bao gồm với cyclodextrin (CD) [83]
Nhựa trao đổi ion (IER) là các chất điện phân có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, có liên kết chéo với các vị trí liên kết rộng dẫn đến khả năng nạp thuốc rất cao [80] Do đó, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc vận chuyển các hợp chất đắng Chúng hấp phụ hiệu quả vào thuốc và che giấu vị đắng của nó mà không tạo ra vị ngay sau khi uống Sự hấp phụ này đạt được nhờ các điện tích trái dấu của hạt nhựa Chúng tạo thành các chất hấp phụ không hòa tan hoặc cộng hưởng thông qua liên kết ion yếu Do đó, phức hợp nhựa – thuốc được hình thành không thể bị phá vỡ trong điều kiện pH nước bọt Vì vậy, mùi vị khó chịu của thuốc được che giấu một cách thích hợp Tuy nhiên, phức hợp này nhanh chóng bị phá vỡ và thuốc được giải phóng khi tiếp xúc với dịch dạ dày [57] Việc lựa chọn IER thích hợp là điều cần thiết để mang lại hương vị tối ưu Sự lựa chọn này phụ thuộc vào tính tương hợp của nhóm chức, nồng độ của nhóm trao đổi và tỷ lệ trương nở, bên cạnh khả năng tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học của nhựa
1.2.1.5 Tạo tiền thuốc, muối và các dẫn chất
Tiền thuốc được sử dụng rộng rãi để khắc phục vị của các hợp chất đắng bằng cách làm giảm khả năng hòa tan của thuốc trong nước bọt và/hoặc làm giảm ái lực của thuốc với các thụ thể Sử dụng thuốc giảm đau opioid đặt dưới lưỡi là một cách hữu ích để cải thiện sinh khả dụng so với đường uống, nhưng những hợp chất này có vị đắng Tuy nhiên, nhiều tiền chất khác nhau của nalbuphin, naloxon, naltrexone, oxymorphon, butorphanol và levallorphan, trong đó nhóm hydroxyl 3-phenolic được este hóa, lại không có vị đắng Hussain và các cộng sự chỉ ra rằng sự khác biệt về mùi vị không phải do sự khác biệt về độ hòa tan trong nước mà do chính nhóm chức phenol tương tác với thụ thể vị giác [41]
Do đó, sinh khả dụng của thuốc qua đường đặt dưới lưỡi được cải thiện so với đường uống mà không có vị đắng đặc trưng
Một cách che vị khác là chuyển thuốc tan trong nước thành dạng muối ít tan hơn Giảm độ tan của thuốc bằng cách tạo muối làm cho thuốc trở nên mất đi vị đắng do độ tan của dược chất trong nước bọt giảm, do đó vị giác kém nhạy cảm hơn Vị đắng của cloramphenicol là một bất lợi nghiêm trọng đối với việc sử dụng nó trong các công thức dành cho trẻ em Tuy nhiên, chloramphenicol palmitat (CP), một dạng este ít tan, thực tế không có vị vì độ hòa tan trong nước thấp Dạng CP được thủy phân thành chloramphenicol có hoạt tính nhờ tác dụng của lipase tuyến tụy [8]
1.2.1.6 Những phương pháp che vị khác
Các chất lipid có thể hoạt động như chất làm chậm giải phóng và cung cấp một chất nền chịu trách nhiệm ngăn chặn vị đắng của thuốc Sự phân tán rắn của cefuroxim axetil (CA) với acid stearic, acid béo bão hòa, có thể che giấu hiệu quả vị đắng của CA và tăng cường đáng kể sinh khả dụng qua đường uống của nó [8] CA được phủ acid stearic trong các vi cầu như một phương tiện che giấu mùi vị bằng cách sử dụng quy trình phun lạnh đơn giản Để tăng khả năng che giấu vị giác và đẩy nhanh quá trình giải phóng thuốc từ acid stearic lipophilic, các vi cầu này được tạo hạt cùng sucrose trước khi bổ sung hương vị để tạo ra hỗn dịch nước ngọt và có hương vị của thuốc [21] Các hạt cốt lipid của ondansetron HCl với các viên geleol (glycerol monostearat) thu được bằng kỹ thuật nung chảy nóng chảy thủ công Việc đánh giá mùi vị của các hạt được thực hiện bằng phương pháp in vitro dựa trên sự giải phóng thuốc, cho thấy sự giải phóng thuốc từ hạt bị chậm lại đáng kể so với thuốc nguyên chất và lượng geleol cao hơn dẫn đến khả năng che giấu mùi vị cao [48]
Một số ứng dụng của Eudragit E trong bao che vị và bảo vệ hoạt chất
Các polyme Eudragit đã được nghiên cứu về khả năng ứng dụng trong các công thức che vị, đặc biệt là các Eudragit E Do Eudragit E có nhóm chức amin bậc 3, nó có thể tạo
8 thành các màng film có khả năng trương nở và thấm, không tan ở pH ≥ 5, nhưng có thể hòa tan nhanh chóng bằng cách tạo thành muối ở pH ≤ 5 Vì vậy, nó có thể ngăn ngừa sự giải phóng thuốc ở nước bọt (pH 6,8 - 7,4) và dễ dàng hòa tan trong dịch dạ dày (pH 1,0
Antonio và các cộng sự đã thành công trong việc che giấu vị đắng của propranolol hydrochlorid (PR) bằng cách bao phủ chúng bằng Eugragit E PO Các vi hạt Eudragit E
Tổng quan về các phương pháp đánh giá tính thấm của dược chất qua ruột
Con đường vận chuyển dược chất qua đường ruột
Các hợp chất có thể được vận chuyển qua hàng rào ruột qua nhờ các cơ chế vận chuyển khác nhau (Hình 1.2) Con đường vận chuyển và tốc độ hấp thu của các hợp chất này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nhau liên quan đến các yếu tố sinh lý của mô (ví dụ: thành phần và độ dày của lớp nhầy, tình trạng bệnh hoặc tính thấm của màng, pH ruột, nồng độ acid mật, thành phần của dịch tụy, diện tích bề mặt, hoạt tính enzym, hàm lượng lipid và protein của màng và lượng Peyer's patches trong mô), các tính chất lý hóa của hợp chất (ví dụ: khả năng tan trong nước, trọng lượng phân tử, trạng thái tập trung, điện tích, khả năng tạo liên kết hydro và tính kỵ nước) và các yếu tố thuộc về công thức
Hình 1.2 Các con đường vận chuyển qua màng ruột
Nhìn chung, các hợp chất được vận chuyển thông qua một trong các cơ chế sau đây: (1) Vận chuyển qua kẽ tế bào (ví dụ: các hợp chất nhỏ thân nước và có tính thân nước)
(2) Vận chuyển xuyên qua tế bào
Vận chuyển thụ động (các hợp chất thân lipid)
Nhập bào (ví dụ: protein và nucleotide nhỏ)
Vận chuyển qua các protein mang (ví dụ: glucose và amino acid)
(3) Vận chuyển qua trung gian tế bào [106]
Việc vận chuyển các hợp chất qua hàng rào ruột cũng có thể được tạo điều kiện thuận lợi bởi các loại tế bào có trong lớp đệm, bao gồm tế bào M, mảng Peyer (Peyer’s patches), tế bào đuôi gai và đại thực bào
Các mô hình đánh giá tính thấm dược chất qua ruột
Các đặc tính hóa lý của một dược chất, các chức năng sinh lý của đường tiêu hóa và các đặc tính sinh hóa và vật lý của hàng rào biểu mô đều ảnh hưởng đến quá trình hấp thu thuốc phức tạp ở ruột Vì đường uống là đường dùng phổ biến nhất, nên để có hiệu quả điều trị đòi hỏi phải hấp thu đủ ở ruột để đảm bảo rằng thuốc có mặt tại vị trí đích Sinh khả dụng đường uống tốt diễn ra khi thuốc có tính thấm và độ hòa tan tối đa tại vị trí hấp thu Do đó, mức độ hấp thu in vivo (fa) có thể được dự đoán dựa trên các phép đo độ hòa tan và tính thấm [29] Mối quan hệ cơ bản giữa tốc độ hấp thu thuốc được xác định bằng hệ số thấm và mức độ hấp thu đã dẫn đến việc sử dụng các mô hình thí nghiệm làm đại diện thay thế để dự đoán sự hấp thu của các thuốc đường uống [22], [75], [92] Các phương pháp khác nhau có thể được sử dụng để đánh giá tính thấm của ruột và hấp thu thuốc; mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng So với các nghiên cứu về sự hấp
10 thu thuốc in vivo, việc đánh giá tính thấm của ruột đơn giản và dễ dàng hơn Tuy nhiên, một hạn chế phổ biến với các mô hình là khả năng mô phỏng điều kiện sinh lý như tốc độ tháo rỗng, tốc độ vận chuyển, pH đường tiêu hóa Mặc dù rất khó để phát triển một hệ thống có thể mô phỏng tất cả các điều kiện tồn tại trong ruột người, nhiều mô hình đánh giá tính thấm đã được phát triển và sử dụng rộng rãi
1.3.2.1 Phương pháp túi ruột a) Phương pháp túi ruột lộn ngược
