NGUYỄN THU hà NGHIÊN cứu tác DỤNG bảo vệ THẦN KINH của TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS) TRÊN mô HÌNH đột QUỴ não THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sỹ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS) TRÊN MƠ HÌNH ĐỘT QUỴ NÃO THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HÀ Mã sinh viên: 1701132 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS) TRÊN MƠ HÌNH ĐỘT QUỴ NÃO THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế TS Lê Thị Xoan Nơi thực hiện: Viện Dược Liệu HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập rèn luyện Trường Đại học Dược Hà Nội, em nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô anh chị trực tiếp hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Bộ môn Dược lực – cô tạo điều kiện có góp ý để giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp TS Lê Thị Xoan – Khoa Dược lý, sinh hoá Viện Dược Liệu – với kinh nghiệm quý báu người trước, cô tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện suốt trình làm thực nghiệm TS Hà Vân Oanh – Bộ môn Dược học cổ truyền – cô ln hết lịng giúp đỡ em từ lúc bắt đầu tới lúc gặp khó khăn q trình thực đề tài ThS Nguyễn Thị Thanh Loan – Nghiên cứu sinh Viện Dược Liệu, ThS Trần Nguyên Hồng – nghiên cứu viên Viện Dược Liệu nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức thực tế quý báu có góp ý kịp thời giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể cán Khoa Dược lý, sinh hố Viện Dược Liệu ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo cho em lời động viên, khích lệ để em có thêm động lực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội luôn nhiệt huyết giảng dạy, quan tâm tạo điều kiện tốt cho sinh viên suốt năm học tập rèn luyện trường thân yêu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln bên động viên, khích lệ học tập sống Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên, Nguyễn Thu Hà MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tai biến mạch máu não 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại, nguyên nhân 1.1.3 Đặc điểm hệ thống động mạch máu não 1.1.4 não Đặc điểm sinh lý tuần hoàn não chế tự điều hòa cung lượng máu 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh đột quỵ nhồi máu não 1.1.5.1 Vùng lõi thiếu máu vùng penumbra (vùng tranh tối tranh sáng) 1.1.5.2 Ảnh hưởng thiếu máu não cục cấp độ tế bào 1.1.5.3 Ảnh hưởng thiếu máu não cục toàn cấu trúc não 1.1.5.4 Phù não 1.1.6 1.2 Điều trị đột quỵ nhồi máu não Mơ hình gây nhồi máu não thực nghiệm 10 1.2.1 Tổng quan mơ hình 10 1.2.2 Thuyên tắc động mạch não (MCAO)- Mơ hình Intraluminal suture 12 1.3 Tổng quan tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai & K.M.Feng) 13 1.3.1 Vị trí phân loại 13 1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 13 1.3.3 Thành phần hóa học 14 1.3.4 Tác dụng dược lý 16 1.3.4.1 Tác dụng tiêu sợi huyết 16 1.3.4.2 Tác dụng giảm đau chống viêm 16 1.3.4.3 Tác dụng chống ung thư 17 1.3.4.4 Tác dụng sinh sản 17 1.3.4.5 Tác dụng tăng sức đề kháng thể 17 1.3.4.6 Tác dụng bảo vệ thần kinh 18 1.3.5 Công dụng 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Động vật thí nghiệm 19 2.1.3 Hoá chất, trang thiết bị 19 2.1.3.1 Hoá chất 19 2.1.3.2 Trang thiết bị, dụng cụ 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Mơ hình gây tắc động mạch não (Middle cerebral artery occlusion – MCAO) 22 2.2.2 Đánh giá tổn thương thần kinh 23 2.2.3 Thí nghiệm quay góc (corner test) 24 2.2.4 Định lượng nồng độ malondialdehyd (MDA) vỏ não chuột phương pháp đo quang 24 2.2.5 Đánh giá chức hàng rào máu não 25 2.2.6 Phương pháp phân tích số liệu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ 27 3.1 Ảnh hưởng cao chiết tam thất hoang lên cân nặng chuột sau phẫu thuật MCAO 27 3.2 Ảnh hưởng cao chiết tam thất hoang lên chức thần kinh vận động chuột MCAO 28 3.2.1 Cao tam thất hoang cải thiện điểm chức thần kinh chuột MCAO 28 3.2.2 Cao tam thất hoang cải thiện chức vận động chuột MCAO thử nghiệm quay góc 29 3.3 Ảnh hưởng cao chiết tam thất hoang lên nồng độ malondialdehyde (MDA) não chuột MCAO 30 3.4 Ảnh hưởng cao chiết tam thất lên chức hàng rào máu não chuột MCAO 31 3.4.1 Ảnh hưởng cao chiết tam thất hoang đến mức độ phù não chuột 31 3.4.2 Ảnh hưởng cao chiết tam thất hoang đến tính thấm hàng rào máu não 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 4.1 Mơ hình thun tắc động mạch não (MCAO) – Mơ hình Intralumianl suture 34 4.