Trong mô hình túi ruột (hoặc ruột) lộn ngược, một phần ruột được lấy ra khỏi động vật đã được gây mê, rửa sạch bằng dung dịch đệm và lộn ngược qua một thanh hoặc ống Ruột được chia thành các túi từ 2 đến 4 cm được buộc ở mỗi đầu, chứa đầy dung dịch đệm được cung cấp oxy Túi ruột được ủ trong đệm với dược chất [59] (hình 1.3) Sau một thời gian xác định, lấy mẫu và xác định lượng thuốc trong túi Một nhược điểm của loại thí nghiệm này là trong các thí nghiệm túi lộn ngược, tốc độ hấp thu có thể chậm không giống với thử nghiệm in vivo, vì hợp chất phải đi qua các lớp cơ và chất lỏng bị ứ đọng [89] Trong điều kiện tối ưu, mô có thể tồn tại trong tối đa 2 giờ và hệ thống này chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu cơ chế hấp thu thuốc, chuyển hóa thuốc ở ruột, vai trò của chất vận chuyển trong hấp thu thuốc và để nghiên cứu vai trò của các enzym đường ruột trong quá trình vận chuyển thuốc qua màng [5] Với sự hiện diện của P-gp dọc theo ruột chuột, mô hình túi ruột lộn ngược cũng có thể hữu ích để nghiên cứu hoạt động của P-gp trong ruột đối với sự hấp thu thuốc ở ruột Bằng cách so sánh động học vận chuyển của cơ chất khi không có hoặc có chất ức chế P-gp, phương pháp này có thể được sử dụng để đánh giá vai trò của P-gp trong sự hấp thu thuốc ở ruột và sàng lọc các chất được cho là có khả năng ức chế P-gp
Hình 1.3 Mô hình túi ruột lộn ngược [101] b) Phương pháp túi ruột không lộn ngược
Trong mô hình túi ruột không lộn ngược, đoạn ruột sau khi lấy từ động vật không được lộn ra ngoài và dược chất được đưa vào trong túi Sau đó, túi được đặt trong dung dịch đệm được cung cấp oxy và lượng dược chất thấm qua được xác định tại các thời điểm [92] Nghiên cứu của Ruan và cộng sự đã xác nhận và chứng minh khả năng ứng
11 dụng của phương pháp này đối với 11 hợp chất được bán trên thị trường Kết quả chỉ ra rằng có mối tương quan giữa tính thấm của các thuốc mô hình và dữ liệu hấp thu in vivo tương ứng [71] Mô hình này cung cấp một phương pháp thay thế cho phương pháp túi ruột lộn ngược để đánh giá tính thấm và ước tính sự hấp thu thuốc ở người
1.3.2.2 Ussing Chamber a) Cấu tạo thiết bị
Hệ thống Ussing Chamber "cổ điển" (Hình 1.3) gồm có hai nửa và có các cổng dọc và ngang trên mỗi nửa tạo thành hệ thống tuần hoàn và tạo kết nối điện Mỗi bên đều gồm có các phần: bộ phận đưa khí vào giúp tạo lực đẩy để tuần hoàn và cung cấp oxy cho dung dịch đệm, lớp áo nước nhằm duy trì nhiệt độ trong quá trình tuần hoàn dung dịch, bộ phận để đo điện thế và dòng điện
Hình 1.4 Cấu trúc hệ thống Ussing Chamber [89] b) Ưu nhược điểm
Vì kỹ thuật Ussing Chamber sử dụng các đoạn mô ruột nên chúng vẫn chứa các đặc điểm hình thái và sinh lý của ruột, bao gồm sự tương tác của nhiều quá trình phức tạp, chẳng hạn như tương tác giữa môi trường đa bào [70] Việc sử dụng các đoạn mô ruột mô phỏng tốt hơn về cấu trúc phức tạp trong cơ thể sống (sự kết tụ tế bào, sự hiện diện của lớp chất nhầy) và do đó thể hiện tốt hơn các quá trình khác nhau có thể xảy ra trong cơ thể Hơn nữa, các đoạn mô ruột từ các vùng khác nhau của ruột non và ruột già cho phép nghiên cứu khả năng hấp thu và phản ứng miễn dịch theo vùng, điều không thể thực hiện được khi sử dụng các mô hình nuôi cấy tế bào đơn lẻ
Hạn chế chính của việc sử dụng các đoạn mô ruột ex vivo là sự không sẵn có của mô người (khỏe mạnh) Do đó, mô động vật thường được sử dụng Mô ruột của lợn có thể được sử dụng thay thế dựa trên sự tương đồng cao của nó với mô của người [33], [64], [93] Khi sử dụng mô người, thường sử dụng một đoạn nhỏ sinh thiết không bệnh, có thể ít nhiều bị ảnh hưởng bởi mô bệnh lân cận Tuy nhiên, bên cạnh tác động của các tác dụng phụ có thể xảy ra của mô bệnh và/hoặc quá trình điều trị bằng thuốc trước đây, sự khác biệt giữa các cá thể giữa con người hoặc bất kỳ mô hình động vật không lai giống nào
12 khác cũng ở giai đoạn khỏe mạnh là rất cao, khiến việc so sánh trực tiếp kết quả trở nên khó khăn Một hạn chế lớn khác của việc sử dụng các đoạn mô ruột ex vivo là khả năng tồn tại của mô bị hạn chế Các nghiên cứu trước đây của Haslam và cộng sự [37], Rozehnal và cộng sự [70] và Sjửberg và cộng sự [76] đó chỉ ra rằng mụ ruột chỉ tồn tại trong tối đa 150 phút (trung bình 120 phút), đủ lâu để nghiên cứu sự hấp thu dược chất c) Kiểm soát khả năng tồn tại và tính toàn vẹn của màng
Các nghiên cứu trước đây [37], [70], [76] đã sử dụng hiệu điện thế (>4 mV), dòng điện ngắn mạch (>100 μA/cm 2 ), điện trở xuyên biểu mô (TEER; >20 Ω cm 2 ) để theo dõi liên tục khả năng tồn tại Điện trở thấp cho thấy rò rỉ mô Các dấu hiệu khác có thể được nghiên cứu song song với nghiên cứu vận chuyển bao gồm chuyển hóa đường ruột của testosterone và midazolam, bằng cách định lượng các chất chuyển hóa ở nội bào, ngăn cho và ngăn nhận Sự vận chuyển qua kẽ tế bào có thể được đánh giá bằng cách đo tính thấm của Lucifer Yellow (giá trị Papp < 6×10 −6 cm/s) [70], rò rỉ fluorescein isothiocyanate dextran sang mặt bên (FD4; < 0,5 %) [95], hoặc vận chuyển tuyến tính atenolol (R 2 > 0,995 với ít nhất 3 điểm dữ liệu) [37] Các giá trị cao hơn các giá trị được đề cập ở trên, cho thấy sự không toàn vẹn của mô ruột Lý tưởng nhất là theo dõi nhiều tham số để đánh giá khả năng tồn tại và tính toàn vẹn của niêm mạc ruột song song với quá trình vận chuyển hợp chất cần quan tâm
So với các thử nghiệm in vivo, đánh giá tính thấm in vitro bằng các tế bào nuôi cấy nhanh chóng hơn và hạn chế sử dụng động vật, giảm sai số cá thể cũng như kiểm soát được các biến trong quá trình, cung cấp thông tin chuyên sâu về các cơ chế (ví dụ: qua trung gian chất mang so với thụ động), các con đường (ví dụ: xuyên tế bào so với qua kẽ tế bào) và sự khác biệt trong khu vực (ví dụ: ruột non so với ruột già) liên quan đến vận chuyển qua biểu mô; và đơn giản hơn về mặt phân tích vì các hợp chất đang được phân tích trong dung dịch đệm chứa nước thay vì máu toàn phần hoặc huyết tương [101] Việc ứng dụng thành công các mô hình trong in vitro để dự đoán sự hấp thu thuốc qua niêm mạc ruột phụ thuộc vào mức độ tương đồng của mô hình trong in vitro với đặc điểm của biểu mô ruột trong cơ thể sống
Dòng tế bào Caco-2 lần đầu tiên được phân lập vào những năm 1970 từ tế bào ung thư biểu mô tuyến đại tràng ở người Trong quá trình tăng trưởng, các tế bào Caco-2 trải qua các quá trình tăng sinh và biệt hóa [12] Tế bào Caco-2 được sử dụng nhiều trong mô hình đánh giá tính thấm in vitro (hình 1.5) Khi được phát triển trong điều kiện tiêu chuẩn, các tế bào Caco-2 đã biệt hóa hoàn toàn rất giống với các tế bào ruột bình thường về các đặc điểm hình thái Do quan sát thấy mối tương quan giữa quá trình thấm in vitro ở Caco-
2 và in vivo ở người với các thuốc được vận chuyển thụ động, các tế bào Caco-2 có thể
Nguyên, vật liệu và thiết bị
Nguyên, vật liệu
Các nguyên liệu và hoá chất chính được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2.1 Nguyên vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Cao xuyên tâm liên (chứa 32,6% andrographolid) Trung Quốc TCNSX
5 Methanol Đức Tinh khiết HPLC
6 Natri hydroxyd Trung Quốc DĐVN V
7 Acid hydrocloric Trung Quốc DĐVN V
9 Natri Lauryl Sulfate Đức TCNSX
10 Pharmacoat 606 (HPMC E6) Nhật Bản TCNSX
14 Acetonitril Đức Tinh khiết HPLC
16 Propyl parahydroxybenzoat Trung Quốc TCNSX
21 Nước tinh khiết Việt Nam TCCS
Thiết bị
Các thiết bị chính được trình bày trong Bảng 2.2
Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Máy nghiền bi Tencan XQM-2A Trung Quốc
2 Máy khuấy từ IKA RH B1, 415W Đức
3 Máy lắc IKA vortex 3 Đức
4 Thiết bị Zetasizer Nano ZS90 - Malvern Anh
5 Máy tầng sôi Glatt Uni-Glatt Đức
6 Máy thử độ hòa tan ERWERKA DT 600 Đức
7 Cân kỹ thuật Sartorius TE3102S Đức
8 Cân phân tích Sartorius BP121S Đức
9 Tủ sấy tĩnh Memmert Đức
10 Bể siêu âm Elmasonic S120H Đức
11 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Nhật Bản
12 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Mỹ
13 Máy nghiền bi Retsch MM200 Đức
14 Máy khuấy từ IKA RH B1, 415W Đức
15 Máy đo pH để bàn METTLER TOLEDO Thuỵ Sĩ
16 Kính hiển vi điện tử quét S-4800-10W-HI-9057-0006 Nhật Bản
Nội dung nghiên cứu
Đánh giá ảnh hưởng của chất ổn định đến kích thước tiểu phân, độ tan, độ hòa tan và tính thấm của hệ chứa nano andrographolid
Hoàn thiện bào chế và đánh giá một số đặc tính in vitro và in vivo của pellet che vị mang nano andrographolid.
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1 Quy trình bào chế pellet che vị chứa nano andrographolid
2.3.1.1 Phương pháp bào chế pellet chứa nano andrographolid
Bảng 2.3 Công thức dịch nghiền nano andrographolid
18 a) Phương pháp bào chế nano andrographolid
Nghiền khô cao khô xuyên tâm liên bằng máy nghiền phản lực (Hosokawa, ALPINE PX5-001, Đức) với áp suất 2 bar để có kích thước trung bình là 57,8 ± 1,5 μm, độ phân tán kích thước span là 3,295 ± 0,093
Phân tán 6 g cao sau nghiền khô vào 40 ml dung dịch chất ổn định Poloxamer 407 1% bằng khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó chuyển toàn bộ dịch vào cối nghiền Dùng thêm 20 ml dung dịch chất ổn định để tráng cốc và gộp với dịch trong cối Nghiền ướt hỗn dịch thu được với bi zirconi oxyd trong thiết bị nghiền XQM-2A
Số lượng cối nghiền: 4 cối Khối lượng bi zirconi oxyd: 300 g Đường kính bi: 2 mm Tốc độ nghiền: 300 vòng/phút Tiến hành nghiền trong thời gian 3 tiếng, theo chu kỳ nghiền 1 giờ nghỉ 10 phút để thiết bị không bị nóng Sau khi nghiền, cho hỗn hợp trong cối qua rây kích thước 0,7 mm để tách bi, thu lấy dịch nghiền [4]
Sau khi thu được dịch nghiền, phân tán HPMC 4% vào trong cốc dịch thu được sau khi nghiền ở nhiệt độ phòng b) Phương pháp bồi dần nano andrographolid
Quá trình bồi được tiến hành trên thiết bị bao tầng sôi Uni-Glatt: Đưa vào buồng bao 30 g nhân MCC với quy trình bồi dần nano ADG Dịch bồi được bồi lên nhân đến khi đạt được độ dày thích hợp ở chế độ phun từ dưới lên
Các thông số quy trình với quá trình bồi dần nano ADG như sau:
Độ mở súng phun: 0,3 mm
Áp suất súng phun: 1,5 bar
Tốc độ rũ: 2 lần/7,5 giây
Tốc độ phun dịch: 5 vòng/phút
Dịch bồi được khuấy từ trong suốt quá trình bao, sau khi phun hết dịch, pellet được tiếp tục sấy trong buồng bao khoảng 20 phút
Thu sản phẩm vào túi nilon 2 lớp và bảo quản trong bình hút ẩm đến khi sử dụng cho các bước tiếp theo
2.3.1.2 Phương pháp bào chế pellet che vị chứa nano andrographolid
Bảng 2.4 Công thức dịch bao Eudragit E
Nước cất 850 (ml) a) Phương pháp bào chế dịch bao Eudragit E
Hòa tan 8,6 g natri lauryl sulfat vào trong 850 ml nước cất Sau đó, phân tán lần lượt 12,9 g acid stearic và 85,7 g Eudragit E vào trong dung dịch trên ở nhiệt độ phòng trong 1 – 1,5 giờ
Phân tán 42,8 g Talc vào trong dung dịch polyme đã pha trước đó và đồng nhất hóa bằng máy đồng nhất hóa tốc độ cao với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi đồng nhất hóa, lọc hỗn hợp dịch bao qua rây kích thước 180 μm b) Phương pháp bồi dần Eudragit E
Quá trình bồi được tiến hành trên thiết bị bao tầng sôi Uni-Glatt: Đưa vào buồng bao 30 g pellet đã được bồi nano ADG với quy trình bồi dần Eudragit E Dịch bồi được bồi lên pellet đến khi đạt được độ dày thích hợp ở chế độ phun từ dưới lên
Các thông số quy trình với quá trình bồi dần Eudragit E như sau:
Độ mở súng phun: 0,3 mm
Tốc độ phun dịch: 5 vòng/phút
Tốc độ rũ: 2 lần/7,5 giây
Dịch bồi được khuấy từ trong suốt quá trình bao, sau khi phun hết dịch, pellet được tiếp tục sấy trong buồng bao khoảng 10 phút
Thu sản phẩm vào túi nilon 2 lớp và bảo quản trong bình hút ẩm đến khi sử dụng
2.3.2.1 Phương pháp định lượng andrographolid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Điều kiện định lượng ADG bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được tham khảo từ nghiên cứu của Zhao và cộng sự [105] như sau:
Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV của Shimadzu
Pha tĩnh: cột C18, kích thước 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 μm
Pha động: Methanol-Nước (55:45) (tt/tt) với tốc độ dòng 1 ml/phút
Detector UV phát hiện ở bước sóng 225 nm
Dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0100 gam chất chuẩn ADG, hoà tan và định mức tới 50,0 ml bằng methanol sắc ký, thu được dung dịch S1 với nồng độ khoảng 200 μg/ml Pha loãng dung dịch S1 bằng methanol sắc kí để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 100, 60, 20, 10, 4, 2 và 1 μg/ml Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose tái tổ hợp 0,2 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Dung dịch thử: Các mẫu nghiên cứu được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng methanol sắc ký (nếu cần thiết) và lọc qua màng lọc cellulose tái tổ hợp 0,2 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.3.2.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất ổn định đến các đặc tính của nano andrographolid a) Quy trình chuẩn bị mẫu
Phân tán 0,4 g cao sau nghiền khô vào 5 ml dung dịch chất ổn định bằng khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó chuyển toàn bộ dịch vào cối nghiền Dùng thêm
3 ml dung dịch chất ổn định để tráng cốc và gộp với dịch trong cối Nghiền ướt hỗn dịch thu được với bi zirconi oxyd trong thiết bị nghiền Retsch MM200 Khối lượng bi zirconi oxyd: 20 g Đường kính bi: 0,65 mm Tốc độ nghiền: 30 Hz Tiến hành nghiền trong thời gian 2 tiếng, cứ 15 phút nghỉ 5 phút rồi lại tiếp tục nghiền để đảm bảo thiết bị không bị nóng Sau khi nghiền, cho hỗn hợp trong cối qua rây kích thước 0,125 mm để tách bi, thu lấy dịch nghiền
Nano ADG được hóa rắn thông qua kỹ thuật hấp phụ lên một tá dược: Hỗn dịch nano sau khi bào chế được thấm ướt lên Neusiline với tỉ lệ 2 ml hỗn dịch trên 0,67 gam tá dược hấp phụ, tương đương với khoảng 30 mg ADG rồi đem sấy khô ở 40°C Mỗi bước hấp phụ được lặp lại với số lần thấm ướt thích hợp để tăng tỉ lệ dược chất được nạp vào tá dược hấp phụ [2]
Thu sản phẩm vào túi nilon 2 lớp và bảo quản trong bình hút ẩm đến khi sử dụng b) Đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân
Kích thước và phân bố kích thước tiểu phân được đánh giá thông qua các thiết bị Zetasizer Nano ZS90 như sau:
21 Thiết bị Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước hạt sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động Cách tiến hành: tiểu phân nano sau bào chế được pha loãng bằng lượng nước cất phù hợp sao cho chỉ số đếm (count rates) nằm trong khoảng 200 – 400 kcps Tiến hành đo mẫu bằng cuvet nhựa ở 25 0 C, đánh giá thông qua KTTPTB, PDI c) Đánh giá độ tan của nano andrographolid trong nước và đệm phosphat pH 6,8 Độ tan của ADG trong các môi trường khác nhau (nước tinh khiết và đệm phosphate pH 6,8) được tiến hành như sau:
Cân lượng mẫu thử chứa khoảng 30 mg ADG vào trong ống ly tâm có chứa 5 ml môi trường, bọc kín và đậy nắp Các ống ly tâm được đặt trong bể lắc điều nhiệt với tốc độ 120 vòng/phút, nhiệt độ 37 0 C trong 48 giờ Sau 48 giờ, lấy các ống ra, ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút Hút lấy lớp dịch phía trên, lọc qua màng cellulose tái tổ hợp 0,2 μm, pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng methanol sắc ký Định lượng nồng độ ADG trong các mẫu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao d) Đánh giá độ hòa tan của nano andrographolid trong đệm phosphat pH 6,8
Phương pháp định lượng andrographolid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thẩm định phương pháp định lượng andrographolid in vitro bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tiến hành đánh giá một số tiêu chí của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký như phần 2.3.2.1, kết quả thu được như sau:
Tiến hành sắc ký trên các mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn theo phương pháp phân tích Ghi lại sắc ký đồ Xác định thời gian lưu của chất phân tích trong các mẫu
Kết quả trên hình PL-1.1 và PL-1.2 cho thấy thời gian lưu của pic ADG trên sắc ký đồ của mẫu thử là khoảng 7 phút, tương tự với sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào ở thời gian lưu trên Như vậy, tá dược và dung môi không ảnh hưởng đến kết quả định tính và định lượng ADG
Tiến hành sắc ký với dãy dung dịch chuẩn ở khoảng nồng độ 1–200 μg/ml Ghi lại sắc ký đồ Khảo sát tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của ADG bằng phương pháp bình phương tối thiểu Kết quả được thể hiện ở hình 3.1
Kết quả cho thấy có mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của ADG trong khoảng nồng độ từ 1 μg/ml đến 200 μg/ml với hệ số tương quan R 2 = 0,9996 > 0,99