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh tam thất hoang 36 4.3 Cơ chế tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết tam thất hoang mơ hình MCAO 38 4.3.1 Tác dụng chống oxy hóa cao chiết tam thất hoang 38 4.3.2 Tác dụng bảo vệ hàng rào máu não tam thất hoang 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AHA/ASA American Heart Association/ American Stroke Association (Hiệp hội Tim mạch học/ Hiệp hội Đột quỵ Hoa Kỳ) CBF Cerebrospinal fluid CCA Common carotid artery (Động mạch cảnh chung) ECA External carotid artery (Động mạch cảnh ngoài) EtOH Ethanol ICA Internal carotid artery (Động mạch cảnh trong) MCA Middle cerebral artery (Động mạch não giữa) MCAO Middle cerebral artery occlusion (Thuyên tắc động mạch não giữa) MDA Malondialdehyd tpA Human tissue-type plasminogen activator TTH 150 mg/kg lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 150mg/kg DANH MỤC BẢNG Bảng Trang 1.1 Các hợp chất saponin phân lập từ tam thất hoang 15 2.1 Hóa chất sử dụng đề tài 19 2.2 Các lô chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 21 3.1 Cân nặng chuột sau phẫu thuật MCAO 27 3.2 Điểm đánh giá tổn thương thần kinh chuột sau phẫu thuật MCAO 28 DANH MỤC HÌNH Hình Trang 1.1 Một số mơ hình gây thiếu máu não cục invivo 11 1.2 Hình ảnh rễ củ tam thất hoang 14 1.3 Saponin dẫn chất oleanolic 14 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý cao chiết tam thất hoang 2.2 Sơ đồ gây tắc động mạch não 2.3 Hình ảnh chuột sau phẫu thuật MCAO với thang điểm đánh giá theo thang điểm thần kinh 20 23 23 2.4 Hình ảnh chuột di chuyển thí nghiệm quay góc 24 2.5 Hình ảnh chuột sau tiêm Evans Blue theo đường tiêm tĩnh mạch đuôi 26 3.1 Đồ thị số lần quay trái chuột 29 3.2 Đồ thị biểu diễn nồng độ MDA não chuột 30 3.3 Hình ảnh não chuột sau tiêm Evans Blue qua đường tiêm tĩnh mạch đuôi 31 3.4 Đồ thị biểu diễn khối lượng hai bán cầu não chuột 32 3.5 Đồ thị biểu diễn nồng độ Evans Blue (µg/g) não chuột 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê Hội Đột Quỵ Hoa Kỳ, đột quỵ nguyên nhân tử vong phổ biến thứ hai giới sau bệnh tim thiếu máu cục bộ, nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật người trưởng thành, bệnh lý thường gặp có tỷ lệ tử vong di chứng cao, địi hỏi chi phí y học xã hội Tỷ lệ mắc bệnh tăng lên theo tuổi nam cao nữ [36], [7] Do dân số già nên gánh nặng tăng lên nhiều 20 năm tới, đặc biệt nước phát triển Đột quỵ gây 9% tổng số ca tử vong giới, tỷ lệ tử vong đột quỵ 10 – 12 % nước phương Tây 12% số người 65 tuổi Tỷ lệ tử vong thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi, có khác biệt quốc gia [36] Tại nước ta, ước tính hàng năm có khoảng 200000 người bị đột quỵ, tỉ lệ tử vong khoảng 50% Bệnh đột quỵ xảy phần não bị tổn thương tắc nghẽn mạch máu nuôi não gây đột quỵ nhồi máu não (xấp xỉ 85%) vỡ mạch máu não gây đột quỵ xuất huyết não Lúc này, não không cung cấp oxy đủ để hoạt động nên vùng não ngưng hoạt động kéo theo không điều khiển quan khác hoạt động, gây liệt nửa người, tay, chân, rối loạn ngơn ngữ, ý thức vào hôn mê … không cấp cứu kịp thời, cách vùng não chết người bệnh tử vong Trong lần đột quỵ đầu tiên, khoảng 1/3 số bệnh nhân bị ảnh hưởng nhẹ, 1/3 bị tàn phế nặng 1/3 bị tử vong; lần đột quỵ tái phát có nguy tử vong tàn phế cao [14] Việc điều trị bệnh đột quỵ não nhiều hạn chế Cho đến nay, tPA (human tissuetype plasminogen activator - yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ) liệu pháp FDA (Food and Drug Administration) phê chuẩn điều trị đột quỵ nhồi máu não với khả làm tan cục máu đông phục hồi tưới máu đến vùng não bị thiếu máu Tuy nhiên, t-PA có giới hạn phạm vi tác dụng 4,5 tính từ thời điểm bắt đầu bị đột quỵ việc sử dụng thuốc mang đến nguy tử vong xuất huyết não Do đó, phát triển liệu pháp điều trị đột quỵ não cần thiết [14] Nhu cầu sử dụng thuốc để phòng chống lại bệnh ngày cao, đặc biệt sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Các thuốc cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu có tiềm điều trị đột quỵ hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống chết tế bào theo chương trình, bảo vệ thần kinh an toàn sử dụng thời gian dài [41] Tam thất hoang có tên khoa học Panax stipuleanatus Tsai & Feng, thuộc chi Panax L, họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae Theo y học cổ truyền, tam thất hoang sử dụng để tán ứ, chảy máu suy nhược thể Một số nghiên cứu chứng minh rễ củ Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng hai bán