Do đó, khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng ADG trong các mẫu thử y = 45383x - 10634 R² = 0,9996
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ADG
3.1.1.3 Độ lặp lại và độ ổn định hệ thống
Chuẩn bị mẫu chuẩn dung dịch ADG nồng độ khoảng 60 μg/ml rồi tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký, lặp lại thao tác 6 lần Độ lặp lại được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 5,3% ứng với ngưỡng nồng độ từ 10-100 μg/ml Độ ổn định hệ thống được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 2% Kết quả thu được ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Độ lặp lại và độ ổn định hệ thống của phương pháp phân tích ADG invitro
Lần Diện tích pic (mAu.s) Thời gian lưu (phút)
Kết quả cho thấy, giá trị độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic và thời gian lưu của ADG đều nằm trong khoảng quy định, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại và độ ổn định hệ thống đạt yêu cầu
Kết quả đánh giá các tiêu chí trên cho thấy có thể sử dụng phương pháp HPLC để định lượng ADG trong quá trình nghiên cứu in vitro Tuy nhiên, phương pháp này chưa phù hợp để định lượng nồng độ ADG trong huyết tương để đánh giá sinh khả dụng của ADG đường uống (cỡ ng/ml), vì vậy, đề tài sử dụng phương pháp định lượng andrographolid trong huyết tương sử dụng HPLC bằng điều kiện sắc ký khác
Thẩm định phương pháp định lượng andrographolid trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Tiến hành đánh giá một số tiêu chí của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện sắc ký như phần 2.3.2.4c, kết quả thu được như sau:
Tiến hành phân tích các mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ADG, mẫu chuẩn ADG pha trong methanol Sắc ký đồ của các mẫu được thể hiện ở các hình trong phụ lục PL1.3 Từ sắc ký đồ ta có thể thấy, thời gian lưu của ADG và nội
29 chuẩn trên nền huyết tương thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở mẫu huyết tương trắng ở khoảng thời gian lưu của các pic nói trên Từ kết quả trên cho thấy, phương pháp xây dựng đáp ứng tiêu chuẩn về tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký với dãy dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn ADG với khoảng nồng độ từ 20 ng/ml đến 1000 ng/ml cú thờm 1 àg/ml nội chuẩn Ghi lại sắc ký đồ Khảo sát tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn và nồng độ của ADG bằng phương pháp bình phương tối thiểu Kết quả được thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic và nồng độ
ADG trong huyết tương thỏ
Kết quả cho thấy có mối quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn và nồng độ của ADG trong khoảng nồng độ từ 20 ng/ml đến 1000 ng/ml với hệ số tương quan R 2 = 0,9984 Do đó, khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng ADG trong các mẫu huyết tương
3.1.2.3 Độ ổn định hệ thống, độ lặp lại và độ thu hồi Độ ổn định hệ thống được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 2% Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở mức nồng độ 200 ng/ml cú thờm 1 àg/ml nội chuẩn, phõn tớch lặp lại 6 lần Độ lặp lại được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic, với yêu cầu giá trị RSD không vượt quá 11% và độ thu hồi trong khoảng 80 - 110% ứng với ngưỡng nồng độ từ 100-1000 ng/ml theo yêu cầu của AOAC Độ thu hồi được tính theo công thức: y = 0,0004x - 0,0106 R² = 0,9984
T ỷ lệ diện tí ch p ic
Nồng độ ADG (ng/ml)
𝐶 𝑐× 100%, với Ct là nồng độ ADG trong mẫu trắng thêm chuẩn và Cc là nồng độ ADG chuẩn thêm (lý thuyết) Kết quả thu được ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Độ phù hợp hệ thống, độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích ADG trong huyết tương
Lần Thời gian lưu Tỷ lệ diện tích pic Độ thu hồi (%)
Kết quả cho thấy, giá trị độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic và độ thu hồi của ADG đều nằm trong khoảng quy định, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại và độ thu hồi đạt yêu cầu
Kết quả đánh giá các tiêu chí trên cho thấy điều kiện HPLC đã chọn có thể sử dụng để định lượng ADG trong huyết tương thỏ.
Kết quả nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của chất ổn định đến các đặc tính của hệ nano andrographolid
Trong quá trình bào chế nano tinh thể, chất ổn định là một trong những thành phần quan trọng đối với sự hình thành và ổn định hỗn dịch nano [3] Chất ổn định thường sử dụng là các chất diện hoạt, có khả năng hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano, hạn chế sự kết tập tiểu phân nhờ lực đẩy tĩnh điện (với chất diện hoạt ion hoá) hoặc lực cản không gian (với chất diện hoạt không ion hoá) [53] Sự có mặt của chất diện hoạt ở nồng độ thích hợp có ý nghĩa cải thiện độ tan và tốc độ hoà tan dược chất [38] Một số nhóm chất diện hoạt như poloxamer (Poloxamer 407), cremophor (Cremophor RH40) và tween (Tween 80) cũng đã được báo cáo là có khả năng ức chế bơm P-gp tại ruột [6], [39], [66] Những đặc điểm này tương đối phù hợp để góp phần giải quyết những yếu tố cản trở hấp thu của ADG bao gồm độ tan, độ hoà tan thấp và hiện tượng bơm ngược tại ruột non, từ đó nâng cao sinh khả dụng của ADG Từ những thông tin trên, đề tài đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số chất diện hoạt không ion hoá: Poloxamer 407, Cremophor RH
40 và Tween 80 tới đặc tính của hệ nano andrographolid
31 Đánh giá kích thước tiểu phân
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và loại chất ổn định đến kích thước tiểu phân của nano ADG
Loại chất diện hoạt Nồng độ KTTP TB PDI
Tiến hành đánh giá kích thước tiểu phân của ADG từ các công thức theo phần 2.3.2.2a, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3
Theo chiều tăng của nồng độ chất diện hoạt, kích thước tiểu phân có xu hướng giảm Tuy nhiên, với Poloxamer 407, khi nồng độ chất diện hoạt tăng, kích thước tiểu phân giảm Nồng độ chất diện hoạt tương ứng với mẫu có KTTPTB nhỏ nhất với mỗi chất diện hoạt lần lượt là: 1% đối với Poloxamer 407 và 5% đối với Cremophor RH 40 và Tween
Với các chất diện hoạt, khi KLPT tăng, kích thước phân tử chất diện hoạt tăng, cản trở sự kết tập tiểu phân tốt hơn, giúp tiểu phân nano tạo thành dễ đạt và duy trì kích thước nhỏ Poloxamer 407 có KLPT lớn nhất, do đó ở nồng độ 1%, nó đã cho KTTP nhỏ hơn
300 nm, trong khi Cremophor RH40 và Tween 80 ở nồng độ 5% mới cho tiểu phân có kích thước xấp xỉ 300 nm
Về nồng độ chất diện hoạt, khi nồng độ tăng dần tới một ngưỡng tối ưu, khả năng bao phủ bề mặt tiểu phân nano tăng, giúp tiểu phân nano dễ đạt và duy trì kích thước nhỏ [53] Tuy nhiên, khi tăng nồng độ chất ổn định cao vượt ngưỡng tối ưu, quá trình nghiền có thể bị cản trở do độ nhớt lớn của hệ, ngoài ra, độ nhớt lớn còn tăng khả năng lưu giữ bọt khí trong dịch, tạo thành bề mặt lỏng-khí cạnh tranh hấp phụ chất ổn định [88] Poloxamer 407 là chất diện hoạt có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cơ bản tương đối cao, ngưỡng nồng độ tối ưu thấp hơn nồng độ giới hạn được khảo sát, do đó có thể quan sát được hiện tượng này
32 Đánh giá độ tan của nano andrographolid
Hình 3.3 Độ tan của ADG trong nước của công thức chứa các chất ổn định với nồng độ khác nhau
Tiến hành đánh giá độ tan của ADG từ các công thức theo phần 2.3.2.2a, kết quả được thể hiện ở hình 3.3 và 3.4
Xét về môi trường đệm pH 6,8 và môi trường nước, có thể thấy độ tan của ADG trong các công thức khác nhau không đáng kể (p > 0,05) trong dung môi nước và môi trường đệm phosphat 6,8 Điều này phù hợp với cấu trúc của ADG, ADG không có các nhóm chức có tính acid hoặc base đủ mạnh để chuyển sang dạng ion hóa trong dung môi nước hay môi trường đệm phosphat pH 6,8
Xét theo chiều tăng dần của nồng độ chất diện hoạt, với Tween 80 và Cremophor RH40 đều thấy nếu tăng nồng độ các chất diện hoạt, độ tan của ADG tăng dần Ngược lại
Nồng độ của chất diện hoạt (kl/tt)
Nồng độ chất diện hoạt (kl/tt)
Hình 3.4 Độ tan của ADG trong đệm phosphate pH 6,8 của công thức chứa các chất ổn định với nồng độ khác nhau
33 với Poloxamer 407, khi tăng nồng độ Poloxamer 407 thì độ tan của ADG giảm dần Điều này phù hợp với lý thuyết khi kích thước tiểu phân của ADG giảm, năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc tăng lên, làm tăng độ tan của ADG
Xét ở nồng độ 1%, 3% hay 5% của các chất diện hoạt, độ tan của công thức chứa Poloxamer 407 luôn có độ tan cao hơn công thức chứa Cremophor RH40 và Tween 80 Ngoài cơ chế tăng độ tan do giảm kích thước tiểu phân, trong cơ chế hình thành micell, một trong những cơ chế làm tăng độ tan của một chất không phân cực là tăng thể tích lõi kị nước, nơi chứa đựng các tiểu phân dược chất ít tan Khi chiều dài phần kị nước dài hơn, thể tích lõi kị nước tăng, lượng tiểu phân dược chất ít tan sẽ đi vào trong lõi của micell nhiều hơn, làm tăng độ tan của dược chất ít tan [63], [91] Điều này phù hợp với thực tế được thể hiện ở hình 3.5, có thể thấy chiều dài của phần kị nước của Poloxamer
407 dài hơn, đồng nghĩa với việc độ tan của ADG trong công thức chứa Poloxamer 407 1% cao hơn các chất diện hoạt khác Hơn thế nữa, Poloxamer 407 là một chất diện hoạt thân nước mạnh với HLB = 22 [38], giúp hỗ trợ hòa tan dược chất tốt hơn
Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của Tween 80, Poloxamer 407 và Cremophor RH40
34 Đánh giá độ hòa tan của nano andrographolid
Nguyên liệu Cremorphor RH40 Tween 80
Hình 3.4 Độ hòa tan của ADG trong các mẫu bào chế với loại chất ổn định khác nhau và nguyên liệu trong môi trường đệm phosphate pH 6,8 (n=3, TB ± SD)
Tiến hành đánh giá độ hòa tan của ADG với các mẫu chứa các chất ổn định có nồng độ 1% theo phần 2.3.2.2b, kết quả được thể hiện ở hình 3.2 Kết quả cho thấy, độ hòa tan của công thức chứa Poloxamer 407 1% có tốc độ và mức độ hòa tan cao hơn các mẫu khác đáng kể (p < 0,05) Kết quả này phù hợp với lý thuyết, khi kích thước các tiểu phân ADG càng nhỏ, diện tích bề mặt tiếp xúc của dược chất và dung môi tăng, làm tăng tốc độ hòa tan Đánh giá tính thấm của nano andrographolid
Thời điểm (phút) L ư ợ n g d ư ợ c ch ất t h ấm q u a m àn g ( à g /c m 2 )
Nguyên liệu Tween 80 Cremorphor RH40 Poloxamer 407
Hình 3.6 Lượng dược chất thấm qua màng theo thời gian của trong các mẫu bào chế với loại chất ổn định khác nhau và nguyên liệu (n=3, TB ± SE)
Ng uy ên li ệu
Hình 3.7 Hệ số thấm biểu kiến của các mẫu bào chế với loại chất ổn định khác nhau và nguyên liệu (n=3, TB ± SE)
Tiến hành đánh giá lượng dược chất thấm qua màng và hệ số thấm biểu kiến của ADG với các mẫu chứa các chất ổn định có nồng độ 1% theo phần 2.3.2.2.c, kết quả được thể hiện ở hình 3.6 và 3.7 Kết quả cho thấy, lượng ADG thấm qua màng của mẫu chứa Poloxamer 407 1% cao hơn so với mẫu chứa Tween 80 1%, Cremophor RH40 1% và cao nguyên liệu, tuy nhiên xu hướng chưa rõ ràng (p > 0,05) Mặt khác, hệ số thấm biểu kiến mẫu chứa Poloxamer 407 1% cao hơn đáng kể so với mẫu chứa Tween 80 1%, Cremophor RH40 1% và cao nguyên liệu (p < 0,05)
Tiểu phân ADG hấp thu tốt ở phần giữa và dưới của ruột theo cơ chế khuếch tán thụ động [27] Để thấm qua màng ruột, thuốc phải duy trì ở trạng thái hòa tan Đối với các dược chất thuộc nhóm IV theo BCS, nồng độ thuốc có thể hòa tan về bản chất là rất thấp, nên tăng độ hòa tan của dược chất nhằm tăng nồng độ thuốc tự do trong dung dịch có thể tạo ra một động lực quan trọng cho hấp thu [67], [96] Khả năng thấm của công thức chứa Poloxamer 407 1% cao hơn so với các công thức chứa các chất diện hoạt còn lại có thể được giải thích do lượng dược chất được hòa tan tốt hơn
P-glycoprotein (P-gp) là một protein gắn màng glycosyl, có hoạt động như là bơm tống thuốc, sử dụng ATP để vận chuyển nhiều cơ chất khác nhau với cấu trúc đa dạng [72] P-gp làm hạn chế sự hấp thu thuốc bằng cách đưa các phân tử thuốc ngược trở lại
36 trong lòng đường tiêu hóa khi thuốc được hấp thu tại ruột [17] Như vậy, bơm P-gp có tác dụng làm giảm sinh khả dụng của thuốc dùng đường uống, giảm tác dụng điều trị của thuốc
Cơ chế vận chuyển dược chất quay trở lại lòng ruột của bơm P-gp được minh họa bởi Hình 3.8
Hình 3.8 Chu kì vận chuyển cơ chất của bơm P-gp
Trong chu kì vận chuyển, P-gp gắn với ATP và cơ chất Sau khi ATP được thủy phân giải phóng ADP và Pi, hình dạng của vị trí gắn cơ chất thay đổi để giải phóng chúng quay trở lại lòng ống tiêu hóa Hình dạng của vị trí gắn nucleotid cũng thay đổi, làm ATP không thể gắn vào Sau đó, ADP và Pi đã giải phóng trước đó tiếp tục làm thay đổi hình dạng của vị trí gắn nucleotid, giúp chúng gắn được với ATP Khi phân tử ATP khác gắn với P-gp, ATP tiếp tục được thủy phân, tạo nên chu kì vận chuyển mới Như vậy, bất kì yếu tố nào ảnh hưởng đến chu trình vận chuyển của bơm P-gp đều ảnh hưởng đến hoạt động của bơm Poloxamer 407 là một chất ức chế hoàn toàn bơm P-gp bằng cách tương tác với ty thể trong các tế bào, trong khi ty thể chịu trách nhiệm cho việc sản xuất ATP, do đó, làm cạn kiệt ATP [94], đồng thời làm hóa lỏng màng làm ức chế ATPase [18] Trong khi đó, Erin và cộng sự đã chỉ ra Tween 80 và Cremophor RH40 chỉ ức chế 1 phần bơm P-gp do khả năng hóa lỏng màng yếu của chúng [40] Điều này đúng với thực nghiệm khi khả năng thấm của công thức chứa Poloxamer 407 1% tốt hơn so với công thức chứa Tween 80 1% và Cremophor RH40 1%
Kết quả nghiên cứu đánh giá đặc tính của pellet mang nano andrographolid được che vị bằng Eudragit E
Vị đắng của dược chất, đặc biệt andrographolid - “vua của vị đắng” , là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tuân thủ điều trị và hiệu quả lâm sàng của thuốc Do đó, việc che vị là một yếu tố quan trọng trong phát triển công thức bào chế nhằm đảm bảo tuân thủ của bệnh nhân cũng như hiệu quả điều trị cho các chế phẩm thuốc dùng đường uống Tuy nhiên, việc che vị cũng cần phải cân nhắc việc tránh làm cản trở sự giải phóng của dược chất, ảnh hưởng đến sinh khả dụng cũng như tác dụng điều trị của ADG
DS Nguyễn Quốc Hoài đã bào chế thành công pellet mang nano ADG để cải thiện độ hòa tan và sinh khả dụng của dược chất, tuy nhiên, pellet sau khi bào chế vẫn chưa giải quyết được vấn đề độ đắng của dược chất bởi màng bao beta-glucan chưa cho thấy rõ ràng sự hiệu quả trong che vị [4]
Eudragit E có đặc điểm không tan ở pH ≥ 5, nhưng có thể hòa tan nhanh chóng bằng cách tạo thành muối ở pH ≤ 5 [44] Vì những đặc điểm đó, đề tài tiến hành nghiên cứu hiệu quả che vị của màng bao Eudragit E với pellet mang nano ADG
Khả năng che vị in vitro của pellet sau bao Eudragit E
Tiến hành đánh giá khả năng che vị của màng bao Eudragit E theo mục 2.3.2.3.a Kết quả cho thấy, pellet mang nano ADG sau khi bao Eudragit E với độ dày màng 20% cho nồng độ ADG tự do là 0,86 ± 0,02 μg/ml, nhỏ hơn ngưỡng đắng của nguyên liệu là 1,28 μg/ml [4] Như vậy, pellet sau bao Eudragit E với độ dày 20% đã che vị hiệu quả cho vị đắng của ADG như báo cáo của Marie và các cộng sự [35]
Khả năng giải phóng andrographolid trong môi trường HCl pH 1,2
Mứcđộ giải phóng dược chất (%)
Nguyên liệu Pellet nano ADG
Hình 3.9 Khả năng giải phóng ADG từ pellet mang nano ADG và Eudragit E
Tiến hành đánh giá khả năng giải phóng dược chất ở môi trường HCl pH 1,2 theo mục 2.3.2.3b và kết quả được thể hiện ở hình 3.3.2 Có thể thấy rằng, tốc độ giải phóng ADG từ pellet chậm ở 10 phút đầu, khi mà màng bao Eudragit E chưa được rã hoàn toàn, ADG sẽ giải phóng từ từ, khuếch tán qua lớp Eudragit E trương nở Sau thời điểm đó, khi màng bao Eudragit E được rã hoàn toàn, mức độ giải phóng của ADG sẽ giống như pellet chỉ bồi nano ADG Như vậy, lớp bao Eudragit E chỉ làm chậm giải phóng ADG trong 10 phút đầu, sau đó không ảnh hưởng đến khả năng giải phóng của nano ADG, cho thấy màng bao Eudragit E phù hợp cho mục đích che vị
Quan sát hình thái màng bao bằng kính hiển vi điện tử quét
Bằng cách quan sát hình thái hệ tiểu phân nano ADG bằng SEM được thể hiện ở Hình 3.10, DS Nguyễn Hữu Mạnh đã chỉ ra rằng các tiểu phân của hỗn dịch nano ADG sau khi hóa rắn có kích thước khá đồng đều với KTTP TB là 233,4 ± 40,9 nm, tương đồng với kết quả KTTP TB đã khảo sát ở máy nghiền Retsch MM200 Điều này cho thấy quá trình hóa rắn không ảnh hưởng đến KTTP