cầu não Số liệu biểu diễn dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn với *p < 0,05; **p < 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý; ###p < 0,001 so sánh với lô chứng sinh lý; nsp > 0,05, ΔΔp < 0,01 so sánh bán cầu não trái với bán cầu não phải lô Nhận xét: - Khối lượng bán cầu não trái phải lô sinh lý gần khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) - Lô bệnh lý không điều trị cho kết cân nặng hai bán cầu não khác nhau, cụ thể bán cầu não trái lớn não phải Đồng thời, khối lượng bán cầu não trái lô bệnh lý lớn rõ rệt so với lô sinh lý khác biệt có ý nghĩa thơng kê với pbl-sl < 0,01 Như vậy, chuột sau 72 phẫu thuật MCAO gây tắc động mạch não trái bị phù bán cầu não trái đột quỵ não - Lô TTH 150 mg/kg có khối lượng bán cầu não trái giảm rõ rệt so với lô bệnh lý khác biệt có ý nghĩa thống kê với pTTH150-bl 0,05) Như vậy, Edaravon mg/kg khơng có tác dụng cải thiện chức hàng rào máu não chuột MCAO 33 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Mơ hình thun tắc động mạch não (MCAO) – Mơ hình Intralumianl suture Hiện giới có nhiều mơ hình sử dụng để nghiên cứu đánh giá tác dụng chống đột quỵ não thuốc Trong phải kể đến mơ hình thun tắc động mạch não MCAO – intraluminal suture MCAO – intraluminal suture lần thực Koizumi cộng vào năm 1986 chuột cống Nhóm Koizumi sử dụng sợi phẫu thuật nylon, kích cỡ 4-0 có đầu phủ silicon (đường kính 0,25 - 0,30mm) cho tỷ lệ đạt nhồi máu thành cơng 93% [70] Mơ hình MCAO có nhiều ưu điểm gây thiếu máu não cục vĩnh viễn thoáng qua vùng não cung cấp máu MCA Sợi monofilament đưa vào gốc MCA để làm cản trở dòng máu lưu thông cung cấp máu cho động mạch Thời gian làm tắc nghẽn động mạch não gây tổn thương có tính lặp lại cá thể vùng thể vân tân vỏ não 60 phút [38] Làm thông mạch cách bỏ sợi monofilament mô trạng thái phục hồi mạch máu não tự nhiên điều trị người Mơ hình MCAO có ưu điểm chủ động gây thiếu máu não cục tạm thời vĩnh viễn vùng não cung cấp MCA Sợi monofilament đưa vào gốc MCA làm cản trở dòng máu cung cấp vào động mạch Có thể chủ động gây mơ hình thiếu máu não tạm thời vĩnh viễn rút sợi monofilament khỏi mạch máu cách chủ động Phương pháp gây tổn thương có tính lặp lại vùng vỏ não striatum Làm thơng mạch cách bỏ sợi monofilament mơ hình hóa trạng thái phục hồi mạch máu não sau huyết khối bị đánh tan cách tự nhiên dùng thuốc tPA bệnh nhân đột quỵ [33] Ưu điểm kỹ thuật tạo tổn thương lặp lại; mô thiếu máu cục tạm thời vĩnh viễn; tái tưới máu vị trí thương tổn, can thiệp nhanh; thích hợp cho nghiên cứu dài hạn sau gây thiếu máu não; khơng địi hỏi phải phẫu thuật xâm lấn sọ não điều ảnh hưởng đến áp suất nhiệt độ sọ Tuy nhiên, nhược điểm có tỉ lệ tử vong cao thiếu máu nghiêm trọng [34], [37] Mặc dù giới mơ hình áp dụng phổ biến Việt Nam nay, mơ hình nghiên cứu cịn Mơ hình MCAO triển khai lần thành công phịng thí nghiệm Viện Dược Liệu, áp dụng để đánh giá tác dụng chống đột quỵ não dược liệu như: rễ củ tam thất [24], dành dành [14] hồng [15] để đánh giá tác dụng dược liệu điều trị thiếu máu não cục 34 Các nghiên cứu thử tác dụng theo hướng chống đột quỵ não dược liệu khác trước thực phương pháp MCAO Viện Dược Liệu cho tỷ lệ sống sót chuột khoảng 80% làm tắc MCAO 60 phút cho kết nhuộm TTC sau 24h, vùng nhồi máu não chiếm khoảng 40% thể tích bán cầu [24] Mơ hình phù hợp để đánh giá tác dụng chống đột quỵ với tỷ lệ sống sót cao kinh nghiệm triển khai mơ hình tính sẵn có Viện dược liệu nên chúng tơi tiếp tục sử dụng mơ hình MCAO – intraluminal suture nghiên cứu tác dụng chống đột quỵ cao chiết rễ củ tam thất hoang Trong trình triển khai mơ hình chúng tơi nhận thấy mơ hình cịn có số nhược điểm sau: - Tỷ lệ tử vong chuột lần thực nghiệm cao (khoảng 10-15%) Nguyên nhân gây tử vong chuột + Kỹ thuật khơng thể áp dụng cho động vật tỉnh táo nên phải sử dụng thuốc gây mê Pentobarbital Natri, gây tai biến chết chuột, làm chuột ngưng thở liều thuốc mê + Chuột bị xuất huyết nhện đứt mạch máu ICA nội sọ [70] với tỷ lệ 12 % [39] Thực tế, chúng tơi sử dụng dây có kích cỡ 0,27 mm, chuột có tỷ lệ tử vong lớn chuột sống sót tích nhồi máu cao đột biến so với chuột MCAO khác Mặc dù, sử dụng sợi đầu silicon, giảm tỷ lệ xuất huyết nhện so với dùng sợi dây có đầu đốt - Khả lặp lại nhồi máu bị ảnh hưởng yếu tố khác Chẳng hạn kích thước đầu silicon gây tắc động mạch não [70], định chuột bị tổn thương não nặng kích thước q lớn hay khơng bị tổn thương não kích thước nhỏ Đầu silicon chúng tơi sử dụng làm