Hình 3.10 Hình ảnh chụp SEM tiểu phân nano ADG [2]
Tiến hành quan sát hình thái màng bao trên mặt cắt pellet tối ưu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Quy trình chuẩn bị mẫu theo phương pháp ghi ở phần 2.3.2.3b, kết quả được thể hiện ở hình 3.11 a) Độ phóng đại 150 lần b) Độ phóng đại 1000 lần
Hình 3.11 Hình ảnh chụp SEM mặt cắt của pellet mang nano ADG và Eudragit E ở các độ phóng đại khác nhau (a, b)
Từ hình 3.11, có thể thấy độ dày màng bao trên pellet tương đối đồng đều, màng bao gồm hai lớp, lớp nano ADG ở bên trong và Eudragit E ở bên ngoài Khi tăng độ phóng đại lên vào từng lớp, có thể thấy các tiểu phân nano đã được bồi theo từng lớp lên
Kết quả đánh giá sinh khả dụng của pellet chứa nano andrographolid và
Kết luận: Từ các đánh giá trên, có thể kết luận pellet nano ADG sau khi bồi Eudragit
E với độ dày 20% đã che vị hiệu quả cho ADG và không ảnh hưởng đến khả năng giải phóng của dược chất
3.4 Kết quả đánh giá sinh khả dụng của pellet chứa nano andrographolid và Eudragit E
Tiến hành thí nghiệm đánh giá sinh khả dụng của pellet mang nano ADG như đã trình bày ở mục 2.3.2.4 Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.10
Bảng 3.4 Thông số dược động học của ADG đánh giá trên mô hình thỏ
Thông số Nguyên liệu Pellet mang nano ADG
Nguyên liệu Pellet chứa nano ADG
Hình 3.10 Nồng độ ADG trong huyết tương thỏ của mẫu nguyên liệu và pellet tối ưu
Từ Bảng 3.4 và Hình 3.10 có thể thấy: so với nguyên liệu gốc, chỉ số AUC0-∞ và
Cmax của pellet nano ADG cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) với AUC0-∞ cao gấp 2,3 lần và Cmax cao gấp 5,27 lần, còn Tmax giảm từ 180 phút xuống 142,5 phút Có thể thấy
Tmax của nguyên liệu và pellet gần như không thay đổi Khi xuống dạ dày thỏ, tiếp xúc với môi trường acid của dịch dạ dày, lớp vỏ Eudragit E trương nở, nano ADG giải phóng từ từ Sau đó, lớp Eudragit E đã được rã hoàn toàn, lượng nano ADG được giải phóng ồ ạt Sự cải thiện về hấp thu này là do nano ADG có độ tan và độ hoà tan cao gấp nhiều lần so với nguyên liệu (theo định luật Fick thì độ tan càng lớn tốc độ hấp thu theo cơ chế khuếch tán thụ động càng tăng), ngoài ra Poloxamer 407 còn có vai trò của chất ức chế bơm tống thuốc P-gp [34], vì vậy tốc độ và mức độ hấp thu của nano ADG đều tăng lên rõ rệt so với nguyên liệu gốc Như vậy, kết quả của thử nghiệm đánh giá sinh khả dụng đường uống đã chứng minh được ý nghĩa cải thiện khả năng hấp thu của nano ADG, làm cơ sở cho việc tăng cường tác dụng của nano ADG so với nguyên liệu gốc
Từ những đánh giá trên có thể thấy, pellet bồi nano ADG và Eudragit E đã cải thiện mức độ hấp thu của ADG, từ đó nâng cao sinh khả dụng của dược chất Việc nâng cao sinh khả dụng của dược chất giúp giảm liều cần uống vào cơ thể bệnh nhân, từ đó giảm thiểu được những tác dụng phụ cho bệnh nhân và giúp đạt hiệu quả điều trị mong muốn
42 Đồng thời, pellet che giấu vị đắng của dược chất một cách hiệu quả, làm tăng tính dễ chịu khi sử dụng, đặc biệt quan trọng đối với các bệnh nhân nhạy cảm với mùi vị khó chịu Điều này có thể cải thiện sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân, giúp họ duy trì liệu trình điều trị đầy đủ và đúng cách
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Để tiếp tục hoàn thiện và phát triển nghiên cứu, đề tài xin đưa ra một số kiến nghị sau đây:
1 Nghiên cứu bào chế viên nén chứa pellet nano adrographolid và nâng cấp quy mô bào chế
2 Nghiên cứu đánh giá các cơ chế tăng tính thấm của công thức tối ưu
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Đặng Thị Huế (2023), Nghiên cứu bào chế và đánh giá tính thấm của hệ nano tự nhũ hóa chứa silymarin, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà
2 Nguyễn Hữu Mạnh (2022), Bước đầu ứng dụng phương pháp nghiền bi trong bào chế hệ nano andrographolid và betaglucan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp
3 Nguyễn Ngọc Chiến (2019), Công nghệ nano và ứng dụng trong sản xuất thuốc,
Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp
4 Nguyễn Quốc Hoài (2023), Nghiên cứu bào chế pellet che vị chứa nano andrographolid và nano betaglucan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp
5 Acra Sari A., Ghishan Fayez K (1991), "Methods of investigating intestinal transport", Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 15(3), pp 93S-98S
6 Al-Mohizea A M., Zawaneh F., et al (2014), "Effect of pharmaceutical excipients on the permeability of P-glycoprotein substrate", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 24(5), pp 491-495
7 Amroyan E., Gabrielian E., et al (1999), "Inhibitory effect of andrographolide from Andrographis paniculata on PAF-induced platelet aggregation",
8 Andersgaard H., Finholt P., et al (1974), "Rate studies on dissolution and enzymatic hydrolysis of chloramphenicol palmitate", Acta Pharm Suec, 11(3), pp 239-48
9 Antonio Lopalco, Nunzio Denora , et al (2020), "Taste masking of propranolol hydrochloride by microbeads of EUDRAGIT® E PO obtained with prilling technique for paediatric oral administration", International Journal of Pharmaceutics, 574, pp
10 Artursson Per, Karlsson J (1991), "Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells", Biochemical and biophysical research communications, 175(3), pp 880-885
11 Artursson Per, Palm Katrin, et al (2001), "Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport", Advanced drug delivery reviews, 46(1- 3), pp 27-43
12 Awortwe Charles, Fasinu P S., et al (2014), "Application of Caco-2 cell line in herb-drug interaction studies: current approaches and challenges", Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences: a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques,
13 Ayenew Z., Puri V., et al (2009), "Trends in pharmaceutical taste masking technologies: a patent review", Recent Pat Drug Deliv Formul, 3(1), pp 26-39
14 Balap Aishwarya, Atre Bhagyashri, et al (2016), "Pharmacokinetic and pharmacodynamic herb–drug interaction of Andrographis paniculata (Nees) extract and andrographolide with etoricoxib after oral administration in rats",
15 Balap Aishwarya, Lohidasan Sathiyanarayanan, et al (2017), "Herb-drug interaction of Andrographis paniculata (Nees) extract and andrographolide on pharmacokinetic and pharmacodynamic of naproxen in rats", Journal of ethnopharmacology, 195, pp 214-221
16 Balap Aishwarya, Lohidasan Sathiyanarayanan, et al (2017), "Pharmacokinetic and pharmacodynamic interaction of andrographolide and standardized extract of Andrographis paniculata (Nees) with nabumetone in Wistar rats", Phytotherapy Research, 31(1), pp 75-80
17 Bansal T., Akhtar N., et al (2009), "Novel formulation approaches for optimising delivery of anticancer drugs based on P-glycoprotein modulation", Drug Discov Today, 14(21-22), pp 1067-74
18 Batrakova E V., Li S., et al (2001), "Mechanism of pluronic effect on P- glycoprotein efflux system in blood-brain barrier: contributions of energy depletion and membrane fluidization", J Pharmacol Exp Ther, 299(2), pp 483-93
19 Behzadi S S., Toegel S., et al (2008), "Innovations in coating technology", Recent
Pat Drug Deliv Formul, 2(3), pp 209-30
20 Bley O., Siepmann J., et al (2009), "Characterization of moisture-protective polymer coatings using differential scanning calorimetry and dynamic vapor sorption", J Pharm Sci, 98(2), pp 651-64
21 Bothiraja C., Pawar Atmaram P., et al (2009), "Eudragit® EPO Based
Nanoparticle Suspension of Andrographolide: In Vitro and In Vivo", Nanoscience and Nanotechnology Letters, 1(3), pp 156-164
22 Burton Philip S., Goodwin Jay T., et al (2002), "Predicting drug absorption: how nature made it a difficult problem", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 303(3), pp 889-895
23 Cava M P., Chan W R., et al (1962), "The structure of andrographolide",
24 Chellampillai Bothiraja, Pawar Atmaram Pandurang (2011), "Improved bioavailability of orally administered andrographolide from pH-sensitive nanoparticles", European journal of drug metabolism and pharmacokinetics, 35, pp 123-129
25 Chen Meili, Xie Chunying, et al (2010), "Solubility of Andrographolide in
Various Solvents from (288.2 to 323.2) K", Journal of Chemical & Engineering
26 Chien Chao-Feng, Wu Yu-Tse, et al (2010), "Herb–drug interaction of
Andrographis paniculata extract and andrographolide on the pharmacokinetics of theophylline in rats", Chemico-biological interactions, 184(3), pp 458-465
27 Daodee S., Wangboonskul J., et al (2007), "Membrane transport of andrographolide in artificial membrane and rat small intestine", Pak J Biol Sci,
28 Du Ping, Jiang Qikun, et al (2016), "Nanonization of andrographolide by a wet milling method: the effects of vitamin E TPGS and oral bioavailability enhancement", RSC Advances, 6(103), pp 101404-101414
29 Egan William J., Lauri Georgio (2002), "Prediction of intestinal permeability",
Advanced drug delivery reviews, 54(3), pp 273-289
30 Eugenie Mussard, Annabelle Cesaro, et al (2019), "Andrographolide, A Natural
Antioxidant: An Update", Antioxidants, 8, pp 20
31 Fagerholm Urban, Johansson Monica, et al (1996), "Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum", Pharmaceutical research,
32 George M., Ghosh I (2013), "Identifying the correlation between drug/stabilizer properties and critical quality attributes (CQAs) of nanosuspension formulation prepared by wet media milling technology", Eur J Pharm Sci, 48(1-2), pp 142-
33 Groenen Martien A M., Archibald Alan L., et al (2012), "Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution", Nature,
34 Guan Yanbin, Huang Jiangeng, et al (2011), "Effect of pluronic P123 and F127 block copolymer on P-glycoprotein transport and CYP3A metabolism", Archives of Pharmacal Research, 34(10), pp 1719-1728
35 Guhmann M., Preis M., et al (2015), "Design, development and in-vitro evaluation of diclofenac taste-masked orodispersible tablet formulations", Drug Dev Ind Pharm, 41(4), pp 540-51
36 Han M., Yu Q., et al (2018), "Preparation and Characterization of a Novel
Aqueous Dispersion for Enteric Coating of Pantoprazole Sodium Pellets", Acta Pharm, 68(4), pp 441-455
37 Haslam Iain S., O'Reilly Derek A., et al (2011), "Pancreatoduodenectomy as a source of human small intestine for Ussing chamber investigations and comparative studies with rat tissue", Biopharmaceutics & drug disposition, 32(4), pp 210-221
38 Heng Paul W S., Wan Lucy S C., et al (1990), "Role of Surfactant on Drug
Release from Tablets", Drug Development and Industrial Pharmacy, 16(6), pp
39 Huang Jiangeng, Si Luqin, et al (2008), "Effect of pluronic F68 block copolymer on P-glycoprotein transport and CYP3A4 metabolism", International Journal of Pharmaceutics, 356(1), pp 351-353
40 Hugger E D., Novak B L., et al (2002), "A comparison of commonly used polyethoxylated pharmaceutical excipients on their ability to inhibit P- glycoprotein activity in vitro", J Pharm Sci, 91(9), pp 1991-2002
41 Hussain M A., Aungst B J., et al (1988), "Improved buccal delivery of opioid analgesics and antagonists with bitterless prodrugs", Pharm Res, 5(9), pp 615-8
42 Incecayir Tuba, Tsume Yasuhiro, et al (2013), "Comparison of the permeability of metoprolol and labetalol in rat, mouse, and Caco-2 cells: use as a reference standard for BCS classification", Molecular pharmaceutics, 10(3), pp 958-966
43 Iruretagoyena M I., Tobar J A., et al (2005), "Andrographolide interferes with T cell activation and reduces experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse", J Pharmacol Exp Ther, 312(1), pp 366-72
44 Ishikawa T., Watanabe Y., et al (1999), "Preparation and evaluation of tablets rapidly disintegrating in saliva containing bitter-taste-masked granules by the compression method", Chem Pharm Bull (Tokyo), 47(10), pp 1451-4
45 Jayakumar T., Hsieh C Y., et al (2013), "Experimental and Clinical
Pharmacology of Andrographis paniculata and Its Major Bioactive
Phytoconstituent Andrographolide", Evid Based Complement Alternat Med, 2013, pp 846740
46 Jiang Yunxia, Wang Fang, et al (2014), "Development of andrographolide loaded
PLGA microspheres: Optimization, characterization and in vitro–in vivo correlation", International Journal of Pharmaceutics, 475(1), pp 475-484
47 Katsuragi Y., Sugiura Y., et al (1995), "Selective inhibition of bitter taste of various drugs by lipoprotein", Pharm Res, 12(5), pp 658-62
48 Kharb V., Saharan V A., et al (2014), "Formulation and evaluation of lipid based taste masked granules of ondansetron HCl", Eur J Pharm Sci, 62, pp 180-8
49 Larregieu Caroline A., Benet Leslie Z (2013), "Drug discovery and regulatory considerations for improving in silico and in vitro predictions that use Caco-2 as a surrogate for human intestinal permeability measurements", The AAPS journal,
50 Lennernọs H., Palm K., et al (1996), "Comparison between active and passive drug transport in human intestinal epithelial (Caco-2) cells in vitro and human jejunum in vivo", International journal of pharmaceutics, 127(1), pp 103-107
51 Li Hewei, Dong Ling, et al (2014), "Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats", International Journal of Pharmaceutics, 466(1-2), pp 133-138
52 Li Hong, Jin Hyo-Eon, et al (2013), "An improved prediction of the human in vivo intestinal permeability and BCS class of drugs using the in vitro permeability ratio obtained for rat intestine using an Ussing chamber system", Drug development and industrial pharmacy, 39(10), pp 1515-1522
53 Li J., Wang Z., et al (2021), "Progress in the development of stabilization strategies for nanocrystal preparations", Drug Deliv, 28(1), pp 19-36
54 Lipkowitz K B (1998), "Applications of Computational Chemistry to the Study of Cyclodextrins", Chem Rev, 98(5), pp 1829-1874
55 Liu P., De Wulf O., et al (2013), "Dissolution studies of poorly soluble drug nanosuspensions in non-sink conditions", AAPS PharmSciTech, 14(2), pp 748-56
56 Loureiro Damasceno J P., Silva da Rosa H., et al (2022), "Andrographis paniculata Formulations: Impact on Diterpene Lactone Oral Bioavailability", Eur
57 Lu M Y., Borodkin S., et al (1991), "A polymer carrier system for taste masking of macrolide antibiotics", Pharm Res, 8(6), pp 706-12
58 Lu W J., Lee J J., et al (2011), "A novel role of andrographolide, an NF-kappa B inhibitor, on inhibition of platelet activation: the pivotal mechanisms of endothelial nitric oxide synthase/cyclic GMP", J Mol Med (Berl), 89(12), pp
59 Mariappan T T., Singh Saranjit (2004), "Evidence of efflux-mediated and saturable absorption of rifampicin in rat intestine using the ligated loop and everted gut sac techniques", Molecular pharmaceutics, 1(5), pp 363-367
60 Matsui R., Uchida S., et al (2015), "Combination effect of physical and gustatory taste masking for propiverine hydrochloride orally disintegrating tablets on palatability", Biol Pharm Bull, 38(1), pp 17-22
61 Nugroho A E., Andrie M., et al (2012), "Antidiabetic and antihiperlipidemic effect of Andrographis paniculata (Burm f.) Nees and andrographolide in high- fructose-fat-fed rats", Indian J Pharmacol, 44(3), pp 377-81
62 Panossian A., Hovhannisyan A., et al (2000), "Pharmacokinetic and oral bioavailability of andrographolide from Andrographis paniculata fixed combination Kan Jang in rats and human", Phytomedicine, 7(5), pp 351-364
63 Park S., Mun S., et al (2020), "Influences of added surfactants on the water solubility and antibacterial activity of rosemary extract", Food Sci Biotechnol,
64 Patterson Jannine K., Lei Xin Gen, et al (2008), "The pig as an experimental model for elucidating the mechanisms governing dietary influence on mineral absorption", Experimental Biology and Medicine, 233(6), pp 651-664
65 Petrovick G F., Breitkreutz J., et al (2016), "Taste-masking properties of solid lipid based micropellets obtained by cold extrusion-spheronization", Int J Pharm, 506(1-2), pp 361-70
66 Pollard John, Rajabi-Siahboomi Ali, et al (2019), "High-throughput screening of excipients with a biological effect: a kinetic study on the effects of surfactants on efflux-mediated transport", Journal of Pharmacy and Pharmacology, 71(6), pp