thủ cơng kích thước khơng đồng đều; thêm vào đó, mạch máu chuột khác nên biết kích thước đầu silicon tối ưu để gây tắc động mạch não chuột Điểm khác biệt mơ hình thí nghiệm chúng tơi so với mơ hình nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh chuột khác kết hợp hai phương pháp đánh giá tổn thương thần kinh chuột theo phương pháp Menzies [52] thử nghiệm quay góc Với phương pháp đánh giá điểm tổn thương thần kinh có nhược điểm xảy sai số cịn mang tính chủ quan nghiên cứu viên chẳng hạn cảm nhận độ bám chuột thử nghiệm quay góc lại hồn tồn khách quan rõ ràng Như hai thử nghiệm kết hợp làm giảm sai số, tăng tính xác cho mơ hình nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết rễ củ tam thất hoang chuột phẫu thuật MCAO 35 4.2 Tác dụng bảo vệ thần kinh tam thất hoang Liều tác dụng cao chiết rễ củ tam thất hoang Từ kết đề tài nghiên cứu TS Lê Thị Xoan cộng [12] cao chiết rễ củ TTH liều thấp 75 mg/kg có làm giảm tỷ lệ thể tích vùng nhồi máu não chuột sau 24 phẫu thuật MCAO so với chuột bệnh lý, nhiên chưa đạt ý nghĩa thống kê Trong liều TTH 150mg/kg thể tác dụng làm giảm rõ rệt tỷ lệ thể tích vùng nhồi máu não khoảng thời gian đánh giá khác biệt có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) Như tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh chuột bị đột quỵ rễ củ tam thất hoang có phụ thuộc vào liều Kết khả quan thí nghiệm giúp chúng tơi tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu sâu tác dụng chế bảo vệ thần kinh cao chiết tam thất hoang điều trị đột quỵ nhồi máu não Do mức liều 75mg/kg cao chiết rễ củ tam thất hoang tác dụng dược lý đáng kể điều trị đột quỵ não chuột nên mơ hình này, chúng tơi thử nghiệm tác dụng dược lý cao chiết rễ củ tam thất hoang mức liều 150mg/kg Cân nặng chuột sau phẫu thuật MCAO Thí nghiệm theo dõi cân nặng chuột lô sinh lý không làm phẫu thuật MCAO chuột làm phẫu thuật MCAO ngày sau phẫu thuật Kết thí nghiệm cho thấy chuột lơ sinh lý phát triển bình thường, cân nặng trì ổn định có xu hướng tăng nhẹ chuột lô bệnh lý, cao chiết TTH 150mg/kg edaravon mg/kg giảm rõ rệt ngày sau phẫu thuật MCAO Ở ngày thứ 3, lô edaravone TTH 150mg/kg có cải thiện so với lơ bệnh lý không điều trị (p < 0,05) Như cân nặng chuột điều trị cao chiết rễ củ TTH 150mg/kg có giảm so với nhóm chứng sinh lý so với nhóm bệnh lý khơng điều trị cân nặng chuột nhóm cải thiện rõ rệt Việc cải thiện cân nặng góp phần cải thiện thể trạng chuột bị đột quỵ nhồi máu não Tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh Mục đích cuối điều trị đột quỵ cải thiện sức khỏe thể bệnh nhân thuốc can thiệp cần không bảo vệ mô não thúc đẩy phục hồi, mà cịn cần phục hồi chức tồn diện Điều dẫn đến nhà nghiên cứu đột quỵ đánh giá hành vi thường xuyên nghiên cứu họ, làm cho trở thành khía cạnh quan trọng nghiên cứu đột quỵ [70] Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết tam thất hoang liều 150 mg/kg có tác dụng cải thiện chức thần kinh vận động thơng qua tiêu chí: điểm chức thần kinh số lần quay trái thử nghiệm quay góc 36 Đánh giá tổn thương thần kinh tiến hành theo phương pháp Menzies cộng (1992) Chuột bị tổn thương não trái ảnh hưởng đến thần kinh não trái có biểu vận động nửa người đối bên (bên phải) bất thường Tổn thương thần kinh não trái nghiêm trọng biểu liệt nửa người bên phải thể rõ tương đương với điểm tổn thương thần kinh chuột lớn Chúng thực đánh giá tổn thương thần kinh vòng ngày sau phẫu thuật MCAO Khoảng thời gian giúp cho chúng tơi đánh giá cách tồn diện thay đổi điểm tổn thương thần kinh chuột thấy chuyển biến tích cực lô thuốc Phẫu thuật MCAO nghiên cứu nhằm gây nhồi máu não trái chuột, gây giảm khả vận động nửa người bên phải chuột Tổn thương thiếu máu cục nguyên nhân gây suy giảm chức cảm giác vận động Và để đánh giá suy giảm chức thần kinh chuột sau phẫu thuật MCAO, tiến hành làm thử nghiệm góc Thử nghiệm góc kiểm tra dễ thực hiện, khách quan, áp dụng để đánh giá thiếu hụt chức lâu dài nên lý chọn thử nghiệm để quan sát tổn thương thần kinh cảm giác chuột sau phẫu thuật đột quỵ [68] Thử nghiệm góc tận dụng nhiều bất đối xứng phần cảm giác vận động liên quan đến rối loạn chức vỏ não thể vân, bao gồm sai lệch cảm giác rung, tư sử dụng chi ghi lại mơ hình chuột [29], [64] Thí nghiệm tiến hành vào ngày thứ sau phẫu thuật MCAO Kết cho thấy lô chuột bệnh lý làm phẫu thuật MCAO có số lần quay trái nhiều lơ chứng sinh lý khơng làm phẫu thuật MCAO lại có số lần quay trái thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê (psl-bl < 0,01) Như vậy, lơ chuột bệnh lý có xu hướng quay trái nhiều dây thần kinh tiếp nhận cảm giác phía bên phải chuột bị tổn thương nhồi máu não trái nên chuột cảm nhận bị kích thích từ phía bên trái mạnh từ có xu hướng quay sang trái nhiều Kết nghiên cứu trước cho thấy mơ hình MCAO cho thấy, cao chiết cồn tam thất hoang liều 150 mg/kg có tác dụng cải thiện chức vận động thơng qua tiêu chí kéo dài thời gian thử nghiệm rotarod cải thiện trí nhớ thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến [12] Như vậy, kết nghiên cứu đề tài bổ sung thêm chứng khoa học tác dụng bảo vệ chức thần kinh rễ củ tam thất hoang chuột gây đột quỵ MCAO 37 4.3 Cơ chế tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết tam thất hoang mơ hình MCAO 4.3.1 Tác dụng chống oxy hóa cao chiết tam thất hoang MDA sản phẩm trình oxy hóa tế bào tổn thương nhồi máu não gây nên định lượng MDA xác định tác dụng chống oxy hóa mẫu thử cao chiết tam thất hoang Để định lượng MDA sử dụng phương pháp định lượng trực tiếp định lượng thông qua dẫn xuất MDA với chất khác Phương pháp phân tích định lượng MDA trực tiếp dựa nguyên lý kết hợp HPLC với đo quang phổ tử ngoại Phương pháp định lượng trực tiếp cho độ nhạy đặc hiệu cao nhiên có hạn chế khó khăn kĩ thuật Phương pháp đòi hỏi thiết bị HPLC với detector có độ nhạy cao, thời gian chạy sắc ký để tách MDA thành phần khác mẫu lớn, tùy thuộc vào loại mẫu, thời gian khác [46] Ở nghiên cứu này, sử dụng phương pháp định lượng gián tiếp MDA thơng qua phức MDA(TBA)2 tính dễ thực hiện, xử lý đồng thời nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng có kết tương đối xác Test TBA phương pháp phổ biến để định lượng MDA thông qua phức MDA(TBA)2 Phương pháp đánh giá xác lượng MDA nhiều so với việc dùng dải bước sóng tử ngoại để đo trực tiếp khơng có riêng MDA mà nhiều aldehyde khác có khối lượng phân tử nhỏ hấp thụ dải bước sóng Sản phẩm cộng phản ứng MDA(TBA)2 Phức ổn định, hấp thụ cực đại bước sóng 535 nm [56] Thí nghiệm định lượng MDA não chuột ngày thứ sau phẫu thuật MCAO Kết định lượng nồng độ MDA não chuột cho thấy lơ chứng bệnh lý có nồng độ MDA cao rõ rệt so với lô chứng bệnh lý Như vậy, nguyên nhân gây tổn thương tế bào mô não nhiều chuột sau phẫu thuật MCAO stress oxy hóa Lơ Edaravon mg/kg cho kết định lượng MDA có giá trị giảm so với lô chứng bệnh lý khác biệt có ý nghĩa thống kê (pedaravon-bl < 0,001) Do đó, edaravon có làm giảm tổn thương tế bào q trình oxy hóa mơ hình MCAO Kết phù hợp với công bố trước chế tác dụng chống oxi hóa edaravone mơ hình MCAO [45] Lơ TTH 150mg/kg có kết làm giảm rõ rệt nồng độ MDA so với lô chứng bệnh lý không điều trị nên cao chiết rễ củ TTH 150 mg/kg có tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh chuột MCAO thông qua chế làm giảm q trình oxy hóa tế bào mô não chuột bị tổn thương thiếu máu cục 38 4.3.2 Tác dụng bảo vệ hàng rào máu não tam thất hoang Tác dụng làm giảm phù não Phù não nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tàn tật đột quỵ thiếu máu não cục Phù não nhiễm độc tế bào hàng rào máu não bị phá vỡ Trong đột quỵ, bơm ion phụ thuộc lượng bị chức sau có giảm lưu lượng dịng máu, dẫn đến K+ trao đổi với Na+, Cl-, Ca2+, đồng thời kéo theo nước gây phù nhanh chóng tế bào thần kinh tế bào thần kinh đệm (phù nhiễm độc) Hoặc hàng rào máu não bị phá vỡ dẫn đến tăng tính thấm mao mạch làm cho nước phân tử hòa tan nước vào não dễ dàng gây phù (phù vận mạch) [36] Nhằm xác định thông số phù não, tiến hành mổ lấy não chuột, loại bỏ thùy khứu giác tiểu não sau cân xác khối lượng bán cầu cân phân tích Kết cho thấy chuột sau 72 phẫu thuật MCAO có bán cầu não trái phù rõ rệt so với lô chuột sinh lý không làm thủ thuật MCAO (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05), bán cầu não phải chuột sau phẫu thuật MCAO có mức độ phù não khơng đáng kể so với lô chuột sinh lý (sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p> 0,05) Ngun nhân chuột làm phẫu thuật MCAO gây tắc động mạch não trái sau 72 nên tế bào mô bán cầu não phải bị tổn thương không đáng kể Lô Edaravon 6mg/kg cho kết làm giảm mức độ phù não trái rõ ràng so sánh với lô bệnh lý với pedaravon-bl < 0,01 từ kết luận Edaravon 6mg/kg có tác dụng làm giảm phù não điều trị đột quỵ não TTH 150mg/kg cho kết giảm rõ rệt mức độ phù não trái so với lô bệnh lý không đươc điều trị (pTTH-bl < 0,05) Như vậy, cao chiết rễ củ TTH 150mg/kg cho thấy tác dụng chống phù não điều trị đột quỵ nhồi não