67 Porter Christopher J H., Anby Mette U., et al (2011), "Lipid-based formulations: exploring the link between in vitro supersaturation and in vivo exposure", Bulletin
68 Prakash S Eugine Leo, Manavalan R %J Int J Pharm Pharm Sci (2012),
"Development, characterization and toxicity evaluation of nanoparticles of andrographolide", 4(1), pp 497-501
69 Refaat A., Sokar M., et al (2016), "A dual strategy to improve psychotic patients' compliance using sustained release quetiapine oral disintegrating tablets", Acta Pharm, 66(4), pp 515-532
70 Rozehnal Veronika, Nakai Daisuke, et al (2012), "Human small intestinal and colonic tissue mounted in the Ussing chamber as a tool for characterizing the intestinal absorption of drugs", European Journal of Pharmaceutical Sciences,
71 Ruan L P., Chen S., et al (2006), "Prediction of human absorption of natural compounds by the non-everted rat intestinal sac model", European journal of medicinal chemistry, 41(5), pp 605-610
72 Sharom F J (1997), "The P-glycoprotein efflux pump: how does it transport drugs?", J Membr Biol, 160(3), pp 161-75
73 Shegokar R., Muller R H (2010), "Nanocrystals: industrially feasible multifunctional formulation technology for poorly soluble actives", Int J Pharm,
74 Shen Y C., Chen C F., et al (2002), "Andrographolide prevents oxygen radical production by human neutrophils: possible mechanism(s) involved in its anti- inflammatory effect", Br J Pharmacol, 135(2), pp 399-406
75 Sinko Patrick J., Leesman Glen D., et al (1991), "Predicting fraction dose absorbed in humans using a macroscopic mass balance approach", Pharmaceutical research, 8, pp 979-988
76 Sjửberg Åsa, Lutz Mareike, et al (2013), "Comprehensive study on regional human intestinal permeability and prediction of fraction absorbed of drugs using the Ussing chamber technique", European Journal of Pharmaceutical Sciences,
77 Smail Shahla, Ghareeb Mowafaq, et al (2021), "Studies on Surfactants,
Cosurfactants, and Oils for Prospective Use in Formulation of Ketorolac Tromethamine Ophthalmic Nanoemulsions", Pharmaceutics, 13, pp 467
78 Song Im-Sook, Nam So-Jeong, et al (2021), "Enhanced bioavailability and efficacy of silymarin solid dispersion in rats with acetaminophen-induced hepatotoxicity", Pharmaceutics, 13(5), pp 628
79 Songvut P., Suriyo T., et al (2022), "A comprehensive review on disposition kinetics and dosage of oral administration of Andrographis paniculata, an alternative herbal medicine, in co-treatment of coronavirus disease", Front Pharmacol, 13, pp 952660
80 Sriwongjanya M., Bodmeier R (1998), "Effect of ion exchange resins on the drug release from matrix tablets", Eur J Pharm Biopharm, 46(3), pp 321-7
81 Stange Ulrike, Führling Christian, et al (2014), "Taste masking of naproxen sodium granules by fluid-bed coating", Pharmaceutical Development and Technology, 19(2), pp 137-147
82 Strickley R G., Iwata Q., et al (2008), "Pediatric drugs a review of commercially available oral formulations", J Pharm Sci, 97(5), pp 1731-74
83 Sun D Z., Li L., et al (2006), "Isothermal titration calorimetry and 1H NMR studies on host-guest interaction of paeonol and two of its isomers with beta- cyclodextrin", Int J Pharm, 316(1-2), pp 7-13
84 Suo Xu‐Bin, Zhang Han, et al (2007), "HPLC determination of andrographolide in rat whole blood: study on the pharmacokinetics of andrographolide incorporated in liposomes and tablets", Biomedical Chromatography, 21(7), pp 730-734
85 Syukri Yandi, Martien Ronny, et al (2018), "Novel Self-Nano Emulsifying Drug
Delivery System (SNEDDS) of andrographolide isolated from Andrographis paniculata Nees: Characterization, in-vitro and in-vivo assessment", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 47, pp 514-520
86 Szejtli J., Szente L (2005), "Elimination of bitter, disgusting tastes of drugs and foods by cyclodextrins", Eur J Pharm Biopharm, 61(3), pp 115-25
87 Trivedi N P., Rawal U M (2001), "Hepatoprotective and antioxidant property of
Andrographis paniculata (Nees) in BHC induced liver damage in mice", Indian J
88 Van Eerdenbrugh Bernard, Vermant Jan, et al (2009), "A screening study of surface stabilization during the production of drug nanocrystals", Journal of Pharmaceutical Sciences, 98(6), pp 2091-2103
89 Verhoeckx Kitty, Cotter Paul, et al (2015), "The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models", pp 211-273
90 Verma N., Vinayak M (2008), "Antioxidant action of Andrographis paniculata on lymphoma", Mol Biol Rep, 35(4), pp 535-40
91 Vinarov Zahari, Dobreva Petra, et al (2017), "Effect of surfactant molecular structure on Progesterone solubilization", Journal of Drug Delivery Science and
92 Volpe Donna A (2010), "Application of method suitability for drug permeability classification", The AAPS journal, 12, pp 670-678
93 Walters Eric M., Agca Yuksel, et al (2011), "Animal models got you puzzled?: think pig", Annals of the New York Academy of Sciences, 1245(1), pp 63-64
94 Wei Z., Yuan S., et al (2013), "Mechanism of inhibition of P-glycoprotein mediated efflux by Pluronic P123/F127 block copolymers: relationship between copolymer concentration and inhibitory activity", Eur J Pharm Biopharm, 83(2), pp 266-74
95 Westerhout Joost, van de Steeg Evita, et al (2014), "A new approach to predict human intestinal absorption using porcine intestinal tissue and biorelevant matrices", European Journal of Pharmaceutical Sciences, 63, pp 167-177
96 Williams Hywel D., Anby Mette U., et al (2012), "Toward the establishment of standardized in vitro tests for lipid-based formulations 2 The effect of bile salt concentration and drug loading on the performance of type I, II, IIIA, IIIB, and IV formulations during in vitro digestion", Molecular pharmaceutics, 9(11), pp
97 Xu H., Staszewski L., et al (2004), "Different functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors", Proc Natl Acad Sci U S A, 101(39), pp 14258-
98 Yan Yu, Fang Lian-Hua, et al (2018), "Andrographolide", Natural Small
Molecule Drugs from Plants, Du Guan-Hua, Springer Singapore, Singapore, pp
99 Yan Yu, Fang Lian-Hua, et al (2018), "Andrographolide", Natural Small
Molecule Drugs from Plants, pp 357–362
100 Yang T., Shi H X., et al (2013), "Hypolipidemic effects of andrographolide and neoandrographolide in mice and rats", Phytother Res, 27(4), pp 618-23
101 Yang Yongsheng, Zhao Y., et al (2017), "Oral drug absorption: Evaluation and prediction", Developing solid oral dosage forms, Elsevier, pp 331-354
102 Ye L., Wang T., et al (2011), "Poor oral bioavailability of a promising anticancer agent andrographolide is due to extensive metabolism and efflux by P- glycoprotein", J Pharm Sci, 100(11), pp 5007-17
103 Yen Ching-Chi, Chen Yi-Chen, et al (2018), "Nanoemulsion as a strategy for improving the oral bioavailability and anti-inflammatory activity of andrographolide", International journal of nanomedicine, 13, pp 669
104 Zeng B., Wei A., et al (2022), "Andrographolide: A review of its pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and clinical trials and pharmaceutical researches",
105 Zhao Jingxiang, Yang Gengliang, et al (2002), "Determination of
Andrographolide, Deoxyandrographolide and Neoandrographolide in the Chinese Herb Andrographis paniculata by Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography", Phytochemical Analysis, 13, pp 222-227
106 Zhu R., Zhang Y., et al (2024), "Wogonoside alleviates microglia-mediated neuroinflammation via TLR4/MyD88/NF-kappaB signaling axis after spinal cord injury", Eur J Pharmacol, 973, pp 176566
Phụ lục 1 Pic sắc kí của andrographolid 55
Phụ lục 2: Hình ảnh kết quả đo mẫu trên thiết bị Zetasizer ZS90 57
Phụ lục 3 Độ tan của nano andrographolid trong môi trường nước và đệm phosphat pH 6,8 58
Phụ lục 4 Độ hòa tan của andrographolid 59
Phụ lục 5 Tính thẩm của andrographolid 60
Phụ lục 6 Kết quả nồng độ andrographolid trong huyết tương của mô hình đánh giá sinh khả dụng đường uống trên thỏ 60