Tác dụng cải thiện tính thấm hàng rào máu não Hàng rào máu não (Blood-Brain Barrier BBB) màng sinh học có tính chất chọn lọc ngăn cản chất có hại cho tế bào não Hàng rào máu não bao gồm tế bào nội mô (endothelial cell), tế bào hình (astroglia), tế bào ngoại mạch (pericyte), đại thực bào ngoại mạch màng đáy, chúng liên kết chặt chẽ với Với đặc tính đó, chúng hạn chế chặt chẽ di chuyển chất từ máu vào não, tế bào nội mô mao mạch phận khác thể lại khơng có đặc tính [55] Tình trạng viêm, stress oxy hóa kích thích liên quan đến miễn dịch sang chấn chấn thương sọ não, đột quỵ, nguyên nhân chủ yếu liên quan đến thay đổi tính thấm hàng rào máu não [28] chúng gây phá vỡ cấu trúc hoạt động vịng dính (các phức hợp protein liên kết tế bào biểu mơ nội mơ) dải bịt (có vai trò ngăn chặn chất 39 hòa tan nước rị rỉ, khơng cho chất vào khoảng gian bào phía dưới) làm giảm hoạt động protein kết nối [59], [69] Evans Blue loại thuốc nhuộm liên kết với albumin Trong điều kiện sinh lý, nội mơ thấm nước, ion khơng thấm protein albumin, Evans Blue liên kết với albumin lưu thông mạch máu Khi hàng rào máu não bị tổn thương làm tăng tính thấm thành mạch nên cho protein nhỏ albumin qua Do đó, Evans Blue mạch vào mơ Các mơ bị tăng tính thấm cho thấy màu xanh lam tăng lên đáng kể so với mơ có nội mạc nguyên vẹn Chúng lựa chọn phương pháp định lượng nồng độ Evans Blue để đánh giá tính thấm hàng rào máu não đột quỵ nhồi máu tính đơn giản, dễ thực tương đối xác [57] Kết định lượng Evans Blue não chuột sau 72 phẫu thuật MCAO cho thấy nồng độ Evans Blue não trái phải lô chuột bệnh lý cao rõ rệt so với lô sinh lý không làm thủ thuật MCAO (###pbl-sl< 0,001) Như vậy, chuột bị đột quỵ não có hàng rào máu não bị tổn thương hai bán cầu não dẫn đến tăng tính thấm gây rị rỉ Evans Blue ngồi Lơ Edaravon 6mg/kg có nồng độ Evans Blue cao rõ rệt so với lô sinh lý (###pedaravon-sl < 0,001), nhiên khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý không điều trị (pedaravon-bl> 0,05) Do đó, lơ chuột điều trị Edaravon khơng có tác dụng cải thiện mức độ tổn thương hàng rào máu não gây thiếu máu não cục Lơ TTH 150 mg/kg có nồng độ Evans Blue hai bán cầu não giảm rõ rệt so với lô chứng bệnh lý không điều trị (p < 0,05) chứng tỏ cao chiết rễ củ TTH 150 mg/kg có tác dụng cải thiện mức độ tổn thương tính thấm hàng rào máu não chuột MCAO, tác dụng TTH vượt trội so với edaravone Như vậy, chế tác dụng cao chiết rễ củ TTH 150mg/kg thông qua chế giảm stress oxy hóa bảo vệ hàng rào máu não chuột MCAO 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Cao chiết rễ củ tam thất hoang liều 150 mg/kg có tác dụng bảo vệ thần kinh chuột gây đột quỵ thiếu máu não cục phương pháp gây thuyên tắc động mạch não (MCAO) - Tác dụng bảo vệ thần kinh chuột bị đột quỵ thiếu máu não cục cao chiết tam thất hoang theo chế chống oxy hóa bảo vệ hàng rào máu não Kiến nghị - Đây bước đầu nghiên cứu chế tác dụng chống đột quỵ rễ củ tam thất hoang, cần tiến hành thêm đề tài để tìm hiểu rõ chế tác dụng rễ củ tam thất hoang với thời gian nghiên cứu dài - Tìm hiểu thành phần hoạt chất có tác dụng bảo vệ thần kinh chuột MCAO 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 11 12 13 14 15 Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ Thuật, tr 560-600 Nguyễn Văn Chương, Bài giảng chuyên đề: Thần kinh học: Đại cương đột quỵ não, tr 13-16 Nguyễn Văn Đăng (2006), Tai biến mạch mãu não, NXB Y học, Hà Nội Lê Huy Hòa (2002), "Nghiên cứu xâm nhiễm ung thư đại tràng", Tạp chí Y học thưc hành, (431), tr 101-104 Trần Cơng Luận (2002), "Phân tích thành phần hóa học tác dụng dược lý thân rễ củ hai loài sâm Panax bipinatifidus Seem Panax Stipuleanatus H Tsai et K.M.Feng", Đề tài cấp Bộ Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược Liệu, 14, tr 17-23 Lê Thị Luyến (2007), Bệnh học, Bộ Y Tế, Hà Nội, tr 342 Phan Tố Như (2021), Bài giảng phát tay: Đột quỵ não, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 1-4 Nguyễn Tập (2007), "Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái Sâm vũ diệp Tam thất hoang Việt Nam", Tạp chí Dược Liệu, 11(5), tr 177-181 Trần Mỹ Tiên , Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam trí nhớ", Tạp chí Dược Liệu, 11(5), tr 202-206 Trường Đại học Y Hà Nội - Bộ môn Sinh lý học (2006), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội Viện Dược Liệu (2020), Cơng trình nghiên cứu khoa học Viện Dược Liệu 2016 2020, NXB Khoa học kỹ thuật, Viện Dược liệu, tr 441-446 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 711-714 Lê Thị Xoan (2018), Nghiên cứu tác dụng chống đột quỵ não số dược liệu, Viện Dược Liệu Lê Thị Xoan, Đặng Thị Hạnh (2018), "Tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết giàu flavonoid từ hồng mơ hình đột quỵ não thực nghiệm", Tạp chí Dược Liệu, 23(2), tr 104-110 Tiếng Anh 16 Yang P F., Song X Y., et al (2016), "Advances in pharmacological studies of Panax notoginseng saponins on brain ischemia-reperfusion injury", Yao Xue Xue Bao, 51(7), pp 1039-46 17 Chongren Yang, Zhidong Jiang, et al (1985), " Two new oleanolic acid-type saponins from Panax Stipuleanatus ", 7(01), pp 18 Dipiro Joseph T, Talbert Robert L, et al (2016), Pharmacotherapy: a pathophysiologic approach 10th 19 Kikuchi K, Miura N, et al (2011), "Beneficial effects of the free radical scavenger edaravone (Radicut) in neurologic diseases" 20 Li Fuhai, Fisher Marc %J Stroke therapy (2001), "Animal modeling for developing stroke therapy", pp 83-96 21 Liang Chun, Ding Yan, et al (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells", 32(9), pp 3513-3516 22 Noda Noriko, Wakasugi Hiro %J Japan Medical Association Journal (2001), "Cancer and oxidative stress", 44(12), pp 535-539 23 Wu Z Y Raven P H., Hong D Y (2007), "Flora of china", Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis, pp 489-491 24 Xoan Le Thi, Phuong Nguyen Thi (2016), "Neuroprotective effect of Panax notoginseng against ischemic neuronal injury in mice", Journal of Medical Materials, 21(3), pp 169-174 25 Zou K, Zhu S, et al (2002), "Analysis of saponins of Panax stipuleanatus by using HPLC and APIMS/MS techniques", 24, pp 355-357 26 Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, Springer Science & Business Media 27 Aguilar Diaz De Leon J., Borges C R (2020), "Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay", J Vis Exp, (159) 28 Banks W A (2015), "The blood-brain barrier in neuroimmunology: Tales of separation and assimilation", Brain Behav Immun, 44, pp 1-8 29 Barth T M., Jones T A., et al (1990), "Functional subdivisions of the rat somatic sensorimotor cortex", Behav Brain Res, 39(1), pp 73-95 30 Brinker G., Franke C., et al (1999), "Thrombolysis of cerebral clot embolism in rat: effect of treatment delay", Neuroreport, 10(16), pp 3269-72 31 Brouns R., De Deyn P P (2009), "The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke", Clin Neurol Neurosurg, 111(6), pp 483-95 32 Chen J., Zacharek A., et al (2005), "Endothelial nitric oxide synthase regulates brain-derived neurotrophic factor expression and neurogenesis after stroke in mice", J Neurosci, 25(9), pp 2366-75 33 Chiang T., Messing R O., et al (2011), "Mouse model of middle cerebral artery occlusion", J Vis Exp, (48) 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Deb P., Sharma S., et al (2010), "Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis", Pathophysiology, 17(3), pp 197-218 Dirnagl U., Iadecola C., et al (1999), "Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view", Trends Neurosci, 22(9), pp 391-7 Donnan G A., Fisher M., et al (2008), "Stroke", Lancet, 371(9624), pp 1612-23 Durukan A., Tatlisumak T (2007), "Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia", Pharmacol Biochem Behav, 87(1), pp 179-97 Engel O., Kolodziej S., et al (2011), "Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model", J Vis Exp, (47) Fluri F., Schuhmann M K., et al (2015), "Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research", Drug Des Devel Ther, 9, pp 3445-54 Fujimura M., Morita-Fujimura Y., et al (1999), "Manganese superoxide dismutase mediates the early release of mitochondrial cytochrome C and subsequent DNA fragmentation after permanent focal cerebral ischemia in mice", J Neurosci, 19(9), pp 3414-22 Gaire B P (2018), "Herbal Medicine in Ischemic Stroke: Challenges and Prospective", Chin J Integr Med, 24(4), pp 243-246 Ghosh N., Ghosh R., et al (2014), "Advances in herbal medicine for treatment of ischemic brain injury", Nat Prod Commun, 9(7), pp 1045-55 Goldim M P S., Della Giustina A., et al (2019), "Using Evans Blue Dye to Determine Blood-Brain Barrier Integrity in Rodents", Curr Protoc Immunol, 126(1), pp e83 Huang Y., McNamara J O (2004), "Ischemic stroke: "acidotoxicity" is a perpetrator", Cell, 118(6), pp 665-6 Jaiswal M K (2019), "Riluzole and edaravone: A tale of two amyotrophic lateral sclerosis drugs", Med Res Rev, 39(2), pp 733-748 Janero D R (1990), "Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury", Free Radic Biol Med, 9(6), pp 515-40 Jia D., Deng Y., et al (2014), "Neuroprotective effect of Panax notoginseng plysaccharides against focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats", Int J Biol Macromol, 63, pp 177-80 Li Q., Han X., et al (2016), "Organotypic Hippocampal Slices as Models for Stroke and Traumatic Brain Injury", Mol Neurobiol, 53(6), pp 4226-4237 Liang C., Ding Y., et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett, 20(23), pp 7110-5 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Liang C., Ding Y., et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", J Ginseng Res, 37(1), pp 74-9 Luo H., Hu J., et al (2018), "In vivo and in vitro neuroprotective effects of Panax ginseng glycoproteins", Int J Biol Macromol, 113, pp 607-615 Menzies S A., Hoff J T., et al (1992), "Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model", Neurosurgery, 31(1), pp 100-6; discussion 106-7 Mergenthaler P., Dirnagl U., et al (2004), "Pathophysiology of stroke: lessons from animal models", Metab Brain Dis, 19(3-4), pp 151-67 Mhairi Macrae I (1992), "New models of focal cerebral ischaemia", Br J Clin Pharmacol, 34(4), pp 302-8 Patel J P., Frey B N (2015), "Disruption in the Blood-Brain Barrier: The Missing Link between Brain and Body Inflammation in Bipolar Disorder?", Neural Plast, 2015, pp 708306 Perše M (2013), "Oxidative stress in the pathogenesis of colorectal cancer: cause or consequence?", Biomed Res Int, 2013, pp 725710 Radu M., Chernoff J (2013), "An in vivo assay to test blood vessel permeability", J Vis Exp, (73), pp e50062 Rousselet E., Kriz J., et al (2012), "Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining", J Vis Exp, (69), pp Saraiva C., Praỗa C., et al (2016), "Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases", J Control Release, 235, pp 34-47 Shi Z Y., Zeng J Z., et al (2019), "Chemical Structures and Pharmacological Profiles of Ginseng Saponins", Molecules, 24(13) Shu P P., Li L X., et al (2021), "Identification and quantification of oleanane triterpenoid saponins and potential analgesic and anti-inflammatory activities from the roots and rhizomes of Panax stipuleanatus", J Ginseng Res, 45(2), pp 305-315 Siesjö B K., Katsura K., et al (1996), "Acidosis-related damage", Adv Neurol, 71, pp 209-33; discussion 234-6 Takizawa S., Hogan M., et al (1991), "The effects of a competitive NMDA receptor antagonist (CGS-19755) on cerebral blood flow and pH in focal ischemia", J Cereb Blood Flow Metab, 11(5), pp 786-93 Tillerson J L., Cohen A D., et al (2001), "Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine", J Neurosci, 21(12), pp 442735 White D J., Camfield D A., et al (2020), "Effects of Panax quinquefolius (American ginseng) on the steady state visually evoked potential during cognitive performance", Hum Psychopharmacol, 35(6), pp 1-6 66 Woodruff T M., Thundyil J., et al (2011), "Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke", Mol Neurodegener, 6(1), pp 11 67 Zhang D., Dong Y., et al (2017), "Efficacy and Safety of Cerebrolysin for Acute Ischemic Stroke: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials", Biomed Res Int, 2017, pp 4191670 68 Zhang L., Schallert T., et al (2002), "A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia", J Neurosci Methods, 117(2), pp 207-14 69 Zhao Z., Hu J., et al (2014), "Activation of AMPK attenuates lipopolysaccharideimpaired integrity and function of blood-brain barrier in human brain microvascular endothelial cells", Exp Mol Pathol, 97(3), pp 386-92 70 Dirnagl U (2010), Rodent Models of Stroke, Neuromethods Trang web 71 https://www.thuocdantoc.org/duoc-lieu/sam-vu-diep ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HÀ Mã sinh viên: 1701132 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ THẦN KINH CỦA TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS) TRÊN MƠ HÌNH ĐỘT QUỴ NÃO THỰC NGHIỆM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... nhiều nghiên cứu chứng minh có tác dụng bảo vệ thần kinh thực nghiệm lâm sàng [47], [65], [16], [60], [51] Vì đề tài ? ?Nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh tam thất hoang (Panax stipuleanatus) mơ hình. .. chứng khoa học tác dụng bảo vệ chức thần kinh rễ củ tam thất hoang chuột gây đột quỵ MCAO 37 4.3 Cơ chế tác dụng bảo vệ thần kinh cao chiết tam thất hoang mô hình MCAO 4.3.1 Tác dụng chống oxy